P P = macromolecola con n siti di legame identici e indistinguibili

XX = legante (ioni, piccole molecole,..)

A p= 1 atm, T = costante vi sono n equilibri:

P + X PX⇄

PX + X PX⇄ 2

PX2 + X PX⇄ 3

PXi + X PX⇄ i+1

PXn-1 + X PX⇄ n

A cui sono associate n costanti di equilibrio:

]X][P[

]PX[K 1

]X][PX[

]PX[K 2

2

]X][PX[

]PX[K

i

ii

1

]X][PX[

]PX[K

n

nn

1

L’equilibrio:

P + jX PX⇄ j

]X][PX[

]PX[

]X][PX[

]PX[

]X][P[

]PX[

]X][P[

]PX[K

j

j

j

jjtot

1

2

j

iij

jtot KKKKK

121

Generalmente le concentrazioni delle singole specie PX, PX2, PX3,… non sono sperimentalmente determinabili, mentre è possibile determinare la concentrazione delle specie polimero legato (Σi[PXi]), polimero non associato [P] e molecole di legante libero [X].

β = numero medio di siti occupati

n

ii

n

ii

]PX[

]PX[i

]erolimpototale.[conc

]occupatisiti[

0

1

Esempio: n=4 (Emoglobina, Hb)

]HbX[]HbX[]HbX[]HbX[]Hb[

]HbX[]HbX[]HbX[]HbX[

432

432 432

[siti occupati] = [PX] + 2 [PX2] + 3[PX3] + 4[PX4] =

= [HbX] + 2 [HbX2] + 3[HbX3] + 4[Hb4]

[conc. totale polimero] = [P] + [PX] + [PX2] + [PX3] + [PX4]=

= [Hb] + [HbX] + [HbX2] + [HbX3] + [HbX4]

1) ciascun sito di legame può legare una sola molecola di legante;

2) i siti sono identici;

3) i siti sono indipendenti, quindi non interagiscono tra loro e hanno tutti la stessa energia di interazione con il legante, indipendentemente da quante molecole di legante si siano già legate sul polimero.

Poiché gli n siti sono tutti identici e indistinguibili e consideriamo gli eventi di binding indipendenti tra di loro, possiamo prendere in considerazione l’equilibrio generico:

sito libero + X sito occupato⇄

]X][liberisiti[

]occupatisiti[K

b

n

ii C]PX[i]occupatisiti[

1

btot

n

iitot C]P[n]PX[i]P[n]liberisiti[

1

fC]liberolegante[

fbtot

b

CC]P[n

CK

tot

b

]P[

C

fftot

b

C nCC]P[n

CKlim

f

0

n]P[

]P[nlim

tot

tot

C f

fbtot

b

CC]P[n

CK

Moltiplicando e dividendo per [P]tot a destra:

ff

tot

btot

totb

CnC]P[

C]P[n]P/[C

K

Da cui si ottiene:

f

f

KC

nKC

1

fC

nKClimf

0

nlimfC

fC

nKClimf

0

nK

nlim maxC f

nmax

n]P[n

]PX[i

]totali[siti

]occupatisiti[

tot

n

ii

1

Θ = frazione di siti occupati

0 ≤ Θ ≤1

Θ = probabilità di trovare un sito occupato ( n siti identici e indipendenti)

1-Θ = probabilità di trovare un sito libero

f

f

KC

KC

n

1

fC

KClimf

0

1

fClim

L’equazione di Langmuir può essere derivata da semplici considerazioni cinetiche:

PXXPi

d

k

k

fddd C)(k]X][P[kv 1

Per la velocità della reazione diretta:

iii k]PX[kv

Per la velocità della reazione inversa:

All’equilibrio:

id vv

ifd kC)(k 1

Da cui si ottiene facilmente:

f

f

KC

KC

1

i

d

k

kK

f

f

KC

nKC

1

fnKCn

111

Alternativamente:

KnKC f

ff nKCKC

f

f

KC

nKC

1

Non cooperativo

Cooperatività positiva

Cooperatività negativa

Nel caso di due diversi siti di legame non interagenti n1 e n2:

f

f

CK

CKn

1

111 1

f

f

CK

CKn

2

222 1

C K K C K CK 1

C K K )n (n Kn Kn

C K 1

n

C K 1

n

C

C

C

2f21f2f1

f21212211

f2

22

f1

11

f

2

f

1

f

KK

C KK )n (n Kn Kn C K K )K (K C f21212211f2121

f

)C K K K (K C KK )n (n Kn Kn C f2121f21212211

f

Isoterma di associazione (25°C, pH=7.2) di ioni Mg2+ con t-RNA.n1=6 n2=10 K1=7.14104 M-1 K2=5103 M-1

)KK(KnKn

Clim

fC f

2122110

ff

fC

CKKCKK)nn(C

limf

2121210

K1+K2

P + A P + A ⇄⇄ PA PA

P = macromolecola con un solo sito di binding A = ligando

]][[

][

AP

PAK

[P]0[A]0

Membrana semipermeabile

Inizialmente:

[P] [A][PA]

[A]

All’equilibrio:

All’equilibrio:

(A)dx = (A)sx

Poiché i potenziali chimici di riferimento sono gli stessi:

a(A)dx = a(A)sx

(A)dx c(A)dx = (A)sx c(A)sx

Assumendo:

(A)dx≈ (A)sx

c(A)dx = c(A)sx E quindi:

Nel box di sinistra:

c(A)tot,sx = c(A)b,sx+ c(A)f,sx

c(A)0 = c(A)tot,sx + c(A)f,dx = c(A)b,sx + 2 c(A)f,dx

c(A)b,sx = c(A)0 - 2 c(A)f,dx

Quindi:

[PA] = c(A)b,sx = c(A)0 - 2 c(A)f,dx

[P] = [P]0 - [PA] [A] = c(A)sx = c(A)dx

dx,fsx,b

sx,b

)A(c))A(c]P([

)A(c

]A][P[

]PA[K

0

dx,fdx,f

dx,f

)A(c))A(c)A(c]P([

)A(c)A(cK

2

2

00

0

La costante di associazione può essere determinata dalle concentrazioni iniziali di polimero e di ligando e dalla determinazione sperimentale della concentrazione di ligando libero (scomparto di destra).

KlnRTGB 0

1. Perdita dei gradi di libertà traslazionali e rotazionali

000 rot,trrot,tr STG

Per un legante di P.M.=200 (T=25°C):

10 50 molkJG rot,tr

2. Restrizioni alle rotazioni interne

000 .int.rot.int.rot STG

10 65 molkJG .int.rot

Per ogni grado di libertà interno perduto:

3. Effetti idrofobici

10 20 molkJ.Ghydr

Per 1Å2 di superficie sottratta al solvente:

4.Interazioni tra gruppi funzionali (legame idrogeno, dipolo-dipolo, Van der Waals)

5. Interazioni elettrostatiche

6. Rilascio di molecole di solvente dalla sfera di idratazione

10 350 molkcal.HB

110 4010 KmolcalSB

Generalmente a Tamb:

Processi di associazione sono generalmente guidati dall’entropia.