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RISULTATI E CONCLUSIONI Il ciclo di allevamento in vitro della C. sativa, prevede un rinnovo degli espianti ogni 20-25 giorni, determinando pertanto un notevole dispiego di tempo e materiale. L’esigenza di mantenere in vitro numerose accessioni di canapa farmaceutica ha pertanto spinto verso la ricerca di soluzioni alternative al continuo rinnovo delle colture. I primi risultati ottenuti dalla sperimentazione in atto, hanno fornito spunti interessanti: tutti gli espianti mantenuti a temperatura di 5 ± 1 °C al buio e le tesi a 15°C (sia al buio che con alternanza di luce) con l’aggiunta di saccarosio, hanno arrestato/limitato la crescita e si sono mantenuti vitali nei 4 mesi di conservazione (fig. 2): riportati alle condizioni standard hanno ripreso la normale crescita vegetativa. Gli espianti mantenuti a 25°C (con alternanza di luce/buio) addizionati con mannitolo, hanno presentato un progressivo imbrunimento a partire dai tessuti esterni fino ad arrivare alla morte del germoglio (fig. 3); il fenomeno è stato più contenuto nelle tesi con saccarosio dove il 50% dei germogli è rimasto vitale e ha ripreso l’attività di crescita una volta trasferito su MSc (fig. 4). Utilizzo di tecniche di micropropagazione nel processo di produzione di cloni di Cannabis sativa ad uso farmaceutico. Graziella Paglia 1 , Ilaria Alberti 1 , Gianpaolo Grassi 1 1 CREA-CI, Consiglio per la ricerca in agricoltura e l’analisi dell’economia agraria, Centro di ricerca per la cerealicoltura e colture industriali, Azienda sperimentale di Rovigo, Via G. Amendola, 82, 45100 Rovigo. e-mail: [email protected] INTRODUZIONE Per lunghi anni, la coltivazione della Cannabis sativa L. è stata abbandonata, portando ad un depauperamento della ricchezza varietale: tuttavia in questi ultimi 20 anni, la C. sativa è stata oggetto di nuove ricerche, sia nel settore delle produzione da fibra che nel settore medico dove, grazie alla scoperta del sistema endocannabinoide, sono stati formulati preparati per la cura di malattie gravi o altamente invalidanti. Ciclo della pianta di Cannabis sativa uso farmaceutico Fotoperiodo Riproduttivo Taleaggio Trapianto Giorno 74 Raccolto 0 -19 12h luce 12h buio 18h luce 6h buio 18 Cambio fotoperiodo Asc. H 2 O 60 69 Fioritura 42 d Fotoperiodo Vegetativo La coltivazione di piante di Cannabis sativa L. ad uso terapeutico, prevede un ciclo di produzione che ha inizio presso la sede del CREA-CI di Rovigo, con la preparazione di talee allevate in ambiente protetto, ottenute da piante madri coltivate indoor. Successivamente le talee vengono trasferite presso lo Stabilimento Chimico Militare di Firenze dove si completa il ciclo di produzione. Nell’ambito di questo ciclo di produzione le tecniche di micropropagazione vengono ampiamente utilizzate presso la sede CREA-CI di Rovigo, al fine di migliorare il germoplasma selezionato per usi terapeutici, per mantenere elevato il livello di sanità del materiale vegetale selezionato e garantire la sua conservazione in sicurezza. Per salvaguardare nel tempo le innumerevoli varietà conservate presso la sede, è stata avviata la sperimentazione per valutare la capacità del germoplasma di C. sativa a resistere a lunghi periodi di conservazione in vitro : a tale scopo diversi protocolli di in vitro storage in “slow growth conditions” sono attualmente in fase di valutazione. MATERIALI E METODI Germogli apicali della varietà CINRO, che da nostre osservazioni presenta una buona adattabilità alla coltura in vitro , sono stati espiantati da piante madri allevate in serra e posti su mezzo di coltura Murashige & Skoog con complesso vitaminico Gamborg, addizionato con 30 gr/L di saccarosio e 8 gr/L di agar a pH 5,7 (MS crescita = MSc): Sono state eseguite n. 3 subcolture al fine di ottenere un quantitativo di espianti idoneo alla sperimentazione. L’interazione di diversi fattori di crescita (temperatura e luce), con differenti gradienti osmotici, ottenuti addizionando al substrato di crescita, mannitolo e saccarosio come da tab. 1, sono stati testati per individuare la combinazione più idonea alla lunga conservazione della canapa in vitro, secondo le schema di fig. 1. TESI BUIO LUCE/BUIO (18h/6h) GERMOGLI (N.) 5±1°C 15°C 15°C 25°C MSc+Mannitolo 1% 12 12 12 12 48 MSc+Mannitolo 2% 12 12 12 12 48 MSc+Saccarosio 30 g/L 12 12 12 12 48 MSc+Saccarosio 20 g/L 12 12 12 12 48 MSc 12 12 12 12 48 240 Tab. 1 – protocollo di lavoro e n. di germogli per le diverse condizioni di conservazione 0 mesi 4 mesi 8 mesi 12 mesi Controllo vitalità 6 germogli Subcultura MS crescita Fig. 1 schema operativo per ogni tesi Espianto in substrati di conservazione 2 mesi 4 mesi 12 germogli 6 germogli 3 germogli Controllo vitalità Subcultura MS crescita 3 germogli Espianto in substrati di conservazione Questi primi dati raccolti mettono in evidenza che, nonostante la C. sativa abbia esigenze termiche elevate, la varietà CINRO sembra adattarsi alla conservazione in vitro anche a basse temperature: se questo aspetto si estendesse anche a tutte le altre varietà, risulterebbe determinante per razionalizzare e limitare i costi di mantenimento delle numerose linee e varietà conservate presso il CREA-CI di Rovigo. La sperimentazione in atto prevede di verificare lo stato del materiale vegetale al termine dei 12 mesi e di ottimizzare le combinazioni di: substrati e temperature per le varietà di interesse. Fig. 2 – germogli mantenuti a temperatura di 5 ± 1 °C al buio Fig. 3 – progressivi imbrunimenti dei germogli mantenuti a 25°C (con alternanza di luce/buio) addizionati con mannitolo Fig. 4 - ripresa dell’attività di crescita dei germogli una volta trasferiti su MSc
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RISULTATI E CONCLUSIONI
Il ciclo di allevamento in vitro della C. sativa, prevede un rinnovo degli espianti ogni 20-25 giorni, determinando pertanto un notevole dispiego di tempo e materiale. L’esigenza di mantenere in vitro numerose accessioni di canapa farmaceutica ha pertanto spinto verso la ricerca di soluzioni alternative al continuo rinnovo delle colture. I primi risultati ottenuti dalla sperimentazione in atto, hanno fornito spunti interessanti: tutti gli espianti mantenuti a temperatura di 5 ± 1 °C al buio e le tesi a 15°C (sia al buio che con alternanza di luce) con l’aggiunta di saccarosio, hanno arrestato/limitato la crescita e si sono mantenuti vitali nei 4 mesi di conservazione (fig. 2): riportati alle condizioni standard hanno ripreso la normale crescita vegetativa. Gli espianti mantenuti a 25°C (con alternanza di luce/buio) addizionati con mannitolo, hanno presentato un progressivo imbrunimento a partire dai tessuti esterni fino ad arrivare alla morte del germoglio (fig. 3); il fenomeno è stato più contenuto nelle tesi con saccarosio dove il 50% dei germogli è rimasto vitale e ha ripreso l’attività di crescita una volta trasferito su MSc (fig. 4).
Utilizzo di tecniche di micropropagazione nel processo di produzione di cloni di Cannabis sativa ad uso farmaceutico.
Graziella Paglia1, Ilaria Alberti1, Gianpaolo Grassi1
1 CREA-CI, Consiglio per la ricerca in agricoltura e l’analisi dell’economia agraria, Centro di ricerca per la cerealicoltura e colture industriali, Azienda sperimentale di Rovigo, Via G. Amendola, 82, 45100 Rovigo. e-mail: [email protected]
INTRODUZIONE
Per lunghi anni, la coltivazione della Cannabis sativa L. è stata abbandonata, portando ad un depauperamento della ricchezza varietale: tuttavia in questi ultimi 20 anni, la C. sativa è stata oggetto di nuove ricerche, sia nel settore delle produzione da fibra che nel settore medico dove, grazie alla scoperta del sistema endocannabinoide, sono stati formulati preparati per la cura di malattie gravi o altamente invalidanti.
Ciclo della pianta di Cannabis sativa uso farmaceutico
Fotoperiodo Riproduttivo
Taleaggio Trapianto
Giorno 74
Raccolto
0 -19
12h luce 12h buio
18h luce 6h buio
18
Cambio fotoperiodo Asc. H2O
60 69
Fioritura
42 d
Fotoperiodo Vegetativo
La coltivazione di piante di Cannabis sativa L. ad uso terapeutico, prevede un ciclo di produzione che ha inizio presso la sede del CREA-CI di Rovigo, con la preparazione di talee allevate in ambiente protetto, ottenute da piante madri coltivate indoor. Successivamente le talee vengono trasferite presso lo Stabilimento Chimico Militare di Firenze dove si completa il ciclo di produzione.
Nell’ambito di questo ciclo di produzione le tecniche di micropropagazione vengono ampiamente utilizzate presso la sede CREA-CI di Rovigo, al fine di migliorare il germoplasma selezionato per usi terapeutici, per mantenere elevato il livello di sanità del materiale vegetale selezionato e garantire la sua conservazione in sicurezza. Per salvaguardare nel tempo le innumerevoli varietà conservate presso la sede, è stata avviata la sperimentazione per valutare la capacità del germoplasma di C. sativa a resistere a lunghi periodi di conservazione in vitro: a tale scopo diversi protocolli di in vitro storage in “slow growth conditions” sono attualmente in fase di valutazione.
MATERIALI E METODI
Germogli apicali della varietà CINRO, che da nostre osservazioni presenta una buona adattabilità alla coltura in vitro, sono stati espiantati da piante madri allevate in serra e posti su mezzo di coltura Murashige & Skoog con complesso vitaminico Gamborg, addizionato con 30 gr/L di saccarosio e 8 gr/L di agar a pH 5,7 (MS crescita = MSc): Sono state eseguite n. 3 subcolture al fine di ottenere un quantitativo di espianti idoneo alla sperimentazione. L’interazione di diversi fattori di crescita (temperatura e luce), con differenti gradienti osmotici, ottenuti addizionando al substrato di crescita, mannitolo e saccarosio come da tab. 1, sono stati testati per individuare la combinazione più idonea alla lunga conservazione della canapa in vitro, secondo le schema di fig. 1.
TESI BUIO LUCE/BUIO (18h/6h)
GERMOGLI (N.)
5±1°C 15°C 15°C 25°C
MSc+Mannitolo 1% 12 12 12 12 48
MSc+Mannitolo 2% 12 12 12 12 48
MSc+Saccarosio 30 g/L 12 12 12 12 48
MSc+Saccarosio 20 g/L 12 12 12 12 48
MSc 12 12 12 12 48
240 Tab. 1 – protocollo di lavoro e n. di germogli per le diverse condizioni di conservazione
0 mesi 4 mesi 8 mesi 12 mesi
Controllo vitalità
6 germogli Subcultura MS crescita
Fig. 1 schema operativo per ogni tesi
Espianto in substrati di
conservazione
2 mesi 4 mesi
12 germogli 6 germogli 3 germogli
Controllo vitalità Subcultura MS crescita
3 germogli Espianto in substrati di
conservazione
Questi primi dati raccolti mettono in evidenza che, nonostante la C. sativa abbia esigenze termiche elevate, la varietà CINRO sembra adattarsi alla conservazione in vitro anche a basse temperature: se questo aspetto si estendesse anche a tutte le altre varietà, risulterebbe determinante per razionalizzare e limitare i costi di mantenimento delle numerose linee e varietà conservate presso il CREA-CI di Rovigo.
La sperimentazione in atto prevede di verificare lo stato del materiale vegetale al termine dei 12 mesi e di ottimizzare le combinazioni di: substrati e temperature per le varietà di interesse.
Fig. 2 – germogli mantenuti a temperatura di 5 ± 1 °C al buio
Fig. 3 – progressivi imbrunimenti dei germogli mantenuti a 25°C (con alternanza di luce/buio) addizionati con mannitolo
Fig. 4 - ripresa dell’attività di crescita dei germogli una volta trasferiti su MSc
