REGOLAZIONE ESPRESSIONE GENICA

Con ESPRESSIONE GENICA si intende quellaserie di eventi che dall'attivazione dellatrascrizione di un gene, conducono alla

produzione della proteina corrispondente.La regolazione di questi processi è molto finee la sua complessità aumenta salendo la scala

evolutiva.• Studiare la regolazione dell'espressione di un

gene significa accertare in quali tessuti vieneespresso, in quali condizioni e qual è l'effetto

di tale espressione.

La regolazione dell’espressione genica

• Nei procarioti:

– un’espressione genica selettiva permette alle cellule di risparmiare energia

– La regolazione avviene prevalentemente a livello trascrizionale

• Negli eucarioti:

– l’espressione genica selettiva permette alle cellule di svolgere ruoli specializzati

– La regolazione avviene a vari livelli

Regolazione genica nei procarioti

• Geni costitutivi: sono costantemente attivi (es. geni che codificano per gli

enzimi della glicolisi)

• Geni regolati: la loro espressione è regolata in modo tale che la quantità del

corrispondente prodotto (proteina o RNA) è controllata in relazione al fabbisogno

cellulare (es. sintesi adattativa di enzimi)

I batteri utilizzano strategie diverse per regolare la sintesi degli enzimi

• Vie cataboliche : induzione da substrato

• Vie anaboliche : repressione da prodotto finale

Gli enzimi che catalizzano queste vie sono spesso regolati in modo coordinato: la sintesi di tutti gli enzimi coinvolti in una particolare via viene attivata o repressa

simultaneamente

Vie cataboliche e induzione da substrato

Vie anaboliche : repressione da prodotto finale

La sintesi del triptofano

Caratteristiche comuni ai due processi

1. Il controllo è effettuato a livello genomico

2. Il controllo viene indotto da piccole molecole (effettori) che modificano la

conformazione di molecole che controllano l’espressione genica

Per le vie cataboliche i substrati (lattosio)

Per le vie anaboliche i prodotti finali (triptofano)

I geni coinvolti nel catabolismo del lattosio sono organizzati in un operone inducibile

La delezione del gene lac I origina cellule che producono sempre le tre proteine indipendentemente dalla presenza dell’induttore

Lac I codifica per un repressore

Regolazione dell’operone lac

I repressori e gli attivatori sono molecole proteiche che legano il DNA

Regolazione della sintesi del triptofano: operone reprimibile

Gli operoni lac e trp spiegano il controllo negativo della

trascrizione• Per le vie cataboliche la forma attiva del

repressore (che si lega al DNA) è rappresentata dalla proteina repressore libera

dall’effettore• Per le vie anaboliche la forma attiva è quella della proteina repressore legata all’effettore che

in questo caso può definirsi corepressore

In entrambi i casi il risultato è lo stesso: il repressore attivo previene la trascrizione

dell’operone bloccando il legame della RNA polimerasi al DNA

Controllo positivo della trascrizione

La forma attiva della proteina regolativa “accende” l’espressione dell’operone

Esempio: repressione da catabolitaIl glucosio ha la capacità di inibire la sintesi degli enzimi catabolici prodotti dagli operoni batterici

inducibili

Il glucosio agisce inibendo indirettamente l’adenilato ciclasi l’enzima che catalizza la sintesi

di cAMP da ATP. Quindi più è alta la concentrazione di glucosio

meno cAMP è prodotto.Il cAMP agisce legando la proteina recettore del

cAMP (CRP) che è un attivatore della trascrizione

Il Fenomeno dell’attenuazione permette la regolazione della trascrizione dopo la fase di inizio

Yanofsky: l’operone trp possiede un nuovo sito di regolazione negativa chiamato sequenza leader (o L) che viene trascritta per produrre un segmento di mRNA leader di 162 nucleotidi, localizzato al 5’ dell’mRNA poligenico trp.

La sequenza leader dell’mRNA del triptofano

L’attenuazione nell’operone

trp

Differenze della regolazione genica fra procarioti ed eucarioti

• Dimensione e complessità del genoma

• Compartimentazione del genoma

• Organizzazione strutturale del genoma

• Stabilità dell’mRNA

• Modificazione post-traduzionale delle proteine

• Turnover delle proteine

Come è fatto un gene?

Eucarioti

Come è fatto un gene?

Procarioti

I geni degli eucarioti sono organizzati diversamente da quellidei procarioti:

nel DNA degli eucarioti sono presenti regioni molto estese che non vengono rappresentate negli mRNA maturi

che si trovano nel citoplasma

I geni degli eucarioti sono discontinui, presentano cioè regioni codificanti (esoni) alternate a regioni non codificanti (introni)

Il prodotto intermedio della trascrizione negli eucarioti (trascritto primario)

contiene sia gli esoni che gli introni

Il trascritto primario subisce una serie di modificazioni prima di essere

esportato nel citoplasma, dove verrà tradotto.

Cellula umana contiene circa 30000 geni

RNA genes

Geni per proteine

Ogni cellula in un determinato momento esprime solo una piccola parte di questo potenziale (˜ 5000

geni)

Geni housekeeping Geni tessutospecifici

metabolismobiosintesimembranaistoniribosomali DIFFERENZIAMENTO CELLULARE

A QUESTA ESPRESSIONE SELETTIVA NON CORRISPONDE (IN GENERE) UNA VARIAZIONE DEL CONTENUTO DI DNA

La regolazione genica negli eucarioti

La regolazione dell’espressione genica negli eucarioti, è un meccanismomolto complesso che si avvale della presenza:

• di siti di regolazione presenti sul DNA e

• di numerose molecole che svolgonouna funzione di controllo in termini di attivazione e repressione.

L’integrazione dei vari segnali richiede una enorme flessibilità per far fronte alla complessità degli eucarioti, in particolare quelli

multicellulari.

Le maggiori differenze fra regolazione negli eucarioti e procarioti riguardano:

1) La presenza dei nucleosomi: le loro modificazioni influenzano l’accesso ai geni da parte dei fattori di regolazione;

2) vi sono molti più siti di regolazione (cui corrispondono più proteine regolatorie) anche molto distanti dal sito di inizio della trascrizione

sia a monte che a valle.3) la struttura interrotta dei geni consente un ulteriore livello di

regolazione a livello dello splicing;

REGOLAZIONE ESPRESSIONE GENICANEGLI EUCARIOTI

Stato di condensazione- decondensazione CROMATINA

Trascrizione

Post trascrizione

Traduzione

Post Traduzione

Attività delle proteine

NUCLEO

controllo trascrizionale: legame di fattori trascrizionali tessuto specifici, legame diretto di ormoni, fattori di crescita o elementi intermedi a elementi risponsivi di geni inducibili

controllo post-trascrizionale: splicing alternativo, polyA alternativo, RNA editing tessuto-specifico

controllo del trasporto

mRNA

controllo della stabilitàdegradazionetraduzione

PROTEINA

controllo post-traduzionale

PROTEINA attiva o inattiva

DNA Meccanismi epigenetici: controllo a lungo raggio mediante rimodellamento della struttura della cromatina

Trascritto primario

(precursore)

mRNA

controllo traduzionale

CITOPLASMA

Esistono molteplici livelli di regolazione dell’espressione genica negli eucarioti

Livelli multipli di regolazione

dell’espressione genica degli

eucarioti

La

Il primo livello di regolazione dell’espressione genica riguarda lo stato di condensazione della cromatina

ATTIVAZIONE DELLA CROMATINA:

Puffing cromosomici in ghiandole salivari di Drosophila.

Lo svolgimento localizzato della struttura cromosomica indica trascrizione in quella regione

In cosa consistono, a livello molecolare le modificazioni dello stato di condensazione della cromatina associate

alla attivazione trascrizionale?

La decondensazione locale

della cromatina è unadissociazione

temporanea degli istoni che “scopre” il

DNAe lo rende accessibile

al macchinariodella trascrizione

Meccanismi epigeneticiFattori che vengono trasmessi alla progenie, ma che non

sono direttamente attribuibili alla sequenza del DNA.

•Modificazioni degli istoni

Acetilazioni, fosforilazioni e metilazioni, responsabili di cambiamenti conformazionali della cromatina.

•Metilazione del DNA

Nelle cellule eucariotiche la metilazione è a carico della C. Solo il 3% delle C sono metilate ed in genere è bersaglio

della metilazione la C della doppietta CpG.

I residui amminoacidici all’N-terminale di ciascun istone (20-60 residui) si estendono al di fuori della superficie del nucleosoma.Queste regioni sono particolarmente ricche in lisina (K) che può

essere reversibilmente modificata mediante acetilazione, fosforilazione e metilazione.

Meccanismi epigenetici: Modificazioni degli Istoni

Modificazioni degli istoni H3 e H4

La lisina 9 di H3 può essere sia acetilata che metilata. L’acetilazione è associata alla cromatina trascrizionalmente attiva, ma se la regione cromatinica viene metilata a livello del DNA (CpG), le proteine che si legano al DNA metilato richiamano le deacetilasi istoniche, che rimuovono i gruppi acetile e le metil transferasi istoniche, legate alle CpG binding protein, metilano gli istoni. Il risultato è la condensazione della cromatina.

Dissociazione temporanea degli istoni

Ipermetilazione del promotore

Repressori e attivatori possono dirigere la deacetilazione/acetilazione degli istoni a

livello di specifici geni

Importanza della

struttura modulare

e delle interazioni proteina-proteina

Meccanismi epigenetici: Metilazione del DNA

La metilazione del DNA è un processo post-replicativo. L’estensione delle modificazioni riguardanti la metilazione del DNA è fondamentalmente decisa

durante lo sviluppo. La metilazione del DNA è quindi uno dei meccanismi correlati con il differenziamento cellulare, tramite l’inibizione dell’espressione

genica a livello trascrizionale.

I geni trascrizionalmente attivi hanno promotori ipometilati

La metilazione regola l’espressione

I geni trascrizionalmente attivi hanno promotori ipometilati

Livello di metilazione dei geni del globina durante lo sviluppo

Hb EMBRIONE

Hb FETO

Hb ADULTO

2

Hb A (97%) 2

Hb A2(2%)

1

Hb A3 (fetale) (1%)

Organizzazione dei geni delle globine

Caratteristica Cromatinaattiva

Cromatinainattiva

Conformazionedella cromatina

Estesa, aperta Condensata

Metilazione delDNA

Poco metilataspecialmentenelle regionidel promotore

Metilata

Acetilazionedegli istoni

Is toni acetilati Is toni nonacetilati

CARATTERISTICHE DELLA CROMATINA

REGOLAZIONE ESPRESSIONE GENICANEGLI EUCARIOTI

Stato di condensazione- decondensazione CROMATINA

Trascrizione

Post trascrizione

Traduzione

Post Traduzione

Attività delle proteine

IL SECONDO LIVELLO DI REGOLAZIONE E’ RAPPRESENTATO DALLA REGOLAZIONE DELLA

TRASCRIZIONE

Come viene regolata la trascrizione trascrizione?

Il meccanismo è altamente complesso che si avvale della presenza di :

Sequenze di regolazione sul DNA Attive solo in cis:

Promotori , enhancer, silencer

Proteine di regolazione che si legano a questesequenze operano in trans:

sono molecole diffusibili:Attivatori, repressori

Regioni regolatorie sul DNA

Proteine di regolazione che si legano a queste sequenze

Le regioni regolatorie comprendono:

Il core del promoter

altri elementi anche molto distanti dal sito di inizio:

ehnacers (o silencers) che a attivano o reprimono la trascrizione

Insulators che deliminato le regioni di controllo da parte degli

enhancers (o silencers).

LE REGIONI REGOLATORIE SUL DNA

PROMOTORI:

CONTENGONO DIVERSE REGIONI: TATA box, CAAT box, GC box ed altri elementi cis agenti.

Tali elementi sono reclutati dai fattori di trascrizione

Alcuni set di geni, come quelli del locus della beta-globina o dei geni Hox, devono essere espressi secondo una sequenza ordinata.

Questo è reso possibile da una regione regolatoria denominata locus control region (LCR) o global control region (GCR), che attraverso un meccanismo

ancora sconosciuto, controlla l’espressione sequenziale dei geni.

Le regioni insulator scoperte finora nei vertebrati legano una proteina zinc-finger

denominata CTCF ("CCCTC binding factor”)

PROTEINE DI REGOLAZIONE

Appartengono a famiglie e presentano MOTIVI STRUTTURALI COMUNI molto conservati.

Zinc-finger Leucine zipper helix-turn-helix

Alcune proteine che si legano al DNA

Zinc-finger: struttura (C2H2)

Ci sono zinc-fingers con struttura C4 (4 cisteine) e C6 (6 cisteine)

Zinc-finger: Il recettore dell’estrogeno, ER

Un dimero di ER si inserisce nel solco maggiore del DNA, provocando l’apertura della doppia elica

Leucine-zipper

Due eliche (Jun e Fos), tenute insieme da legami idrofobici fra leucine

Ruolo dei fattori di trascrizione nellaregolazione dell’espressione genica

Il controllo trascrizionale è regolato dall’azione di molte proteine,chiamate FATTORI DI TRASCRIZIONE

FATTORI DI TRASCRIZIONE GENERALI (GTF):

si legano al promotorein associazione con la

RNA polimerasi

FATTORI DI TRASCRIZIONE SPECIFICI: si legano a vari siti regolatori di diversi

geni.

Agiscono come

ATTIVATORI TRASCRIZIONALI

REPRESSORI TRASCRIZIONALI

FATTORI GENERALI DI TRASCRIZIONE

(Sono chiamati generali perchè intervengono nella trascrizione di differenti tipi digeni in una ampia varietà di organismi diversi)

Svolgono un ruolo in tutti gli aspetti della trascrizione:

legame della polimerasi

inizio

allungamento

terminazione

Formazione del complesso di preinizio:

1) Legame di una proteina che riconosce il TATA box (TBP) e

che fa parte di un complesso molto più grande : TFIID

determina una profonda distorsione nella conformazione del DNA

Formazione delcomplesso di inizio

della trascrizione

TFIID è formatoda 10 subunità diverse

TFIIH è il solo GTF con attivitàenzimatica: una subunità funzionacome chinasi per fosforilare l’RNApolimerasi, le altre come enzimi

che srotolano l’RNA (elicasi).Dopo l’inizio della trascrizione

alcuni GTF sono lasciati indietro.Fino a che TFIID è attaccato al

promotore altre polimerasi si possonoattaccare

LA FOSFORILAZIONE DELLA POLIMERASI

Al momento dell’attacco l’enzima non è fosforilato, la sua fosforilazioneavviene a livello del dominio C terminale (CTD) ed è catalizzata

da almenno 4 differenti chinasi fra cui TFIIH

La fosforilazione permette il distcco dell’enzima dal complesso dipre-inizio per muoversi lungo la stampo del DNA

La RNA polimerasi ed i suoi GTF sono in grado di promuovere la trascrizione basale della maggior parte dei promotori in vivo.

Una grossa varietà di FATTORI SPECIFICI DI TRASCRIZIONE è in grado di legarsi a numerosi siti regolatori del DNA, DETERMINANDO:

se un complesso di pre-inizio si assembla al promotore oppure no

la velocità della polimerasi

Mentre il TATA box determina il sito di inizio della trascrizione

il CAAT ed il GC box (definiti anche elementi prossimali del promotore)regolano la frequenza con cui la polimerasi trascrive il gene.

GLI ATTIVATORI sono grossi complessi molecolari che possono

Interagire con l’apparato di base della trascrizione

(GTF e polimarasi)

Agire sulla cromatina

Elementi distali Elementi prossimali

Promotore basale

• Una serie di fattori trascrizionali deve legarsi al promotore prima che possa farlo la RNA polimerasi. Quindi se la RNA polimerasi potrà iniziare la trascrizione dipenderà anche dal

legame di proteine regolatorie, attivatori e repressori.

GLI ATTIVATORI DELLA TRASCRIZIONEAl contrario dei siti di legame al DNA, le regioni di attivazione mancano di

una struttura ben definita, anche per il fatto che devono riconoscere superfici proteiche di natura molto differente.

Al contrario degli attivatori procariotici che interagiscono direttamente con la polmerasi posizionandola sul promotore, gli attivatori eucariotici reclutano indirettamente la polimerasi interagendo con componenti del

complesso trascrizionale come TFIID o il complesso mediatore.

Il complesso Mediatore

Recentemente è stato scoperto nel lievito, grazie alla selezione di mutanti condizionali e in seguito, in Drosophila e nei mammiferi, un complesso multimerico che funge da

intermediario essenziale per l’interazione tra i fattori trascrizionali specifici (a controllo positivo e negativo) e

quelli generici nel controllo dell’inizio della trascrizione da parte della RNA

Diversi fattori trascrizionali specifici devono essere presentiper “accendere” completamente un gene

I vantaggi del Controllo Combinatorio Negli eucarioti i geni non sono organizzati in operoni

Con pochi fattori trascrizionali ( alcune centinaia ) in combinazioni diverse si può controllare espressione di tutti i geni centinaia) l’espressione

Geni che devono essere accesi insieme condividono elementi di regolazione e proteine di regolazione “accesi”

Possibilit di regolazione fine del livello di trascrizione Possibilità Combinatorio: ••••

L’attivazione della trascrizione è risultato dell’ integrazione di molteplici

segnali provenienti da complessi di proteine regolatrici posizionate su

molteplici siti di regolazione

CHI REGOLA I REGOLATORI?

REGOLAZIONE POST-TRASCRIZIONALE