Presentazione di PowerPoint - UniTE

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI TERAMO CORSO DI LAUREA MAGISTRALE IN MEDICINA VETERINARIA

Corso Integrato: Diagnostica per Immagini e di Laboratorio

Modulo: Basi di Diagnostica di Laboratorio (2 CFU)

Roberto Giacominelli Stuffler

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Il Laboratorio di Diagnostica Clinica

Il laboratorio di diagnostica clinica si avvale di tecniche tipiIl laboratorio di diagnostica clinica si avvale di tecniche tipiche della chimica che della chimica analitica, della biochimica e della biologia molecolare,analitica, della biochimica e della biologia molecolare,

nel laboratorio di diagnostica clinica vengono stimati parametrinel laboratorio di diagnostica clinica vengono stimati parametri utili alla utili alla biochimica clinica ed alla biologia molecolare clinica;biochimica clinica ed alla biologia molecolare clinica;

la biochimica clinica e la biologia molecolare clinica studiano la biochimica clinica e la biologia molecolare clinica studiano il singolo il singolo soggetto malato per raccogliere dati che abbiano valore di provesoggetto malato per raccogliere dati che abbiano valore di prove semeiologichesemeiologiche a favore o contrarie alla diagnosia favore o contrarie alla diagnosi formulata dal clinico.formulata dal clinico.

La semeiotica La semeiotica éé unauna disciplina che studia i sintomi ed i segni delle malattie e di cdisciplina che studia i sintomi ed i segni delle malattie e di come ome entrambi debbano essere integrati per giungere alla diagnosi.entrambi debbano essere integrati per giungere alla diagnosi.

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IL LABORATORIO DI DIAGNOSTICA ED IL CONTROLLO DI QUALITAIL LABORATORIO DI DIAGNOSTICA ED IL CONTROLLO DI QUALITA’’Prelievo, raccolta e conservazione di materiali biologiciPrelievo, raccolta e conservazione di materiali biologiciVariabilitVariabilitàà analitica ed errori di misuraanalitica ed errori di misuraControllo dei metodi impiegati in un laboratorio di diagnosticaControllo dei metodi impiegati in un laboratorio di diagnosticaVariabilitVariabilitàà biologica e valori di riferimentobiologica e valori di riferimento

BIOCHIMICA CLINICABIOCHIMICA CLINICAMisure spettrofotometriche per la misura di Misure spettrofotometriche per la misura di analitianalitiMetodi Metodi immunochimiciimmunochimici per la misurazione di antigeniper la misurazione di antigeniDosaggi enzimatici dei fluidi biologiciDosaggi enzimatici dei fluidi biologiciProteomicaProteomica applicata alla diagnosticaapplicata alla diagnostica

BIOLOGIA MOLECOLARE CLINICABIOLOGIA MOLECOLARE CLINICAEnzimi di restrizioneEnzimi di restrizioneLa reazione di PCR nella diagnostica clinicaLa reazione di PCR nella diagnostica clinicaRealReal--Time PCRTime PCRPrevenzione da contaminazioni in un laboratorio di biologia molePrevenzione da contaminazioni in un laboratorio di biologia molecolarecolare

TESTI CONSIGLIATITESTI CONSIGLIATIMETODOLOGIE DI BASE PER LA BIOCHIMICA E LA BIOTECNOLOGIA, METODOLOGIE DI BASE PER LA BIOCHIMICA E LA BIOTECNOLOGIA, A.J.A.J. Ninfa, D.P. Ninfa, D.P. BallouBallou, , Ed. ZanichelliEd. ZanichelliBIOTECNOLOGIA MOLECOLARE, R.G. BIOTECNOLOGIA MOLECOLARE, R.G. GlickGlick, , J.J.J.J. Pasternak, Ed. ZanichelliPasternak, Ed. Zanichelli

BIOCHIMICA CLINICA

Roberto Giacominelli StufflerRoberto Giacominelli Stuffler

VET.

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Misure Spettrofotometriche

La spettrofotometria rappresenta una tecnica ampiamente utilizzaLa spettrofotometria rappresenta una tecnica ampiamente utilizzata per il dosaggio di ta per il dosaggio di numerosi numerosi analitianaliti,,permette di risalire alla concentrazione dellpermette di risalire alla concentrazione dell’’analitaanalita stesso.stesso.

abcA

Legge di Legge di LambertLambert--BeerBeer

A=Assorbimento della soluzionea=Coefficiente di estinzione molareb=Cammino ottico della soluzionec=Concentrazione del campione

abAc

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Lo Spettrofotometro

Cuvette: -

vetro

-

quarzo

visibile : tungsteno

UV : deuteriolampada

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Maggiore Maggiore éé la la quantitquantitàà di di molecolemolecole cheche la la luceluce incontraincontra, , maggioremaggiore éé ll’’assorbimentoassorbimento, , minoreminore éé ll’’intensitintensitàà di di luceluce trasmessatrasmessa,,in in unauna cineticacinetica enzimaticaenzimatica éé necessarionecessario che substrato e prodotto abbiano un diverso che substrato e prodotto abbiano un diverso assorbimento in qualche zona spettrale (visibileassorbimento in qualche zona spettrale (visibile--ultravioletto); ultravioletto); luce visibile: luce visibile: nmnm 380380--780, 780, luce ultravioletta: luce ultravioletta: nmnm 200200--380.380.

Intensità di luce INCIDENTE

I0 I

Intensità di luceTRASMESSA

Assorbimento del campione

a concentrazione C

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TrasmittanzaTrasmittanza TT = I/I= I/I00

Assorbanza A = Assorbanza A = --Log T =Log T = LogLogIIoo

/I/I

Luce incidenteLuce incidente

I0 I

l

Luce trasmessaLuce trasmessa


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Relazione tra Concentrazione ed Assorbimento di una Sostanza ad una certa Lunghezza d’onda

Legge di Lambert-Beer: A = abc

c = concentrazione Molare della sostanza che assorbe la luce. b = lunghezza del cammino ottico espressa in cm. a = Coefficiente di Estinzione Molare della sostanza che assorbe luce.

lI0 I

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Curve Standard

Si può risalire alla concentrazione di unSi può risalire alla concentrazione di un’’analitaanalita in una soluzione utilizzando uno in una soluzione utilizzando uno standard a concentrazione nota.standard a concentrazione nota.

stst AAcc ::

stst

cAAc

Questo rapporto Questo rapporto èè valido solo se le concentrazioni dellvalido solo se le concentrazioni dell’’analitaanalita incognito e dello incognito e dello standard sono comparabili.standard sono comparabili.

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Retta di Taratura

y = 0,0395x + 0,0356R2 = 0,9966

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 2 4 6 8 10 12 14

AssorbimentoConcentrazione

mbyx

bmxy

La formula La formula èè applicabile solamente se lapplicabile solamente se l’’assorbimento del campione incognito assorbimento del campione incognito èè compreso fra il valore minimo e massimo della retta di taratura.compreso fra il valore minimo e massimo della retta di taratura.

EE’’ consigliabile ricavare la concentrazione dellconsigliabile ricavare la concentrazione dell’’analitaanalita da una serie di standard a da una serie di standard a concentrazione nota, piuttosto che da un singolo standard.concentrazione nota, piuttosto che da un singolo standard.

m è il coefficiente angolare ed esprime la pendenza della retta.b = y quando x = 0.

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Metodi fotometrici

Analisi fotometrica direttaAnalisi fotometrica diretta

Può essere effettuata sia nel visibile sia nellPuò essere effettuata sia nel visibile sia nell’’UV. EUV. E’’applicabile quando si applicabile quando si studiano sostanze che assorbono studiano sostanze che assorbono ““naturalmentenaturalmente”” ad una particolare ad una particolare lunghezza dlunghezza d’’onda,onda,spesso, per rendere il saggio specifico, spesso, per rendere il saggio specifico, èè necessario effettuare un necessario effettuare un procedimento di separazione prima dellprocedimento di separazione prima dell’’analisi.analisi.

Analisi fotometrica indirettaAnalisi fotometrica indiretta

EE’’ usata nella maggior parte delle applicazioni in biochimica clinusata nella maggior parte delle applicazioni in biochimica clinica. La ica. La sostanza da analizzare subisce unsostanza da analizzare subisce un’’adatta reazione chimica, che la adatta reazione chimica, che la trasforma in un derivato trasforma in un derivato fotoassorbentefotoassorbente,,si parla di si parla di analisi fotometrica basata sullo sviluppo del coloreanalisi fotometrica basata sullo sviluppo del colore..

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Metodi fotometrici

Acido lattico-piruvico Conversione NAD/NADH in presenza di LDH

Glucosio Glucosio ossidasi-perossidasi; esochinasi-glucosio-6-fosfato deidrogenasi, etc.

Ammoniaca Reazione di Berthelot dopo mineralizzazione

Urea Ureasi-reazione Berthelot

Proteine Lettura UV; dosaggio dell’ammoniaca; reazione con biureto

Deidrogenasi Test ottico semplice per deidrogenasi

Emoglobina Reattivo di Drabkin

Calcio Acido Cloranilico

Magnesio Giallo titanio

Colesterolo Reattivo di Liebermann Burchard; reazione enzimatica – Trinder.

Lipidi totali Reagente solfofosfovanilico

Sostanze Reazioni di Assorbimento

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Metodi Immunochimici

Le tecniche immunochimiche permettono la rivelazione di un Le tecniche immunochimiche permettono la rivelazione di un antigeneantigene (proteine, (proteine, polisaccaridi e acidi nucleici) mediante polisaccaridi e acidi nucleici) mediante anticorpianticorpi, sfruttando il riconoscimento , sfruttando il riconoscimento specifico di un determinante antigenico (specifico di un determinante antigenico (epitopoepitopo,, che che éé quella piccola parte di quella piccola parte di antigene che lega l'anticorpo specificoantigene che lega l'anticorpo specifico).).

ANTICORPI

Western Blotting

Cromatografiadi affinità

Immuno-Microscopia

CitoFluorimetria

ELISA RIA FIA

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Epitopi sull’antigene

Anticorpi Anticorpi PoliclonaliPoliclonali

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Anticorpi MonoclonaliAnticorpi Monoclonali

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luminolo + H2 O2 luminolo oxluminolo + H2 O2 luminolo ox


Procedura di colorazione con anticorpiProcedura di colorazione con anticorpi

Colorazione DirettaColorazione Diretta

HRPHRP h

Colorazione IndirettaColorazione Indiretta

HRPHRP h

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Colorazione DirettaColorazione Diretta

SvantaggiSvantaggiVantaggiVantaggi

Costo MinoreCosto MinoreRapiditRapiditàà

Scarsa Scarsa sensibilitsensibilitàà..

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Colorazione IndirettaColorazione Indiretta


Elevata sensibilitElevata sensibilitààVersatilitVersatilitàà

Costo MaggioreCosto MaggioreTempi piTempi piùù lunghi.lunghi.

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BlockingBlocking

Incubazione con anticorpo primarioIncubazione con anticorpo primario

LavaggiLavaggi

LavaggiLavaggi

Incubazione con anticorpo secondarioIncubazione con anticorpo secondario

Rivelazione.Rivelazione.

Fasi del saggio immunologicoFasi del saggio immunologico

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I dosaggi immunologici permettono una determinazione quantitativI dosaggi immunologici permettono una determinazione quantitativa di una a di una data sostanza (ormoni, proteine, etc.).data sostanza (ormoni, proteine, etc.).Caratteristiche di questi dosaggi sono:Caratteristiche di questi dosaggi sono:

1.1. sensibilitsensibilitàà,,2.2. economiciteconomicitàà,,3.3. praticitpraticitàà ((velociveloci, , semplicisemplici, , applicabiliapplicabili a a moltimolti campionicampioni per per voltavolta),),4.4. possibilitpossibilitàà di di automatizzareautomatizzare ilil processoprocesso..

Esistono diverse tipologie di dosaggio immunologico:Esistono diverse tipologie di dosaggio immunologico:

1.1. immunodosaggiimmunodosaggi competitivicompetitivi ((RIARIA = = Radio Radio ImmunoImmuno AssayAssay),),2.2. dosaggidosaggi ImmunometriciImmunometrici ((IRMAIRMA = = ImmunoImmuno Radio Radio MetricMetric AssayAssay; ;

sandwichsandwich--ELISAELISA),),3.3. dosaggidosaggi di di immunoassorbimentoimmunoassorbimento con con enzimienzimi ((ELISA ELISA = Enzyme = Enzyme

Linked Linked ImmunoImmuno--Sorbent AssaySorbent Assay).).

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Immunodosaggi Competitivi

antigene marcato

quantità fissa

antigene “freddo”

incognita

Ab

quantità fissa

EQUILIBRIO

Separazione dell’antigene libero da quello legato

MISURA della radioattività

CC’è’è sempre bisogno di una curva standard.sempre bisogno di una curva standard.

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Dosaggio RIA

RIA: Radio RIA: Radio ImmunoImmuno AssayAssay

Gli antigeni vengono normalmente marcati con Gli antigeni vengono normalmente marcati con 125125I o I o 33H.H.La separazione dellLa separazione dell’’antigene libero da quello legato antigene libero da quello legato èè possibile utilizzando possibile utilizzando diverse tecniche (proteina A, ammonio solfato, ecc.)diverse tecniche (proteina A, ammonio solfato, ecc.)


Richiedono piccole quantitRichiedono piccole quantitàà di anticorpodi anticorpoSensibilitSensibilitàà elevata (per lo elevata (per lo 125125I 10I 10--1212--1010--1414 M)M)

Non sono automatizzabili.Non sono automatizzabili.

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Dosaggi Immunometrici

antigene marcato antigene “freddo Ab

Immunodosaggio competitivo (RIA)

antigene “freddo” Ab marcato

Dosaggi immunometrici conanticorpo radiomarcato (IRMA)

limitante

In eccesso

HRP

Dosaggi immunometrici conanticorpo enzima-marcato (s-ELISA):

enzima HRP = Horseradish (il rafano è una pianta erbacea perenne) Peroxidase.

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Dosaggi Immunometrici

Componenti del saggio:Componenti del saggio:

1.1. AbAb di cattura (immobilizzato su pozzetto),di cattura (immobilizzato su pozzetto),2.2. AgAg presente nella miscela che deve essere dosato,presente nella miscela che deve essere dosato,3.3. AbAb di rivelazione.di rivelazione.

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Sandwich ELISA

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Caratteristiche dei dosaggi immunometrici

SvantaggiSvantaggi

VantaggiVantaggi

SensibilitSensibilitààVelocitVelocitààAutomatizzabilitAutomatizzabilitàà (Lettori ELISA, robot)(Lettori ELISA, robot)Analisi di molti campioni per voltaAnalisi di molti campioni per volta

Uso di due anticorpi (non sempre Uso di due anticorpi (non sempre disponibili e comunque costosi).disponibili e comunque costosi).

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Dosaggi di immunoassorbimento

Dosaggi immunometrici (IRMA o s-ELISA) Dosaggi di immunobinding (ELISA)

v

Ab adsorbito

HRP

Ag adsorbito

Sono effettuati sempre su piastre da Sono effettuati sempre su piastre da microtitolazionemicrotitolazione a 96 pozzetti a 96 pozzetti (oggi anche a 384 e 1536 pozzetti) in polistirene o polivinilclo(oggi anche a 384 e 1536 pozzetti) in polistirene o polivinilcloruro.ruro.

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Saggio ELISA Diretto

ELISA: ELISA: EnzymeEnzyme--LinkedLinked ImmunoImmuno--SorbentSorbent AssayAssay

In questo caso, il saggio In questo caso, il saggio èè detto diretto, perchdetto diretto, perchèè utilizza un solo utilizza un solo anticorpo specifico per il nostro antigene e marcato con un enzianticorpo specifico per il nostro antigene e marcato con un enzima.ma.

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Saggio ELISA

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Saggio ELISA indiretto

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Saggio ELISA indiretto

Enzimi e Diagnostica Clinica

Gli enzimi sono proteine dotate di attivitGli enzimi sono proteine dotate di attivitàà catalitiche, con un ruolo fondamentale catalitiche, con un ruolo fondamentale nella regolazione delle varie vie metaboliche,nella regolazione delle varie vie metaboliche,essi hanno alta specificitessi hanno alta specificitàà di substrato.di substrato.

La quantitLa quantitàà in peso di enzima presente in un campione biologico in peso di enzima presente in un campione biologico èè estremamente piccola,estremamente piccola,conviene quindi valutare la sua attivitconviene quindi valutare la sua attivitàà enzimatica, misurandola come velocitenzimatica, misurandola come velocitàà della reazione catalizzata.della reazione catalizzata.

1U = 1mol/minuto

Una Una unitunitàà di attivitdi attivitàà èè la quantitla quantitàà di enzima che catalizza la conversione di una di enzima che catalizza la conversione di una micromolemicromole di substrato per minuto in condizioni standard di temperatura, di substrato per minuto in condizioni standard di temperatura, pH e pH e concentrazione di substrato,concentrazione di substrato,ll’’enzima deve essere il fattore limitante della reazione, mentre ienzima deve essere il fattore limitante della reazione, mentre il substrato deve l substrato deve essere in eccesso,essere in eccesso,nella maggior parte dei casi, la quantitnella maggior parte dei casi, la quantitàà di enzima presente in un campione di enzima presente in un campione biologico biologico èè direttamente proporzionale alla sua attivitdirettamente proporzionale alla sua attivitàà..

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ISOENZIMIISOENZIMI

Enzimi che catalizzano la stessa reazione, ma Enzimi che catalizzano la stessa reazione, ma presentano diverse proprietpresentano diverse proprietàà molecolari (carica, molecolari (carica, punto isoelettrico, solubilitpunto isoelettrico, solubilitàà, peso molecolare)., peso molecolare).La base della loro uguaglianza funzionale risiede in La base della loro uguaglianza funzionale risiede in pochi domini strutturalmente simili (omologhi).pochi domini strutturalmente simili (omologhi).La loro diversitLa loro diversitàà èè invece data dalle sequenze invece data dalle sequenze proteiche presenti al di fuori dei domini omologhi.proteiche presenti al di fuori dei domini omologhi.

Da un punto di vista diagnostico Da un punto di vista diagnostico èè importante poter importante poter distinguere ldistinguere l’’attivitattivitàà dovuta ad un particolare dovuta ad un particolare isoenzima. Enzimi ubiquitari possono presentare isoenzima. Enzimi ubiquitari possono presentare isoforme tessutoisoforme tessuto--specifiche.specifiche.

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LDH (LDH (latticolattico--deidrogenasideidrogenasi))

Enzima ubiquitario. Un aumento in circolo può essere dovuto a neEnzima ubiquitario. Un aumento in circolo può essere dovuto a necrosi di crosi di uno degli organi in cui uno degli organi in cui èè espresso.espresso.

CK (CK (creatinfosfochinasicreatinfosfochinasi))

EE’’ presente prevalentemente nei muscoli scheletrici, nel miocardiopresente prevalentemente nei muscoli scheletrici, nel miocardio e nel e nel cervello. Da un punto di vista clinico cervello. Da un punto di vista clinico èè importante la sua utilizzazione importante la sua utilizzazione nella diagnostica dellnella diagnostica dell’’infarto al miocardio.infarto al miocardio.

Fosfatasi AlcalinaFosfatasi Alcalina

Espresso in molti tessuti (fegato, ossa, intestino, placenta, reEspresso in molti tessuti (fegato, ossa, intestino, placenta, reni), presenta ni), presenta forme isoenzimatiche specifiche per ogni tessuto.forme isoenzimatiche specifiche per ogni tessuto.I valori normali sono piI valori normali sono piùù elevati in due sole condizioni fisiologiche: elevati in due sole condizioni fisiologiche: nellnell’’infanzia e nella gravidanza.infanzia e nella gravidanza.I livelli di fosfatasi alcalina aumentano nelle epatopatie e nelI livelli di fosfatasi alcalina aumentano nelle epatopatie e nelle malattie le malattie ossee.ossee.

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AST E ALT (AST E ALT (aspartatoaspartato e e alaninaalanina aminotransferasiaminotransferasi))

LL’’AST AST èè legato ai mitocondri, mentre llegato ai mitocondri, mentre l’’ALT ALT èè citosolicacitosolica. Normalmente . Normalmente sono impermeabili alle membrane plasmatiche. Un aumento in circosono impermeabili alle membrane plasmatiche. Un aumento in circolo lo indica la presenza di cellule non piindica la presenza di cellule non piùù integre.integre.LL’’AST AST èè presente in molti tessuti, mentre lpresente in molti tessuti, mentre l’’ALT ALT èè maggiormente maggiormente concentrata nel fegato.concentrata nel fegato.

ColinesterasiColinesterasi

EE’’ un enzima un enzima plasmaspecificoplasmaspecifico, prodotto dal fegato per essere messo in , prodotto dal fegato per essere messo in circolazione.circolazione.Il Il livellolivello delldell’’enzimaenzima diminuiscediminuisce quandoquando ilil fegatofegato non non èè pipiùù in in gradogrado di di sintetizzaresintetizzare proteineproteine. Il . Il dosaggiodosaggio delldell’’enzimaenzima nellenelle epatitiepatiti èè peròperò di di scarsascarsa utilitutilitàà, , perchperchèè la la diminuzionediminuzione èè evidenteevidente dopodopo la prima la prima settimanasettimana di di malattiamalattia..

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Metodi di Misura dell’Attività Enzimatica

PreincubazionePreincubazione

Misura della velocitMisura della velocitàà di reazione enzimaticadi reazione enzimatica

sistema di misura a due punti,sistema di misura a due punti,

La velocitLa velocitàà di reazione viene misurata dalle variazioni delle di reazione viene misurata dalle variazioni delle concentrazioni di substrato (S) o di prodotto (P) in unconcentrazioni di substrato (S) o di prodotto (P) in un’’unitunitàà di di tempo (tempo (--dSdS//dtdt e e +dP+dP//dtdt).).Le misure devono essere effettuate subito e per tempi brevi, perLe misure devono essere effettuate subito e per tempi brevi, per evitare levitare l’’accumulo dei prodotti o laccumulo dei prodotti o l’’esaurimento dei substrati:esaurimento dei substrati:

Per ottenere una perfetta Per ottenere una perfetta termostatazionetermostatazione della miscela di della miscela di reazione, il campione in esame viene reazione, il campione in esame viene preincubatopreincubato con gli altri con gli altri componenti della reazione per alcuni minuti.componenti della reazione per alcuni minuti.

sistema di misura in continuo.sistema di misura in continuo.

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Metodi di Misura dell’Attività Enzimatica

Sistema di misura a due puntiSistema di misura a due punti

Si eseguono solo due determinazioni, una senza campione Si eseguono solo due determinazioni, una senza campione (bianco) e una con il campione. La differenza fra le due misure (bianco) e una con il campione. La differenza fra le due misure permette di stabilire la variazione della concentrazione del permette di stabilire la variazione della concentrazione del substrato.substrato.

Sistema di misura in continuoSistema di misura in continuo

Permette di monitorare la variazione di concentrazione nel tempoPermette di monitorare la variazione di concentrazione nel tempo..EE’’ il metodo piil metodo piùù usato per misurare unusato per misurare un’’attivitattivitàà enzimatica. In molte enzimatica. In molte situazioni la reazione viene seguita tramite la misura situazioni la reazione viene seguita tramite la misura delldell’’assorbanza della miscela di reazione.assorbanza della miscela di reazione.

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Sistema di Misura in Continuo

DC BA Enzima

A o B A o B ““coloraticolorati””

Diminuzione dellDiminuzione dell’’assorbanzaassorbanza

C o D C o D ““coloraticolorati””

Aumento dellAumento dell’’assorbanza.assorbanza.

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Sistema di Misura in Continuo

fosfatoonitrofenolp- OHfosfatonitrofenilp 2 alcalinafosfatasi

GialloGiallo

AA405.405.

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Test Ottico Semplice

ADBADHA sideidrogena N N

A260A340

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Test Ottico Semplice

0,0

0,20,4

0,6

0,81,0

1,2

1,4

1,6

1,8

200 250 300 350 400 450

NAD

NADH

ADLattatoHADHPiruvato LDH N N

A340 Attività LDH

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Test Ottico con Indicatore

DCBA enzima

Per alcune reazioni enzimatiche, nessuno dei composti che si forPer alcune reazioni enzimatiche, nessuno dei composti che si formano o mano o scompaiono presenta un assorbimento nel visibile o nellscompaiono presenta un assorbimento nel visibile o nell’’UV.UV.In questo caso In questo caso èè possibile possibile ““accoppiareaccoppiare”” alla reazione primaria una reazione detta alla reazione primaria una reazione detta ““indicatriceindicatrice””..

NADENADHD) (o C sideidrogena

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Test Ottico con Indicatore

piruvatoglutammatoalaninaratochetogluta ALT

NADlattatoHNADHpiruvato LDH

toossalacetaglutammatoaspartatoratochetogluta AST

NADmalatoHNADHtoossalaceta MDH

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Considerazioni Generali

LL’’attivitattivitàà catalitica in vitro degli enzimi dipende da numerosi fattori incatalitica in vitro degli enzimi dipende da numerosi fattori interdipendenti, terdipendenti, che devono essere studiati variando la loro concentrazione singoche devono essere studiati variando la loro concentrazione singolarmente.larmente.

Essi sono:Essi sono:

1.1. concentrazione di substrato (deve saturare completamente lconcentrazione di substrato (deve saturare completamente l’’enzima);enzima);2.2. quantitquantitàà di di enzimaenzima cheche catalizzacatalizza la la reazionereazione;;3.3. statostato di di attivazioneattivazione delldell’’enzimaenzima;;4.4. quantitquantitàà di di cofattoricofattori cheche intervengonointervengono nellanella reazionereazione;;5.5. presenzapresenza di di inibitoriinibitori;;6.6. temperaturatemperatura di di incubazioneincubazione ((dada 3030°°C a 37C a 37°°C, un C, un aumentoaumento di 1di 1°°C C provocaprovoca unauna

variazionevariazione del 10% del 10% delldell’’attivitattivitàà delldell’’enzimaenzima););7.7. pH del mezzo di pH del mezzo di reazionereazione ((devedeve essereessere pipiùù vicinovicino possibilepossibile allall’’optimumoptimum).).

Proteomica Applicata alla Diagnostica

ScopertaScoperta di di nuovinuovi target per lo target per lo svilupposviluppo di di farmacifarmaci

Campione del tessuto affetto

Campione del tessuto normale

2D-electrophoresis

pH

Mas

s

Identificazione di una proteina espressa solo nel tessuto affetto

Soluzione di proteina concentrata

Cristallizzazione della proteina

Struttura dellaproteina

Inibitori per inattivare la proteina

X-raybeam

Cristallo dellaproteinaDiffraction pattern

Rifinitura strutturalee calcolo del modello atomico

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Elettroforesi di Proteine

LL’’elettroforesi elettroforesi èè la migrazione di particelle cariche in un campo elettrico. Partla migrazione di particelle cariche in un campo elettrico. Particelle con icelle con carica positiva migrano verso il catodo, quelle con carica negatcarica positiva migrano verso il catodo, quelle con carica negativa vanno verso iva vanno verso ll’’anodo.anodo.AmminoacidiAmminoacidi, , peptidipeptidi, , proteineproteine, , nucleotidinucleotidi ed ed acidi nucleiciacidi nucleici possiedono gruppi possiedono gruppi ionizzabili e quindi, in dipendenza dal pH, possono essere preseionizzabili e quindi, in dipendenza dal pH, possono essere presenti in soluzione come nti in soluzione come specie cariche.specie cariche.

Esistono diversi tipi di gel per elettroforesi applicabili alle Esistono diversi tipi di gel per elettroforesi applicabili alle proteine:proteine:

1.1. elettroforesi su gel di elettroforesi su gel di poliacrilammidepoliacrilammide in condizioni denaturanti (SDSin condizioni denaturanti (SDS--PAGE);PAGE);2.2. elettroforesielettroforesi in in condizionicondizioni native;native;3.3. isoelettrofocalizzazioneisoelettrofocalizzazione (IEF);(IEF);4.4. elettroforesielettroforesi bidimensionalebidimensionale (2D PAGE = (2D PAGE = 2D 2D polyacrilamidepolyacrilamide gelgel--electrophoresiselectrophoresis).).

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Gel di Poliacrilammide

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Gel di Poliacrilammide

La dimensione dei pori del gel decresce con lLa dimensione dei pori del gel decresce con l’’aumentare della concentrazione di aumentare della concentrazione di acrilammideacrilammide..

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Mobilità Elettroforetica

La mobilitLa mobilitàà elettroforetica di una certa molecola elettroforetica di una certa molecola èè determinata da:determinata da:

1.1. carica;carica;2.2. dimensionidimensioni e forma;e forma;3.3. viscositviscositàà del mezzo.del mezzo.

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Per avere una separazione solo in base alla massa delle proteinePer avere una separazione solo in base alla massa delle proteine, bisogna eliminare , bisogna eliminare ll’’effetto della carica.effetto della carica.Ciò Ciò èè possibile effettuando lpossibile effettuando l’’elettroforesi in presenza di un agente denaturante delle elettroforesi in presenza di un agente denaturante delle proteine (proteine (SDS = SDS = SodiumSodium DodecylDodecyl SulphateSulphate) e di un riducente dei legami disolfuro () e di un riducente dei legami disolfuro (-- mercaptoetanolomercaptoetanolo, DTT, DTT).).

SDS-PAGE

Il Il --mercaptoetanolomercaptoetanolo èè un solfuro che distrugge i legami un solfuro che distrugge i legami SS--SS eventualmente presenti eventualmente presenti nelle proteine.nelle proteine.Il Il SDSSDS èè un potente detergente anionico, si lega alle proteine tramite lun potente detergente anionico, si lega alle proteine tramite le sue catene e sue catene apolari, distruggendone la struttura secondaria e terziaria.apolari, distruggendone la struttura secondaria e terziaria.La carica netta della proteina viene completamente mascherata daLa carica netta della proteina viene completamente mascherata dallll’’SDSSDS e la e la separazione nel gel avviene solo in base alle separazione nel gel avviene solo in base alle dimensioni molecolaridimensioni molecolari..

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Valutazione del Peso Molecolare con SDS-PAGE

La determinazione della massa molecolare di una proteina mediantLa determinazione della massa molecolare di una proteina mediante SDSe SDS--PAGE va PAGE va effettuata utilizzando la concentrazione di effettuata utilizzando la concentrazione di acrilammideacrilammide adeguata alla massa delle adeguata alla massa delle proteine da separare.proteine da separare.

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SDS-PAGE: Metodo Discontinuo

Gel di Impaccamento (Gel di Impaccamento (stackingstacking gelgel): ): gelgel a bassa concentrazione di a bassa concentrazione di acrilammideacrilammide e e quindi con pori larghi, sul quale si caricano i campioni.quindi con pori larghi, sul quale si caricano i campioni.Gel di Separazione (Gel di Separazione (resolvingresolving gelgel): ): gelgel ad alta concentrazione di ad alta concentrazione di acrilammideacrilammide e e quindi con bassa porositquindi con bassa porositàà, nel quale avviene la separazione in base alla massa , nel quale avviene la separazione in base alla massa molecolare.molecolare.

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Metodi di Colorazione della Proteine

CoomassieCoomassie BrilliantBrilliant BlueBlue: le proteine vengono colorate per immersione in una : le proteine vengono colorate per immersione in una soluzione di soluzione di coomassiecoomassie. Si rivelano fino a 100ng di proteina.. Si rivelano fino a 100ng di proteina.

Silver Silver stainingstaining: ioni : ioni AgAg++ vengono ridotti ad vengono ridotti ad AgAg metallico sulle proteine, conferendo metallico sulle proteine, conferendo loro una colorazione scura. Rivela fino a 1ng di proteina. Può eloro una colorazione scura. Rivela fino a 1ng di proteina. Può essere impiegata ssere impiegata dopo la colorazione con dopo la colorazione con coomassiecoomassie..

Colorazione di Colorazione di SchiffSchiff con acido periodico (PAS)con acido periodico (PAS): permette di distinguere i diversi : permette di distinguere i diversi componenti di una miscela di componenti di una miscela di glicoproteineglicoproteine. Ha scarsa sensibilit. Ha scarsa sensibilitàà e spesso viene e spesso viene accoppiata al Western accoppiata al Western blottingblotting..

Western Western blottingblotting: la proteina di interesse viene identificata nella miscela con : la proteina di interesse viene identificata nella miscela con anticorpi specifici e rilevata per mezzo di anticorpi secondari anticorpi specifici e rilevata per mezzo di anticorpi secondari coniugati ad un coniugati ad un enzima. La presenza del complesso enzima. La presenza del complesso proteinaproteina--anticorpoanticorpo--anticorpoanticorpo secondario può secondario può essere rilevata con metodi colorimetrici o essere rilevata con metodi colorimetrici o chemioluminescentichemioluminescenti. Permette di rivelare . Permette di rivelare pgpg di proteina.di proteina.

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Principio del Western Blotting

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Struttura di un anticorpo

Catena leggera

Catena pesante

Legami disolfuro intracatena

Legami disolfuro intercatena

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Colorazione DirettaHRPHRP

luminolo + H2 O2

h

luminolo ox

Colorazione Indiretta

HRPHRP

luminolo + H2 O2

h

luminolo ox

Procedura di colorazione con anticorpi

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Fasi dell’immunocolorazione

BlockingBlocking

Incubazione con anticorpo primarioIncubazione con anticorpo primario

LavaggiLavaggi

LavaggiLavaggi

Incubazione con anticorpo secondarioIncubazione con anticorpo secondario

ECLECL EnhancedEnhanced ChemiluminescenceChemiluminescence

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La reazione in gioco

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Isoelettrofocalizzazione (IEF)

LL’’IEFIEF èè unauna elettroforesielettroforesi in un in un gradientegradiente di pH di pH costruitocostruito tratra un un canodocanodo e un e un anodoanodo. . EssoEsso separasepara le le molecolemolecole in in funzionefunzione del del loroloro diversodiverso puntopunto isoelettricoisoelettrico..EE’’ un un metodometodo ad ad altaalta risoluzionerisoluzione, in , in quantoquanto èè possibilepossibile separareseparare proteineproteine con con puntipunti isoelettriciisoelettrici cheche differisconodifferiscono per 0.01 per 0.01 unitunitàà di pH.di pH.

Per Per crearecreare ilil gradientegradiente di pH di pH sisi usanousano anfolitianfoliti di di sintesisintesi ((miscelemiscele di di acidiacidi poliamminopoliammino policarbossilicipolicarbossilici) ) cheche sisi introduconointroducono nelnel supportosupporto. . Se Se sisi vuolevuole analizzareanalizzare qualitativamentequalitativamente unauna miscelamiscela di di proteineproteine sisi dovrdovràà usareusare un un gradientegradiente di pH (di pH (eses. 3. 3--10).10).Un Un intervallointervallo di pH di pH pipiùù ristrettoristretto èè inveceinvece utile per utile per determinazionideterminazioni di di pIpI o o quandoquando sisi analizzanoanalizzano proteineproteine con con pIpI molto molto similisimili..

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I I campionicampioni possonopossono essereessere caricaticaricati in in qualunquequalunque puntopunto del gel.del gel.

Le Le proteineproteine sisi muoverannomuoveranno verso verso ilil loroloro puntopunto isoelettricoisoelettrico..

Le Le proteineproteine non non sarannosaranno pipiùù carichecariche al al loroloro pIpI..

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GliGli impieghiimpieghi delldell’’IEFIEF sonosono::

1. 1. lala determinazionedeterminazione del del pIpI di di unauna proteinaproteina: la : la distanzadistanza di di migrazionemigrazione delladella proteinaproteina sisi confrontaconfronta con con quellaquella di di proteineproteine con con pIpI notonoto,,

2. 2. lala separazioneseparazione di di isoenzimiisoenzimi: : sisi possonopossono distingueredistinguere differentidifferenti formeforme molecolarimolecolari dellodello stessostesso enzimaenzima, , cheche differisconodifferiscono per per pochipochi amminoacidiamminoacidi,,

3. 3. lolo studio studio delladella microeterogeneitmicroeterogeneitàà di di unauna proteinaproteina: : èè possibilepossibile scoprirescoprire se se la la proteinaproteina subiscesubisce unauna modificazionemodificazione postpost--traduzionaletraduzionale ((fosforilazionefosforilazione).).

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Gel Elettroforesi Bidimensionale

EssaEssa combinacombina le le caratteristichecaratteristiche delladella IEFIEF ((proteineproteine separate in base separate in base allaalla loroloro caricacarica) ) con con quellaquella delladella SDSSDS--PAGEPAGE ((separazioneseparazione in base in base allealle dimensionidimensioni delledelle proteineproteine).).La La combinazionecombinazione delledelle due due tecnichetecniche nellnell’’elettroforesielettroforesi bidimensionalebidimensionale permettepermette di di analizzareanalizzare e e separareseparare unauna miscelamiscela complessacomplessa di di proteineproteine..

11°° GelGel: : IEFIEF susu gel di gel di poliacrilammidepoliacrilammide, in , in presenzapresenza di di anfolitianfoliti. Le . Le proteineproteine, , nellonello statostato denaturatodenaturato, , sisi separanoseparano quindiquindi in base al in base al loroloro pIpI..

22°° GelGel: : ilil 11°° gel gel èè posizionatoposizionato soprasopra ilil gel gel contenentecontenente SDSSDS. Durante . Durante ll’’elettroforesielettroforesi nellanella secondaseconda dimensionedimensione, le , le proteineproteine legate legate allall’’SDSSDS entranoentrano nelnel gel e gel e sisi separanoseparano in base al in base al peso peso molecolaremolecolare..

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PROBLEMA ASSOCIATO ALLPROBLEMA ASSOCIATO ALL’’ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE:ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE:

Gel 2D possono essere usati per separare >1000 bande/spot, mentrGel 2D possono essere usati per separare >1000 bande/spot, mentre le cellule e le cellule esprimono da 1000 a 10000 proteine diverse.esprimono da 1000 a 10000 proteine diverse.

APPROCCI PER MIGLIORARE LA SEPARAZIONE DELLE PROTEINE:APPROCCI PER MIGLIORARE LA SEPARAZIONE DELLE PROTEINE:

Separazione in base alle differenti solubilitSeparazione in base alle differenti solubilitàà o compartimentazione o compartimentazione delle proteinedelle proteine

Intervallo piIntervallo piùù stretto delle IPG stretto delle IPG stripsstrips per focalizzare un particolare per focalizzare un particolare intervallo di intervallo di pIpI

Le IPG Le IPG stripsstrips ((ImmobylineImmobyline PolyacrilamidePolyacrilamide Gel Gel stripsstrips) sono strisce di gel di ) sono strisce di gel di acrilamide con gradiente fisso di pH.acrilamide con gradiente fisso di pH.

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ZOOMINGZOOMINGUsare strip IPG ad Usare strip IPG ad intevallointevallo ristretto, in modo da focalizzare un particolare ristretto, in modo da focalizzare un particolare intervallo di intervallo di pIpI..

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Proteomica

Lo studio del genoma (Lo studio del genoma (genomicagenomica) o della trascrizione genica non ) o della trascrizione genica non èè sufficiente sufficiente per descrivere le differenze che possono esistere fra una cellulper descrivere le differenze che possono esistere fra una cellula ed una ed un’’altra.altra.

GenomaGenoma

Molti hanno varianti di Molti hanno varianti di splicingsplicing,,

molti subiscono modificazioni extramolti subiscono modificazioni extra--chimiche chimiche che alterano la loro funzione,che alterano la loro funzione,

molti subiscono tagli proteolitici,molti subiscono tagli proteolitici,

molti devono essere trasportati a localizzazioni molti devono essere trasportati a localizzazioni specifiche per avere una competenza specifiche per avere una competenza funzionale;funzionale;

35000 geni35000 geni

éé pipiùù utile studiare lutile studiare l’’insieme delle proteine contenute in una cellula (insieme delle proteine contenute in una cellula (proteomaproteoma),),

la la proteomicaproteomica èè ll’’analisi diretta del analisi diretta del proteomaproteoma, cio, cioèè la misura della presenza di la misura della presenza di proteine in una cellula e della loro abbondanza relativa.proteine in una cellula e della loro abbondanza relativa.

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Proteomica

PerchPerchèè studiare la studiare la ProteomicaProteomica??

Per comprendere meglio lPer comprendere meglio l’’espressione e la formazione delle proteine:espressione e la formazione delle proteine:

controllo controllo trascrizionaletrascrizionale,,

controllo controllo postpost--trascrizionaletrascrizionale ((splicingsplicing alternativo, editing alternativo, editing delldell’’RNA),RNA),

controllo controllo traduzionaletraduzionale e della degradazione,e della degradazione,

controllo delle modificazioni controllo delle modificazioni postpost--traduzionalitraduzionali (fosforilazione, (fosforilazione, glicosilazioneglicosilazione, attacco di lipidi, taglio , attacco di lipidi, taglio peptidico):peptidico):

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Proteomica

Il Il proteomaproteoma cambia la sua composizione in seguito a diversi stimoli, che cambia la sua composizione in seguito a diversi stimoli, che agiscono a diversi livelli:agiscono a diversi livelli:

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Espressione Proteica Differenziale

Attraverso lAttraverso l’’elettroforesi bidimensionale elettroforesi bidimensionale èè possibile confrontare il possibile confrontare il proteomaproteoma di di una cellula in seguito ad un trattamento:una cellula in seguito ad un trattamento:

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Analisi dell’Immagine

II gel bidimensionali possono essere gel bidimensionali possono essere acquisiti mediante scanner e camere digitali acquisiti mediante scanner e camere digitali e le proteine ottenute analizzate tramite e le proteine ottenute analizzate tramite software specializzati (software specializzati (ImageMasterImageMaster, Melanie , Melanie III, III, PDQuestPDQuest).).

Le funzioni del software:Le funzioni del software:

•• quantificazione,quantificazione,•• identificazione,identificazione,•• allineamento,allineamento,•• confronto,confronto,•• corrispondenza fra due bande.corrispondenza fra due bande.

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Identificazione di una Proteina

Una volta identificato uno spot dUna volta identificato uno spot d’’interesse in una mappa bidimensionale, interesse in una mappa bidimensionale, èè possibile risalire a quale proteina corrisponde.possibile risalire a quale proteina corrisponde.

LL’’identificazione richiede normalmente lidentificazione richiede normalmente l’’analisi mediante analisi mediante spettrometria di spettrometria di massa (MS)massa (MS) e ricerca su database della proteina corrispondentee ricerca su database della proteina corrispondente.

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Principio della Spettrometria di Massa

Si puSi può ò separare una miscela di ioni in funzione del loro rapporto massaseparare una miscela di ioni in funzione del loro rapporto massa/carica /carica (generalmente tramite campi magnetici),(generalmente tramite campi magnetici),

tale miscela tale miscela èè ottenuta ionizzando le molecole del campione, principalmente faottenuta ionizzando le molecole del campione, principalmente facendo cendo loro attraversare un fascio di elettroni ad energia nota,loro attraversare un fascio di elettroni ad energia nota,

le molecole cosle molecole cosìì ionizzate sono instabili e si frammentano in ioni piionizzate sono instabili e si frammentano in ioni piùù leggeri secondo leggeri secondo schemi tipici in funzione della loro struttura chimica;schemi tipici in funzione della loro struttura chimica;

il diagramma che si ottiene, cioil diagramma che si ottiene, cioèè la la separazioneseparazione degli ioni in base al rapporto degli ioni in base al rapporto massa/carica (m/z), massa/carica (m/z), èè il cosiddetto il cosiddetto spettro di massaspettro di massa, tipico di ogni , tipico di ogni composto in quanto direttamente correlato alla sua struttura chicomposto in quanto direttamente correlato alla sua struttura chimica ed alle mica ed alle condizioni di ionizzazione cui condizioni di ionizzazione cui èè stato sottoposto.stato sottoposto.

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LL’’identificazione di uno spot richiede la digestione con enzimi pridentificazione di uno spot richiede la digestione con enzimi proteolitici (tripsina) oteolitici (tripsina) che generano frammenti della proteina che si vuole identificare.che generano frammenti della proteina che si vuole identificare.

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La digestione con tripsina della banda estratta dal gel bidimensLa digestione con tripsina della banda estratta dal gel bidimensionale permette di ionale permette di ottenere unottenere un’’impronta (impronta (fingerprinterfingerprinter), caratteristica ed unica per ogni proteina. ), caratteristica ed unica per ogni proteina.

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Spettrometria di Massa

Per separare i frammenti generati dalla digestione con tripsina Per separare i frammenti generati dalla digestione con tripsina si utilizza la si utilizza la spettrometria di massaspettrometria di massa (MS).(MS).Gli spettrometri di massa permettono di misurare accuratamente lGli spettrometri di massa permettono di misurare accuratamente la massa della a massa della maggior parte delle molecole che possono essere ionizzate in fasmaggior parte delle molecole che possono essere ionizzate in fase gassosa.e gassosa.

La La sorgente di ionisorgente di ioni permette di convertire permette di convertire le molecole in ioni in le molecole in ioni in fase gassosafase gassosa

LL’’analizzatore di massaanalizzatore di massa permette di separare gli permette di separare gli ioni in base al rapporto ioni in base al rapporto massa/carica (m/z)massa/carica (m/z)

Il detector Il detector èè un un moltimolti-- plicatore di elettroniplicatore di elettroni che che permette di identificare i permette di identificare i frammentiframmenti

Gli Gli spettrispettri ottenuti ottenuti indicano lindicano l’’intensitintensitàà degli ioni rispetto al degli ioni rispetto al rapporto m/zrapporto m/z

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MALDI-TOF

Una variante della spettrometria di massa applicabile allUna variante della spettrometria di massa applicabile all’’identificazione di frammenti identificazione di frammenti proteici proteici èè la la MALDIMALDI--TOF MSTOF MS ((MALDI = MALDI = desorbimentodesorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice)./ionizzazione laser assistito da matrice).

I peptidi I peptidi tripticitriptici vengono vengono coco-- cristallizaticristallizati con la cosiddetta con la cosiddetta matricematrice su un supporto in su un supporto in acciaio.acciaio.Il supporto con la matrice Il supporto con la matrice viene irradiato da un laser a viene irradiato da un laser a 337nm.337nm.La matrice con il peptide La matrice con il peptide incluso viene vaporizzato.incluso viene vaporizzato.I peptidi nello stato gassoso I peptidi nello stato gassoso vengono vengono protonatiprotonati ed entrano ed entrano nella nella MSMS..

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Principio della MALDI-TOF

La tecnica consiste nell'La tecnica consiste nell'assorbirassorbire il campione su di una matrice organica (es. e il campione su di una matrice organica (es. glicerologlicerolo, , acido succinicoacido succinico ecc.) e, portata in ecc.) e, portata in soluzionesoluzione, nel bombardarla , nel bombardarla successivamentesuccessivamente con un fascio con un fascio laserlaser (spesso un laser ad (spesso un laser ad azotoazoto). ).

La matrice deve possedere determinate caratteristiche chimicoLa matrice deve possedere determinate caratteristiche chimico--fisiche: fisiche:

1) essere facilmente evaporabile, 1) essere facilmente evaporabile,

2) avere un certo carattere 2) avere un certo carattere acidoacido, in modo da fungere da fonte di , in modo da fungere da fonte di protoniprotoni incoraggiando la ionizzazione dell'incoraggiando la ionizzazione dell'analitaanalita, ,

3) possedere un forte 3) possedere un forte assorbimentoassorbimento ottico nella regione ottico nella regione UVUV tale che le permetta di tale che le permetta di assorbire la radiazione laser in modo efficiente, assorbire la radiazione laser in modo efficiente,

4) possedere gruppi polari ed essere idrosolubile.4) possedere gruppi polari ed essere idrosolubile.

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La matrice La matrice èè formata da piccole molecole organiche che, aggiunte allformata da piccole molecole organiche che, aggiunte all’’analitaanalita, evita la , evita la fotodissociazionefotodissociazione dei campioni indotti dalldei campioni indotti dall’’irradiazione laser diretta.irradiazione laser diretta.

Queste molecole, in grado di assorbire la luce del laser utilizzQueste molecole, in grado di assorbire la luce del laser utilizzato, sono mescolate ato, sono mescolate con i campioni e lasciati asciugare in modo da formare un supporcon i campioni e lasciati asciugare in modo da formare un supporto cristallino su un to cristallino su un supporto di acciaio.supporto di acciaio.

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Tramite il Tramite il desorbimentodesorbimento, il campione viene rilasciato in forma ", il campione viene rilasciato in forma "clusterizzataclusterizzata", ovvero ", ovvero complessato con la matrice,complessato con la matrice,

l'l'analitaanalita viene ionizzato e vaporizzato; viene ionizzato e vaporizzato;

vengono cosvengono cosìì ottenuti ioni generalmente a singola carica. ottenuti ioni generalmente a singola carica.

Molto spesso la tecnica MALDI viene abbinata a Molto spesso la tecnica MALDI viene abbinata a spettrometrispettrometri dotati di analizzatore a dotati di analizzatore a tempo di volo (tempo di volo (TimeTime ofof flight, flight, TOFTOF).).

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Gli ioni del campione ottenuti con il MALDI vengono dirottati inGli ioni del campione ottenuti con il MALDI vengono dirottati in un tubo (un tubo (tubotubo di di volovolo) a cui viene applicato il vuoto e accelerati con un campo elett) a cui viene applicato il vuoto e accelerati con un campo elettrico ad alto rico ad alto voltaggio fino al detector, che registrervoltaggio fino al detector, che registreràà il il ““tempo di volotempo di volo”” ((timetime--ofof--flightflight), cio), cioèè il il tempo che impiegheranno per attraversare il campo.tempo che impiegheranno per attraversare il campo.

Frammenti piFrammenti piùù piccoli avranno tempi di percorrenza pipiccoli avranno tempi di percorrenza piùù brevi, mentre frammenti pibrevi, mentre frammenti piùù grandi impiegheranno pigrandi impiegheranno piùù tempo per attraversare il tubo. Attraverso il tempo di tempo per attraversare il tubo. Attraverso il tempo di percorrenza sarpercorrenza saràà possibile risalire al rapporto m/z del frammento.possibile risalire al rapporto m/z del frammento.

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Per aumentare la risoluzione dei picchi ottenuti con il MALDIPer aumentare la risoluzione dei picchi ottenuti con il MALDI--TOF TOF èè possibile usare possibile usare un un reflettorereflettore, che si comporta da specchio di ioni., che si comporta da specchio di ioni.

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Robotica

MALDI-TOF

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MALDI-TOF

StrumentazioneStrumentazione

RaccoltaRaccolta degli degli spotspotDigestioneDigestione

MALDIMALDI--TOFTOF

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Gli Usi della MALDI-TOF

Questa tecnica Questa tecnica èè indicata per l'analisi di composti termolabili e ad alto indicata per l'analisi di composti termolabili e ad alto peso peso molecolaremolecolare, ad es. , ad es. biopolimeribiopolimeri quali:quali:

proteineproteine, , ppeptidieptidi, , zzuccheriuccheri;;esse sono molecole particolarmente fragili e soggette a distruziesse sono molecole particolarmente fragili e soggette a distruzione troppo rapida con one troppo rapida con

le tecniche di ionizzazione convenzionali. le tecniche di ionizzazione convenzionali.

La MALDILa MALDI--TOF viene comunemente utilizzata anche per la caratterizzazione TOF viene comunemente utilizzata anche per la caratterizzazione dei dei farmacifarmaci..

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Analisi del Profilo dell’Espressione Proteica

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MultiplexedMultiplexed ProteomicsProteomics (MP)(MP)

La La glicosilazioneglicosilazione delle proteine delle proteine èè sempre pisempre piùù riconosciuta come una delle piriconosciuta come una delle piùù importanti alterazioni biochimiche associate alla trasformazioneimportanti alterazioni biochimiche associate alla trasformazione maligna.maligna.

La La ProteomicaProteomica MultiplexedMultiplexed (MP) (MP) èè una nuova tecnologia che permette di rilevare e una nuova tecnologia che permette di rilevare e quantificare, con tecniche fluorescenti, le variazioni dei livelquantificare, con tecniche fluorescenti, le variazioni dei livelli di li di glicosilazioneglicosilazione delle proteine, sia nel gel bidimensionale (2delle proteine, sia nel gel bidimensionale (2--D), sia nel D), sia nel Western Western blottingblotting. .

Queste nuove informazioni permettono quindi di affrontare questiQueste nuove informazioni permettono quindi di affrontare questioni fondamentali oni fondamentali come quelle riguardanti lo studio dei tumori. come quelle riguardanti lo studio dei tumori.

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MultiplexedMultiplexed ProteomicsProteomics (MP)(MP)

Presentazione di PowerPoint - UniTE

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