Ottimizzazione dell’agrotecnica della canapa (Cannabis sativa L.) per applicazioni di tipo

farmaceutico.

Salvatore Casano

Tesi di laurea di:

Relatore:Prof. Dario Giambalvo

Correlatori:Dott. Giampaolo Grassi

Dott. Piero Trapani

Dipartimento Agronomia Ambientale e TerritorialeDipartimento Agronomia Ambientale e Territoriale

Istituto Sperimentale Colture Industriali - Sez. RovigoIstituto Sperimentale Colture Industriali - Sez. Rovigo

L’Italia, agli inizi del XX secolo, era il maggior produttore (circa 100.000 ha)

di fibra e seme di canapa in Europa

Attuale rivalutazione della canapa in virtù delle sue molteplici utilizzazioni

La canapa è stata ampiamente coltivata sin dall’antichità

L’attuale superficie nel mondo investita a canapa (da fibra e da seme) ammonta a

circa 75.000 ettari (in Italia poco più di 1.000 ettari)

Utilizzazioni

Fibra

Cellulosa

Solventi, vernici, saponi, lubrificanti, materie plastiche

Biodiesel

Cibo (per consumo umano e per l’alimentazione zootecnica)

Integratori alimentari

Biomassa da energia

Oli essenziali

Applicazioni farmaceutiche

POTENZIALI CAMPI DI IMPIEGO TERAPEUTICO DEI DERIVATI DELLA CANAPA

A: Patologie per le quali esistono evidenze incontrovertibili:

Trattamento della nausea in chemioterapia

Stimolazione dell’appetito in pazienti con sindrome da deperimento Aids–correlata

B: Patologie per le quali esistono promettenti evidenze preliminari:

Terapia del dolore

Effetti neuroprotettivi e antiossidanti (ictus e traumi cranici)

Sindrome di Gilles de la Tourette

Glioblastomi

Artrite reumatoide

Glaucoma

Epilessia

Sclerosi multipla (sollievo da dolore neuropatico)

il SATIVEX® è il primo farmaco contenente cannabinoidi ottenuti da estratti vegetali ad essere accettato dalla farmacopea ufficiale di un Paese occidentale

Δ9-THC/CBD

1:1

E’ ottenuto dopo estrazione chimica, purificazione e titolazione di due varietà “monochemiotipiche”: una ricca in Δ9-THC e l’altra in CBD; entrambe

sono caratterizzate da un elevato grado di purezza (circa 95 %) del cannabinoide principale rispetto ai secondari

Spray sub-linguale a % standardizzata di Δ9-THC e CBD

POTENZIALI CAMPI DI IMPIEGO TERAPEUTICO DEI DERIVATI DELLA CANAPA

C: Patologie in cui esistono evidenze meritevoli di ulteriori approfondimenti:

Terapia dei tumori

Lesioni midollari (tetraplegia, paraplegia)

Malattie neurodegenerative (distonie, Parkinson, Huntington, Alzheimer)

Asma bronchiale

Malattie autoimmuni e patologie infiammatorie croniche (lupus eritematoso, morbo di Crohn, colite ulcerosa, etc.)

Sindromi ansioso–depressive e altre sindromi psichiatriche

Patologie cardiovascolari

Sindromi da astinenza nelle dipendenze da sostanze

Prurito intrattabile

Gli effetti terapeuticieffetti terapeutici della canapa sono dovuti alla presenza di p.a.p.a. appartenenti alla famiglia dei cannabinoidi cannabinoidi (gruppo di composti a 21 atomi di C

unicamente prodotti dal genere Cannabis);

ad oggi ne sono stati identificati oltre 60, comprendendo anche i loro acidi carbossilici, analoghi e prodotti di trasformazione

I cannabinoidi più abbondanti nei tessuti vegetali sono:

Δ9-THC (delta9-tetraidrocannabinolo)

CBD (cannabidiolo)

CBC (cannabicromene)

CBG (cannabigerolo)

Δ9-THCV, CBDV e CBGV (omologhi propilici)

Il CBGCBG è il precursoreprecursore di tutti i cannabinoidi e, per via enzimatica, viene convertito negli altri cannabinoidi principali

Il Δ9-THCΔ9-THC è il cannabinoide più studiato per gli effetti terapeuticieffetti terapeutici, ma è dotato di attività psicotropaattività psicotropa

Il CBDCBD modula l’attività del Δ9-THCΔ9-THC attenuandone gli effetti collateraliattenuandone gli effetti collaterali e prolungandone l’effetto terapeuticoprolungandone l’effetto terapeutico

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,50,0

0,5

1,5

2,0

1,0

% Δ

9-T

HC

% CBD

non psicotropo

psicotro

po

semi-psicotropo

Classificazione dei fenotipi in base al contenuto in cannabinoidiClassificazione dei fenotipi in base al contenuto in cannabinoidi

L’Istituto Sperimentale Colture Industriali Sezione Operativa Periferica di Rovigo

da alcuni annida alcuni anni si occupa di si occupa di selezionareselezionare varietà varietà di di

canapacanapa monoiche e monoiche e linee monochemiotipichelinee monochemiotipiche

Obiettivi della ricerca

acquisire informazioni sulle principali caratteristiche di genotipi di canapagenotipi di canapa valutandone il comportamento in termini di

parametri biometrici e, soprattutto, di concentrazioni % in cannabinoidi al variare di alcuni aspetti dell’agrotecnica

acquisire informazioni sulle variazionivariazioni del contenuto % in cannabinoidi nelle foglie durante il ciclo biologico della coltura

CBD e CBGCBD e CBG Δ9-THC esentiΔ9-THC esenti

MATERIALI e METODI

L’attività di ricerca è stata articolata in due distinte prove:L’attività di ricerca è stata articolata in due distinte prove:

previamente e regolarmente autorizzate dal Ministero ai sensi dell’ art. 26 D.P.R. n° 309/90 (coltivazione di

canapa a scopi sperimentali)

PROVA 1: 20 linee inbred20 linee inbred

PROVA 2:PROVA 2: 2 progenie clonali2 progenie clonali

4 4 pacchetti di coltivazionepacchetti di coltivazione (substrato + concimazione)

T1T1SubstratoSubstrato: mix di vari tipi di torba (in prevalenza torba nera)ConcimazioneConcimazione: minerale (in prevalenza azotata in fase vegetativa e

fosfo-potassica in fase di fioritura)

T2T2SubstratoSubstrato: fibra di coccoConcimazioneConcimazione: formulati minerali specifici forniti dalla ditta produttrice

(Coco A e Coco B)

T3T3SubstratoSubstrato: torba bianca e compost di cortecceConcimazioneConcimazione: formulati minerali specifici forniti dalla ditta produttrice

(Terra Vega – f. vegetativa e Terra Flores – f. fioritura)

T4T4SubstratoSubstrato: torba bianca e compost di cortecceConcimazioneConcimazione: formulati organici specifici forniti dalla ditta produttrice

(Bio Vega – f. vegetativa e Bio Flores – f. fioritura)

Pacchetti di coltivazione in valutazione

Prova 1 – Linee inbred

Sito: Monselice (PD) - presso una serra dell’Istituto Tecnico Agrario “Kennedy”

Periodo: dal 2 agosto al 18 ottobre 2004

Semina: il 2 agosto in cubetti di torba pressata

N° piante: 200 totali - 50 per trattamento

Trapianto: dopo una settimana circa in vasi da 5 litri precedentemente invasati con i rispettivi substrati

Illuminazione: dal trapianto fino al 14/9 (fase vegetativa): 18 ore di luce dal 14/9 alla raccolta (fase riproduttiva): 11 ore di luce

Irrigazione: interventi giornalieri per mantenere il substrato sempre in condizioni prossime alla CIC

Raccolta: il 18 ottobre (15-20 giorni d’anticipo rispetto al presunto ottimale)

Prova 2 – Progenie clonali

Sito: Rovigo - presso una serra dell’Istituto Sperimentale per le Colture Industriali

Periodo: dal 4 ottobre 2004 al 14 gennaio 2005

N° piante: 68 (24 clone E1 e 44 clone E7) - 17 per trattamento

Trapianto: il 4/10 in vasi da 2 litri precedentemente invasati con i rispettivi substrati

Illuminazione: dal trapianto fino al 2/11 (fase vegetativa): 18 ore di luce dal 2/11 alla raccolta (fase riproduttiva): 11 ore di luce

Irrigazione: interventi giornalieri per mantenere il substrato sempre in condizioni prossime alla CIC

Raccolta: il 14 gennaio 2005

Rilievi (a maturazione)

Altezza delle piante

Diametro del fusto

Biomassa epigeica complessiva e ripartita nelle sue componenti (fusto, foglie, infiorescenze)

Determinazione del contenuto in cannabinoidicannabinoidi nelle infiorescenze mediante analisi gas-cromatografica [L’estrazione è stata effettuata seguendo i metodi ufficiali UE (Reg. 796/2004); solvente (n-esano) e standard interno (squalene)]

Prova 1 – Linee inbred

T1 T2 T3 T4 DMS

Altezza (cm) 117,3 101,1 137,3 127,6 18,2

Diametro fusto (mm) 4,9 3,6 5,6 5,2 0,6

Biomassa epigeica (g/pianta) 26,3 15,5 33,1 28,1 4,3

Incidenza del fusto sulla biomassa epigeica (%)

37,7 28,5 39,3 38,8

Incidenza foglie e infiorescenze sulla biomassa epigeica (%)

62,3 71,5 60,7 61,2

Effetti dei differenti trattamenti su alcuni parametri biometrici

Differenze minime significative per P≤0,05

Contenuto medio in CBD nelle infiorescenze (%)

b bab

a

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

T1 T2 T3 T4

CB

D (

%)

Prova 1 – Linee inbred

Contenuto medio in CBD nelle infiorescenze (%)

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

379 453 454 463 633 634 635 666 763 764 778 903 1064 1086 1090 1095 1098 1100 1101 1102

CB

D (

%)

DMS (P≤0,05)

Prova 1 – Linee inbred

Contenuto medio in Δ9-THC nelle infiorescenze (%)

a

b

ab

ab

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

T1 T2 T3 T4

Δ9

-TH

C (

%)

Prova 1 – Linee inbred

Contenuto medio in Δ9-THC nelle infiorescenze (%)

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

379 453 454 463 633 634 635 666 763 764 778 903 1064 1086 1090 1095 1098 1100 1101 1102

Δ9

-TH

C (

%)

DMS (P≤0,05)

Prova 1 – Linee inbred

Contenuto medio in CBG nelle infiorescenze (%)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

T1 T2 T3 T4

CB

G (

%)

Prova 1 – Linee inbred

Contenuto medio in CBG nelle infiorescenze (%)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

2,6

379 453 454 463 633 634 635 666 763 764 778 903 1064 1086 1090 1095 1098 1100 1101 1102

CB

G (

%)

DMS (P≤0,05)

Prova 1 – Linee inbred

Peso delle infiorescenze (g/pianta)

a

a

b

ab

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

T1 T2 T3 T4 E1 E7

Pes

o

infi

ore

scen

ze

(g/p

ian

ta)

Trattamento Clone

Prova 2 – Progenie clonali

Contenuto in CBD nelle infiorescenze (%)

b

a

d

c

b

a

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

T1 T2 T3 T4 E1 E7

CB

D (

%)

Trattamento Clone

Prova 2 – Progenie clonali

Relazione tra peso delle infiorescenze (g/pianta) e contenuto in CBD (% e g/pianta)

y = -0,0162x2 + 0,113x - 0,0635

R2 = 0,9987

y = -0,299x2 + 0,9361x + 4,2101

R2 = 0,9998

3,0

3,4

3,8

4,2

4,6

5,0

1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5

Peso infiorescenze (g/pianta)

CB

D (

% s

.s.)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20C

BD

(g/p

ian

ta)

Prova 2 – Progenie clonali

Contenuto in Δ9-THC nelle infiorescenze (%)

a

b

bb

a

b

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

T1 T2 T3 T4 E1 E7

Δ9-

TH

C (

%)

Trattamento Clone

Prova 2 – Progenie clonali

Andamento del contenuto in CBD (%) nelle foglie per effetto delle variabili agronomiche studiate.

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

2,2

2,4

2,6

2,8

3

0 15 30 45 60 75 90

Giorni dal 1° novembre

CB

D(%

)

T1 T2 T3 T4 E1 E7

Prova 2 – Progenie clonali

Conclusioni

E’ stata riscontrata una ampia variabilità tra le linee in esame, che peraltro hanno mostrato una notevole stabilità di risposta al variare dei trattamenti applicati

Sono state individuate linee stabili nel profilo chemiotipico e con elevato contenuto in CBD e CBG

Le % in cannabinoidi più elevate sono state realizzate con i “trattamenti” caratterizzati da un limitato apporto di elementi fertilizzanti

Il contenuto in percentuale in cannabinoidi si riduce progressivamente all’aumento della produzione di infiorescenze per pianta

Dal confronto tra le tesi T3 e T4, caratterizzate da uguale substrato ma da differenti tipologie di concime utilizzato, rispettivamente minerale ed organico, emerge come la produzione in CBD per pianta non è variata in modo significativo tra i due trattamenti

La ricerca ha inoltre messo in evidenza un graduale decremento delle concentrazioni percentuali in cannabinoidi nelle foglie con il progredire della fase riproduttiva; ciò è presumibilmente collegato ai processi di senescenza delle foglie ma potrebbe anche essere legato a processi di traslocazione dei metaboliti verso le infiorescenze. Tale aspetto meriterebbe ulteriori approfondimenti sperimentali

Conclusioni