Microbiologia Clinica e

Laboratorio Docente :Docente : Dott.ssa Mariateresa Vitiello

Dipartimento di Medicina Sperimentale Sez. Microbiologia e Microbiologia ClinicaSeconda Università degli Studi di Napoli

Facoltà di Medicina e ChirurgiaE-mail: mteresa.vitiello@unina2.it

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Temi cardine del programma

1. Lo sviluppo della microbiologia come scienza.

2. Modalità di interazione tra microrganismi e ambiente.

3. La natura e l’importanza delle tecniche adottate per isolare, coltivare, osservare e identificare i microrganismi.

4. Le principali tecniche batteriologiche e parassitologiche.

5. I più frequenti batteri e parassiti agenti eziologici di malattie

Programma d’esame• Rapporti ospite-parassita: saprofitismo, patogenicità, virulenza, opportunismo, fonti e

serbatoi, veicoli e vettori di microrganismi, modalità di trasmissione e vie di ingresso, colonizzazione batterica, micetica, protozoaria e virale

• Flora microbica normalmente residente nei vari distretti corporei

• Principi di diagnostica microbiologica: procedure di raccolta, conservazione, trasporto e trattamento dei campioni. Metodi di diagnosi diretta ed indiretta

• Diagnostica batterica: esame microscopico, colturale, sierologico diretto, saggi di sensibilità agli antibiotici, reazioni Ag-Ab “in vitro”, tecniche di diagnostica molecolare per analizzare DNA ed RNA (PCR, ibridazione molecolare con sonde marcate, dot blot)

• I principali batteri responsabili di malattie: Enterobatteri, Stafilococchi, Streptococchi, Brucelle, Pasteurelle, Treponemi, Micobatteri

• Diagnostica parassitologica: tecniche colturali e substrati utilizzati in parassitologia (caratteristiche e differenze per scelta d’impiego), metodiche per identificazione da campioni biologici (esame diretto ed esame attraverso coltura), tecniche di preparazione vetrini, coloranti per la parassitologia, tecniche d’identificazione: metodologia classica

• I principali parassiti responsabili di malattie: Toxoplasma, Plasmodi, Cestodi

INTRODUZIONE ALLA INTRODUZIONE ALLA MICROBIOLOGIAMICROBIOLOGIA

Storia e scopo della Storia e scopo della MicrobiologiaMicrobiologia

DefinizioneDefinizione

La Microbiologia è la scienza che studia La Microbiologia è la scienza che studia i microrganismi e la loro attività.i microrganismi e la loro attività.

Ha per oggetto la forma, la struttura, la Ha per oggetto la forma, la struttura, la riproduzione, la fisiologia, il riproduzione, la fisiologia, il metabolismo e l’identificazione dei metabolismo e l’identificazione dei microrganismi.microrganismi.

Dimensioni dei batteri e dei Dimensioni dei batteri e dei virusvirus

Koneman et al. Color Atlas and Textbook of Microbiology 5th Ed. 1997

Dimensioni dei microrganismi

DefinizioneDefinizione

Comprende lo studio della loro Comprende lo studio della loro distribuzione in natura, delle relazioni distribuzione in natura, delle relazioni tra loro e con gli altri esseri viventi, tra loro e con gli altri esseri viventi, degli effetti benefici e dannosi che degli effetti benefici e dannosi che hanno sugli esseri umani, delle hanno sugli esseri umani, delle modificazioni fisiche e chimiche che modificazioni fisiche e chimiche che provocano nel loro ambiente.provocano nel loro ambiente.

Settori della MicrobiologiaSettori della Microbiologia

• BATTERIOLOGIA• PROTOZOOLOGIA

(Parassitologia)• MICOLOGIA• ALGOLOGIA• VIROLOGIA

Membri del mondo microbico

• Cellule procariotiche sono prive di un nucleo delimitato da una membrana (batteri)

• Cellule eucariotiche possiedono un nucleo racchiuso da una membrana, sono morfologicamente più complesse e generalmente più grandi delle cellule procariotiche (alghe, protozoi e miceti)

Eukaryotic cell Prokaryotic cell

Gram +

Gram -

Cell wallRough endoplasmic reticulum

Mitochondria

(e.g. animal)

Nucleoid

Nucleus

Cell membrane

Cytoplasm

Flagellum

Cell (inner) membrane Outer membrane

Ribosomes

Granule

Cell wall

Capsule

Pili

Differenze tra cellula procariotica ed Differenze tra cellula procariotica ed eucarioticaeucariotica

Tipi di Classificazione

• Schema a cinque regni comprendente Monera, Protista, Fungi, Animalia e Plantae. I microbi si trovano nei primi tre regni

• Schema a tre regni, basato sul confronto dell’RNA ribosomale. Classifica i microrganismi in Bacteria (batteri veri), Archaea e Eucarya (eucarioti)

Regno degli Archaea – tutti procarioti

• Procariotici• Si distinguono dai Bacteria per sequenze

ribosomali caratteristiche• Non contengono peptidoglicano nella parete• Molti si trovano in ambienti estremi

Includono:– Metanogeni– Alofili estremi– Termofili estremi

• Non si conoscono specie patogene

Regno Eucarya – tutti eucarioti

• animali, piante e microrganismi eucarioti– I microrganismi comprendono i protisti (alghe unicellulari,

protozoi, muffe) e funghi – La maggior parte sono più grandi delle cellule procariotiche

Fungi Protozoa Algae

Parassiti animali pluricellulari

Regno dei Bacteria – tutti procarioti

• La maggior parte è costituita da singole cellule• La maggior parte contiene peptidoglicano nella

parete• Possono sopravvivere in una infinità di ambienti • La maggior parte non sono patogeni ed hanno

un ruolo fondamentale nel riciclo dei nutrienti

BATTERIBATTERI

FormaSferica (cocchi)

Cilindrica/bastoncellare (bacilli)

Curvata (vibrioni, spirilli)CELLULA BATTERICACELLULA BATTERICA

STRUTTURESTRUTTURE FUNZIONEFUNZIONE

Involucro• Capsula• Parete cellulare• Membrana citoplasmatica

Aderenza, ostacola la fagocitosiProtezione, rapporto ospite parassitaScambi osmotici, secrezione, meccanismi energetici

Citoplasma• Mesosomi

• Ribosomi

Metabolismo generaleDivisione cellulare,secrezione di esoenzimi,fosforilazione ossidativaSintesi proteica

Sostanza nucleare (nucleo)

genetica

Strutture accessorie• Flagelli• Ciglia• Pili o fimbrie• Spore (cellule dormienti)

Mobilità Movimenti ondulatoriAderenza, trasferimenti geneticiSopravvivenza a condizioni avverse

COMPONENTI STRUTTURALI COMPONENTI STRUTTURALI DEI BATTERIDEI BATTERI

Peptidoglicano

CromosomaMesosom

a

Ribosomi

CapsulaSpazio periplasmatico

Flagello

Citoplasma

Membrana esterna

Membrana citoplasmatica

interna

Corpo basale

pilo

Granulo intracitoplasmatico

pilo

Cocchi e bacilli

Spirilli

Forma: cocchi (in colonie), diplococchi, streptococchi, spirilli, vibrioni, bacilli (isolati), spirochete.

Caratteristiche della parete cellulare: Gram-positivi o Gram-negativi

Gram: Speciale colorazione inventata dall'omonimo scienziato, che permette di dividere in due grandi tronconi i batteri, i Gram + e i Gram -, in base alla composizione della parete batterica.

COCCHICOCCHI

BACILLIBACILLI

SPIRILLISPIRILLI

ESEMPIESEMPI

STREPTOCOCCHISTREPTOCOCCHI

STAFILOCOCCHISTAFILOCOCCHI

MORFOLOGIA BATTERICAMORFOLOGIA BATTERICA

ENTEROBATTERIENTEROBATTERI

TREPONEMA PALLIDUMTREPONEMA PALLIDUM

VIBRIO CHOLERAEVIBRIO CHOLERAE

MORFOLOGIA BATTERICAMORFOLOGIA BATTERICA

MORFOLOGIA BATTERICA (COCCHI)MORFOLOGIA BATTERICA (COCCHI)

COCCHI COCCHI SINGOLISINGOLI

DIPLOCOCCHDIPLOCOCCHII

TETRADITETRADI

SARCINESARCINE

STREPTOCOCCHISTREPTOCOCCHI

STAFILOCOCCHSTAFILOCOCCHII

MORFOLOGIA BATTERICA (BACILLI)MORFOLOGIA BATTERICA (BACILLI)

BACILLIBACILLI

COCCOBACILLICOCCOBACILLI

DIPLOBACILLIDIPLOBACILLI

STREPTOBACILLISTREPTOBACILLI

Nomenclatura e classificazione dei microrganismi

• Linneo (Linnaeus) stabilì il metodo della nomenclatura binomiale nel sistema di classificazione delle piante e degli animali.

• A ciascun organismo sono attribuiti due nomi (in origine in latino): il primo si riferisce al GENERE di appartenenza dell'organismo stesso ed è uguale per tutte le specie che condividono alcuni caratteri principali; il secondo termine, che è spesso descrittivo, designa la SPECIE propriamente detta.

• Staphylococcus aureus– Descrive la distribuzione a grappolo

dal greco [stafule]: grappolo e [coccos]: (bacca, acino d'uva) ed il colore dorato delle colonie.

Nomi scientifici

• Escherichia coli– Rende omaggio allo scienziato che lo

ha scoperto, Theodor Eshcerich, e descrive l’habitat del batterio, il colon.

Nomi scientifici

Ruolo dei Microrganismi nelle malattie

• Non era poi così ovvio

• Stabilire una connessione dipendeva dallo sviluppo di tecniche per lo studio dei microbi

• Una volta stabilito, ha permesso lo studio delle difese dell’ospite - l’immunologia

L’età dell’oro della Microbiologia (1857-1914)

• Sono stati identificati molti organismi che producono malattie

• È stato intrapreso lo studio del metabolismo microbico

• Sono state raffinate le tecniche microbiologiche

• È stata migliorata la comprensione del ruolo dell’immunità e di come controllare e prevenire le infezioni microbiche

Identificazione delle relazioni tra Microrganismi e malattia

• Agostini Bassi (1773-1856)– Ha mostrato che una malattia dei

bachi da seta era causata da un fungo

Altre evidenze…• Joseph Lister

– Fornisce evidenze indirette che i microrganismi sono agenti causali delle malattie

– Sviluppa una metodologia in chirurgia elaborata per impedire l’ingresso dei microrganismi nelle ferite ed una per il trattamento dei ferri chirurgici e per gli abiti da camera operatoria

– Poche volte i suoi pazienti andavano incontro a infezioni post-operative

Prova finale…

• Robert Koch (1843-1910)

– Stabilisce la relazione fra Bacillus anthracis e antrace

– Usa i criteri sviluppati dal suo maestro Jacob Henle (1809-1895)

– Questi criteri sono oggi noti come i postulati di Koch. Usati ancora oggi per stabilire il legame fra una particolare microrganismo ed una particolare malattia

I postulati di Koch

1.1. L’agente causale deve L’agente causale deve essere presente in tutti i essere presente in tutti i casi della malattia di cui è casi della malattia di cui è ritenuto responsabile e ritenuto responsabile e deve essere invece deve essere invece assente negli individui assente negli individui sani.sani.

2.2. L’agente causale deve L’agente causale deve essere isolato essere isolato dall’individuo affetto e, dall’individuo affetto e, posto in coltura, deve posto in coltura, deve dare origine ad una dare origine ad una popolazione cellulare popolazione cellulare omogenea (una sola omogenea (una sola specie).specie).3.3. L’inoculo di una coltura L’inoculo di una coltura pura dell’agente causale in pura dell’agente causale in individui sani deve dare individui sani deve dare luogo alla comparsa della luogo alla comparsa della malattia di cui si ritiene malattia di cui si ritiene responsabile.responsabile.

4.4. L’agente causale deve L’agente causale deve essere re-isolato essere re-isolato dall’individuo infettato dall’individuo infettato sperimentalmente.sperimentalmente.

Lo sviluppo di tecniche per lo studio dei microrganismi patogeni

• Il lavoro di Koch ha permesso la scoperta o lo sviluppo di:– agar– piastre di petri– nutrient broth e nutrient agar– metodi per isolare i microrganismi

Altri sviluppi…

• Pasteur e Roux– Hanno scoperto che la lunga incubazione di colture

prima del trasferimento nell’ospite provocava nel patogeno la perdita della capacità di provocare la malattia

• Pasteur e collaboratori– Hanno sviluppato il vaccino contro il colera dei polli,

antrace e rabbia

Altri sviluppi…

• Emil von Behring (1854-1917) e Shibasaburo Kitasato (1852-1931)– Hanno sviluppato un’antitossina contro difterite e

tetano– Hanno fornito evidenze di un’immunità umorale

• Elie Metchnikoff (1845-1916)– Ha scoperto le cellule fagocitarie del sangue– Ha fornito evidenze di un’immunità cellulare

Lo sviluppo della Microbiologia industriale e dell’Ecologia microbica

• Louis Pasteur– Ha dimostrato che sia la fermentazione alcolica

che altre fermentazioni erano il risultato di attività microbica

– Ha sviluppato il processo di pastorizzazione per conservare il vino

• 1928: Alexander Fleming scoprì il primo antibiotico.

• Osservò che il fungo Penicillium produceva un antibiotico (la penicillina) in grado di uccidere lo Staphylococcus aureus.

• 1940s: la penicillina fu clinicamente testata ed iniziò la produzione del farmaco

Nascita della moderna chemioterapia

• Quando il patogeno supera la resistenza dell’ospite, si ha la malattia.

• Malattie infettive emergenti (EID):

Nuove malattie e malattie a

maggiore incidenza

Malattie Infettive

• West Nile encefalite– West Nile Virus– Diagnosticata per la prima volta nella

regione del West Nile dell’ Uganda nel lontano 1937.

– Nel 1999 è comparsa nella città di New York.

Malattie Infettive Emergenti

• Ebola febbre emorragica– Virus Ebola– Causa febbre, emorragie e coagulazione

del sangue– Isolato per la prima volta nei pressi del

fiume Ebola, Congo

Malattie Infettive Emergenti

• Hantavirus sindrome polmonare– Hantavirus– Identificato per la prima volta nel 1951 in

Korea come causa di febbre emorragica – Nel 1995 è stata denunciata la comparsa

di una nuova malattia caratterizzata da sintomi respiratori negli U.S.

– Il virus U.S., chiamato virus Hantavirus Sin Nombre, probabilmente è stato diffuso in U.S. tramite i ratti intorno al 1900

Malattie Infettive Emergenti

• Sindrome da Immunodeficienza Acquisita (AIDS)– Human immunodeficiency virus (HIV)– Isolato per la prima volta nel 1981.– Epidemia mondiale infettante 40 milioni di

persone; 14000 nuove infezioni ogni giorno.– Malattia a trasmissione sessuale che si trasmette

sia agli uomini che alle donne.– Negli U.S., le persone interessate dall’HIV/AIDS

hanno un’età compresa tra i 13 e 24 anni: il 44% sono donne ed il 63% sono uomini.

Malattie Infettive Emergenti

• Encefalopatia Bovina Spongiforme

– Prioni

– Inoltre causa la malattia di Creutzfeldt-

Jakob disease (CJD)

– La nuova variante di CJD negli uomini è

correlata al consumo di frattaglie bovine

contaminate.

Malattie Infettive Emergenti

• Escherichia coli O57:H7– Ceppi produttori di tossine di E. coli– Identificati nel 1982– Principale causa di diarrea diffusa in

tutto il mondo.

Malattie Infettive Emergenti

• Streptococcus invasivo di gruppo A– La rapida crescita batterica causa un

esteso danno tissutale.– Incremento dell’incidenza dal 1995

Malattie Infettive Emergenti

• Antrace– Bacillus anthracis– Nel 1877, Koch dimostrava che il B.

anthracis era la causa eziologica dell’antrace.

– Veterinari e agricoltori sono soggetti a rischio di antrace cutaneo.

– Nel 2001, la disseminazione di B. anthracis tramite posta infettava 22 persone.

Malattie Infettive Emergenti

L’importanza dei microrganismi

I microbi possono essere: causa di malattie che colpiscono il

regno vegetale ed animale; causa di degradazione degli

alimenti; essenziali per la vita; necessari per i cicli geochimici e la

fertilizzazione del suolo; utilizzati come biomassa e

produttori di farmaci e molecole per uso industriale.

Ruolo dei microrganismi in Ruolo dei microrganismi in natura e loro utilizzazione da natura e loro utilizzazione da

parte dell’uomoparte dell’uomo Vengono utilizzati come modelli Vengono utilizzati come modelli

sperimentali per lo studio della sperimentali per lo studio della genetica molecolare e della genetica molecolare e della fisiologia cellulare.fisiologia cellulare.

Vengono utilizzati per la Vengono utilizzati per la produzione di sostanze utili produzione di sostanze utili all’uomoall’uomo

Alcuni impiegati come fonti per:•produzione commerciale di antibiotici, farmaci e altre sostanze (vari aminoacidi ed enzimi);

•produzione di acido acetico e aceto;

•fermentazione lattica del lattosio per la produzione di formaggi e yogurt;

•acido lattico usato anche per conservazione di crauti e nelle salamoie acide;

• Biotecnologia, l’uso di microbi per produrre cibi e sostanze chimiche (sfruttamento dei microbi sin dall’antichità).

• L’ingegneria genetica è una tecnica nuova nelle biotecnologie. Attraverso l’ingegneria genetica , i batteri ed i funghi possono produrre una varietà di proteine tra cui i vaccini ed enzimi.

• Nelle cellule umane i geni mancanti o difettivi possono essere sostituiti nella terapia genica.

• Batteri geneticamente modificati vengono utilizzati per proteggere i raccolti dagli insetti e dal congelamento.

Biotecnologie Moderne ed Ingegneria Genetica

• Microbi patogeni per gli insetti sono l’alternativa ai pesticidi chimici in agricoltura e nella trasmissione di infezioni.

• Le infezioni da Bacillus thuringiensis sono letali per alcuni insetti, ma innocue per altri animali, come l’uomo, e per le piante.

Insetticidi Biologici

• I batteri degradano la materia organica dei liquami.

• I batteri degradano o detossificano inquinanti come gli olii ed il mercurio

Bioriparatori

Studio dei batteri di interesse medico

Le nozioni che il biotecnologo dovrebbe possedere per ogni batteriopatogeno sono quelle necessarie a configurarne un modello mentale,completo dei caratteri sufficienti a definirne le caratteristichemorfo-funzionali utili a comprendere il meccanismo dell’azionepatogena, e da utilizzare come base per la comprensione delle tecnichedi identificazione a scopo diagnostico impiegate più correntemente nellaboratorio batteriologico.

OFFRIRE AL PAZIENTE LA PRESTAZIONE MIGLIORE

Inquadrare i diversi batteri in un contesto generale, elaborato supochi dati precisi, dando per scontate le ampie zone di uniformità

morfo-funzionale che accomunano larghi gruppi di batteri

Focalizzare l’attenzione sulle peculiarità checaratterizzano i singoli batteri

Elaborazione del modello del batterio X

Non è necessario imparare a memoria se esso è:-sporigeno o asporigeno- mobile o immobile- se produce esotossine o endotossine- se è aerobio o anaerobio- etc

Morfologia Caratteristiche

Esempio: Il batterio in questione è un cocco

Lo dice il nome: stafilococco, streptococco, etc.

Gram-positivo (tutti i cocchi sono Gram-positivi tranne le Neisserie)

Non produrrà endotossine tipiche (Parete cellulare dei Gram-negativi)e quindi dovrà con ogni probabilità produrre esotossine

Immobili (tutti i cocchi sono immobili tranne alcuni enterococchi)

Asporigeno (le spore sono prodotte solo dai bacilli)

Altro esempio: aerobio o anaerobio?

Tutti i batteri di interesse medicosono aerobi-anaerobi facoltativi

Eccezioni:

- Brucelle: aerobi obbligati

- Clostridi: anaerobi obbligati

Altro esempio: sporigeno o asporigeno?

La maggior parte dei batteri di interessemedico sono asporigeni

Eccezioni:- Bacillus spp- Clostridi

Per sapere in quali terreni cresce un batterio è sufficiente ricordare i batteri che necessitano di terreni arricchiti di

particolari sostanze (ad esempio gli emofili) o di incubazione in condizioni particolari (batteri anaerobi e o microaerofili) e,

quei batteri che non ancora sono stati coltivati in terreni abiotici per ragioni sconosciute (Treponemi) o perché parassiti intracellulari obbligati (Rickettsie, Clamidie)

Apprendimento dei caratteri differenziali

Indiscriminata memorizzazione dei numerosi caratteri comuni

SCHEMA DI STUDIO PER LA BATTERIOLOGIA

• Struttura e caratteri antigenici

• Fattori di virulenza

• Patogenesi e immunità (meccanismi dell’azione patogena e risposte dell’ospite)

• Malattia (sindromi cliniche e fattori predisponenti)

• Diagnostica di laboratorio (microbiologica e sierologica)

• Cenni di terapia e profilassi (terapia di elezione e vaccinazione)