La regolazione dell’espressione genica

Quali sono i meccanismi che determinano l’accensione o lo spegnimento dell’espressione

di un gene?

La regolazione dell’espressione genica

• Nei procarioti: – un’espressione genica selettiva permette alle

cellule di risparmiare energia– La regolazione avviene prevalentemente a

livello trascrizionale

• Negli eucarioti: – l’espressione genica selettiva permette alle

cellule di svolgere ruoli specializzati– La regolazione avviene a vari livelli

Regolazione genica nei procarioti

• Geni costitutivi: sono costantemente attivi (es. geni che codificano per gli enzimi della glicolisi)

• Geni regolati: la loro espressione è regolata in modo tale che che la quantità del corrispondente prodotto (proteina o RNA) è controllata in relazione al fabbisogno cellulare (es. sintesi adattativa di enzimi)

NON TUTTI I GENI VENGONO UTILIZZATI NELLO STESSO MOMENTO E NON TUTTI CON LA STESSA “INTENSITÀ”

Regolazione genica = la modalità con cui viene REGOLATA la tipologia e la quantità dei prodotti genici

Prodotto genico = RNA e/o proteina (in ultima analisi)

Regolazione Genica nei Procarioti

Finalità:Rispondere rapidamente ai cambiamenti ambientali

Logica:Risparmiare energia; niente mRNA o proteine che non

servano subito

Base fisiologica:la maggior parte dei geni è espressa costitutivamentepochi geni sono regolati, ognuno con il suo meccanismo

individuale, di induzione o di repressione

I geni strutturali dei batteri sono organizzati in“cluster” : gruppi di geni codificanti per proteinecon funzioni correlate, (es. enzimi di una stessavia metabolica, proteine deputate al trasportointracellulare ecc), che si trovano sotto il dominiodi un unico promotore.

OPERONE

• Geni strutturali: codificano per le proteine di interesse

• Operatore: Sito sul DNA riconosciuto dalla proteina repressore

• Promotore: Sito sul DNA cui si lega l’RNA polimerasi per iniziare la trascrizione dei geni situati a valle

Unità di trascrizione descritta nel 1961 da François Jacob e Jacques Monod, che per questo furono insigniti del premio Nobel.

L’unità completa include:

Promotore Gene 1 Gene 2 Gene 3Operatore

Sono sequenze di DNA

RepressoreRNA

polimerasi

Sono proteine

La capacità dell’RNA polimerasi di iniziare la trascrizione dipende dall’assenza di impedimenti a livello del promotore; possono essere presenti dei repressori che impediscono l’inizio della trascrizione.

Si parla di regolazione negativa

Promotore Gene 1 Gene 2 Gene 3Operatore

Repressore

Il repressore inattivo non si lega all’operatore. La RNA polimerasi può eseguire la trascrizione.

Proteina 3Proteina 2

Proteina 1

N.B.: il sito operatore non viene trascritto e non codifica per nessuna proteina

Promotore Gene 1 Gene 2 Gene 3Operatore

Il repressore attivo si lega all’operatore. La RNA polimerasi NON può eseguire la trascrizione.

Da dove viene il repressore ?

• La trascrizione dei geni strutturali è spesso controllata dall’attività di un altro gene, detto REGOLATORE

• Il gene regolatore codifica per la proteina repressore, che si lega in maniera specifica all’operatore di un operone

• Il gene regolatore può trovarsi in qualsiasi punto del DNA batterico, non necessariamente adiacente all’operone

Repressore

Promotore Operatore GeniRegolatore

RNA

polimerasi

Facciamo un esempio: Escherichia Coli

Per trasformare l’ALLOLATTOSIO in glucosio da utilizzare come fonte di energia sono necessari tre enzimi, codificati da tre geni appartenenti allo stesso operone (lac)

Per sintetizzare il TRIPTOFANO servono cinque enzimi, codificati da cinque geni appartenenti allo stesso operone (trp)

I batteri utilizzano strategie diverse per regolare la sintesi degli enzimi

• Vie catabolichee induzione da substrato

• Vie anabolichee repressione da prodotto finale

Gli enzimi che catalizzano queste vie sono spesso regolati in modo coordinato: la sintesi di tutti gli enzimi coinvolti in una particolare via viene attivata o repressa simultaneamente

Operone lac:

Si tratta di una VIA CATABOLICA, normalmente inattiva (non espressa), che viene attivata (INDOTTA) dalla presenza della molecola da degradare (il lattosio)Induttore

Repressore inattivo

OPERONE TRP:

Si tratta di una VIA ANABOLICA, normalmente attiva (espressa), che viene inattivata o REPRESSA dalla presenza della molecola (il triptofano) che si forma per effetto delle attività enzimatiche.

Repressore inattivo

Corepressore + repressore

Operone triptofano (trp)Operone lattosio (lac)

Geni inducibili Geni reprimibili

Cosa permette al repressore di attaccarsi o meno al sito operatore ?

DOMANDA CHIAVE

Effettore

E’ una molecola che si lega in maniera specifica al repressore.

Questo legame può rendere attivoo inattivoil repressore.

Si lega all’operatore

Si lega all’operatore Trascrizione impedita

Trascrizione impedita

In base all’effetto che il complesso EFFETTORE-REPRESSORE produce

sulla trascrizione si possono distinguere:

• geni inducibili

• geni reprimibili

Caratteristiche comuni ai due processi

1. Il controllo è effettuato a livello genomico

2. Il controllo viene indotto da piccole molecole (effettori) che modificano la conformazione di molecole che controllano l’espressione genicaPer le vie cataboliche i substrati (lattosio)

Per le vie anaboliche i prodotti finali (triptofano)

I geni coinvolti nel catabolismo del lattosio sono organizzati in un operone inducibile

La delezione del gene lac I origina cellule che producono sempre le tre proteine indipendentemente dalla presenza dell’induttore

Lac I codifica per un repressore

Gli operoni lac e trp spiegano il controllo negativo della trascrizione

• Per le vie cataboliche la forma attiva del repressore (che si lega al DNA) è rappresentata dalla proteina repressore libera dall’effettore

• Per le vie anaboliche la forma attiva è quella della proteina repressore legata all’effettore che in questo caso può definirsi corepressore

In entrambi i casi il risultato è lo stesso: il repressore attivo previene la trascrizione dell’operone bloccando il legame della RNA polimerasi al DNA

Il repressore lac si lega ai due operatori come tetramero

• L’ansa si forma tra le repressore legato all'operatore principale e quello a monte, ausiliario a 90 bp . Un'ansa del tutto simile si può formare in alternativa con un operatore a valle, a 400 bp

Operone del triptofano

• l'operone triptofano di E.colicodifica per il leader e per geni strutturali che codificano gli enzimi trp

La attenuazione• Anche con basso Trp molti tradotti terminano

prematuramente, prima del gene trpE. Solo la sequenza leader viene tradotta. Essa è seguita da un terminatore

• Ci sono 4 sequenze complementari nel mRNA 1, 2, 3 e 4. Esse si possono appaiare diversamente

• L’RNA ha una ORF di 14 amino acidi, con una forte RBS e che codifica per 2 trp.

In condizioni di elevata concentrazione di triptofano la sequenza 3 si appaia con la sequenza 4 costituendo la hairpin di terminazione della traduzione .

In condizioni di bassa concentrazione di triptofano il ribosoma si blocca sugli adiacenti codoni per il triptofano permettendo alla sequenza 2 di appaiarsi con la 3 e quindi impedendo la formazione della forcine di terminazione 3 e 4. Quindi la traduzione può continuare

In assenza di sintesi proteica poiché il ribosoma non inizia la traduzione della AUG del peptide leader si forma una forcina appaiando le sequenze 1 e 2 e quindi non si forma quella data dalle sequenze 2 e 3 ne consegue che si forma una forcina con le sequenza 3 4 e gli enzimi per trp non sono espressi

Differenze della regolazione genica fra procarioti ed eucarioti

• Dimensione e complessità del genoma

• Compartimentazione del genoma

• Organizzazione strutturale del genoma

• Stabilità dell’mRNA

• Modificazione post-traduzionale delle proteine

• Turnover delle proteine

• Le cellule eucariotiche sono prive di operoni!

Livelli multipli di regolazione dell’espressione genica degli eucarioti

•Regolazione trascrizionale

•Regolazione post-trascrizionale

•Meccanismi epigenetici e controllo dell’espressione genica a lunga distanza

I meccanismi di controllo usati per regolarel’espressione dei geni umani devono esseremolto più complessi da quelli utilizzati daglialtri organismi.

Cellula umana contiene circa 30000 geni

RNA genes

Geni per proteine

Ogni cellula in un determinato momento esprime solo una piccola partedi questo potenziale (˜ 5000 geni)

Geni housekeeping Geni tessuto - specificimetabolismobiosintesimembranaistoniribosomali DIFFERENZIAMENTO

CELLULARE

A QUESTA ESPRESSIONE SELETTIVA NON CORRISPONDE (IN GENERE)UNA VARIAZIONE DEL CONTENUTO DI DNA

NUCLEO

controllo trascrizionale: legame di fattori trascrizionali tessuto specifici, legame diretto di ormoni, fattori di crescita o elementi intermedi a elementi risponsivi di geni inducibili

controllo post-trascrizionale: splicing alternativo, polyA alternativo, RNA editing tessuto-specifico

controllo del trasporto

mRNA

controllo della stabilità

degradazionetraduzione

PROTEINA

controllo post-traduzionale

PROTEINA attiva o inattiva

DNA Meccanismi epigenetici: controllo a lungo raggio mediante rimodellamento della struttura della cromatina

Trascritto primario(precursore)

mRNA

controllo traduzionale

CITOPLASMA

Esistono molteplici livelli di regolazione dell’espressione genica negli eucarioti

•EUCROMATINA -> TRASCRIZIONE POTENZIALE

a) geni housekeeping

b) geni tessuto-specifici

•ETEROCROMATINA FACOLTATIVA -> inattiva quando condensata.

Fornisce un meccanismo di compensazione:

rapporto geni autosomici/geni X-linked

maschi = 2/1 donne = 1/1

•ETEROCROMATINA COSTITUTIVA ->

sempre inattiva; Localizzata nelle regioni

peri - e centromeriche

CROMATINA

Meccanismi epigenetici

Fattori che vengono trasmessi alla progenie, ma che nonsono direttamente attribuibili alla sequenza del DNA.

•Metilazione del DNA;

Nelle cellule eucariotiche la metilazione è a carico della C.Solo il 3% delle C sono metilate ed in genere è bersagliodella metilazione la C della doppietta CpG.

•Modificazioni degli istoni;

Acetilazioni, fosforilazioni e metilazioni, responsabili dicambiamenti conformazionali della cromatina.

Modificazioni epigenetiche:

• Modificazioni ereditabili che non alterano la sequenza nucleotidica dei geni ma ne alterano l’attivita’:

– Acetilazione degli istoni della cromatina

– Metilazione del DNA

Meccanismi epigenetici: Metilazione del DNA

La metilazione del DNA è un processo post-replicativo. L’estensione delle modificazioniriguardanti la metilazione del DNA è fondamentalmente decisa durante lo sviluppo. Lametilazione del DNA è quindi uno dei meccanismi correlati con il differenziamento cellulare,tramite l’inibizione dell’espressione genica a livello trascrizionale.

Metilazione del DNA

Human Molecular Genetics 2

Le principali funzioni della metilazione sono collegate alla repressione della trascrizione:

• Difesa contro i trasposoni: la metilazione e’ fondamentale per mantenere silenti i genomi dei trasposoni e dei retrotrasposoni

• Regolazione genica:la metilazione contribuisce a stabilire e mantenere uno stato trascrizionalmente inattivo (eterocromatina)

Metilazione e regolazione genica:• Dnmt metilano il DNA• Il DNA metilato è legato da proteine che legano il

metile(MeCP2, MBD1-4)

• Queste a loro volta sono in grado di reclutare diversi HDAC -> repressione della trascrizione

Modificazioni degli istoni H3 e H4

La lisina 9 di H3 può essere sia acetilata che metilata. L’acetilazione è associata alla cromatina trascrizionalmente attiva, ma se la regione cromatinica viene metilata a livello del DNA (CpG), le proteine che si legano al DNA metilato richiamano le deacetilasi istoniche, che rimuovono i gruppi acetile e le metil transferasi istoniche, legate alle CpG binding protein, metilano gli istoni. Il risultato è la condensazione della cromatina.

Caratteristica Cromatina

attiva

Cromatina

inattiva

Conformazione

della cromatina

Estesa, aperta Condensata

Metilazione del

DNA

Poco metilata

specialmente

nelle regioni

del promotore

Metilata

Acetilazione

degli istoni

Istoni acetilati Istoni non

acetilati

CARATTERISTICHE DELLA CROMATINA

Repressori e attivatori possono dirigere la deacetilazione/acetilazione degli istoni a

livello di specifici geni

Importanza della struttura modularee delle interazioni proteina-proteina

Elementi distali Elementi prossimali

Promotore basale

• Una serie di fattori trascrizionali deve legarsi al promotore prima che possa farlo la RNA polimerasi. Quindi se la RNA polimerasi potràiniziare la trascrizione dipenderà anche dal legamedi proteine regolatorie, attivatori e repressori.

Il controllo dell’espressione genica è intrinsecamente rumoroso

Coda di poliAnegli oociti

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Micro RNA (miRNA)

• Piccole molecole di RNA (20-22 nt)

• Prodotte da precursori di 90-100 nt trascritti autonomamente (anche policistronici) o maturati da introni

• Si legano a mRNA che hanno sequenze complementari

• Presenti in tutti gli eucarioti

miRNA

• miRNA lin4 e let7 sono stati scoperti inizialmente nei nematodi

• sono conservati dai vermi fino all’uomo

• la loro funzione è il controllo della TRADUZIONE di specifici mRNA

• funzionano come MODULATORI

Conservazione dei miRNA

Biogenesi dei microRNA

I microRNA sono

molecole, dalla

lunghezza di 21-25

nucleotidi, che regolano

l’espressione dei geni a

livello post-

trascrizionale

Biogenesi dei miRNA nelle piante e negli animali

Funzione dei miRNA

• Controllo della proliferazione cellulare

• Controllo della apoptosi

• Differenziamento ematopoietico

• Controllo dello sviluppo in piante ed animali

• Controllo della identità cellulare delle cellule staminali

I geni per i microRNAsono molto abbondanti

• più di 100 in Arabidopsis

• tra 700 e 1000 nell’uomo

Meccanismi del funzionamento di miRNA in piante

• MicroRNA portano al taglio e degradazione di mRNA

• La gran parte dei bersagli dei miRNAnelle piante codifica per proteine regolatrici suggerendo che i miRNAhanno una funzione gerarchicamente molto elevata

• miRNA coinvolti nello sviluppo e nell’identità delle cellule staminali

Mantenimento dell’identità cellulare (es. pluripotenza) �L’identità cellulare viene mantenuta silenziando mRNAs che non appartengono allo specifico repertorio della cellula

Network di miRNA che controllano specifici pathway (miR-21 regola miRNA che controllano apoptosi: disregolazione di miR-21� cancro. miRNA che controllano la via di segnale dell’insulina, diverse tipologie cellulari hanno maggiore o minore necessità di glucosio quindi il funzionamento di questo network di miRNA è regolato a seconda della tipologia cellulare)

FUNZIONI FISIOLOGICHE DEI miRNA

Tumori: pattern specifico di espressione dei miRNA che permettono didiscriminare i diversi tipi di cancro e di identificare il tessuto di originedelle metastasi

miRNA e cancro

Network trascrittoma-microRNA nel cancro

miRNA e cancro

miRNA oncogeni: miRNA overespressi nei tumori (es. miR-155 èupregolato in tumori maligni del sistema ematopoietico, della mammella,del polmone e del pancreas, miR-380-5p reprime p53 nelneuroblastoma, antagonizzandolo con un oligonucleotide antagonistamigliora la prognosi) � blocco dei miRNA con oligonucleotidi antisenso

miRNA oncosoppressori: miRNA ridotti o mancanti nei tumori. La lorooverespressione limita la proliferazione o induce apoptosi (es. miR-15a-16-1, downregolato in cellule B di pazienti con leucemia linfociticacronica, adenomi della prostata e dell’ipofisi) � miRNA mimics ovettori virali

Strategie per terapie anti-cancro basate su miRNA:

1. Bloccare miRNA oncogeni usando oligonucleotidi antisenso

2. Costrutti Locked nucleic acid (LNA)

3. miRNA sponges

4. miR-mask

5. Small molecule inhibitors

6. Ripristinare l’espressione di miRNA oncosoppressori

7. Riprogrammare le cellule cancerogene

Benefits of the LNA technologySome of the benefits of using LNA include:Ideal for the detection of short RNA and DNA targetsIncreases the thermal stability of duplexesCapable of single nucleotide discriminationResistant to exo- and endonucleases resulting in high stability in vivo and in vitro applicationsIncreased target specificityFacilitates Tm normalizationStrand invasion properties enables detection of “hard to access” samplesCompatible with standard enzymatic processes

Limiti e vantaggi della terapia con miRNA

FUNZIONI DELL'RNA NELLA CELLULA MODERNA

→ → → → traduzione rRNA, mRNA, tRNA

→ → → → maturazione rRNA snoRNA,

→ → → → splicing snRNA, introni gruppi I e II

→ → → → maturazione tRNA RNasi P

→ → → → sintesi DNA primers, telomerasi

→ → → → traslocaz. proteine srpRNA

RNA Interference: il processo attraverso il quale un RNA a doppio filamento interferisce con l’espressione genica:sia inducendo la degradazione di RNA complementare che bloccandone la traduzione

http://www.nature.com/focus/rnai/animations/index.html

Silenziamento Post-trascrizionale (1990)Jorgensen 1990:

Introduzione di transgeni responsabili della pigmentazione della petunia per ottenere petunie più scure

�pigmentazione ridotta del 40% nelle petunie transgeniche

�ridotta espressione sia del gene endogeno che del transgene (cosoppressione)

A variegated petunia. Upon injection of the gene responsible for purple colouring in petunias, the flowers became variegated or white rather than deeper purple as was expected.

1993: Viene identificato il primo miRNA nel C. elegans

1998: Fire e Mello descrivono la presenza di RNA interference nel C. elegans

1999: il silenziamento genico nelle piante è accompagnato dall’accumulo di piccoli frammenti di RNA (20-25 Nt) complementari al gene silenziato. dsRNAs vengono ridotti a piccoli frammenti di 21-23 Nt

2001: Tuschl et al. dimostrano nella Drosophila che una piccola sequenza di RNA può interferire in modo specifico con la trascrizione

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006

"for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA"

Andrew Z. Fire Craig C. MelloStanford University University

of Massachusetts b. 1959 b. 1960

Small RNAs

miRNA siRNA

Prodotti in modo endogeno

Funzione: regolazione dell’espressione genica

sopprimendo la traduzione o la trascrizione di geni target

Exo-siRNA:Introdotti in modo esogeno (virus a dsRNA,

transposoni, transgeni)

Endo-siRNA: derivati da loci genomici endogeni

Funzione principale: rispondere alle minacce esterne sopprimendo la

trascrizione genica dell’”invasore”

Interferenza basata su RNA (RNA interference)

Attori:

Micro RNA (miRNA) precursori a forcina

Small interfering RNA (Si) (2 nt 3’ protrundenti)

Ribonucleasi DICER

RISC (RNA driven interference silencing complex) che comprende: Argonaute, la proteina che srotola il doppio filamento e la ribonucleasi che taglia la sequenza senso a 10-11 nt dal terminale 5’.

Il complesso RISC attivato riconosce sequenze complementari di RNA, le lega e degrada: questo puo’ avvenire diverse volte in quanto l’RNA antisenso, protetto dal complesso proteico è stabile e in cellule che si dividono lentamente puo’ agire per 3-7 giorni.

Risc unwinds dsRNA,the ribonuclease in the Ribonuclease complex hydrolizesnew targets

siRNA sinteticoa doppio filamento

shRNA plasmidico

RNA lungo a doppio filamento

miRNA endogeno

20-25 NT

funzionemiRNA

Formazione del complesso RISC (RNA induced silencing complex)

Complesso RISC attivato

Blocco traduzione

funzionesiRNA

Formazione doppia elica con RNA complementare e attacco di endonucleasi

Amplificazione RNA-dip RNA polimerasi

si RNA – caratteristiche

RNA a doppia elica di 21-23 ntPresenza di terminale 3’ più lungo di 2ntPresenza di gruppi OH in 3’Presenza 5’ fosfatoAlta stabilità nella porzione 5’ senso(ricco in GC)Bassa stabilità nella porzione 5’ antisenso(ricco UA)Bassa stabilità nella zona centrale dove deve avvenire l’attacco della endonucleasi2’ desossitimidina per proteggere siRNA da attività esonucleasiche

Non deve essere complementare a zone intronicheComplementare a una porzione di RNA a non più di 75 basi da codone di inizio trad.

si RNA – caratteristiche

In rosso: siRNA marcatoIn blu: nucleiIn verde la proteina GAPDH

CELLULE HeLa

si RNA non specifico si RNA contro GAPDH

Trattamento: 48h

siRNA come agenti terapeutici

LA SOMMINISTRAZIONE

siRNA come agenti terapeutici

LA SOMMINISTRAZIONE

1. Applicazione topica: instillazione di gocce, aerosol, iniezione intratumorale

2. Somministrazione sistemica: a. iv (molecole di circa 5nm riescono a passare le

membrane, fino a 200 nm passano solo capillari fenestrati : uso di nanocarrier)

b. RNA di sintesi modificati per migliorarne la farmacocinetica

c. Utilizzo di vettori virali e non per esprimere l’RNAdella cellula bersaglio

siRNA come agenti terapeutici

LA SOMMINISTRAZIONE

Modificazione delle molecole di siRNA per una distribuzione più efficiente

modificazioni per evitare le difeseimmunitarie (modificazione con 2’-o-metile nel filamento antisenso)

Metodi di somministrazione:

FISICI

Iniezione idrodinamica: efficace in epatociti ma invasiva

Elettroporazione: campo elettrico che facilita la transfezione di acidi nucleici, utilizzata in vivo nel muscolo, retina, giunture artritiche e tumori

DI CONIUGAZIONE

siRNA IN STUDI CLINICI

Potenziali effetti collaterali della terapia con siRNA:

1. Attivazione del sistema immunitario

2. Effetti off-target

3. Saturazione di vie di silenziamento endogene (miRNA)

Similarità e differenze con oligonucleotidi antisenso

Similarità: - lunghezza- metodologia di delivery comune- induzione di silenziamento genico a livello

post-trascrizionale- digestione di RNAm bersaglio da parte di

endonucleasi- possibilità di stabilizzazione con basi

modificate- similarità nella biodistribuzione

Differenze: - doppio filamento verso singolo filamento- maggiore stabilità della molecola naturale- maggiore efficacia in cellule in coltura- meccanismo di azione mediato da RISC