Acqua&Aria|nr.9|200724

Un terreno contaminato da idrocarburi prelevato daun'area di rifornimento di autocisterne è stato

utilizzato per confrontare i processi degradativioperati da microrganismi autoctoni con quelli

alloctoni di origine marina no-OGM selezionati per ladegradazione degli idrocarburi. Si è verificata

l'effettiva utilità dell'aggiunta di ceppi batterici insiti inquinati e la consistenza del rapporto

costi/benefici

cerca ha messo in evidenza le diverse attitudi-ni dei microrganismi nell'operare la biodegrada-zione degli idrocarburi (Bartha, 1986; Bossert etal., 1995; Davini et al., 2002; Riser, 1998), esisto-no infatti ceppi batterici selezionati per aggre-dire matrici complesse come il petrolio greggioe i suoi derivati di distillazione. Sono presenti già in natura microrganismi estre-mamente specializzati che operano precisi pas-saggi metabolici nei diversi stadi della degrada-zione degli idrocarburi (ZoBell et al., 1944; Zo-Bell, 1946; Sander et al., 1991). In ambientenaturale, la catena metabolica è lenta a formar-si e, in genere, si osserva un accumulo di sostan-ze senza evoluzioni successive. La tecnica del-la bioaugmentation sfrutta la capacità umanadi assemblare in laboratorio una serie di famigliedi microrganismi, non in competizione, che for-mano blend (consorzi) di microrganismi capa-ci di utilizzare ogni passaggio metabolico fino asostanze semplici o addirittura fino a CO2 e ac-qua. Il blend batterico di riferimento per la bioaug-mentation deriva da ricerche e applicazioni tren-tennali che hanno trovato clamorose applica-zioni in tutto il mondo (in Alaska con il versa-mento relativo alla Exxon Valdez, nel golfo delTexas con il versamento Mega Borg, in Kuwaitdopo la guerra con l'Irak, nel Mare del Nord ),ma viste sempre con una certa diffidenza in Ita-lia. Nel nostro Paese esiste un'applicazione su ter-reno contaminato da PCB e su micelio di tetra-cicline (Blundo et al., 1992) documentate. In pratica, il blend batterico si è confermatocapace di aprite l'anello aromatico (Pinelli etal., 1997), sia quello relativo agli idrocarburiche quello delle tetracicline, in due punti a mez-zo delle ossidasi prodotte partecipando attiva-mente alla demolizione/trasformazione del sub-strato. Il consorzio di microrganismi utilizzato

Degradazionedi idrocarburi in suoli contaminati

Ricerca

Suolo

Fra le diverse tecniche di risanamento deisuoli contaminati da idrocarburi, si è osser-vato che affidarsi a batteri autoctoni, an-

corché messi nelle condizioni ottimali per quan-to concerne nutrienti e ossigeno, può richiede-re tempi di recupero molto lunghi . Labioaugmentation (bonifica del terreno conta-minato con l'ausilio di nutrienti e microrganismialloctoni - OGM free) rappresenta una validaalternativa nell'ambito dei sistemi biologici edecocompatibili del trattamento del suolo inqui-nato (Zucchi et al., 2003). In questi anni, la ri-

Paolo Broglio, Ecologia Applicata,

Milano Roberto Blundo,

Ecobios Italia, Roma

1 - Idrocarburi totali nel terreno C (senza inoculo),evoluzione nel tempodelle tre frazioni neltest in bottiglia chiusa

nr.9|2007|Acqua&Aria 25

deriva da ceppi batterici marini di diversa natu-ra prelevati a suo tempo da zone contaminate eallevati in laboratorio, di generazione in genera-zione, fino ad arrivare a cloni resistenti a una di-versa pressione osmotica e quindi in grado dioperare anche in acque dolci o terreni.

Materiali e metodiPreparazione dei terreniPer la preparazione dei terreni si sono prele-vati circa 20 kg di terreno contaminato che è sta-to suddiviso in quattro aliquote omogenee trat-tate nel modo seguente: - Terreno C: terreno inquinato che non subiscealcun inoculo batterico, ma che è stato corret-to per il contenuto di nutrienti (secondo il rap-porto ottimale C:N:P: pari a 100:10:5) al fine difavorire il metabolismo dei batteri autoctoni; - Terreno X: terreno inquinato addizionato conbatteri prodotti da Ecobios Italia. Per la preparazione dei terreni con inoculo bat-terico si sono seguite scrupolosamente le buo-ne pratiche di laboratorio al fine di operare neiquantitativi e nelle condizioni ottimali per lacrescita e il metabolismo batterico. Il test è stato condotto secondo due modalità pa-rallele: in bottiglia chiusa per consentire uncontrollo anche del comparto gassoso; in conte-nitori aperti con aggiunta di acqua e forte aera-zione per ottimizzare gli scambi gassosi.

Allestimento test in bottiglia chiusa Si sono utilizzate bottiglie in vetro Duran da500 mL con tappo a vite dotato di setto in sili-cone predisposto per il prelievo e analisi deigas. Sono state allestite 5 serie di 13 bottiglieciascuna nel modo seguente: le serie C e X so-no state preparate introducendo in ognuna ilrelativo terreno (circa 100 g su base secca in cia-scuna delle 13 bottiglie); la Serie S è stata otte-nuta a partire dal terreno C passando, poi, perla sterilizzazione con raggi gamma. Le bottigliesono state chiuse in modo da impedire scambigassosi con l'esterno.Per una buona conduzione della sperimenta-zione ogni volta che veniva consumata la metàdell'ossigeno presente all'interno dei reattori(quando cioè la concentrazione dell'ossigenoscendeva al di sotto dei 100.000 ppm) si è ope-rato il completo ricambio della stessa atmosfe-ra ventilando aria all'interno del reattore, pre-via caratterizzazione completa.

Allestimento test slurrySi sono disposti 4 contenitori in vetro aperti(becker) della capacità di 2 L e contrassegnaticon le sigle C e X. In ciascun becker si sono in-trodotti circa 900 g del relativo terreno con l'ag-

TTaabbeellllaa 11 -- CCaarraatttteerriizzzzaazziioonnee ddeell tteerrrreennoo ccoonnttaammiinnaattoo

unità di misura

pH 6

Umidità % 9,3

Azoto Totale mg/kg (su s.s.) 245

Fosforo Totale mg/kg (come P, su s.s.) 107

Metilterbutiletere mg/kg( su s.s.) <0,05

Composti Aromatici Totali mg/kg (su s.s.) <0,1

Idrocarburi Totali (IR) mg/kg (su s.s.) 6.900

Idrocarburi <C12 mg/kg (su s.s.) 1.620

Idrocarburi >C12 mg/kg (su s.s.) 2.900

2 - Idrocarburi totali nelterreno X (con inoculo),evoluzione nel tempodelle tre frazioni nel testin bottiglia chiusa

3 - Consumo specificodi ossigeno nel test inbottiglia chiusa

72%

tempo, giorni

Consumo C

mg

/Kg

ss

mo

l/Kg

ss

Acqua&Aria|nr.9|200726

giunta di 100 mL di acqua di fonte. L'insufflazio-ne di aria è stata garantita da un piccolo com-pressore da acquario collegato alle relative po-rose. StrumentazionePer le determinazioni riguardanti il compartogassoso si sono utilizzate le seguenti strumenta-zioni: - Gascromatografo Hewlett-Packard 6890 Se-rier con le seguenti colonne: colonna a setacci inArgon per la determinazione di Ossigeno e Azo-to; poraplot in Elio per la determinazione diAnidride Carbonica e acqua; - Spettrometro di massa Agilent 5973 N per la ri-cerca dei VOC; - Manometro a U a mercurio per la misura del-la pressione all'interno dei reattori; - Termocoppia per il rilevamento della tempera-tura; Per le analisi degli idrocarburi nel terreno si so-no applicate le seguenti metodiche:

- Idrocarburi totali: Metodo ISO-TR 11046/94con analisi mediante spettrofotometria IR; - Idrocarburi C>12: Metodo ISO-TR 11046/94con analisi in Gascromatografia; - Idrocarburi C<12: Metodo EPA 8015-c/00 conanalisi in Gascromatografia con detector a fiam-ma (FID).

Risultati e discussioneL'analisi del terreno prelevato dal sito conta-minato è riassunta nella tabella 1, come si puòosservare, i valori riportati evidenziano una con-taminazione da idrocarburi totali intorno ai 7 gper kg di sostanza secca. Prevalgono gli idrocar-buri pesanti mentre non sono stati riscontrati néi composti aromatici, né la frazione volatile.

Test in bottiglia chiusaNella fase solida dei campioni sottoposti a ste-rilizzazione, sia per gli idrocarburi totali cheper le frazioni C<12 che C>12, non si hanno so-stanziali variazioni nel tempo. Gli idrocarburitotali vengono determinati con sistema IR capa-ce di rilevare le molecole di idrocarburo fino aun valore massimo intorno ai 60 atomi di carbo-nio; in gascromatografia vengono invece deter-minati gli idrocarburi con un numero di atomi dicarbonio non superiori ai 40; in particolare ven-gono differenziati quelli con C<12 (detti legge-ri) e quelli con C>12 (detti pesanti). Per meglio comprendere le trasformazioni degliidrocarburi per ciascuna serie di prova si è cal-colata, per differenza, la frazione di idrocarbu-ri pesantissimi, quelli cioè con oltre 40 atomidi C. Le tre frazioni così distinte in base al nu-mero di atomi di carbonio vengono mostratenegli istogrammi bottiglie X e C. Come si può osservare, nei terreni addizionaticon batteri specifici l'attività degradativa si spin-ge fino a intaccare in modo cospicuo le frazio-ni più pesanti.Se si fa riferimento agli idrocarburi totali (fi-gure 1 e 2) si può osservare che le concentrazio-ni nei 4 terreni presentano nel tempo profilipiuttosto simili: durante i primi 50 giorni sonoevidenti delle fluttuazioni che indicano un mo-desto abbattimento. Tra il 50° e il 70° giorno diincubazione la contaminazione da idrocarburo siriduce drasticamente.Più precisamente, al termine dei 90 giorni disperimentazione l'abbattimento degli idrocar-buri totali risulta essere: nel terreno non inocu-

4 - Produzione specificadi anidride carbonicanel test in bottigliachiusa

5 - Evoluzione neltempo del carbonionella bottiglia C (senzainoculo), concentrazionedi idrocarburi totali nelterreno e C trasformatoin CO2

Tempo, giorni

mg di idrocarburopresenti nel terrenomg di C trasformati in C02

produzione CO2

tempo, giorni

mo

l CO

2/K

gss

lato (C) del 69%; nel terreno denominato X del 72%.Nei medesimi grafici, se si prende in considerazionel'andamento degli idrocarburi C<12 e C>12, si puònotare che i profili relativi a ogni gruppo di inquinan-te ripercorrono l'andamento riscontrato per gli idro-carburi totali. In particolare, si osserva che solo alcompimento dei novanta giorni di sperimentazione sievidenziano gli abbattimenti più significati che mostra-no per ciascuna famiglia valori prossimi ai limiti dilegge.Nella fase gassosa del terreno sterile la composizionenon si è modificata in misura sensibile durante tuttala sperimentazione confermando, quindi, assenza di at-tività metabolica. Le bottiglie della serie S sono le uniche a non aver avu-to necessità di aerazione e pertanto non sono mai

6 - Evoluzione nel tempo del carbonio nella bottiglia X (coninoculo), concentrazione di idrocarburi totali nel terreno e Ctrasformato in CO2

7 - Idrocarburi totali nel terreno C (senza inoculo), evoluzione neltempo delle tre frazioni nel test slurry

mg di idrocarburopresenti nel terrenomg di Ctrasformati in C02

mg

/L

state aperte. Sia per quanto riguarda il consu-mo dell'ossigeno (figura 3) che per quanto ri-guarda la produzione di anidride carbonica (fi-gura 4), il campione X non si differenzia in mo-do significativo dal controllo (C): si può anzievidenziare una respirazione leggermente piùveloce nel campione non inoculato. In sintesi perle suddette tre famiglie in 90 giorni il consumodi ossigeno non supera le 0,19 mol/kg s.s. e laproduzione di anidride carbonica si attesta in-torno alle 0,05 mol/kg s.s.Nelle figure 5 e 6 si mostrano gli andamenti neltempo della quantità di idrocarburi presenti nelterreno e del carbonio allontanato sotto formadi CO2. Il rapporto tra gli idrocarburi persi dalterreno e il Carbonio eliminato come CO2 variada terreno a terreno: mediamente si perdono dai8,5 ai 11 mg di idrocarburo.

Test SlurryLa consistenza del terreno, resa fangosa dal-l'aggiunta di acqua ha consentito di ottenereun maggiore coefficiente di scambio gas-liquidocosì che l'ossigeno disciolto è maggiormentedisponibile alla biomassa in tutto il volume diterreno. Nelle figure 7 e 8 vengono mostrati gliandamenti della concentrazione di idrocarburinel tempo.Come si può osservare già dopo 14 giorni disperimentazione la contaminazione è scesa pertutti i terreni analizzati al di sotto dei limiti pre-

Bartha R. 1986. Biotechnology of petroleum pollutants degradation. Microb. Ecol., 12, 155-172.Blundo R., Broglio P., Brozzo R. 1992. Comunicazione preliminare circa la possibilità di demo-lizione enzimatica a carico di molecole a base di anelli aromatici come PCBs, idrocarburi e an-tibiotici (tetracicline e rifamicine). V Convegno Internazionale Ordine Nazionale dei Biologi.Riva del Garda, 22-25 ottobre 1992.Bossert I.D. , Comperau G.C. 1995. Clean up of petroleum hydrocarbon contamination in soil.Microbial transformation and degradation of toxic organic chemicals. Wiley-Liss Ed. NewYork, 77-107.Davini E., Molinari M., Gioielli B., Sasso R., Audino F., Robertiello A. 2002. La naturale attenuatio-ne assistita per la bonifica di suoli contaminati da prodotto petroliferi. Siti Contaminati,1, 8-12.Pinelli D., Fava F., Nocentini M., Pasquali G.1997, Bioremediation of a polycyclic aromatichydrocarbon-cantaminated soil using different aerobic batch bioreactor system. Journal of SoilContamination, 6, 243- 256.Riser R. E.1998. Remediation of petroleum contaminated soil, Lewis, Boca Ratin FL, 28-34.Sander P.,Wittich R.M., Fortnagel P., Wilkes H., Francke W. 1991. Degradation of 1,2,4 tricloro and1,2,4,5 tetraclorobenzene by Pseudomonas strains. Appl.Environm.Microbiol., 57, 1430-1440.ZoBell C.E., Beckwith I.D. 1944. The deterioration of rubber products by microrganisms. J.Am.Water Works Assoc., 36, 439-453.ZoBell E. 1946. Action of microrganism on idrocarbons. Bact.Rev.,10, 1-49.Zucchi M., Angiolini L., Borin S., Brusetti L., Dietrich N., Gigliotti C., Barbieri P., Sorlini C., Daffon-chio D. 2003. Response of bacterial community during bioremediation of an oil-polluted soil.J. App. Microb., 94, 248-257.

Acqua&Aria|nr.9|200728

BIBLIOGRAFIA

Sistema GC/MSD per la rivelazione di tracce in matrici complesse

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Paolo Broglio, Ecologia Applicata, Milano Roberto Blundo, Ecobios Italia, Roma

Autochthonous and allochthonous microrganism activity inhydrocarbons biodegradation of contaminated soils

In this work we have analysed a hydrocarbons contaminated soil of a filling petrol station in the

Northern Italy characterised by a 20 years lasting pollution. Comparative analysis between autochtho-

nous microrganisms and allochthonous microrganisms appropriately selected to degrade hydrocar-

bons are been made. It is possible demonstrate the advantage coming from the addition of micror-

ganisms directly into contaminated sites.

ABSTRACT

8 - Idrocarburi totali nel terreno X (con inoculo), evoluzione neltempo delle tre frazioni nel test slurry

92%

tempo, giorni

mg

/L

visti dalla vigente normativa (D.M. 471/1999). Si os-serva inoltre che gli abbattimenti degli idrocarburitotali sono per il campione non inoculato C dell'ordi-ne del 72%, per il campione X 92%.

ConclusioniIl presente lavoro ha messo in luce che: se i batteri au-toctoni vengono messi in condizioni ottimali per nu-trienti e per disponibilità di ossigeno, si favorisce la lo-ro attitudine a degradare gli idrocarburi. Nel caso in oggetto, l'attività è ancor più efficace poi-ché, trattandosi di un inquinamento molto vecchio, sisfrutta la capacità metabolica di microrganismi che neltempo si sono naturalmente selezionati e, come dimo-strato nelle prove in slurry, si raggiungono i limiti dilegge in tempi brevi. Le prove con aggiunta di blend batterici selezionatihanno fornito interessanti e inedite informazioni. Ri-sulta infatti evidente come nell'ambito delle tecnichedi biorisanamento di un suolo inquinato da idrocarbu-ri, la Bioaugmentation, rappresenta una tecnica ef-ficace sia in termini di rese che di capacità di demo-lizione della catena idrocarburica. Come già osservato negli grafici 1 e 2 si ha una resa diabbattimento degli idrocarburi totali per i campioninon inoculati C del 69%, mentre per la serie inocula-ta X del 72%. La presente sperimentazione ha infatti dimostratoche l'aggiunta di blend batterici selezionati a un ter-reno contaminato garantisce non solo un migliore ab-battimento degli idrocarburi, ma anche una maggioreefficienza qualitativa nel rompere le catene idrocar-buriche a molti atomi di carbonio come già evidenzia-to nelle figure.

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