Presentazione Giuliano Gasperi
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Transcript of Presentazione Giuliano Gasperi
Il controllo di insetti parassiti nella vite
Anna Rodolfa Malacrida - Giuliano Gasperi
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie “L. Spallanzani”
Università di Pavia
FORMARE E INFORMARE PER AUMENTARE IL LIVELLO DI COMPETITIVITA’ DEL TERRITORIO LOMBARDO
22 ottobre 2013 RICCAGIOIA S.C.p.A. – TORRAZZA COSTE (PV)
Funghi
Peronospora della vite
Oidio o mal bianco della vite
Muffa grigia
Mal dell’esca
Escoriosi
Marciume nero o black-rot
Marciume radicale fibroso
Marciume radicale lanoso
Marciume acido
Malattie della vite
Batteri
Tumore batterico
(Agrobacterium tumifacines)
Virus
Malformazioni infettive
(arricciamento, mosaico
giallo, etc.)
Accartocciamento
Legno riccio
Fitoplasmi
Flavescenza dorata
Rickettsie
Malattia di Pierce
Nematodi
Nematodi galligeni
Acari
Ragno rosso della vite
Ragnetto giallo
Acariosi della vite
Erinosi
Vite
Insetti
Fillossera della vite
(Daktulosphaira vitifogliae)
Cicaline
Scaphoideus titanus
(flavescenza dorata)
Hyalesthes obsoletus
(cicalina del Legno nero)
Empoasca vitis
(cicalina verde della vite)
Eupoecilia ambiguella
(tignola della vite)
Lobesia botrana
(tignoletta dell’uva o della vite)
Drosophila melanogaster
(marciume acido per acetobatteri)
Drosophila suzukii
(rischio presunto)
fillossera della vite (Daktulosphaira vitifoliae, Rhynchota, Homoptera)
cicalina della Flavescenza dorata (FD) (Scaphoideus titanus, Rhynchota, Homoptera)
cicalina del Legno nero (Hyalesthes obsoletus, Rhynchota, Homoptera)
cicalina verde della vite (Empoasca vitis, Rhynchota, Homoptera)
tignola della vite (Eupoecilia ambiguella, Lepidoptera, Hetroneura)
tignoletta dell’uva o della vite (Lobesia botrana, Lepidoptera, Hetroneura)
Drosophila melanogaster, Diptera (marciume acido da acetobatteri)
Drosophila suzukii, Diptera (rischio presunto)
Alcune specie di insetti dannosi per la vite
fillossera della vite (Daktulosphaira vitifoliae)
Su vite Europea
Il danno, determinato dalle sue punture, si riscontra:
sulle radici (formazione di galle nodose) e perdita di capacità assorbente
sulle foglie (galle tondeggianti e rugose) con danno apparentemente trascurabile
Su vite Americana
il danno radicale è limitato perché le radici sono poco sensibili e reattive alle punture
le foglie sono molto reattive e producono un grande numero di galle
All'interno delle galle si completa lo sviluppo degli stadi giovanili e la specie sverna
(in Europa) allo stadio di uovo, a livello radicale
Specie di origine Americana,
arrivata in Europa alla metà
del secolo IX, diffondendosi
rapidamente.
larva 5a età larve 2a-3a età
Scaphoideus titanus
uova adulti in accoppiamento
Specie di origine Americana, monovoltina, svernante come uova nei tralci;
è il vettore del fitoplasma che causa Flavescenza dorata (FD)
Nell’infezione dell’insetto, i fitoplasmi attraversano la parete dell’intestino medio, si moltiplicano
nell’emolinfa, entrano nelle ghiandole salivari e si moltiplicano ulteriormente
Quando l’insetto si nutre su una nuova pianta, i fitoplasmi sono introdotti nel floema (= tessuto
di conduzione della linfa elaborata) insieme con i fluidi salivari, e infettano le cellule del floema
Fitoplasmi
in cellula di floema Il processo di trasmissione è caratterizzato da tre fasi interdipendenti:
1. Acquisizione: alimentazione su piante infette, allo stadio giovanile (ninfe di III e V età)
2. Latenza: periodo variabile (14-28 giorni) che trasforma le cicaline da infette a infettive
(= quando raggiungono le cellule di vari organi, tra cui le ghiandole salivari).
3. Inoculazione: attraverso la saliva durante l’attività trofica, gli adulti sono in grado di
infettare le piante sane su cui si nutrono (tempi d’inoculazione di alcune ore)
A: disseccamento del grappolo
B: arrossamenti fogliari settoriali su vitigno a bacca rossa
C: ingiallimenti e ripiegature fogliari su vitigno a bacca bianca
D: aspetto generale di un filare fortemente colpito
Sintomi riconducibili a Flavescenza dorata (FD)
A B
C D
cicalina del Legno nero (Hyalesthes obsoletus)
Specie polifaga, con ciclo su
differenti organi della pianta ospite.
Vettore di fitoplasma (gruppo Stolbur),
diffente dal fitoplasma trasmesso da
Scaphoideus
cicalina verde della vite Empoasca vitis
Specie diffusa in tutta la regione paleartica
In Italia si ritrova con maggior frequenza nelle regioni settentrionali
Cicadellide polifago, dannoso soprattutto su vite in seguito alle punture
provocate sulle nervature fogliari che determinano alterazioni cromatiche
del lembo fogliare.
L'entità degli attacchi è generalmente limitata, non arrivando a causare
gravi danni sulla qualità e quantità della produzione.
Ha un nemico naturale: parassitoide delle uova (imenottero Anagrus anatomus)
Tignola della vite, Eupoecilia ambiguella
Specie di Lepidottero con 2 generazioni all’anno (1a generazione antofaga), la seconda
(carpofaga) svernante allo stadio di nel ritidoma della vite
Si alterna negli anni con la tignoletta dell’uva (dimensioni minori), ed in talune aree
le due specie coesistono.
tignoletta dell’uva o della vite Lobesia botrana
Specie di Lepidottero con 3 generazioni all’anno:
1a generazione: uova deposte sui bocci fiorali
2a generazione: uova deposte sugli acini
3a generazione: stadio di crisalide va incontro a diapausa nel ritidoma della vite
Drosophila melanogaster (moscerino della frutta o m. dell’aceto)
Specie di dittero, divenuto organismo modello di eccellenza per le ricerche genetiche, di biologia
dello sviluppo, di neurobiologia
Ciclo vitale in natura = 3 – 4 settimane
Le uova sono deposte su materiale organico (frutta) in decomposizione
Marciume acido dell’uva da acetobatteri
Drosophila suzukii (spotted wing drosophila)
Di origine asiatica, è una nuova specie invasiva.
Al di fuori dell’Asia, il 1° record storico è del 1980 in Hawaii
2008: California, USA
2009: Italia, Spagna, Francia, Germania e Svizzera
Nei Paesi in cui si è diffusa ha trovato habitat ideali per espandersi, e lo svernamento avviene
in ambienti associati con le abitazioni
La femmina depone uova nei frutti in maturazione (piccoli frutti, talvolta acini d’uva)
fillossera della vite (Daktulosphaira vitifoliae)
originaria di USA orientali
1a entrata in Europa: Francia, 1863
cicalina della Flavescenza dorata (FD) (Scaphoideus titanus),
Originaria di Stati Uniti
1° entrata in Europa: Francia 1958
drosofila con le ali macchiate (Drosophila suzukii)
originaria di Asia
1° entrata in Europa: 2009
Specie esotiche di insetti dannosi per la vite che hanno espanso il loro areale
di diffusione stabilendo popolazioni derivate, lontano dal loro areale (home-range)
sono tra le altre:
Aspetti dinamici
Estensione della
distribuzione al di là
della zona naturale
Effetti legati alla
stagione
Adattamento
Ospiti
Virus, parassiti
L’ambiente
(Complessità)
Olfatto
Insetti parassiti
Cos’è un processo invasivo?
Quale è l’origine geografica delle specie di interesse ?
Definizione geografica dell’areale di diffusione della
specie esotica
Processi invasivi
Migrazione Invasioni Biologiche
Componente importante dei cambiamenti globali con effetti
potenzialmente dannosi sulla salute pubblica, l'agricoltura e
la biodiversità.
Una popolazione invasiva è un insieme di individui
(propagulo) che:
1) è stato introdotto in una nuova zona (ARRIVO)
2) si è stabilita, accresciuta di numero (STABILIMENTO: la
popolazione cresce e si espande)
3) Si è d
Ma perché alcune specie diventano invasori
di successo? :
(Cicaline, moscerini della frutta, zanzare)
La diversità di caratteri relativi alla «life history» può
implicare sostanzialmente diverse e imprevedibili
potenzialità d’ invasione per ciascuna specie, ciò
determina il successo o il fallimento delle invasioni.
Il punto critico è una comprensione
della storia del processo di
invasione
La variabilità delle popolazioni avventizi dipende
da:
• La storia della popolazione ancestrale
• Il numero/dimensione dei propaguli
• I percorsi geografici dei propaguli: molteplici
popolazioni di origine e siti di introduzione
introduzione di una considerevole variabilità nel
corso di un breve periodo di tempo.
Conoscendo le fasi dell’invasione è possibile prendere in considerazione strategie atte a frenare o bloccare un’invasione
La ricostruzione dei percorsi
d’invasione:
PERCHE’?
• Esso facilita la progettazione di strategie per
prevenire invasioni (misura di quarantena);
• Per eradicazione/contenimento: l'efficacia delle
misure di controllo dipende dalla
diversità/origine genetica e geografica del
genotipo introdotto.
Metodi di ricostruzione di un
percorso invasivo:
• Diretti
- Sulla base di documenti storici di presenza/assenza di taxa invasivi
(e.g.: Scaphoideus titanus in Europa)
Metodi per la ricostruzione
• Indiretti
Modelli genetici osservati dentro e tra le popolazioni con marcatori molecolari (RAPD; SSRs, SNPs, etc.).
Metodi di Clustering:
• Basati sui dendrogrammi (es. neighbour-joining tree) dalle matrici di distanze genetiche tra le popolazioni.
• Antenati in comune degli individui invasori con popolazioni del range nativo (STRUCTURE by Pritchard et al., 2000).
Assegnazione di probabilità: direzione d’introduzione(GeneClass).
Records storici di Scaphoideus titanus
FRANCIA meridionale 1958 ITALIA settentrionale 1963 SVIZZERA occidentale e meridionale 1968 CROAZIA 1987 SLOVENIA 1987 SERBIA 2003 SPAGNA 1995 PORTOGALLO settentrionale 1999
Metodo diretto
La specie è di origine nord-Americana,
introdotta accidentalmente in Europa nel
XX secolo.
Risulta essere monofaga su vite in Europa;
è il vettore specifico di Phytoplasma vitis,
agente eziologico della Flavescenza dorata (FD)
della vite.
FD, inizialmente identificata nella Francia
meridionale, si è diffusa in molte zone viticole
del nord-Italia, della Spagna, della Slovenia e
della Svizzera, assumendo caratteristiche
epidemiche.
Metodi indiretti mediante l’uso di marcatori molecolari che definiscono
il “fingerprint” dei singoli individui di ciascuna popolazione geografica,
presenti sia nell’areale originario della specie (popolazioni ancestrali)
sia nell’areale di diffusione (popolazioni derivate o avventive)
Sviluppo di un database di riferimento che permette studi di tracciabilità
ogniqualvolta si sia in presenza di un focolaio invasivo (outbreak)
Tale database diventa ulteriormente importante se vengono introdotte
informazioni relative alla presenza di un patogeno (es. Fitoplasma) nelle
singole poplazioni
Sviluppo di mappe di rischio
(per arginare sia insetto vettore che il patogeno)
Pattern molecolare di individui di due popolazioni di S. titanus ottenuto con l’uso del
marcatore molecolare RAPD 494N: San Colombano (Italia) e Valois (USA).
Un frammento specifico (410 bp) è presente solo in individui Americani (= marcatore
molecolare di popolazione per saggi di tracciabilità); un frammento monomorfo (430 bp)
è presente in ambedue le popolazioni
Scelta dei marcatori molecolari per determinare i “fingerprints” dei singoli individui
Relazioni genetiche tra popolazioni
illustrate dall’ albero di consenso
Neighbour Joining (NJ), basato su
distanze genetiche D di Nei, derivate
dalle frequenze dei marcatori RAPD.
Le popolazioni Americane sono
chiaramente separate dal mix eterogeneo
delle popolazioni Europee.
USA (NY state)
Francia
Italia
Svizzera
Slovenia
Spagna
Considerazioni dedotte dall’analisi dei dati
In accordo con l’origine Neartica della specie, le due popolazioni native Americane hanno un’elevata
plasticità genetica, che può costituire per la specie un alto potenziale adattativo.
In questo contesto è opportune ricordare che nell’areale originario, S. titanus ha capacità di adattamento
a diversi ospiti.
La diffusione di S. titanus in Europa è avvenuta da occidente ad oriente, adattando il suo ciclo biologico
in relazione con il ciclo di Vitis vinifera (Boudon-Padieu, 2002).
Ma come è avvenuta questa diffusione, dato il suo ristretto grado di mobilità ed il suo essere monovoltino?
Queste caratteristiche biologiche potrebbero suggerire una diffusione “step by step” che dovrebbe riflettere
la cronologia delle invasioni.
Al contrario, i dati genetici mettono in luce una frammentazione genetica tra popolazioni sia entro
che tra i Paesi Europei, senza un gradiente Ovest – Est.
Questo pattern genetico eterogeneo è conseguente ad introduzioni indipendenti (propaguli diversi)
entro e tra le aree Europee.
E’ possibile che questo scenario sia associate agli scambi commerciali di barbatelle infestate da
uova di S. titanus sotto la corteccia (Boudon- Padieu 2002; Weintraub and Beanland 2006).
Vitis vinifera è la pianta ospite di S. titanus ed è anche riserva di fitoplasma.
Considerando la quantità di materiale vivaistico prodotto e scambiato commercialmente, è evidente
la necessità di rigorosi controlli di qualità sia per la presenza di uova che per la presenza di fitoplasma.
Metodi di controllo contro gli insetti
Metodi su base chimica (insetticidi)
Metodi compatibili con l’ambiente
su base biologica (bioinsetticidi, feromoni, etc)
su base genetica (SIT, Tecnica dell’Insetto Sterile)
su base biotecnologica (transgenesi e paratransgenesi)
All’interno di una popolazione esistono fattori biochimici e genetici che conferiscono resistenza
ad un dato insetticida; la velocità di evoluzione della resistenza è correlata a numerosi parametri
Fattori genetici Fattori biologici / ecologici
Resistenza agli Insetticidi
frequenza di alleli di resistenza
numero di alleli resistenti
dominanza di resistenti
interazioni degli alleli resistenti
precedente selezione con altri insetticidi
grado di integrazione di genomi
resistenti con fattori di fitness
Biotici
numero di generazioni / stagione
numero di prole / generazione
monogamia vs poligamia; partenogenesi
Ecologici /Comportamentali
isolamento; mobilità; migrazione
monofagia, oligofagia; polifagia
presenza di rifugi entro l’area trattata
NB: Questi fattori non possono essere facilmente controllati, e l’importanza di alcuni non può
essere definita fino a quando la resistenza si sia espressa
Resistenza agli Insetticidi
Fattori operativi
Caratteristiche chimiche
natura chimica degli insetticidi
relazione di prodotti chimici con
quelli usati in precedenza
persistenza dei residui; formulazioni
Caratteristiche delle applicazioni
soglia di applicazione
soglia di selezione
stadio(i) del ciclo di sviluppo selezionato
modalità di applicazione
selezione limitata nello spazio
selezione alternata
I fattori operativi che influenzano lo sviluppo della resistenza sono mediati dall’uomo,
e pertanto possono essere guidati.
Il management rella resistenza di popolazioni di insetti dannosi sta diventando una componente
estremamente importante di ogni programma di “pest management, specialmente a causa del
fatto che vengono attualmente prodotti meno prodotti pesticidi nuovi.
I nuovi approcci biotecnologici, permettendo di conoscere la struttura del
genoma del parassita (insetto, patogeno), offrono le possibilità di capire
a livello molecolare:
la sua biologia,
i suoi processi riproduttivi
la sua interazione con la pianta ospite
Su queste basi si potrà interferire per bloccare
il rapporto insetto – pianta ospite
il rapporto patogeno – insetto ospite
Aspetti dinamici
Estensione della
distribuzione al di là
della zona naturale
Effetti legati alla
stagione
Adattamento
Ospiti
Virus, parassiti
L’ambiente
(Complessità)
Olfatto
Insetti parassiti
Lo studio dell’olfatto e della chemorecezione permette di identificare l’apparato
molecolare coinvolto nel riconoscimento di importanti segnali per la scoperta del cibo,
per l’accoppiamento e per l’identificazione dei siti di ovoposizione.
Fornisce strumenti per lo sviluppo di prodotti attrattivi / repulsivi, maschio / femmina
specifici, per trappolaggio e monitoraggio (di interesse per industrie biotecnologiche)
Esempio: Ceratitis capitata
mosca mediterranea della frutta
Genomica, genomica funzionale e approcci
biochimici/fisiologici: sequenze specie/sesso specifiche
correlate alla recezione chimica e alla riproduzione
ESTs (profili di espressione) 27,167 high quality ESTs from:
Embryo (10,267 ESTs),
Adult Head (10,986 ESTs),
Male Accessory gland and testes
(5914 ESTs)
Sequenza genomica
Consortium: Pavia, Baylor College, USDA
Obp - Odorant Binding Proteins (OBPs)
Pbp - Pheromone Binding Proteins (PBPs)
Or - Odorant Receptors (ORs)
Csp - Chemosensory Proteins (CSPs)
Ode - Odorant Degrading Enzymes (ODEs)
Noi siamo cratterizzati da geni/proteine coinvolte
nel riconoscimento di ligandi esterni (piante
ospiti e componenti feromoni)
Medfly geni chemosensoriali
Caratterizzazione dei geni: Obp/Pbp
Structural features:
Signal peptide, Conserved Cysteine profile: Classic, Minus-C, Plus-C
(Vieira et al 2011)
Phylogenetic relationships:
looking for orthology with known characterized genes/proteins:
Obp repertoire of D. melanogaster was used as a reference given the
close phylogenetic affinity of the two species (80-100 Mya)
(Ayala et al 1996).
Chromosomal location:
Syntenic groups, Clusters, Cluster conservation
Specificity of tissue expression in relation to the
chemosensorial compartments:
Head, antennae, palps, tarsi
analisi SEM degli organi olfattivi
di Medfly (antennae and maxillary
palps) e identificazione di tre
differenti classi di sensilla
Specificità
dell’espressione tissutale:
I geni Obp sono identificati con funzioni leganti
i ferormoni putativi
Caratterizzaizone dei geni Pbp :
• Localizzazione cromosomica in
gruppi di sintesi;
• Espressione tessuto specifica in
relazione ai comparti
chemosensoriali: testa, antenne,
palpi, tarsi.
Caratterizzazione
funzionale delle
proteine PBP:
• Affinità di binding;
• Cristallizzazione.
Sono Pbps?
Chromosomal location
CcPbprp1 hybridisation to chromosome 6R in position 95b Localizzazione di un gene pheromone binding protein (PBP) sui cromosomi
Espressione
proteica e
purificazione
Purificazione dei ferormoni:
Collection of volatiles
Gas-chromatography-mass
spectrometry
Coupled gas-chromatography
/electroantennography
Comosti attivi antennali Studi di Binding (identificano la specificità
della proteina per il
ligando)
Caratterizzazione funzionale delle proteine PBP
Caratterizzazione di
Pheromone binding protein
Caratterizzazione dei componenti
ferormonici
Analisi SEM degli organi
olfattivi
Saggi di Binding
Seguremo l’approccio che abbiamo adottato per la Medfly:
Siciliano et al.(a) and (b), submitted
22 diversi prodotti chimici isolati dai maschi come
componenti ferormoniche (solo 15 identificati)
19 composti chimici
hanno evidenziato una
elevata risposta
antennale, quando
testati su femmine
14 composti hanno
evidenziato una
risposta antennale,
quando testati su
maschi
Identification of active compounds by GC-EAG
Sono state finora caratterizzate 5 PBPs (Pheromone binding proteins) di
C. capitata e sono stati altresì identificati i loro ligandi (componenti del
feromone)
Silenziando i geni di questi PBPs con opportuni approcci molecolari,
le corrispondenti proteine non verranno più prodotte, e il legame con
lo specifico componente del feromone verrà a mancare.
Di conseguenza, si viene così ad interferire con il riconoscimento tra
i sessi o con altre funzioni evocate dall’emissione di componenti dei
feromoni
L'identificazione e l'espressione in vitro di geni dell’olfatto, permette studi di binding per l'identificazione di molecole
odorose specifiche (ligandi) che innescano la trasduzione di segnale per il riconoscimento della pianta ospite, per
l'attrazione sessuale, e per l'identificazione di siti per l'oviposizione.
Si possono in tal modo mettere a punto metodi biotecnologici che interferiscono con
la capacità dell’insetto di riconoscere odori per la ricerca del frutto, per l'accoppiamento
e per il riconoscimento di siti di oviposizione.
E' quindi possibile identificare nuove molecole che possono rappresentare potenti attrattivi
oppure repellenti, che interferiscono con la capacità dell’insetto di percepire un particolare odore.
Tali molecole sono di grande importanza per attività di monitoraggio e per il controllo di insetti
dannosi.
Infatti, l'interazione tra queste molecole odorose (ligandi) e il complesso OBP o PBP/OR
determina nell'insetto risposte attrattive o repulsive.
L'identificazione di proteine chemosensoriali e dei loro ligandi specifici permette alle compagnie
Biotech di adattare high-throughput technologies utilizzate nell'industria chimico-farmaceutica
per l'identificazione di molecole (ligandi) che interferiscono con la trasduzione di segnale nei
diversi sistemi di chemiorecezione dell’insetto.
Monitoraggio e metodi di eradicazione
delle popolazioni
Le biotecnologie sono importanti anche per l’applicazione
della Tecnica dell’Insetto Sterile (SIT)
La Sterile Insect Technique (= SIT)
Rilascio di un elevato numero di insetti maschi sterili all’interno di una
popolazione wild-type della stessa specie,
così da farli accoppiare e quindi bloccare la riproduzione delle
femmine della popolazione wild-type.
La tecnica SIT prevede l’allevamento di un gran numero di insetti della
specie bersaglio,
esponedoli a radiazioni ionizzanti che detrminano la loro sterilità sessuale,
poi devono essere rilasciati nella popolazione bersaglio.
Il concetto dei SIT è semplice, la pratica è complessa
Il successo dell’applicazione dei SIT richiede:
La capacità di allevare, sterilizzare e distribuire sufficienti insetti per ottenere un
elevato successo dell’insetto maschio sterile nei confronti del maschio wild-type
I maschi sterili devono prevalere in numero rispetto agli omologhi wild-type, devono
perciò poter competere con essi a livello riproduttivo
Vantaggi della strategia SIT
1. Non inquinante
2. Specie-specifico
3. Potenziale per l’eliminazione locale
Campagne di eradicazione:
• New World Screwworm: eradicata da US, Messico, Guatemala,
Belize e Panama (40 anni)
• Tsetse: eradicata a Zanzibar (1994-1997)
• Medfly: eradicata dal Messico (1980-1986)
New World Screwworm Tsetse Medfly
Ad oggi, SIT è il metodo di controllo più ampiamente utilizzato contro le mosche
della frutta appartenenti alla famiglia Tephritidae:
Pectinophora gossypiella Cydia pomonella
ma è anche
diretto a
lepidotteri:
Bactrocera tryoni Bactrocera dorsalis Anastrepha ludens
Limiti della strategia SIT
• Solo i maschi sterili contribuiscono alla soppressione della
popolazione. La presenza di femmine duplica i costi di
allevamento
• Il successo di SIT dipende dalla fitness e competitività
dei maschi sterili e dal comportamento sessuale delle
femmine wildtype
• Infrastrutture necessarie per allevamento, sterilizzazione,
rilascio, monitoraggio
Nonostante notevoli successi, SIT non si è mostrato appropriato per tutte
le specie di insetti dannosi, principalmente per la necessità di disporre
di:
(1) modalità di allevamento intensivo di grandi numeri di insetti per il
rilascio massivo
(2) efficaci metodi di separazione dei sessi
(3) tecniche di sterilizzazione in grado di produrre grandi numeri di insetti
con minimi effetti sulla fitness
(4) efficienti metodi di rilascio
(5) precisi sistemi di marcatura che permettano di identificare
facilmente gli individui rilasciati
Monitoraggio
Fino ad ora le pupe, allevate in laboratorio e
sterilizzate, sono marcate con polveri
fluorescenti per distinguerle dalle pupe wild-
type quando sono catturate nelle trappole,
posizionate intorno all’area di rilascio.
Svantaggi: polvere costosa, non facile da
gestire, pericolosa per la salute umana,
operazione soggetta a errori
Catherine Smallridge
Possibile soluzione: trasformazione
marcatore fluorescente
Marker ideali:
• Durevole
• Poco costoso
• Non tossico (per insetti e ambiente)
• Chiaramente identificabili
• Non devono influenzare il normale comportamento, crescita,
riproduzione, durata della vita.
white+
genes of interest
Transformazione della linea germinale, basata su trasposoni (= sequenze mobili di DNA)
transposase
Vector + Helper
inject we G0 embryo
with vector/helper
mix
backcross G0 adult
to we host strain
select G1 red eye color
transformants
Sviluppo di un sitema di colorazione dello sperma,
Usando un promotore di un gene specifico per la
spermatogenesi,
driving GFP o DsRed expression
Ricerca di base
(studi sul comportamento
durante l’accoppiamento)
Ricerca applicata
(stima di efficacia SIT)
5’ pBac PUb EGFP 3’ pBac attP b2t DsRedEx G G
Sex and tissue-specific expression of Ccb2t in adult individuals
5’ pBac PUb DsRed 3’ pBac
attP b2t G G tGFP
Risultato:
14 linee transgeniche
Quante copie transgene?
Effetto del sito di inserimento?
Penetranza?
Stabilità del transgene?
Stabilità di espressione?
Marcatura sperma?
È un utilizzo fattibile?
Body marker Testes marker
b2t-tGFP Pub-DsRed
Persistenza della fluorescenza in testicoli di mosche morte
Espressione testicolo-specifica del Ccb2t-DsRedEx e -tGFP
era rilevabile in individui adulti, anche dopo tre mesi dalla
morte
tGFP transformed sperm
from testes
DsRedEx transformed sperm
from testes
868 bp la regione a monte del gene Ccb2tubulin è in grado di
dirigere l’espressione di DsRedEx e tGFP durante la
spermatogenesi, questo consente di evidenziare lo sperma verde
o rosso dai testicoli.
Sono queste le linee potenzialmente utili per la marcatura dello
sperma?
La misurazione risulta difficoltosa
Uso in
laboratorio
Eventuale uso in campo
Fattori essenziali di base:
Longevità
Riproduzione
capacità di accoppiamento
trasferimento / conservazione dello sperma
qualità dello sperma
Capacità di
accoppiamento del
maschio
I maschi delle linee 2 Ccb2t-DsRedEx erano significativamente
meno competitivi dei maschi wild-type quando erano in
competizione con le femmine wild-typeIn media hanno guadagnato
solo il 15% degli accoppiamenti.
In esperimenti sulla competizione in accoppiamento, i maschi delle
linee 2 Ccb2t-tGFP erano in grado di competere con i maschi wild-
type per le femmine wild-type.
Questo è stato particolarmente evidenziato in una linea che ha
guadagnato il 47% degli accoppiamenti.
Effetto della proteina esogena DsRedEx?
tGFP transformed sperm DsRedEx transformed sperm
Spermatozoi transgenici sono trasferiti con successo alle femmine.
Essi sono chiaramente visibili nelle spermateche di femmine
fecondate wild-type.
Questo approccio mira all ’ introduzione di un
meccanismo di resistenza in grado di prevenire la
trasmissione della patologia.
Population replacement
Richiede due principali elementi:
(1) Un meccanismo per la resistenza al patogeno (es. fitoplasma in S. titanus)
(2) Un metodo di diffusione del gene nella popolazione
Attualmente è un approccio in via di sviluppo e
necessita di notevole ottimizzazione
Gli avanzamenti tecnologici degli ultimi decenni hanno permesso di
sviluppare e migliorare, a livello teorico e operativo, sia la tecnica
SIT che gli approcci basati sul ‘population replacement’con l’uso
di batteri simbionti (NB: paratransgenesi)
Il batterio acetico Asaia sp., candidato agente di controllo simbiotico per la lotta a FD della vite trasmessa da
Scaphoideus titanus, è trasferito orizzontalmente tra individui che condividono il substrato alimentare.
La trasmissione orizzontale è stata dimostrata tramite prove di cofeeding su dieta artificiale, condotte alimentando su
una stessa soluzione zuccherina prima un individuo colonizzato con un ceppo marcato di Asaia, e successivamente
un esemplare non colonizzato.
Il grafico indica le cicaline risultate positive a PCR quantitativa con primer specifici per
il gene marcatore (colonne azzurre) sul totale di individui saggiati (colonne blu), in seguito a diversi periodi di condivisione
della dieta (da 24 a 96 ore) (modificato da GONELLA et al., 2012)