Riarrangiamento dei geni per le Immunoglobuline e sviluppo...

Riarrangiamento dei geni

per le Immunoglobuline e

sviluppo dei linfociti B

Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2013/2014

• I geni che codificano i recettori per gli antigeni

(BCR e TCR) sono presenti in uno “stato” non

funzionale nella linea germinale

• Diversi eventi di ricombinazione devono avvenire

durante lo sviluppo di ciascun linfocita per rendere

funzionali questi geni

• Ciascun evento richiede l’introduzione di doppie

rotture nel DNA cromosomico


Chromosome localization of Ig loci


• Sia le catene leggere che le catene pesanti sono codificate da famiglie multi-geniche separate

• Nel DNA della linea germinale ciascuna famiglia multi-genica contiene diverse sequenze codificanti, dette segmenti genici, separate da regioni non codificanti

• Durante la maturazione dei linfociti B questi segmenti genici vengono riarrangiati

• Il riarrangiamento crea un esone funzionale corrispondente alla regione variabile


La regione VL è codificata

da più di un segmento genico

• La regione variabile della catena leggera (VL) è codificata da 2 segmenti genici – segmento genico V

• codifica per i primi 95-101 a.a.

– segmento genico J • codifica per pochi a.a. (fino a 13)

Il riarrangiamento dei segmenti V e J crea un esone (VJ)

che codifica per l’intera regione VL


VL

CL

Corrispondenza tra segmenti genici e domini Ig


La regione VH è codificata

da più di un segmento genico

• La regione variabile della catena pesante (VH) è codificata da 3 segmenti genici – segmento genico V

– segmento genico D

– segmento genico J

Il riarrangiamento dei segmenti V, D e J crea un esone (VDJ)

che codifica per l’intera regione VH


VH

Cm1

Cm3

Cm2

Cm4

Corrispondenza tra segmenti genici e domini Ig

Cm1 Cm2 Cm3 Cm4 TM Cyt


Germline organization of Ig light- and

heavy-chain loci in human genome


Riarrangiamento catena k

DNA catena k germ-line

DNA catena k riarrangiato

Trascritto primario catena k

V-J joining

Trascrizione


Trascritto primario catena k

RNA splicing + poliadenilazione

Coda poli-A

Traduzione

mRNA catena k

Polipeptide nascente catena k

Catena k


DNA catena H riarrangiato

Trascritto primario

DNA catena H germ line

Riarrangiamento catena pesante

D-J joining

V-DJ joining

Trascrizione


Catena Hm Catena Hd

splicing alternativo

Trascritto primario catena H

mRNA catena H

Polipeptide nascente catena H

Catena H


Co-espressione di IgM e IgD

• Nelle cellule B naive il trascritto primario della catena pesante contiene sia gli esoni per i domini costanti della catena m che della d – il trascritto primario non contiene esoni per altre catene pesanti (g, e, a)

• Attraverso lo splicing alternativo vengono prodotti sia mRNA per m che per d

• La cellula B naive co-esprime IgM e IgD con la stessa specificità antigenica – stesso esone VDJ per dominio variabile delle catene pesanti m e d

– catena leggera associata identica

• Le altre classi di Ig non sono mai co-espresse


Recombination Signal Sequence, RSS

• Accanto a ciascun segmento genico sono presenti delle sequenze dette recombination signal sequences (RSS)

– 1 RSS è collocata al 3’ di ciascun segmento V

– 1 RSS è collocata al 5’ di ciascun segmento J

– 1 RSS è presente al 5’ e un’altra al 3’ di ciascun segmento D

• Queste sequenze funzionano da segnali per i processi di ricombinazione


Recombination Signal Sequence, RSS

• Ciascuna RSS contiene

– NONAMERO: sequenza conservata non codificante di 9 nucleotidi • sito di legame per RAG1; ancora le proteine RAG al DNA

– EPTAMERO: sequenza conservata non codificante di 7 nucleotidi • aumenta legame di RAG, specifica sito di taglio

– eptamero e nonamero sono separati da uno “spacer” di 12 o 23 paia di basi

• lo spacer varia di sequenza ma la sua lunghezza è conservata e corrisponde a uno (12 bp) o due (23 bp) giri di DNA doppia elica

• la lunghezza dello “spacer” è cruciale per la ricombinazione – permette corretta giustapposizione di nonamero ed eptamero


Sequenze RSS


“Regola 12/23”

Un segmento genico fiancheggiato da una RSS con uno spacer di 12 bp può

ricombinare con un segmento fiancheggiato da uno spacer con 23 bp


Il complesso della ricombinasi V(D)J

• Il complesso di enzimi che opera la ricombinazione somatica V(D)J è detto ricombinasi V(D)J

• Recombinant-Activating Genes: RAG-1 e RAG-2 – i prodotti di questi geni costituiscono la componente della ricombinasi

specifica dei linfociti (B e T) • necessari per la generazione dei recettori per l’antigene

– topi KO per uno dei due geni Rag non sviluppano linfociti B né T

• sono espressi durante lo sviluppo dei linfociti solo quando avviene il riarrangiamento dei geni per il recettore dell’antigene

• La ricombinasi V(D)J include anche enzimi espressi ubiquitariamente e coinvolti nella riparazione del DNA – DNA ligasi IV, DNA-PK (DNA-dependent protein kinase), Ku70/80,

Artemis

• La ricombinazione avviene alle giunzioni tra le sequenze RSS e le sequenze codificanti


Recombinant-Activating Genes:

RAG-1 e RAG-2

• Proteine nucleari, altamente conservate in vertebrati

• Costituiscono la componente della ricombinasi specifica

dei linfociti (B e T)

• Necessari per la generazione dei recettori per l’antigene

• Il core di RAG-1 contiene

– regione per legame a nonamero

– regione centrale che interagisce con eptamero e RAG2

– sito catalitico per taglio DNA


• Il core di RAG-2

– è necessario per il taglio del DNA

– interagisce con RAG1

– aumenta l’affinità di legame con il DNA

• RAG2 contiene una regione che lega la lisina 4

trimetilata dell’istone H3 (H3K4me3)

– guidando il complesso RAG nelle regioni di cromatina attiva

Recombinant-Activating Genes:

RAG-1 e RAG-2


Fasi della ricombinazione 1

• RAG1 e RAG2

riconoscono RSS – (alla formazione del complesso

partecipano anche altre proteine)

• le RSS di un segmento V e

di uno J sono portate in

prossimità


Segmento genico V

Segmento genico J

RSS - 1 giro

RSS - 2 giri



• taglio di un filamento di

DNA da parte di RAG-1 e

RAG-2 alla giunzione

delle RSS con le

sequenze codificanti

– tra eptamero e segmento

genico codificante

Segmento genico V

Segmento genico J

RSS - 1 giro

RSS - 2 giri



• l’estremità tagliata del

segmento genico codificante,

viene unita al filamento

opposto producendo una

“forcina”

• all’estremità della RSS,

viene prodotta una doppia

rottura del DNA

Segmento genico V

Segmento genico J

RSS - 1 giro

RSS - 2 giri

• Vengono reclutate altre proteine – Ku70/Ku80

• La forcina viene tagliata in posizione casuale – RAG/Artemis

– l’estremità viene poi modificata da • esonucleasi

• TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase)

• Riparo e legame delle sequenze codificanti e di quelle segnale – DNA ligasi IV

Ricombinazione 4


Generazione della diversità anticorpale

(GOD, Generation Of Diversity)

• Molteplici segmenti genici – diverse combinazioni V-(D)-J

• Flessibilità nel processo di giunzione – aggiunta e rimozione di nucleotidi

• Combinazione di catene pesanti e leggere

• Ipermutazione somatica – in linfociti B attivati



200 1.2x106 6x103

6x103 0.72x106

1.92x106

120

Possibili combinazioni teoriche

x

x

=

=

+

=

Figure 3-6 Variabilità degli aminoacidi nelle Ig

Regione V catena pesante Regione V catena leggera

Variabili

tà

Variabili

tà

FR, frame region HV, hyper-variable region

HV3 ha una

varibilità maggiore

di HV1 e HV2

HV3 ha una

variabilità maggiore

di HV1 e HV2


La regione del DNA dove avviene la giunzione V(D)J

codifica per la regione ipervariabile 3 (HV3) che

corrisponde al CDR3

HV regions

HV1 HV2 HV3

HV1 HV2 HV3


Flessibilità nel processo di giunzione:

aggiunta e rimozione di nucleotidi

• l’estremità tagliata del segmento genico codificante, viene unita al filamento opposto producendo una “forcina”

• (v. diapo precedenti)

Eptamero della RSS

Eptamero della RSS




(P-addition)

• Il taglio della forcina genera un filamento singolo

• Gli enzimi di riparazione aggiungono nucleotidi complementari a questa sequenza generando una sequenza palindromica – P-nucleotidi

• Variazioni nella posizione del taglio della forcina generano variazioni in questa sequenza


• Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT) aggiunge fino a 15 nucleotidi alle giunzioni D-J e V-DJ.

• I nucleotidi aggiunti generano sequenze randomiche

• La N-addition contribuisce largamente alla variabilità del CDR3 della catena pesante



(N-addition)

• La N addition si verifica quasi

esclusivamente nella catena pesante


Ig TCRab

Diversità totale

(combinazioni

V(D)J e catene

L/H + diversità

giunzioni N/P

addition)

1011 1016

Tuttavia, in un determinato momento ciscun individuo ha un

repertorio di circa 107 cloni B e T


Esclusione allelica

• Ciascuna cellula B esprime i geni riarrangiati

della catena pesante di un solo cromosoma e

i geni riarrangiati della catena leggera di un

solo tipo (k o l) e di un solo cromosoma

– esclusione allelica

• Assicura che una cellula B funzionale

esprima una sola catena pesante e una sola

leggera

una sola specificità antigenica


Esclusione allelica in singole cellule B

I due aplotipi diversi sono espressi

in cellule diverse

Ceppo di aplotipo “a/a” per la catena pesante delle Ig

Ceppo di aplotipo “b/b” per la catena pesante delle Ig

Ibrido F1 di aplotipo “a/b” per la catena pesante delle Ig


Riarrangiamento dei geni per le Immunoglobuline e sviluppo...

Documents

Transcript of Riarrangiamento dei geni per le Immunoglobuline e sviluppo...