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Utilizzo di sistemi LC/MS e LC/MS-MS nell'ambito del TDM dei farmaci anti-infettivi Lorena Baietto (MSc, PhD) Laboratorio di Farmacologia Clinica e Farmacogenetica Università degli Studi di Torino Facoltà di Medicina e Chirurgia, Dipartimento di Scienze Mediche Ospedale Amedeo di Savoia (Torino)

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Utilizzo di sistemi LC/MS e

LC/MS-MS nell'ambito del

TDM dei farmaci anti-infettivi

Lorena Baietto (MSc, PhD)

Laboratorio di Farmacologia Clinica e Farmacogenetica

Università degli Studi di Torino

Facoltà di Medicina e Chirurgia, Dipartimento di Scienze Mediche

Ospedale Amedeo di Savoia (Torino)

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ARGOMENTI TRATTATI:

Utilità del TDM dei farmaci anti-infettivi in campo clinico

Metodi che abbiamo validato in laboratorio per il

dosaggio dei farmaci antinfettivi nella pratica clinica

Esempi di utilizzo dei sistemi LC-MS e LC-MS-MS nel

dosaggio di alcuni farmaci:

- HPLC-MS nel dosaggio dei farmaci antifungini in

plasma ed in plasma spottato su supporto Dried Plasma

Spots

- UPLC-MS-MS nel dosaggio della colistina in plasma

- UPLC-MS-MS nel dosaggio della daptomicina in

plasma e liquor

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ARGOMENTI TRATTATI:

Utilità del TDM dei farmaci anti-infettivi in campo clinico

Metodi che abbiamo validato in laboratorio per il

dosaggio dei farmaci antinfettivi nella pratica clinica

Esempi di utilizzo dei sistemi LC-MS e LC-MS-MS nel

dosaggio di alcuni farmaci:

- HPLC-MS nel dosaggio dei farmaci antifungini in

plasma ed in plasma spottato su supporto Dried Plasma

Spots

- UPLC-MS-MS nel dosaggio della colistina in plasma

- UPLC-MS-MS nel dosaggio della daptomicina in

plasma e liquor

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IL THERAPEUTIC DRUG MONITORING

DEFINIZIONE: Il monitoraggio terapeutico dei farmaci è un processo che consiste nell'utilizzare le concentrazioni dei farmaci nei liquidi biologici, i principi della farmacocinetica e i criteri della farmacodinamica per ottimizzare la terapia farmacologica del singolo individuo

ridurre i rischi di effetti collaterali, o tossici, ed aumentare, quindi, i benefici dati dal farmaco al paziente .

MIGLIORARE L’EFFICACIA E RIDURRE LA COMPARSA DI RESISTENZA

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TDM e TERAPIA

ANTINFETTIVA:

Correlare l’efficacia e la tossicità di un farmaco con le

concentrazioni plasmatiche

Studiare le interazioni con altri farmaci co-somministrati

Valutare l’efficacia e la tossicità in pazienti con alterazioni

fisiopatologiche ( epatopatia, insufficienza renale,

gravidanza, ecc.)

Valutare l’efficacia e tossicità in popolazioni speciali

(anziani, neonati)

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ARGOMENTI TRATTATI:

Utilità del TDM dei farmaci anti-infettivi in campo clinico

Metodi validati in laboratorio per il dosaggio dei farmaci

antinfettivi nella pratica clinica

Esempi di utilizzo dei sistemi LC-MS e LC-MS-MS nel

dosaggio di alcuni farmaci:

- HPLC-MS nel dosaggio dei farmaci antifungini in

plasma ed in plasma spottato su supporto Dried Plasma

Spots

- UPLC-MS-MS nel dosaggio della colistina in plasma

- UPLC-MS-MS nel dosaggio della daptomicina in

plasma e liquor

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Instrument Pump model Autosampler model Detector Software Column

HPLC (Waters) Binary pump model

1525 717

Micromass ZQ mass detector

Empower Pro software Atlantis dC-18 3µ column (150mm×2.1mm id)

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valori di accuratezza e precisione < 15%

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Procedura di estrazione

50 µl di IS Campioni vortexati per 10 sec

Campioni sonicati (cycle 0.75;

amplitude 80%)

Campioni centrifugati

(7000 x g, 10 min a 4°C

Surnatante trasferito in

provette di vetro Surnatante asciugato a

60°C e ricostituito

Iniezione in HPLC-MS

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Instrument Pump model Autosampler model Detector Software Column

HPLC (Waters) Binary pump model

1525 717

Micromass ZQ mass detector

Empower Pro software Atlantis dC-18 3µ column (150mm×2.1mm id)

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ARGOMENTI TRATTATI:

Utilità del TDM dei farmaci anti-infettivi in campo clinico

Metodi che abbiamo validato in laboratorio per il

dosaggio dei farmaci antinfettivi nella pratica clinica

Esempi di utilizzo dei sistemi LC-MS e LC-MS-MS nel

dosaggio di alcuni farmaci:

- HPLC-MS nel dosaggio dei farmaci antifungini in

plasma ed in plasma spottato su supporto Dried Plasma

Spots

- UPLC-MS-MS nel dosaggio della colistina in plasma

- UPLC-MS-MS nel dosaggio della daptomicina in

plasma e liquor

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HPLC-MS nel dosaggio plasmatico

dei farmaci antifungini

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Antifungini triazoli

Prevenzione e terapia delle infezioni fungine invasive

Farmacocinetica non lineare

Alta variabilità tra i pazienti

Hope WW et al. Curr Opin Infect Dis. 2008;21:580-586.

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Efficacy cut-off in prophylaxis

Itraconazole: Ctrough > 0.5 mg/L

Voriconazole: Ctrough > 0.5 mg/L

Posaconazole: Ctrough > 0.5 mg/L

Efficacy cut-off in therapy

Itraconazole: Ctrough > 1 mg/L

Voriconazole: Ctrough > 2 mg/L

Posaconazole: Ctrough > 1 mg/L

Toxicity cut-off in therapy

Itraconazole: Ctrough > 17.1 mg/L

Voriconazole: Ctrough > 5.5 mg/L

Posaconazole: not defined

Andes D et al. Antimicrob Agents Chemother 2009;53(1):24-34; Lestner JM et al. Clin Infect Dis. 2009;49:928-930.

INEFFICACY

TOXICITY

Pla

sma

con

cen

trat

ion

s narrow

therapeutic window

Ctrough

Time

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Instrument Pump model Autosampler model Detector Software Column

HPLC (Waters) Binary pump model

1525 717

Micromass ZQ mass detector

Empower Pro software Atlantis dC-18 3µ column (150mm×2.1mm id)

Procedura di estrazione: 50 µl di IS 200 µl di acetonitrile 200 µl di campione •Vortex per 10 sec •Cetrifug. per 10 min a 15000 rpm •Diluire SN 1:1 con acqua •Iniezione in HPLC-MS

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Parametri valutati secondo le linee guida FDA1 Accuratezza Precisione Selettività Sensibilità Valori di accuratezza

e precisione < 15% ACCURATEZZA e PRECISIONE

Drugs Nominal value

(mg/L) Accuracy

(%) Precision (R.S.D.%)

Intra-day Inter-day

ITC

0.10 6.23 9.12 6.34

1.50 2.30 4.30 8.70

3.00 0.14 5.72 12.01

5.00 4.60 7.86 12.64

PSC

0.10 8.08 4.89 8.70

1.50 1.30 3.70 7.10

3.00 3.83 4.20 6.61

5.00 4.99 5.77 6.96

VRC

0.12 1.50 5.81 13.30

1.50 1.70 3.60 9.10

4.00 5.78 4.09 8.09

6.00 9.55 5.90 6.09

1 FDA. Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation; 2001.

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SELETTIVITA’ e SENSIBILITA’

Assenza di picchi interferenti in plasma bianco

Buon limite di quantificazione (LOQ) che permette di quantificare anche le basse concentrazioni in modo preciso e accurato.

LOQ

Blank plasma

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HPLC system

Detector Extraction procedure

Dry Step LLOQ

(mg/L)

Time of analysis

(min) References

HPLC UV SPE Yes 0.05-0.15 19 Gordien et al. 2009

HPLC MS-MS Protein precipitation

No 0.010 nr Chahbouni et al. 2010

HPLC MS-MS Protein precipitation

No 0.100 15 Verdier et al. 2010

HPLC MS Protein precipitation

No 0.030 15 Baietto et al. 2010

UPLC MS-MS Protein precipitation

No 0.020 5.1 Decosterd et al. 2010

UPLC UV Protein precipitation

Yes 0.050 6 Wissen et al. 2012

HPLC MS-MS SPE Yes 0.001 3 Beste et al. 2012

Gordien JB et al. J Pharm Biomed Anal 2009;50(5):932-8; Chahbouni A at al. Ther Drug Monit 2010;32(4):453-7; Verdier MC et al. Clin Chem Lab Med 2010;48(10):1515-22; Baietto L et al. Antimicrob Agents Chemother 2010;54(8):3408-13; Decosterd LA et al. Antimicrob Agents Chemother 2010;54(12):5303-15; Wissen at al. Beste KY et al. Clin Chim Acta 2012;413(1-2):240-5.

• Facile e rapida procedura di estrazione (turn around time = 1 day) • Piccolo volume di plasma necessario • Utilizzo della Quinoxaline come IS • Curva di calibrazione adatta alle concentrazione attese nella pratica

clinica • Ad oggi abbiamo analizzato circa 700 campioni provenienti dal Regina

Margherita e Molinette

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MS vs UV

• MS permette di avere migliore sensibilità e

specificità rispetto a UV.

• Procedura di estrazione su MS è più

rapida e non richiede asciugatura (curva, qc e 2

campioni estratti in 30 min con metodo HPLC-MS).

• Metodo su MS richiede minor volume di

plasma (200 µl vs 300 µl).

• Corsa su MS più rapida (15 min vs 18

min).

• Possibilità di fare più iniezioni dello stesso

campione (5 vs 1).

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Certificato relativo all’Interlaboratory Quality Control Program for TDM of antifungal drugs.

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HPLC-MS nel dosaggio dei farmaci

antifungini in plasma spottato su supporto

Dried Plasma Spots

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Dried blood spots (DBS) o dried plasma spots (DPS)?

DPS

DBS

• Nuovo metodo di raccolta dei campioni

• Campioni di sangue e di plasma possono essere conservati e inviati a temperatura ambiente (solo per farmaci stabili a R.T.)

• DPS migliori di DBS (studi clinici si riferiscono a livelli plasmatici; per DPS non è necessario correggere la concentrazione plasmatica per l’ematocrito).

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1. 50 uL di plasma sono spottati su DSSD 2. Filtri vengono asciugati a r.t. per 30 min 3. Filtri vengono arrotolati e trasferiti in una provetta 4. Aggiunta di soluzione estraente e IS 5. Effettuato il tumbling per 15 min at 40 rpm 6. Fase organica è evaporata a 50°C 7. Campioni ricostituiti e iniettati in HPLC-MS

PROCEDURA DI ESTRAZIONE

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Stabilità a temperatura ambiente dei triazoli su DPS

dopo 2 settimane degradazione <17%.

Baietto L et al. J. Antimicrob. Chemother. 2012;67:2645-2649

75

80

85

90

95

100

105

110

0 5 10 15 20 25 30

Pe

rce

nta

ge

re

ma

inin

g (

%)

Time (day)

ITC

PSC

VRC

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Correlazione tra “metodo DPS” e “metodo non-DPS”

r2=0.994

r2=0.959

r2=0.991

Alta correlazione tra i due metodi di estrazione. Linear regression statistically significant (P<0.0001)

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UPLC-MS-MS e dosaggio plasmatico

della colistina

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COLISTINA

Antibiotico lipopeptidico usato come ultima “chance” di difesa

contro Psudomonas e Acinetobacter in pazienti critici

Formata da 30 polimixine, le principali sono la colistina A e la

colistina B

Formulazione orale → COLISTINA SULFATO

Formulazione endovena → COLISTIMETATO (pro-farmaco)

COLISTINA

Idrolisi

in vivo Idrolisi tempo, matrice e

temperatura dipendente

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UPLC-MS-MS

Alta selettività dell’analisi

(molti farmaci concomitanti)

Alta sensibilità (volume di plasma piccolo e

basse concentrazioni plasmatiche attese,

precipitazione e iniezione diretta)

Tempi di analisi in UPLC più rapidi

Riduzione consumo di

solvente

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Procedura di estrazione

Colistina libera

• Soluzione precipitante + IS

(polimixina)

• 200 µl di plasma

• Vortex

• Centrifug a 14000 rpm x 10

min a 4°C

• Surnatante trasferito in vials e

diluito 1:1 con acqua

• Iniezione in UPLC

Colistina totale

• IS (polimixina)

• 200 µl di plasma

• Acido solforico 0.5 M

• Aspettare 30 min

• NaOH 1M

• Soluzione precipitante

• Vortex

• Centrifug a 14000 rpm x 10

min a 4°C

• Surnatante trasferito in vials e

diluito 1:1 con acqua

• Iniezione in UPLC

Instrument Pump model Autosampler model Detector Software Column

UPLC (Waters) ACQUITY Binary Solvent

Manager ACQUITY Sample

Manager TQ Detector MassLynx Acquity UPLC HSS C18 1.8µm (2.1x150mm)

Colistimetato

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min2.20 2.30 2.40 2.50 2.60 2.70 2.80 2.90 3.00 3.10 3.20 3.30 3.40 3.50 3.60 3.70 3.80

%

18

F1:MRM of 1 channel,ES+

578.80>101.20

111025 Mix CMS NO idro 1

Mix Mix

6.100e+0013.30

2.33

2.20

2.122.31

2.23

2.83

2.472.35

2.732.60

2.55

2.48

2.69 2.77

3.173.00

2.99

2.86

2.94

2.93

3.02

3.11

3.21

3.27

3.85

3.60

3.543.48

3.333.35

3.36

3.43

3.69

3.63

3.79

3.87

min2.20 2.30 2.40 2.50 2.60 2.70 2.80 2.90 3.00 3.10 3.20 3.30 3.40 3.50 3.60 3.70 3.80

%

0

F2:MRM of 1 channel,ES+

585.7>101.2

111026 CMS idro 24h 1 Smooth(Mn,2x2)

autosampler stability stabilita' 24 h idro

8.733e+004Colistina A

3.25

4006.17

86653

3.06

Colistimetato idro → Colistina A totale Colistimetato idro → Colistina B totale

min2.20 2.30 2.40 2.50 2.60 2.70 2.80 2.90 3.00 3.10 3.20 3.30 3.40 3.50 3.60 3.70 3.80

%

0

F1:MRM of 1 channel,ES+

578.80>101.20

111026 CMS idro 24h 1 Smooth(Mn,2x2)

autosampler stability stabilita' 24 h idro

5.094e+003Colistina B

2.71

242.66

4929*

2.82

2.89

3.33

Colistimetato no idro → Colistina A Colistimetato no idro → Colistina B

min2.20 2.30 2.40 2.50 2.60 2.70 2.80 2.90 3.00 3.10 3.20 3.30 3.40 3.50 3.60 3.70 3.80

%

26

F2:MRM of 1 channel,ES+

585.7>101.2

111025 Mix CMS NO idro 1

Mix Mix

4.600e+0013.40

2.27

2.26

2.132.24

2.15

2.21

3.372.582.51

2.47

2.322.45

2.35

2.38

3.00

2.922.812.80

2.60

2.68

2.73

2.90

2.85

2.99

Colistina A

3.26

0.37

14

3.03

3.193.10

3.16

3.34

3.31

3.64

3.46

3.55

3.51

3.73

3.65

3.69

3.77

3.87

3.82

[10 µg/ml]

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0

2,000

4,000

6,000

8,000

10,000

12,000

14,000

16,000

18,000

20,000

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

Co

ncen

trazio

ne p

lasm

ati

ca C

olisit

ina (

ng

/mL

)

Timing (hour)

Concentrazioni plasmatiche colistina

Colistina Totale

Colistina libera

Colistimetato

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HPLC system Detector Extraction procedure

Dry Step Time of analysis

(min) References

HPLC FL (derivatizzazione) SPE No 18 Li et al. 2002 (in rat plasma)

HPLC MS-MS Protein precipitation

No 10 Jansson et al. 2009

HPLC MS-MS SPE Yes 3.8 Gobin et al. 2010

UPLC MS-MS Protein precipitation

No 6 Baietto

Li J et al. AAC 2002;46(10):3304-3307; Jansson B et al. J.Pharm.Biomed.Analys. 2009(49):760-767; Gobin P et al. AAC 2010;54(5):1941-1948.

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Effetto matrice

• Alterazione dell’efficienza della ionizzazione dovuto alla

presenza di sostanze coeluenti che può compromettere

l’affidabilità dei risultati.

• Matrici biologiche sono miscele molto complesse

• Interferenza più frequente nel caso si utilizzi

spettrometro a singolo quadrupolo piuttosto che a triplo

quadrupolo.

• Rimedi:

→ ottimizzare processo estrazione

→ ottimizzare separazione cromatografica

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• Tempi di ritenzione

diversi

• Recupero >90%

• Effetto matrice <15%

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UPLC-MS-MS e dosaggio della daptomicina

in plasma e liquor

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• Antibiotico lipopeptidico usato nelle infezioni a

carico di cute e tessuti molli e nelle endocarditi

del cuore destro sostenuti da MRSA.

• Valida opzione terapeutica nel trattamento delle

infezioni a carico del Sistema Nervoso Centrale

come le meningiti sostenute da MRSA.

Daptomicina

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Daptomycin TDM

Efficacy cut-off: Cmax > 60 mg/L

Toxicity cut-off: Cmin > 24.3 mg/L

Cmax

Cmin

Pea et al. 2011. The Annals of Pharmacotherapy. July/August, Volume 45,e37;

Bhavnani SM, Rubino CM, Ambrose PG, Drusano GL. 2010. Clin Infect Dis ;50:1568-74)

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Daptomicina

• Antibiotico lipopeptidico usato nelle infezioni a

carico di cute e tessuti molli e nelle endocarditi

del cuore destro sostenuti da MRSA.

• Valida opzione terapeutica nel trattamento delle

infezioni a carico del Sistema Nervoso Centrale

come le meningiti sostenute da MRSA.

valutare la farmacocinetica liquorale della daptomicina in pazienti

portatori di Derivazione Ventricolare Esterna (DVE) con sospetto di

SIRS-Sepsi o Shock settico di qualsiasi origine, richiedente una terapia

empirica per cui la somministrazione di Daptomicina è indicata

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Compound name: Daptomicina

Coefficient of Determination: R^2 = 0.998984

Calibration curve: -2.729e-005 * x̂ 2 + 0.0168139 * x

Response type: Internal Std ( Ref 2 ), Height * ( IS Conc. / IS Height )

Curve type: 2nd Order, Origin: Force, Weighting: 1/x, Axis trans: None

ng/ml-0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200

Re

sp

on

se

-0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

ng/ml

Re

sid

ua

l

9.693

min2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75 4.00 4.25 4.50 4.75

%

0

F2:MRM of 2 channels,ES+

313.0926>246.4657

121120 QC H 1 plasma Smooth(Mn,6x6)

qc qc

1.202e+005QX (IS)

2.88

10537.46

119923

min

%

0

F1:MRM of 4 channels,ES+

811.2>802.5

121120 QC H 1 plasma Smooth(Mn,5x5)

qc qc

1.996e+005Daptomicina

2.51

12849.00

199370

Sample Name Std. Conc RT IS Area %Dev ng/ml

121120 QC H 1 130 2.51 10537.46 -4.8 123.718

121120 QC M 1 60 2.51 11374.86 -5 56.991

121120 QC L 1 6.5 2.51 11198.31 0.3 6.519

121120 QC H 2 130 2.51 10862.58 2.3 133.015

121120 QC M 2 60 2.51 11170.5 1.7 60.991

121120 QC L 2 6.5 2.51 10382.87 9.2 7.1

121120 QC H 3 130 2.51 10859.4 2 132.557

121120 QC M 3 60 2.51 10939.91 8.9 65.356

121120 QC L 3 6.5 2.51 10790.83 4.7 6.806

121120 QC H 4 130 2.51 11202.6 8.4 140.974

121120 QC M 4 60 2.51 11077.87 9.1 65.455

121120 QC L 4 6.5 2.51 11251.9 4.2 6.775

121120 QC H 5 130 2.51 10939.09 5.5 137.158

121120 QC M 5 60 2.51 10783.08 9.7 65.815

121120 QC L 5 6.5 2.51 11119.61 -1.5 6.401

121120 QC H 6 130 2.51 11334.69 5.1 136.656

121120 QC M 6 60 2.51 11487.65 3.6 62.175

121120 QC L 6 6.5 2.51 10456.14 -8.5 5.95

Analisi daptomicina in plasma

r2 = 0.998

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Cromatogrammi relativi a LOQ e bianco estratti da liquor

Daptomicina [0.078 µg/ml]

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Vantaggi metodo sviluppato

• Rapida procedura di estrazione

• Ampio range di calibrazione per plasma e

liquor

• Buona accuratezza e precisione del

metodo

• Buona sensibilita’ del metodo

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Conclusioni

• Rilevatore massa e massa-massa sono adatti

sia alle analisi di routine, sia alla ricerca perchè

permettono di avere risultati accurati, precisi e

altamente selettivi.

• L’alta sensibilità e specificità permettono di

utilizzare metodi di estrazione rapidi (es.

precipitazione proteica) riducendo i tempi

necessari alla preparazione del campione.

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• Prof. Di Perri

• Dr. Antonio D’Avolio

• Dr. Andrea Calcagno

• Prof. Francesco Giuseppe De Rosa

• Prof. Stefano Bonora

• Dott.ssa Jessica Cusato

• Dott. Marco Simiele

• Dott.ssa Alessandra Ariaudo

• Dott. Amedeo De Nicolò

• Dott.ssa Cristina Marra

• Agnese Sofia De Nigris

• Mauro Sciandra

Ringraziamenti