ISSN 0853 - 2788Akreditasi No: 345/Akred-LIPIIP2MBV07l2011

OPTIMASI DAN VALIDASI METODA PENGUJIANWEDELOLAKTON SECARA KROMATOGRAFI CAIR

KINERJA TINGGI DENGAN TEKNIK DETEKSI FLUORESENSI (KCKT - F)

'Iiisna Yuliana1*,YosiAristiawan3, Iwan Bastiawanz,Julia J. Kantasubrata3, Muljadji Agmaz

"Kopertis WIlayah IV Jabar - Banten, Bandung, Jawa Barat, Indonesia2loniversitas Padjadjaran, Bandung, Jawa Barat, Indonesia

3lpPKimia - LIP!, Bandung & Serpong, Jawa Barat, Indonesia.Email: ~oo.com

Diterima : 15Desember 2011; Disetujui .' 10 Januari 2012

ABSTRAKWedelolakton memiliki berbagai aktifitas

biologis sehingga banyak digunakan untukpengobatan berbagai penyakit. Dalam penelitianini telah dikembangkan metoda analisiswedelolakton dalam ekstrak herbal Eclipta alba L.Haask sebagai kandidat bahan acuan inhouse.Penentuan kandungan wedelolakton dalam sampeluji dilakukan seeara KCKT fasa terbalikmenggunakan detektor fluoresensi (KCKT-F) daneampuranmetanol : asamasetat 0,35% sebagai fasagerak:. Telah dilakukan juga validasi metodaterhadap penetapan wedelolakton ini. Paramatervalidasi yang dilakukan meliputi konfirmasiidentitas (selektifitas), linieritas (rentang kerja),presisi, recovery, sensitifitas, batas deteksi dankuantitasi. Analisis statistik data menunjukkanbahwa metoda ini eukup reprodusibel dan selektifuntukpenentuan wedelolakton.

Kata kunci: Wedelo1akton, KCKT-F, optimasi metode,validasimetode,batas konfidensi.

ABSTRACTWedelolakton has a wide range of biological

activities and used for the treatment of variousailments. In the present study an experiment ofquantitative determination of wedelolactone inherbal extract of Eclipta alba L. Hask has beendeveloped by using RP - HPLC - Fluorimetrytechnique and mixture methanol:0.35% acetic acid(H20) (50:50 vlv) as mobile phase, applied to theherbal extract as inhouse reference materialcandidate samples. The method was validated forthe confirmation of identity (selectivity), linearity,precision, recovery, sensitifity, limit of detection

JKTI, Vol. 14, No.1, Juni 2012

and limit of quantitation. Statistical analysis of thedata showed that the method is reproducible andselective for the estimation of wedelolactonedetermination.Keywords: Wedelolactone, HPLC-F, method optimization,

method validation, confidence limit.

PENDAHULUANWedelolak:ton adalah senyawa organik

turunan kumestan terkandung dalam tanamanEclipta alba L. Hask. Struktur kimia wedelolaktondiberikan pada Gambar 1. Wedelolaktonmerupakan marker bioaktif dati urang-aring yangpaling banyak dieari oleh industri obat-obatan danherbal karena mem.ilikiberbagai fungsi. Dari basilskrining farmakologi dari tumbuhan ataupun basilsintesis diungkapkan bahwa wedelolaktonmempunyai aktifitas sebagai antihepatotoksik'",immunomodulator'", antioksidan'", anti radang'",penawar racun bisa ular(S-7),penghambat virushepatitis C(8), analgesik'" , antiosteoporetik''",menekan aktifitas dan pertumbuhan androgendalam sel kanker prostat seeara sinergis'", efekfarmakologis pada sistem sa.raf12), antimv=, danantibakteri?",

oHO

Gambar 1. Struktur kimia wedelolakton

1

Beberapa metoda penentuan wedelolaktontelah dikembangkan. Teknik kromatografi lapisantipis preparatif dengan deteksi menggunakanspektrofluorometer telah digunakan untukmenetapkan kandungan wedelolakton dalamekstrak metanol urang aring(lS).Fasa gerak yangdigunakan adalah campuran toluen : aseton : asamformat (II : 6 : I) dengan fasa diam silika gel G.Pengukuran dengan spektro:t1uorometer dilakukanpada panjang gelombang eksitasi 384 nm danpanjang gelombang emisi 458 nm. Metodespektrofotometri'!" sudah dilakukan untukpenetapan kandungan wedelolakton. Pengukuranwedelolakton dilakukan pada panjang gelombangmaksimum 351 nm. Teknik kromatografi lapisantipis kinerja tinggi (KLTKT)(l7)untuk menetapkankandungan wedelolakton sudah dilakukan denganfasa gerak yang sarna seperti yang digunakan olehPatel & Mishra(lS).KLTKT dengan sistem deteksifluoresensi telah dilakukan pada panjanggelombang 366 nm?", Pengembangan metodeKLTKT telah banyak dilakukan dengan jenis dankomposisi eluen yang berbeda(l9-22).Penentuanwedelolakton dengan metoda kromatografi cairkinerja tinggi (KCKT) fasa terbalik dilakukanmenggunakan teknik deteksi UV-Vis pada panjanggelombang 351 nm dan teknik elusi isokratikmenggunakan metanol:asam asetat 0,5% dalam airdengan perbandingan 55:45 (v/v)(23).Teknik yangsarna digunakan tetapi dengan sistem elusi berbedayaitu sistem gradien dengan menggunakan pelarutMeOH:lIzO (0, I% asam asetat) dengan komposisi10:90 hingga 80:20 (v/v) dalam waktu 40 menir",Penentuan wedelolakton secara KCKT denganteknik deteksi fluoresensi belum pemahdilaporkan. Oleh karenanya penelitian inibertujuan untuk mengembangkan metodepenentuan wedelolakton dengan KCKTmenggunakan detektor:t1uoresensi (KCKT-F).

BAHAN DAN METODA

BahanBahan kimia yang digunakan adalah standar

wedelolakton murni yang diperoleh melalui prosesisolasi dari daun urang aring (Eclipta alba L. Hask)dan telah dikarak.terisasi dengan 13C_NMR; IH_NMR; Spektrometri Massa. Metanolchromatography grade, asam asetat p.a.,aquabidest dan disaring melalui sistem Millipore.

2

Peralatan

Peralatan yang digunakan adalahseperangkat alat KCKT dari Waters 2690 Alliance,kolom CI8 (4,6 x 250 mm), dan detektor:t1uoresensi dari Waters 474, neraca analitik mikromerk Mettler Toledo AT 20 serta peralatan gelaslainnya.

MetodaPeniapan ekstrak herbal sebagai kandidatbahan acuan wedelolakton (inhouse).

Kandidat bahan acuan wedelolakton berupaekstrak dibuat dari daun Eclipta alba L. Haask dandibuat dalam pelarut metanol. Sejumlah ekstrakditimbang dengan teliti menggunakan neracamikro sekitar 10 mg, kemudian diencerkan dalamsejumlah massa metanol. Konsentrasiwedelolakton dalam ekstrak dibuat sekitar 50 ug/gsecara gravimetrik. Selanjutnya larutan kemudiandianalisis dengan KCKT-F

Optimasi metodaSebelum optimasi metoda dilakukan

pertama-tama dilakukan optimasi terhadapsensitifitas detektor (gain) terlebih dahulu. Padatahap ini dibuat variasi konsentrasi standarwedelolakton dengan rentang (10 - 100) ug/gmenjadi 6 titik konsentrasi. Setiap deretkonsentrasi standar diukur dengan dua gain yangberbeda (lOx dan 100Ox). Cara yang sarnadilakukan dalam mengoptimasi panjanggelombang, bedanya setiap deret konsentrasidiukur dengan dua panjang gelombang eksitasiyaitu 384 nm dan 350 nm. Panjang gelombangemisi yang digunakan adalah 458 nm. Padaoptimasi panjang gelombang, pengukurandilakukan hanya dengangain yang sudah optimum.Untuk mencari konsentrasi asam asetat optimum,dibuat 3 konsentrasi wedelolakton yang berbedayaitu 10, 50 dan 100 ug/g. Larutan tersebut masingmasing diukur tiga kali ulangan denganmenggunakan campuran eluen yang konsentrasiasam asetatnya bervariasi (0,1; 0,2; 0,35; 0,5 dan1%) dalam aquamillipore dan komposisi fasa gerakyang digunakan adalah metanol:asam asetatdengan perbandingan (50:50 v/v).

JKTI, Vol. 14, No.1, Juni 2012

Valldasi metodaKonfirmasiidentit&s

Konfirmasi identitas wedelolaktondilakukan dengan metode KCKT menggunakandetektor photometric diode array (PDA) terhadapsampel ekstrak kandidat bahan acuan dandibandingkan dengan standarwedelolakton. Setiappuncak yang timbul akibat pemisahan didalamsampel ekstrak kemudian diukur kurva serapanpanjang gelombang maksimum. Kehadiranwedelolakton dievaluasi dengan membandingkanpanjang gelombang puncak komponen targetterhadappanjang gelombangpuncak standar.Linieritas (rentang kerja)

Dibuat kurva kalibrasi untuk melihatlinieritas (daerah kerja), yaitu dengan caramembuat larutan standar wedelolakton denganrentangkonsentrasi 1-130ug/g.Presisi

Dilakukan penetapan konsentrasiwedelolakton di dalam sampel ekstrak herbalkandidat bahan acuan dengan enam kalipengulangan secara independen.Datas deteksi dan batas kuantitasi pengukuran

Batas deteksi dan kuantitasi pertama tamaditentukan melalui perhitungan berdasarkan kurvakalibrasi yang diperoleh. Selanjutnya dilakukanverifikasi dengan cara membuat larutan standardengan konsentrasi sebesar batas deteksi dankuantitasi hasil perhitungan selanjutnya diukurdenganmetode KCKT-F.Perolehan kemball (recol'ery)

Dilakukan dengan cara menambahkan tigatingkat konsentrasi standar wedelolakton (2000,4000 dan 8000 ug/g) secara terpisah terhadapsampel ekstrak herbal kandidat bahan acuan yangditeliti. Campuran larutan dianalisis denganKCKT-F dengan tiga kali ulangan secaraindependenuntuk setiaptingkatkonsentrasi.

BASIL DAN PEMBAHASAN

Optimasi Metode KCKT - F.Sensitifitas detektor (gain)

Penggunaan gain 1000x lebih baik: biladibandingkan dengan gain lOx. Hal ini dapat

JKTI, Vol. 14, No.1, Juni 2012

dilihat pada kurva dengan menggunakan gain1000xmenunjukkan sensitifitas yang lebih tinggi(Gambar 2). Sensitifitas kurva ditunjukkan olehnilai slope kurva kalibrasi. Gain 1000punmenunjukkan kinerja yang lebih baik:bila dilihatdari nilai koefisien korelasi (I).Nilai 1 untuk gain1000x sebesar 1 dan 1untuk gain lOx sebesar0,9967. Bila ditinjau dari simpangan baku relatifuntuk slope yang diperoleh dari 6 serikonsentrasi?", gain 1000x pun menunjukkankinerja lebih baik:.Nilai simpangan baku relatifslopeuntukgain 1000sebesarO,3%lebihkecil biladibandingkanuntukgain 10(3,3%).

Perb audingan kurva kalibrasi antar aGain 10 & 10004,5E-t{)6

4,OE-t{)63,5E-t{)6

.:0: 3,OE-t{)6'"uS 2,5E-t{)6r:l. 2,OE-t{)6'"!1 1,5E-t{)6..:I

I,OE-t{)65,OE-t{)5O,OE-t{)O

y= 50280x - 16346,2=1

• GainlO

• Gainl000

y= 3ilx + 9,2395~= 0,9967• • •

o 50 lOaKensentrasi Wedelolallion (ug/g)

Gambar 2. Grafik perbandingan nilai gain

Optimasi Panjang Gelombang EksitasiPengukuran panjang gelombang maksimum

wedelolakton dengan spektrofotometer diperolehdata 350 nm. Saat pengukuran panjang gelombangdengan spektrofluorometer diperoleh data panjanggelombang eksitasi maksimum 342 nm danpanjang gelombang emisi 458 nm. Dari literaturdiperoleh data panjang gelombang eksitasi untukwedelolakton 384 nm dan panjang gelombangemisi 458 nm(lS).Olehkarena itu pada penelitian inidilakukan konfirmasi terhadap tiga panjanggelombang eksitasi 350, 342 dan 384 nm untukmemperoleh panjang gelombang eksitasi yangoptimum. Panjang gelombang 350 nm merupakanpanjang gelombang eksitasi optimum dalampenentuan wedelolakton dengan KCKT - F. Halini terlihat dari kurva kalibrasi dengan ••• 350menunjukkan sensitifitas yang lebih baik: biladibandingkan dengan •••384 nm (Gambar 3). Halyang sama ditunjukkan ketika oks 350 nmdibandingkan terhadap •••342nm (Gambar4).

3

Perbandingan A eksitasi 350 nm dan 384 nm3,OE-I{)5

v= 27540x+21695R2~ 0,995

2,5E-I{)).l<;

2,OE-I{)5'""§ 1,5 E-I{)5n,v.

~ I,OE-I{)5....l5,OE-I{)4

O,OE-I{)O

0

y~ 2526,x + 8911,R2~ 0,895

• eksitasi384 run

• eksitasi350

6 8 102 4

KonsentrasiWedelolakton ugg

Gambar 3. Kurva kalibrasi dengan menggunakan eks 350 nmdan384 nm

Perbandingan A.ks 342 nm dan 350 nm1400000

1200000

1000000.l<;'"§ 800000';;:

600000'""....l400000

200000

00

y~ 25040x - 21362R2~ 0,996

y= 23260x - 9286,R2= 0,991

+342 run

.350 nrn

10 20 30 40 50 60Konsentra siWedelolakton(ugell

Gambar 4 Kurva kalibrasi dengan menggunakan eks 342 nmdan 350nm

Optimasi EluenUntuk lima konsentrasi asam asetat yang

dicobakan dibuat masing masing kurva antara luaspuncak versus konsentrasi (Gambar 5A, 5B, 5C,5D, 5E). Gambar 5F menunjukkan penggabungan5 kurva perbandingan konsentrasi asam asetatdalam sistem eluen. Tiga konsentrasi asam asetatpertama (0,1; 0,2 clan 0,35%) menunjukkanperubahan luas puncak yang relatif sama terhadapperubahan konsentrasi. Hal ini terlihat dari nilaislopepada Gambar 5A, 5B clan5C clanjuga terlihatdari kurva tiga konsentrasi asam tersebut yangberhimpitan (Gambar 5F). Dari gambartersebutpun terlihat tiga konsentrasi asam tersebutmenunjukkan sensitifitas yang lebih baik biladibandingkan dengan 2 konsentrasi asam asetatlainnya(0,5 clan1,0%).

4

kurva kalibmi dengankonseutnstasam asetal 0,2'"

:;:: I~§ II'''' Ij II'''' I

jPE+05.

01''''L--______ iQ ~ ~ ro ro ~ ~ I

gnsentnsi. 'f't~ldakfJJl. m,II(_-.---J

kurva kalibrasi dNlgallkonsentminsam "etatO,I','''''''/12PE+M

~ +16985 1

j Ii''''~i ll'+~~5~E+OS

01'''''--------o ~ " w ~ ~ rn I

,__ -=I»=""'=nfn.si."edelolactonem.g~ !

A

kurvn kallbrasi dengankunseutrastasam a!1latO,,15"

"''''i~2,oE+{I61

iii'''', y.21711,+17178A != 1,0£+06~

S,DE+l)5

0/''''' '-' ------

y' 21848,+ 17792

B

kurva kalibrasidengankonsentrasiasam as(ltatOI~~'

2,!iE~oti I'I'''' I

1"'''1a II'''' I

5,oE+05

0,0£+00!)L-_~ -W-"-~-'-OO-I)) !kDJISIe)(trasiwtielohct1lltt:)!I'~ I

• t: 170ll, +18434

Dckurva kalibrasi dengan konsenrrasi asam

asetar 1.0',

o ~ ~ ro ro ~ ~RICZJltnsi wedelolatfOl.t .,1Jr;

E

PerbnlldUlaan konsentrasl asammlatd~lamsistemeilleu

l~"'I/·a.:O'I"1 :::: ::::ill''''~ ''''i'••• 5,DEtill .H.v:lpy.

'PE'" -----o .so 100 1$0

'•• "ntrasi ."',~bcU", mg/l>;

F

Gambar 5. Kurva perbandingan konsentrasi asam asetatdalam sistem eluen.

Dari Tabell. Konsentrasi asamasetat 0,2 clan0,35% menunjukkan variasi yang cukup baik biladibandingkan dengan tiga konsentrasi asam asetatlainnya (0,1; 0,5 clan 1,0%). Hal ini terlihat darinilai rerata KV (0,4 clan0,7%)yang diperoleh yangberasal dari tiga satuan konsentrasi wedelolaktonyang berbeda yaitu 10;50 clan100ug/g.Nilai rerataKV ini lebihbaik dibandingkan dengannilai rerataKV lainnya (3,4; 6,0 clan26,6%). Nilai rerata KVuntuk konsentrasi asam asetat 0,2% lebih baik biladibandingkan dengan konsentrasi asam asetat0,35%. Akan tetapi bila didasarkan pada bentukkromatogram yang diperoleh (Gambar 6 clan 7)maka yangmemberikan bentukkromatogram yangpaling baik adalah yang menggunakan asam asetat0,35% sebagai campuran eluen. Oleh kar~yakonsentrasi asam asetat 0,35% dianggap palingoptimal sebagai campurandalam sistemeluen.

JKTI, Vol. 14, No.1, Juni 2012

Tabell. Variasi konsentrasi asam asetat (HAc) terhadapluas puncak.

Konsentrasi HAc rerata sd KV reratawedelolakton (%) luas puncak: luas (%) KV

(ug/g) n=3 puncak: (%)

10 0,1 3,51E+05 3,0IE+04 8,6

50 0,1 1,32E+06 1,42E+04 1,1 3,4

100 0,1 2,31E+06 1,56E+04 0,7

10 0,2 3,34E+05 2,06E+03 0,6

50 0,2 1,38E+06 4,90E+03 0,4 0,4

100 0,2 2,31E+06 5,50E+03 0,2

10 0,35 3,31E+05 4,96E+03 1,5

50 0,35 1,36E+06 7,35E+03 0,5 0,7

100 0,35 2,30E+06 4,08E+03 0,2

10 0,5 3,63E+05 3,34E+04 9,2

50 0,5 1,30E+06 6,16E+04 4,7 6,0

100 0,5 1,91E+06 7,87E+04 4,1

10 1,0 6,21E+05 4,79E+04 77,0

50 1,0 1,25E+06 2,58E+04 0,2 26,6

100 1,0 1,82E+06 4,73E+04 2,6

'OJ)()

~10J)()

»e <tlUG (')Q \

0,.,.. 0 0I'! OJr ,.;

ODD ..kl

1.00 ,J)() )J)() 1,00 SOD 6J)() 1.00UI!IIl"

Gambar 6. Kromatogram wedelolakton menggunakankonsentrasi asam asetat 0,25%

~-

80,00

60,00

>e 10,00

1.00 6,00 &,00 10,002.00

Gambar 7. Kromatogram wedelolakton menggunakankonsentrasi asam asetat 0,35%

JKTI, Vol. 14, No.1, Juni 2012

Validasi metoda

Konfirmasildentitas

Konfirmasi identitas diperlukan untukmemastikan agar analit yang ditentukan di dalamekstrak herbal kandidat bahan acuan adalah benarwedelolakton dan bukan senyawa lainnya. Untukitu dilakukan analisis KCKT terhadap standar danterhadap ekstrak herbal kandidat bahan acuan yangditeliti dengan detektor PDA. Puncakwedelolakton dalam sampel dikonfirmasi denganmembandingkan kurva serapan dari wedelolaktondalam sampel terhadap kurva serapan dariwedelolakton standar. Dari Gambar 8 dan 9 terlihatbahwa kurva serapan wedelolakton dalam sampelsesuai dengankurva serapan standarwedelolakton.

Baku Langsung WedelolaktanmAll

, 1

700jnm200 300 500 600400

Gambar 8. Kurva serapan untuk puncak standar wedelolaktonpada waktu retensi tR 11,281 menit

11.208 (Wedelolaktan)

r~~

300 >,I

200 i I g, \~ M

100°1 ~~ ~ /\ Io~ ~ "'-~---,~"-d),,,,-:----~-_----!I"L,- I" , 1 i , , , 1 " 'I'" i Iii i , 1

200 300 400 500 600 700 nm

Gambar 9. Kurva serapan untuk puncak dengan wakturetensi tR 11,208 menit pada ekstrak herbalkandidat bahan acuan inhouse.

Rentang kerja analisis wedelolakton

Kurva kalibrasi antara luas puncak versuskonsentrasi linier pada rentang 0,7 ug/g sampai129,2 ug/g. Garis kalibrasi direpresentasikandengan persamaan regresi linier Y = 24806 +22170X dengan nilai koefisien korelasi (r) =0,9996 dan sensitifitas metode sebesar (221,7±1,2)X Hi luas puncak/satuankonsentrasi (Gambar 10).

5

Kurva knllbrnsi wedelclaktou3,5E+06

3,OE+06.;; 2,5E+06...S 2,oE+06~~ 1,5E+06~ I,OE+06

5,OE+05O,OE+OO9fL------------

y =22170)( + 24806R'=0,999

o W W W W 100 lW lW

Konsentrn siWede Iolakton (uglg)

Gambar 10. Kurva kalibrasi standar wedelolakton

PresisiMetodaPresisi metoda ditentukan dengan perolehan

nilai KV basil pereobaan kemudian dibandingkanterhadap KVHorwitz(2S)setelah dika1ikan denganfaktor 2/3.Kandunganwedelolakton dalam ekstrakkandidat bahan acuan didapat 5750 ug/g dansimpangan baku sebesar 278 ug/g. KV basilpereobaan diperoleh 4,8% lebih besar biladibandingkan dengan KVHorwitz-repeatabilitas(2,9%). Akan tetapi KV basil pereobaan ini masiheukup baik bila ditinjau dari nilai Horrat(2S).NilaiHorrat merupakan rasio antara KV basil pereobaandibagi dengan KVHorwitz-repeatabilitas. NilaiHorrat untuk penentuan wedelolakton denganmetodaKCKT-Fadalah 1,7Iebihkeeildari2.

Datas Deteksi dan Datas KuantitasiBatas deteksi dan kuantitasi perhitungan(24,26)

yang didasarkan pada persamaan kurva kalibrasiY= 24806+22170Xmasing masing sebesar 2,2 ug/gdan 7,2 ug/g. ICH Guide, 1996(26)mensyaratkanbahwa nilai hasil perhitungan tersebut perludiverifikasi di laboratorium. Hasil pereobaan dilaboratorium untuk batas deteksi pengukuranadalah 0,3 ug/g dengan nilai KV sebesar 66,6%jauh lebih besar bila dibandingkan dengan KVHorwitz untuk repeatabilitas (12,8%). Sedanguntuk batas kuantitasi pengukuran diperoleh nilaisebesar 0,7 ug/g dengan KV sebesar 7,7% relatiflebih keeil bila dibandingkan dengan KV Horwitzuntuk repeatabilitas (11,2%). Hasil verifikasimenunjukkan baik batas deteksi maupun bataskuantitasi pengukuran lebih keeil dibandingkandenganbasil perhitungan.

6

Recovery MetodaPenetapan perolehan kembali (recovery)

dilakukan dengan teknik adisi standar.Tiga tingkatkonsentrasi ditambahkan pada sampel ekstrakkandidat bahan acuan, Masing masing level dibuat3 kali pengulangan seeara independen dan diukur 1kali untuk setiap ulangannya. Persen perolehankembali dapat dilihatpadaTabel2.

Tabel 2. Hasil uji Recovery Wedelolakton

Wedelolak Wedelolak Wedelolakton ton total ton dalam Wedelolak Rerat sdperhitunga hasil extrak

ton hasil a recoven analisis sampcl pengukura recove

IY(%)(ug/g) n (ug/g) ~J'(%)

(ug/g) (ug/g)

2070,53 8221,03 2197,25

2156,32 8030,84 6023,78 2007,06 101,94 7,68

2027,22 8185,29 2161,51

4097,07 10204,42 4226,45

4258,95 10252,42 5977,97 4274,45 103,88 3,93

4259,01 10582,94 4604,97

8146,11 14631,97 8654,00

7941,99 13542,78 5977,97 7564,81 103,18 6,93

7739,33 14340,76 8362,79

Penentuan wedelolakton dalam sampel ekstrakkandidat bahan acuan.

Sampel ekstrak kandidat bahan aeuaninhouse merupakan ekstrak tumbuhan urang aring(Eclipta alba L.Hask) dalam metanol. Dalamproses pembuatannya beberapa komponenpengganggu telah dihilangkan. Denganmenggunakan metode yang telah tervalidasi makadidapat interval konfidensi?" kandunganwedelolakton dalam ekstrak sampel sebesar (5750±320)ug/g (tingkatkepereayaan95%dandb= 5)

KESIMPULANMetoda KCKT dengan deteksi fluoresensi

merupakan metoda yang sederhana, eermat danspesifik untuk penentuan wedelolakton. Intervalkonfidensi kandunganwedelolakton dalam ekstrakkandidat bahan acuan adalah (5750 ± 320) ug/gdengantingkatkepereayaan 95%.

JKTI, Vol. 14, No.1, Juni 2012

DAFTAR PUSTAKA

1. S.C. Franca, B.W. Bertoni, A.M.S. Pereira,1995, Antihepatotoxic agent inmicropropagated planlets of Eclipta alba.Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 40: 297-299.

2. M.O. Jayathirta, and S.H. Mishra, 2004,Preliminary immunomodulatory activities ofmethanol extracts ofEclipta alba and Centellaasiatica.Phytomedicine, 11,(4),361- 365.

3. A.S. Majumdar, 2008, Preliminary studies onthe antioxidant activity of Tribulus terrestrisand Eclipta alba, Pharmacognosy Magazine,4, (13),102-107.

4. O. Arunachalam, N. Subramanian, O.P.Pazhani, and V. Ravichandran, 2009, Anti-inflammatory activity ofmethanolic extract ofEclipta prostrata L. (Astearaceae), AfricanJournal ofPharmacy andPharmacology 3 (3),097-100.

5. P.A. Melo, D.A. Pinheiro, H.D. Ricardo,F.F.A.Fernandes, M.A. Tomaz, C.Z. El-Kik,M.A. Strauch, T.F. da Fonseca, D.N.Sifuentes, S. Calil-Elias, C.D. Buarque, F.V.Brito, P.RR Costa, A.J.M. Da Silva, 2010,Ability of a synthetic coumestan to antagonizeBothrops snake venom activities, Toxicon 55,488-496.

6. P. Phitayanukul, S. Laovachirasuwan, RBavovada, N. Pakmanee, R Suttisri, 2004,Antivenom potential of butanolic extract ofEclipta prostata against Malayan pit vipervenom, Journal of Ethnopharmacology 90,347-352.

7. L.C.Diogo, S.R Fernandes, S.Marcussi, D.L.Menaldo, P.O. Roberto, P.V.F. Matrangulo,P.S. Pereira, S.C. Franca, S. Giuliatti, A.M.Soares, andM.V.Lourenco, 2009, Inhibitionsnake venoms and phospholipases A2 byextract from native and genetically modifiedEclipta alba: isolation of actove compound,Basic & Clinical Pharmacology &Toxicology,104,293 - 299.

8. N.K. Basu, A.B. Waffol T.T.Talele,A. Basu,P.R.R. Costa, A.J.M. da Silva, S.O.Sarafianos, and F. Noel, 2008, Identification

JKTI, Vol. 14, No.1, Juni 2012

and characterization of coumestans as novelHCV NS5B polymerase inhibitors, NucleicAcidsResearch, 36,(5),1482-1496.

9. M. Sawant, J.C. Issac and S.Narayanan, 2004Analgesic Studies on Total alkaloids andalcohol extracs of Eclipta alba (Linn.) Hask.Phytother.Res.18(2): 111-113.

10. S. Annie, RO. Prabhu, S. Malini, 2006,Activity of Wedelia calendulacea Less. inpost-menopausal osteoporosis,Phytomedicine 13,43 -48.

11. F.M. Lin, L.R Chen, E.H. Lin, F.C. Ke, H.Y.Chen, M. Tsai, and P.W. Hsiao, 2007,Compound from Wedelia chinesnsissynergistically suppress androgen activity andgrowth in prostate cancer cells,Carcinogenesis 28 (12),2521- 2529.

12. T.Prakash, N.R RaoA.H.M.V. Swamy,2008,Neuropharmacological studies on Wedeliacalendulacea Less stem extract,Phytomedicine 15,959-970.

13. S. Tewtrakul, S. Subhadhirasakul, S.Cheenpracha, anD C. Karalai, 2007, HIV-lProtease and HIV-l integrase inhibitorysubstances from Eclipta prostrate,Phytotherapyresearch, 21,1092-1095.

14. S. Dalal, S.K. Kataria, K.V. Sastry, S.V.S.Rana, 2010, Phytochemical screening ofmethanolic extract and antibacterial activityof active principles of hepatoprotective herb,eclipta alba,Ethnobotanical Leaflets 14:248-58.

15. M.B. Patel, & S.H. Mishra, 2006,-A SimpleSpectrofluorometric estimation ofwedelolakton in methanol extract of Ecliptaalba, Pharmacognosy Magazine 2, (7), 168 -171.

16. Pallavi Rai, & S.H. Mishra, 2007,Development of a simple and sensitivespectrophotometric method for thesimultaneous determination of asiaticosideand wedelolakton in a polyherbalformulation, Pharmacognosy Magazine 2,(7),47-51.

17. K.P. Unnikhrishnan, Anu Fhatima, K.M.Hashim, I. Balachandran, 2007, AntioxidantStudies andDetermination ofWedelolakton in

7

Eclipta Albae, Journal of Plant Sciences2(4):459-464.

18. R.M. Thorat, Y.M. Jadhav, V.J. Kadam, S.S.Kamble, K.P.Salaskar,2009, Development ofHPTLC method for estimation ofWedelolakton, Quercetin and Jatamason inPolyherbal Formulation, International JournalofChemTechResearchCODEN(USA), I (4),1079-1086.

19. M.D. Phale, P.D. Hamrapurkar, M.A.Chachad, 2010, Precise and SensitiveHPTLCMethod for Quantitative Estimation ofWedelolactone in Eclipta Alba Hassk,Pharmacophore, 1(2), 103-111.

20. N.S. Wani, T.A.Desmukh, Y.R.Patil, 201O,ARapid Densitometric Method forQuantification of Wedelolactone in HerbalFormulation using HPTLC, J. Chern. Metrol,4(1),28-33.

21. K. Savita, K. Prakashchandra, 2011,Optimization of Extraction Conditions andDevelopment of Sensitive HPTLC Methodfor Estimation of Wedelolactone in differentextracts of Eclipta alba, International Journalof Pharmaceutical Sciences and DrugResearch, 3(1): 56-61.

8

22. M.N. Prajapati, T.A. Deshmukh, Y.R. Patil,B.K. Shrikhande, 2011, Development andValidation of HPTLC Method forSimultaneous Determination ofWedelolactoneandPhyllanthin inHepasuportTablet,DerPharmacia Sinica,2(4):140-147.

23. H. Yuan,Yunli, Zhao, Xiaoying, Wang, QianTang, Xiaoxia Gao, Zhiguo Yu, 2007,Simultaneousdetermination ofwedelolactoneand isodernetil-wedelolactone in herba ecliptaby reverse-phase high performance liquidchromatography,SePu, 25(3), 371-373.

24. K. Danzer 2010, Analytical Chemistry,Theoretical and Metrological Fundamentals,Springer-Verlag,BerlinHeidelberg.

25. AOAC, 2000, OfficialMethods ofAnalysis ofAOAC International, 17 th ed, AOACInternational,Gaithersburg,Maryland,USA.

26. ICH-Q2B, 1996, Validation of AnalyticalProcedures: Methodology, Guidance forIndustry, International Conference ofHarmonization,Geneva.

27. T. Farrant, 1997, Practical Statistic for theAnalytical Scientist, The Royal Society ofChemistry,LGCTeddington,Cambridge.

JKTI, Vol. 14, No.1, Juni 2012