Relazione analisi microbiologica alimentare Di succo di mandarino pastorizzato Analisi Coliformi totali e colimetria del succo di mandarino a cura di Ivan Vinci 08/02/2010

Scienze

dell’Enogastronomia

Mediterranea

e

Salute

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CONTEGGIO DEI COLIFORMI

I coliformi sono batteri a forma bastoncellare, appartenenti alla

famiglia delle Enterobatteriaceae, Gram negativi, asporigeni,

aerobi ed anaerobi facoltativi, capaci di crescere in presenza di sali

biliari. Quasi tutti possiedono una β-galattosidasi che li rende

capaci di fermentare il lattosio con produzione di acido lattico, d

aldeidi e di gas in 24-48 ore a temperature comprese tra 37° e

44°C. Sono abitualmente svelabili con le prove dei coliformi i

seguenti generi: Escherichia, Citrobacter, KIebsiella, Enterobacter,

etc.

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COLIFORMI FECALI

La denominazione «Coliformi fecali» fu introdotta

successivamente a quella dei coliformi per evidenzia le specie di

certa provenienza fecale. I costituenti del gruppo (ad esempio

Escherichia coli, Klebsiella), oltre a rispondere alle caratteristiche

comuni tutti i coliformi devono possedere la capacità di

fermentare il lattosio con produzione di acido lattico e di gas dopo

un’incubazione di 24-28 ore a temperature più elevate di 37°C,

aggirandosi, secondo le metodiche, tra i 44 e i 44,5°C. Il saggio

positivo dei coliformi fecali ha valore di indicatore fecale

certamente più significativo di quello dei semplici coliformi, in

quanto è supponibile che la maggiore rappresentanza nel gruppo

sia sostenuta dagli stipiti di Escherichia coli. La presenza di

coliformi fecali, pur non rappresentando una prova di

identificazione, può far presupporre la presenza di altri

microrganismi di derivazione intestinale, tra i quali non si può

escludere la presenza di patogeni, anche se nessuna informazione

si può trarre sul numero e sulla identità di questi. L'importanza

della determinazione dei Coliformi negli alimenti è soprattutto

quella di valutare, oltre la carica iniziale e il livello igienico

dell’alimento, l'efficacia dei trattamenti di bonifica operati e di

mettere in evidenza eventuali ricontaminazioni avvenute dopo i

trattamenti stessi. Molto importante è anche valutare la presenza

di Coliformi ai fini della salubrità delle materie prime dei

semilavorati per i quali non è previsto un trattamento di bonifica

finale. Infine, la presenza di Coliformi in acque telluriche, non

sottoposte ad alcun trattamento, è un elemento negativo nel

giudizio di potabilità. La ricerca dei batteri Coliformi e la

valutazione della loro concentrazione numerica è definita

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colimetria. La colimetria è un test basilare in microbiologia

alimentare e ambientale, che viene condotto quasi su ogni singolo

lotto di alimento, in quanto, come già detto, può fornire una

utilissima informazione circa la igienicità dei campione e delle

manipolazioni da questo subite. Può essere eseguita: 1) con il

metodo del conteggio diretto su terreno solido; 2) con il metodo

M.P.N. in terreno liquido; 3) con il metodo delle membrane

filtranti.

1 Piastra di terreno cromogeno in cui sono cresciute colonie di coliformi (blu e fucsia). Nello specifico le colonie di

colore fucsia sono di Escherichia coli.

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Colimetria per succo di mandarino pastorizzato.

21/01/2010

Metodo MPN (numero più probabile): brodo di coltura Lauryl

Tryptose broth.

Preparo 2+1 bottiglie con 150 ml di brodo; 10+1 tubi con 18 ml di

brodo; 10 tubi con 9 ml di brodo. In ogni contenitore inserisco le

campanelle e provvedo alla sterilizzazione in caldaia alla

temperatura di 120° C per 15 min. Aspetto che la temperatura dei

contenitori raggiunga quella ambientale.

Inoculo per inclusione 50 ml di succo di mandarino in ognuna delle

bottiglie contenenti 150 ml di brodo al 5,12%; 10 ml di succo di

mandarino in ognuno dei tubi contenenti 18 ml di brodo al 4,73%;

1 ml di succo in ognuno dei tubi contenenti 9 ml di brodo al 3,56%.

Provvedo a correggere il pH del campione da 50 ml di succo e del

campione da 10 ml di succo. Non correggo quello da 1 ml di succo

poiché la quantità di succo non interferisce con il pH della

soluzione.

2 pHmetro, strumento con il quale si stabilisce il pH di un campione liquido.

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Il pH iniziale del campione in esame da 50 è di 5,25. Aggiungo 9,7

ml di soda al 4% portando il pH del campione a 7,02.

Il pH iniziale del campione da 10 ml di succo è di 4,72. Aggiungo

1,85 ml di soda al 4% portando il pH al valore di 7,05.

Dopo aver corretto il pH con la soluzione di soda non sterile, gli

stessi volumi di soda sterile sono stati aggiunti alle provette e alle

bottiglie dei due lotti (2 bottiglie da 50 ml di succo e 10 provette

da 10 ml di succo).

Inserisco i campioni in termostato a 37°C per 48 h.

Allo scadere del tempo previsto, controllo se nel terreno vi sia o

meno presenza di intorbidimento e gas nelle campanelle di

Durham. Nello specifico dei lotti analizzati di succo di mandarino

pastorizzato non vi è alcuna presenza di coliformi.

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La prassi, qualora si fosse riscontrato intorbidimento e produzione

di gas, sarebbe stata la seguente:

Schema generale

Si prendono in considerazione solo i tubi o la bottiglia di campione

con presenza di gas e intorbidimento e si effettuano ulteriori

analisi di conferma, cioè:

Subcultura con BGBB (brilliant green bile broth), terreno selettivo

che conferma la presenza di Coliformi fecali quali Yersinia,

Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter;

LTB (Lauryl Tryptose Broth)

2 gg

Positivi

+ TW Kovacs

37°C – 2gg 44°C – 1gg

BGBB BGBB

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Preparato il terreno bile verde brillante, inserite le campanelle di

Durham e sterilizzato, si inocula 1 ml di campione, preso dal tubo

o bottiglia risultata positiva, almeno in due tubi per ogni diluizione

positiva.

Si pongono i tubi in termostato: una a 44°C per 24 ore e una a

37°C per 48 ore.

Si osserva la formazione di torbidità e gas nelle campanelle di

Durham.

Si calcola il numero più probabile grazie alla tabella di Mc Crady e

si riporta il valore ottenuto per 100 ml di campione, ossia

moltiplicando il valore corrispondente nella tabella per l’inverso

del fattore di diluizione (se la diluizione maggiore è 10⁻² il fattore

diluizione sarà 10²)

3 Esempio di subcultura in BGBB (verde brillante): il primo tubo risulta negativo vista la limpidezza del liquido; il

secondo e il terzo tubo risultano positivi vista la torbidità del brodo nel secondo e la presenza di gas nelle campanella di Durham del terzo tubo .

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4 Esempio della tabella di Mc Crady per il calcolo MPN di batteri.

Parallelamente sarà effettuata una seconda sub cultura con brodo

triptonato con aggiunta del reattivo di Kovacs per la verifica di

indolo (selettivo per Escherichia Coli).

Si inocula un tubo contenente brodo triptonato con 1 ml di

campione risultato positivo alla colimetria totale e si incuba a 37°C

da 2 a 5 giorni.

Terminato il tempo stabilito, si aggiunge 0,2 ml di reattivo di

Kovacs su 10 ml si brodo e si osserva il viraggio del colore verso il

rosso. Se tale viraggio (entro 1/3 minuti) non avviene, la presenza

di E. Coli è negativa, altrimenti si conferma la presenza di E. Coli in

un determinato campione.

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5 La presenza di indolo nel primo tubo stabilisce la presenza di E. Coli nel campione in esame.

Analisi presenza lieviti, muffe e batteri totali in 2 lotti di succo di mandarino pastorizzato 21/01/2010.

Preparo due differenti terreni di coltura, MEA (Malt Extract Agar,

terreno per microrganismi acidofili) e PCA (Plate Count Agar,

terreno per microrganismi mesofili). Dopo la sterilizzazione in

caldaia a 120°C per 15 min. e il raffreddamento a 45°C di tutti i

contenitori, provvedo ad acidificare il MEA con acido lattico nello

specifico 2 ml di acido al 10% per 100 ml di terreno.

Preparo le diluizioni dei campioni (lotto A e lotto B) intero e 10⁻¹.

Includo 1 ml di succo in 9 ml di acqua distillata portando la

diluizione del campione a 10⁻¹ (0,1 ml di succo)

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Semino il campione di succo di mandarino nelle piastre Petri alle

quali successivamente aggiungo i terreni: 5 per ogni lotto con il

PCA e 5 per ogni lotto con il MEA. Dopo aver miscelato bene il

contenuto delle piastre e aspettato la solidificazione, inserisco il

tutto in termostato per 5 giorni a 30° C.

Allo scadere del tempo previsto estraggo le piastre dall’incubatore

e dalla prima analisi visiva le piastre risultano negative. Il

procedimento di pastorizzazione ha eliminato completamente le

potenziali cariche batteriche del succo di mandarino.

6 Piastra Petri con colonie di coliformi durante la conta.