Pneumocistosi

Prof. Guglielmo Gargani

Dr. Gabriella PiniDipartimento di Sanità Pubblica

sez. Microbiologia

Università degli Studi di Firenze

Corso di Perfezionamento

NUOVI SVILUPPI NELLA DIAGNOSTICA MICROBIOLOGICA E VIROLOGICA (II edizione)

3° modulo: Micologia e Parassitologia

5-6 Novembre 2004

Pneumocystis carinii : La storia

1909 Chagas In polmoni umani e di cavia un tripanosoma

1910 Carini In polmoni ratti

1912 Delanoe e Delanoe

Non è un tripanosoma Pneumocystis carinii

1951 Vanek, Jirovec, Lukes

Polmonite a plasmacellule

Attuale posizione tassonomica

• Phylum Ascomycota

• Classe Archiascomycetes

• Ordine Pneumocystidales

• Famiglia Pneumocystudiaceae

• Genere Pneumocystis

• Specie Pn carinii (ratto) Pn jiroveci (uomo)

Ciclo vitale

• Trofozoita ameboide negli alveoli con filopodi

• Moltiplicazione per scissione binaria• Cellule aploidi che evolvono in

sporoblasti• Sporoblasti o cisti producono all’interno

8 sporozoiti • Sporozoiti si liberano e ricomincia il ciclo

Ciclo Vitale

Mayor Surface Glicoprotein(MSG)

• P.m. 95-160 kDa

Nucleo centraleproteico

Catene laterali carboidrati azotati

glucosio mannosio

n-acetil glicosamina

Determinanti Antigeni Special form

Adesione agli pneumociti

“Special form”

• carinii• rattus• muris • equi• harictologi• mustelae• suis• homini o Pn.jiroveci

• ratto• ratto• topo• cavallo• coniglio• furetto• maiale• uomo

Classi di eterogeneità

Fra special form da specie animali diverse

Fra special form della stessa specie animale

Fra ceppi della stessa specie animale

Pneumocystis organisms :

Pneumocistosi

• A partire dal 1920 compare in bambini istituzionalizzati in Europa occidentale.

• Dopo la II guerra mondiale è nei bambini denutriti in Europa orientale e M.O.

• Dopo gli anni ‘50 in immunodepressi

• Dopo il 1985 è causa frequente di morte in HIV positivi

Human Pneumocysti

s Infection

Dei-Cas E, 2000, Med Mycol 38

Forme clinico-epidemiologiche

• Infezione asintomatica o non diagnosticata• Forma epidemica :dispnea progressiva,

cianosi, perdita di peso diarrea. Febbre e tosse possono mancare

• Forma sporadica in immunodepressi: prevalentemente polmonare

altre localizzazioni possibili

Potential implication of Pneumocystis in SIDS

• PneumocystisPneumocystis cysts were detected in lungs from : cysts were detected in lungs from :

– 31% of 134 cases of Sudden Infant Death Syndrome (SIDS) in Chile

– 15% of 27 SIDS patients in Oxford (UK)

– 3% of 342 infants deceased from other

causes Vargas et al, Clin Infect Dis

1999

Polmonite da P. jiroveci Sintomatologia

Dispnea, tosse non produttiva Cianosi, febbre Reperti radiologici infiltrati polmonari

Evololuzione più rapida in HIV positivi

Immagini radiologiche

Infiltrati interstizio-alveoloari prevalentemte nei lobi inferiori

Possibile reperto negativo fino a poche ore prima dell’exitus

Polmonite da P. jiroveci

Polmonite da P. jiroveci

• Polmonite interstiziale plasmacellulare

• Ispessimento spazi interalveolari

• Alveoli ripieni di sostanza amorfa con ammassi di parassiti

Polmone in pneumocistosi

Le frecce indicano zone confluenti grigio pallido

Cisti negli spazi alveolari

Pneumocistosi

Pneumocystis carinii

Corpi intracistici

P.jiroveci: cisti al microscopio elettronico a trasmissione. Sono visibili corpi intracistici e una spessa parete

Altri fattori di rischio

• Tutte le emopatie

• Tumori solidi

• Adenocarcinoma mammario

• Tumori cerebrali• Immunosoppressione per trapianti

Tipologia di campioni clinici

Materiale

Biopsia aperta del polmone

Biopsia transbronchiale

Lavaggio broncoalveolare (BAL)

Sputo indotto (IS)

Risciacquo orale (OW)

Brushing orale

Sensibilità tecniche di colorazione

>95%

>90%

50-95%

50-85%

Bassa

Bassa

PneumocistosiDiagnostica di Laboratorio

Nebulized saline inhaled by patient to promote deep cough Inexpensive; noninvasive Specimen processing more complex, may delay diagnosis of another pathogen Less sensitive

More expensive, more invasive, risk of periprocedural sedation, requires skilled personnel Larger samples can be sent for staining and can be used to diagnose other infections (bacterial, fungal, viral and mycobacterial cultures) Saline instilled through bronchoscope wedged in airway and fluid withdrawn To 95 percent sensitive

Induced sputum Bronchoalveolar lavage

Esame diretto

Colorazione metenamina-nitrato di argento Gomori- Groccot Colora l’involucro della cisti in nero su fondo verde

Blu di toluidina Colora selettivamente l’involucro della cisti

Colorazione di Giemsa o sua variante rapida Colora sia cisti che trofozoiti nucleo porpora, citoplasma blu (non colora la parete cistica)

                                                    

P.carinii: Con alto ingrandimento sono visibili le cisti di 5-8μm di diametro. L’involucro delle cisti è colorato in nero, i corpi intracistici non sono visibili. Biopsia aperta del polmone.

Impregnazione argentica secondo Gomori (GMS)

P.carinii: sedimento di BAL colorato con metenamina-argento (GMS) che colora l’involucro cistico. Sono visibili cisti rotonde, ovali o piatte di circa 4-5 µm di diametro

Tutti i fungi hanno la stessa affinità per metenamina-argento e possono essere confusi con le cisti di P.carinii. Cryptococcus neoformans in un campione di BAL (GMS).

Colorazione con blu di toluidina

Trofozoiti di P. jiroveci in BAL. Giemsa. I trofozoiti sono piccoli (1-5 µm) e solo i loro nuclei, colorati in porpora , sono visibili (frecce).

P.carinii: Sono visibili cisti (approx. 5-8 µm di diametro) con corpi intracistici, le cisti mature ne contengono 8. Alcune cisti appaiono vuote. Colorazione di Giemsa.

Fungi-Fluor non colora specificamente P. carinii (Colora chitina e cellulosa). Le cisti appaiono in clusters circondati da essudato

schiumoso, il background di fondo interferisce con la chiarezza dell’immagine

Campione di BAL,

colorazione Fungi-Fluor Kit

Polysciences Europe,

Germany (400X)

                                                    

cisti che mostrano le strutture caratteristiche a doppia parentesi o virgola

Esame diretto

Immunoflurescenza con anticorpi monoclonali (contro ag di superficie,

forma cistica e trofozoite) aumento sensibilità

Kit commerciali MonoFluo kit pneumocystis Bio-Rad laboratories

MeriFluor pneumocystis kit Meridian Bioscience Europe

Light diagnostics Pneumocystis carinii DFA Chemicon USA

Immunoflurescenza diretta con anticorpi monoclonaliMeriFluor Pneumocystis kit Meridian Bioscience Europe

                                                        

Light diagnostics Pneumocystis carinii DFA, Chemicon USA Immunoflurescenza diretta con anticorpi monoclonali

Immunofluorescenza indiretta con ac monoclonali

MonoFluo kit pneumocystis Bio-Rad laboratories

are less expensive

require less technical expertise and quipment

may allow the identification of other pathogens on the specimen

clearly differentiate the P. carinii organismmay be more sensitive, particularly in specimens with low numbers of organisms false positives are a problem associated with using the monoclonal antibody stains.

TRADITIONAL STAINS MONOCLONAL ANTIBODY STAINS

Esame colturale

Non utilizzabile per la diagnosi di pneumocistosi

ELISA con ac policlonali su Siero Sensibilità 210ng ag (McNabb, 1988) Immunoblotting con ac monoclonali (2G2) su BAL Aumento della sensibilità (Sethi, 1990)

Metodi non utilizzati a scopo diagnostico

Pneumocystis non si sviluppa in sistemi di coltura continua in vitro

Ricerca di anticorpi

Ricerca di antigeni

Metodi biomolecolari

Gene targets Single copy genes       Dihydropteroate synthase (DHPS)      Tymidylate synthase (TS)      Internal trscribed spacer (ITS)      5S rRNA      18S rRNA Multicopy genes Mitochondrial large subunit rRNA (mt LSU rRNA)  Mitochondrial small subunit rRNA (mt sSU rRNA)  Major surface glycoprotein (MSG)

Scopo: aumentare la resa diagnostica dei campioni clinici meno invasivi (sputo indotto, lavaggio orale….)

1. Wakefield AE, Pixley FJ, Banerji S, Sinclair K, Miller RF, Moxon ER, Hopkin JM. Amplification of mitochondrial ribosomal RNA sequences from Pneumocystis carinii of rat and human origin. Mol Biochem Parasitol 1990;43:69-76.

2. Lu JJ, Chen CH, Bartlett MS, Smith JW, Lee CH. Comparison of six different PCR methods for detection of Pneumocystis carinii. J Clin Microbiol 1995;33:2785-2788.  

Lane S: Standard dei pesi molecolari Lane 1: PCR a singolo step con primer pAZ102-E/pAZ102-H, banda di amplificato di 346bp (Wakefield, 1990)

Lane 2: nested PCR con ITS primer 1724F/ITS2R per il primo step ITS1F/ITS2R1 per il secondo step, banda di amplificato di 550bp. (Lu, 1995)

Metodi biomolecolari Significatività della ricerca del DNA nel BAL mediante

PCR

PCP clinicamente

evidente

Assenza di segni clinici evidenti

HIV- HIV+

Valore altamente predittivo

Non predittivo (17% positivi con nested PCR senza sviluppo della malattia, Sing 2000)

Semplice colonizzazione o fase precoce di malattia? Consigliato un attento monitoraggio

Metodi biomolecolariSensibilità delle metodiche di ricerca del DNA con PCR su

altri campioni clinici

IS Maggiore rispetto ai metodi di microscopia classica (Wakefield 1990, >95% con mt LS rRNA primers)

OW Maggiore rispetto ai metodi di microscopia classica (Wakefield 1990, 56-78%. Fischer 2001, 91% con MSG

primers) Bassa se la colonizzazione polmonare è scarsa (Matos, 2001)

Siero Risultati contraddittori con sensibilità da 0 a 100%

Kit Commerciale per PCR

PNEUMO KIT (AB Analitica)

Kit completo per

Estrazione del DNA da BAL, altri campioni respiratori o tessuti fissati e inclusi in paraffina

Amplificazione (Gene target: rRNA 5S)

Elettroforesi su gel di agarosio: amplificato di 120pb

Controllo interno di amplificabilità (β-globina)

Controllo positivo

M-PCR Kit Maxim Biotech San Francisco USALane M: Standard dei pesi molecolari

Lane 1: Controllo negativo

Lane 2: controllo positivo

Lane 3: Clamydia pneumoniae

Lane 4: Mycoplasma pneumoniae

Lane 5: Pneumocystis carinii

Lane 6: Legionella pneumophyla

Multiplex-PCR

Quantitative Touch-Down Real Time PCR MSG primers

Campioni OW

cut-off a 50 copie DNA per tubo distingue fra infezione e colonizzazione (Larsen 2004) Campioni BAL

cut-off a 103 copie DNA per tubo distingue portatori da pazienti con PCP

(Flori 2004)

Sonde FRET

Metodi biomolecolari

Vantaggi

Aumento della sensibilità

Elevata specificità

Utile per i pazienti che non possono sopportare procedure invasive

Svantaggi

Stadio sperimentale

Mancanza di metodi standard riconosciuti a livello internazionale

Possibili risultati positivi di difficile interpretazione

Metodi di biologia molecolare scopi epidemiologici

Ritrovamento di DNA di P.carinii nelle stanze di pazienti infetti e nell’ambiente esterno ciclo vitale al di fuori dell’ospite?

Studi di tipizzazione genomica

Esiste un genotipo prevalente Diversa virulenza dei genotipi?

E’ possibile la coinfezione con diversi genotipi

Recidiva entro tre mesi Stesso genotipo

Recidiva dopo più di sei mesi Genotipo diverso

Epidemiologia delle infezioni da P. jiroveci

Distribuzione territorialmente differenziata degli stipiti

Stipiti isolati dai pazienti:

Non corrispondono al genotipo prevalente nella regione di nascita

Corrispondono al genotipo prevalente nella regione dove si è manifestata la malattia

Evaluating Pneumocystis airborne transmissibility between hosts with PcP, carriers and susceptible hosts

?

•Pneumocystis DNA was detected in healthcare contacts of PcP patients

Vargas et al, 2000, JCM 38 - 8; Miller et al, 2001, JCM 39

?