NGAL: il nuovo macatore per il danno renale acuto · monitoraggio dei pazienti con scompenso...

lavoro di diploma:

NGAL: il nuovo marcatore per il

danno renale acuto

Tania Morisoli tecnico in analisi biomediche – 3° anno

scuola superiore medico tecnica Locarno 2010/2011

responsabile: dott. Roberto Della Bruna consulente: dr. med. Hans Stricker

Ospedale Regionale di Locarno

Tania Morisoli TAB3 lavoro di diploma 2010/2011

NGAL, il nuovo marcatore per il danno renale acuto 2

ABSTRACT

Introduction The kidneys receive and filter the blood, producing a concentrate containing all the waste to eliminate, the urine. If the kidney is damaged, this process does not work normally and toxic substances accumulate in the body, causing problems. Today in routine, in order to evaluate renal function, creatinine is measured, because it is produced fairly consistantly, filtered by the kidneys but not reabsorbed. Through its value we can apply the formulas that will give us an indication of how the filtration works. Should there be a kidney problem, the creatinine will be accumulated in the plasma, giving us an indication of kidney damage. NGAL may be an alternative for the future, as in the case of kidney damage it increases more sharply and quickly, leading to an early diagnosis.

Objective The purpose of this study was to evaluate whether the parameter NGAL is more helpful in the early diagnosis of acute kidney damage than the currently used creatinine.

Materials and methods Sample: plasma EDTA Equipment: Triage® Meter Kit Triage® NGAL Test Method: fluorescence immunoassay

Results and discussion The results were analyzed statistically and with the help of a doctor. The two parameters are related to each other, but due to the small sample size and the random selection of patients is not possible to confirm the utility of NGAL.

Conclusion This study has laid the foundation on how to continue the evaluation of this parameter in future. We must continue with further study, analyze more samples, and making more careful choices in enrolling patients.

RIASSUNTO

Introduzione I reni ricevono e filtrano il sangue ottenendo, alla fine un concentrato contenente tutte le scorie da eliminare, cioè l’urina. Se il rene subisce dei danni questo processo non avviene più normalmente e si accumulano sostanze tossiche all’interno del corpo causando dei problemi. Oggi in routine, per valutare la funzionalità renale, si misura la creatinina, in quanto viene prodotta in modo abbastanza costante, filtrata dai reni ma non riassorbita. Al suo valore possono essere applicate delle formule che ci danno l’indicazione sulla filtrazione. Dovesse esserci un problema ai reni, essa si accumulerebbe nel plasma segnalandoci un danno renale. NGAL potrebbe essere una valida alternativa per il futuro, in quanto in caso di danno renale aumenta in modo più marcato e veloce portando ad una diagnosi precoce.

Obiettivo L’obiettivo di questo studio è valutare se il parametro NGAL porta realmente ad una diagnosi precoce di danno renale acuto rispetto alla creatinina usata attualmente.

Materiali e metodi Prelievi: plasma EDTA Apparecchio: Triage® Meter Kit Triage® NGAL Test Metodo: immunodosaggio a fluorescenza

Risultati e discussione I risultati sono stati analizzati statisticamente e con l’aiuto di un medico. I due parametri risultano correlati tra loro, ma il numero ridotto di campioni e la selezione casuale dei pazienti non permettono di confermare l’utilità di NGAL.

Conclusione Questo studio ha messo le fondamenta su come proseguire nella valutazione di questo parametro in futuro. Bisogna proseguire con ulteriori studi, analizzare più campioni e scegliere meglio i pazienti da arruolare.



INDICE:

1 Introduzione: i reni e la loro diagnostica .............................................................................................. 4

1.1 Il sistema renale ............................................................................................................................. 4

1.1.1 I reni ........................................................................................................................................ 4

1.1.2 La filtrazione ............................................................................................................................ 5

1.2 Danni .............................................................................................................................................. 6

1.2.1 L’insufficienza renale acuta .................................................................................................... 6

1.2.2 L’insufficienza renale cronica .................................................................................................. 6

1.3 Marcatori dell’insufficienza renale .................................................................................................. 7

1.3.1 La creatinina e la velocità di filtrazione glomerulare ............................................................... 7

1.3.2 Cistatina C .............................................................................................................................. 7

1.3.3 NGAL ...................................................................................................................................... 7

2 Obiettivo ............................................................................................................................................... 8

3 Materiali e metodi ................................................................................................................................. 8

3.1 Materiale ........................................................................................................................................ 8

3.1.1 Campioni ................................................................................................................................. 8

3.1.2 Apparecchio ............................................................................................................................ 8

3.2 Metodo ........................................................................................................................................... 9

4 Risultati .............................................................................................................................................. 10

4.1 Elaborazione statistica ................................................................................................................. 12

4.1.1 Correlazione di Spearman .................................................................................................... 12

4.1.2 Kappa di Cohen .................................................................................................................... 14

4.2 Valutazione odierna e casi di misure seriali ................................................................................. 15

5 Discussione ........................................................................................................................................ 16

6 Conclusione ....................................................................................................................................... 18

7 Ringraziamenti ................................................................................................................................... 18

8 Bibliografia ......................................................................................................................................... 19

8.1 Indice delle figure ......................................................................................................................... 19

9 Allegati ............................................................................................................................................... 20

9.1 Allegato I ...................................................................................................................................... 20

9.2 Allegato II ..................................................................................................................................... 21

9.3 Allegato III .................................................................................................................................... 22

9.4 Allegato IV .................................................................................................................................... 23

9.5 Allegato V ..................................................................................................................................... 24



1 INTRODUZIONE: I RENI E LA LORO DIAGNOSTICA

Il mio lavoro di diploma riguarda NGAL (Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin, in italiano Lipocalina Associata alla Gelatinasi Neutrofila), un nuovo marcatore che dovrebbe aiutare nella diagnostica precoce del danno renale acuto.

Il lavoro è stato suggerito dal dr. med. Hans Stricker, capo servizio di angiologia presso l’ospedale regionale di Locarno, in quanto questo nuovo parametro potrebbe essere utile nel monitoraggio dei pazienti con scompenso cardiaco. Queste persone ricevono farmaci diuretici per correggere l’insufficienza cardiaca, ma questa terapia va ben monitorata e bisogna cercare un equilibrio in cui si riesca a tenere sotto controllo il problema cardiaco senza però far insorgere (o peggiorare) l’insufficienza renale, a questo proposito NGAL potrebbe essere la soluzione ideale in quanto dovrebbe dare indicazioni diagnostiche in tempi più rapidi rispetto alla creatinina usata attualmente [1].

1.1 IL SISTEMA RENALE

Per capire come vengono scelti i marcatori della funzionalità renale si deve avere una conoscenza di anatomia e fisiologia dei reni, quindi di seguito alcune informazioni base per comprendere il meccanismo di filtrazione di questi organi (sono responsabili anche di altri processi, ma non toccando l’argomento trattato in questo lavoro non verranno citati).

1.1.1 I RENI

I reni sono due organi a forma di fagiolo posti nella cavità addominale, ai lati della colonna vertebrale. Essi ricevono il sangue e lo filtrano tramite apposite strutture ottenendo, alla fine di tutto il processo, un concentrato contenente tutte le scorie da eliminare, cioè l’urina.

Sezionandoli si evidenziano macroscopicamente due zone distinte: all’esterno la corticale e all’interno la midollare che è costituita da diverse unità dette piramidi renali al cui apice si trova una papilla renale.

All’osservazione microscopica risultano costituiti da svariate migliaia di nefroni, i quali rappresentano l’unità funzionale del rene (cioè la più piccola porzione di rene in grado di produrre l’urina). I nefroni sono a loro volta costituiti da un corpuscolo renale (capsula di Bowman e glomerulo), un tubulo contorto prossimale, un’ansa di Henle ed un tubulo contorto distale, quest’ultimo scarica poi in un tubulo collettore che si apre al livello della papilla renale da dove l’urina gocciolerà fino ad accumularsi nel bacinetto renale ed in seguito sarà veicolata negli ureteri, per poi proseguire il percorso verso la vescica e la successiva espulsione dal corpo umano [2].

Figura 1: localizzazione dei reni



Figura 2: disegno riassuntivo sulla filtrazione renale

1.1.2 LA FILTRAZIONE

Per formare l’urina si riscontrano vari processi: l’ultrafiltrazione, il riassorbimento e l’escrezione.

Attraverso i reni vengono filtrati circa 180 litri di plasma al giorno.

Nella filtrazione il plasma passa dai capillari glomerulari alla capsula di Bowman, ottenendo così l’ultrafiltrato. Questo processo è poco selettivo, in quanto tutte le piccole molecole passano il filtro (sia i rifiuti sia le sostanze ancora utili), in seguito nei tubuli vengono riassorbite in modo selettivo le sostanze ancora utili all’organismo. Nei tubuli avviene però anche una secrezione di sostanze dal sangue al filtrato, ciò permette la regolazione di vari sistemi presenti nel corpo.

Nel corso di alcune patologie compaiono nell’urina composti che normalmente non sono presenti, o lo sono solo in tracce.

Per misurare la funzionalità renale abbiamo bisogno di una sostanza che sia filtrata senza difficoltà e che, durante il suo percorso lungo i tubuli renali, non dev’essere né secreta né riassorbita [2].



1.2 DANNI

Per svariati motivi, i reni possono venire danneggiati e quindi portare a delle patologie. Esse sono di diverso tipo a seconda dell’insulto subito dall’organo, l’insufficienza renale che ne consegue può essere di due diversi tipi: acuta o cronica.

1.2.1 L’INSUFFICIENZA RENALE ACUTA

L’insufficienza renale acuta (IRA) è una diminuzione improvvisa (ore fino a giorni) della filtrazione renale che porta quindi ad una diminuita escrezione di prodotti di scarto che andranno così ad accumularsi nel sangue. Questa situazione può risultare grave e se non diagnosticata in breve tempo può portare ad un peggioramento della qualità di vita del paziente (dialisi) o addirittura alla sua morte.

Le cause principali della sua insorgenza sono le sepsi generalizzate, agenti nefrotossici (farmaci, mezzi di contrasto) ed interventi chirurgici (possibile riduzione/mancanza di sangue a livello renale) [3].

Per valutarla esistono vari criteri, per fare chiarezza e dare delle linee guida univoche per tutti un gruppo americano denominato Acute Dialysis Quality Initiative (ADQI) ha stilato una classificazione chiamata RIFLE basata sui seguenti criteri:

Tabella 1: classificazione RIFLE

criteri GFR Diuresi

Risk (rischio)

Aumento della creatinina sierica di 1.5 volte o diminuzione della GFR* di 25 – 50%

meno di 0,5 ml/kg per oltre 6 ore

Injury (danno)

Aumento della creatinina sierica di 2.0 volte o diminuzione della GFR di 50 – 75%

meno di 0,5 ml/kg per oltre 12 ore

Failure (insufficienza)

Aumento della creatinina sierica di 3.0 volte o diminuzione della GFR > 75% oppure creatinina ≥ 350 µmol/L (se si è osservato un aumento acuto di almeno 44 µmol/L)

meno di 0,3 ml/kg per oltre 24 ore (oliguria) o anuria per 12 ore

Loss (perdita)

Insufficienza renale acuta persistente; perdita completa della funzionalità renale durante più di 4 settimane

End-stage renal disease (malattia renale terminale)

Stadio terminale della malattia renale durante più di 3 mesi

Come detto in precedenza questa sindrome può risultare grave, per questo motivo si è alla ricerca di marcatori sempre più sensibili e rapidi per cercare di diagnosticarla precocemente.

1.2.2 L’INSUFFICIENZA RENALE CRONICA

Una malattia viene considerata cronica quando persiste per più di 3 mesi.

Anche l’insufficienza renale cronica è una diminuzione della filtrazione renale, ma in questo caso la funzionalità viene persa in modo lento e graduale, quindi rende possibile l’attuazione di misure che ne rallentano l’evoluzione e le complicazioni favorendo la qualità di vita del paziente.

ripresa da http://www.viomecum.ch/index.cfm?9E279853BCDDC0C492883453A0D7763E *GFR: Glomerular Filtration Rate, in italiano VFG velocità di filtrazione glomerulare (vedi pagina 7, punto 1.3.1)



1.3 MARCATORI DELL’INSUFFICIENZA RENALE

1.3.1 LA CREATININA E LA VELOCITÀ DI FILTRAZIONE GLOMERULARE

La creatinina è uno dei composti più abbondanti che viene eliminato con l’urina. È il prodotto di degradazione della creatina, sostanza usata dai muscoli per contrarsi, viene prodotta in modo abbastanza costante (la quantità dipende dalla massa muscolare e dall’età), viene filtrata dai reni ma non riassorbita, quindi è un buon indicatore della funzionalità renale. Dovesse esserci un problema renale, essa non viene filtrata alla normale velocità accumulandosi nel plasma e ciò indicherà che qualcosa non funziona, questo però solo dopo circa 48 ore dall’evento.

Ad esempio, nel reparto di radiologia, la creatinina viene dosata allo scopo di individuare i pazienti con insufficienza renale preesistente per i quali il rischio di sviluppare un’insufficienza renale acuta da mezzo di contrasto aumenta esponenzialmente in relazione ai valori basali di creatinina (istruzioni operative EOLAB, SOP D-10-201).

La determinazione della creatinina, in routine presso EOLAB, avviene tramite il metodo Jaffé cinetico modificato eseguito sull’apparecchio Beckmann DxC800 o DxC600.

Il valore normale della creatinina è diverso tra uomini e donne (in quanto dipendente dalla massa muscolare), i valori di riferimento in EOLAB sono: - uomo: < 106 µmol/L - donna: < 90 µmol/L

Tramite il valore della creatinina è poi possibile ottenere l’informazione sulla velocità di filtrazione glomerulare (GFR, ossia Glomerular Filtration Rate). Questo valore dà realmente l’indicazione su come lavorano i reni. La si può stimare utilizzando svariate formule, le più usate sono la clearance secondo Cockroft-Gault (tramite età e peso del paziente) oppure la GFR secondo MDRD (età).

Un valore di GFR inferiore a 60 ml/min/1,73 m2 è considerato patologico.

1.3.2 CISTATINA C

La Cistatina C è una proteina prodotta in modo endogeno ed indipendente da tutte le cellule del corpo, viene filtrata dai glomeruli, riassorbita nei tubuli e poi degradata, per questo motivo è anch’essa utilizzata come marcatore dell’insufficienza renale. Il suo aumento avviene in modo proporzionale all’insufficienza renale nel giro di circa 24 ore. La Cistatina C è un marcatore più sensibile rispetto alla creatinina perché non è influenzata da metaboliti e/o medicamenti [4].

Presso EOLAB questo parametro viene misurato in nefelometria al laboratorio d’immunologia clinica (LC-CIC) di Bellinzona. I valori di riferimento sul siero sono di 0.50 -0.96 mg/l.

1.3.3 NGAL

NGAL (Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin, ovvero Lipocalina Associata alla Gelatinasi Neutrofila), è una proteina umana da 25 kDa presente fisiologicamente a livelli molto bassi in numerosi tessuti. È una piccola proteina, espressa in modo fisiologico sui neutrofili (fa parte dell’immunità innata, sintetizzata in caso di presenza di patogeni ed ha il ruolo di legare il ferro sottraendolo ai batteri ed inibendone la crescita [5]) e anche sulle cellule epiteliali dove però la sua funzione non è ancora chiara. Allo scopo di trovare un marker più sensibile al danno renale acuto, diverse ricerche hanno mostrato che questa proteina aumenta in modo significativo e velocemente (nel giro di un paio di ore) in caso di danneggiamento delle cellule renali fornendo così in anticipo informazioni sul rischio di sviluppare un’insufficienza renale acuta [6].

Il valore di riferimento fornito dal produttore è: < 149 ng/mL.



2 OBIETTIVO

L’obiettivo del mio lavoro di diploma è valutare, in uno studio preliminare e con la collaborazione di un medico, il comportamento del parametro NGAL rispetto alla creatinina usata attualmente, questo per verificare se effettivamente questa nuova analisi può portare ad una diagnosi precoce di danno renale acuto e quindi valutare se proseguire con degli altri studi per l’introduzione nella routine di laboratorio.

3 MATERIALI E METODI

3.1 MATERIALE

3.1.1 CAMPIONI

I campioni utilizzati in questo studio sono 46 ed il materiale è plasma anticoagulato con EDTA [allegato I].

Per la determinazione di NGAL sono stati scelti i pazienti per i quali è stata richiesta l’analisi BNP (Brain Natriuretic Peptide, marker dell’insufficienza cardiaca) ricevuti dal laboratorio dell’Ospedale Regionale di Locarno nei mesi di marzo ed aprile, questo perché spesso i pazienti con insufficienza cardiaca sviluppano nel corso del loro trattamento anche un’insufficienza renale, quindi sono considerati pazienti a rischio. Inoltre il materiale di questo prelievo è lo stesso di quello necessario per la misurazione di NGAL ed in questo modo siamo sicuri di avere pure il valore del BNP che servirà al medico (dr. Hans Stricker, Ospedale Regionale di Locarno, capo servizio angiologia) per eseguire la sua valutazione, in quanto lo scompenso cardiaco è trattato con diuretici e questa terapia dev’essere monitorata per evitare l’insorgenza o un peggioramento dell’insufficienza renale [7].

All’arrivo di questi campioni in laboratorio, il personale ha effettuato le analisi richieste ed in seguito ha provveduto ad etichettarlo, aliquotarlo e congelarlo in attesa di eseguire la misurazione di NGAL [allegato I].

3.1.2 APPARECCHIO

Per l’analisi di NGAL è stato utilizzato l’apparecchio Triage® Meter ed i test forniti nel kit Triage® NGAL Test (LOT: W47283B, exp.: 15.10.2011)

I test a disposizione erano 50 (2 scatole da 25 test ciascuna).

Visto l’esiguo numero di test, le misurazioni non sono state fatte in doppio, in quanto si voleva avere più dati provenienti da pazienti diversi da poter analizzare.

La sensibilità analitica (cioè la più bassa concentrazione rilevabile distinguibile dallo zero) è stata determinata dal produttore e si attesta a 60 ng/mL, mentre il valore massimo è di 1300 ng/mL [allegato II].

Inoltre il produttore ha analizzato eventuali interferenze dovute a farmaci, essi sono stati analizzati a concentrazioni doppie rispetto alla dose terapeutica massima senza rilevare nessuna reattività significativa [allegato II].

Il marchio Triage® è prodotto da Biosite Inc., San Diego (incorporata nel gruppo Inverness Medical), apparecchio e test sono invece forniti da Alere GmbH (vecchia denominazione: MEDIM Schweiz GmbH).



Figura 3: dispositivo NGAL e Triage® Meter

3.2 METODO

ll Triage® NGAL Test è un rapido immunodosaggio a fluorescenza point-of-care testing (POCT, in questo caso l’analisi può essere eseguita nelle vicinanze della stanza del paziente anche se non direttamente al suo letto, riducendo comunque i tempi d’attesa del risultato) per l’uso con i Triage® Meter per la determinazione quantitativa rapida di NGAL nei campioni di sangue intero o plasma con EDTA come anticoagulante [allegato III].

Sul pozzetto dell’apposito dispositivo vengono dispensate delle gocce del campione (in questo caso plasma EDTA), questo per azione capillare scorrerà lungo il dispositivo reagendo così con i coniugati anticorpali fluorescenti. La presenza dell’analita nel campione impedisce ai coniugati fluorescenti di legarsi alla fase solida della zona di rilevazione, in questo modo la concentrazione dell’analita è correlata in modo inverso alla fluorescenza rilevata dall’apparecchio Triage® Meter [allegato III].



4 RISULTATI

I campioni sono stati analizzati sull’apparecchio Triage® Meter in uso presso il laboratorio dell’ospedale regionale di Locarno.

La misurazione di NGAL non è mai stata fatta su questa macchina, quindi come primo passo va installato sull’apparecchio, seguendo la procedura descritta sul foglio illustrativo, l’apposito code chip fornito in ogni singolo kit Triage® NGAL Test. All’interno di questo chip vi sono tutte le informazioni riguardanti il kit in questione (numero di lotto, data di scadenza, ambito dei controlli, valori normali dell’analita, …) ed esse vengono poi trasferite nella memoria dell’apparecchio dove resteranno memorizzate ed utilizzate per l’analisi del parametro.

In seguito dev’essere controllato lo stato dell’apparecchio (calibrazione, laser, allineamento), ciò viene eseguito tramite l’apposito dispositivo fornito dalla ditta assieme all’apparecchio. Il dispositivo viene inserito nella macchina ed esegue automaticamente il controllo. Tutto è risultato in ordine.

Ogni kit contiene anche due materiali di controllo a concentrazioni diverse, questi vengono sempre analizzati prima di iniziare il lavoro per controllare che lo strumento misuri in modo preciso ed accurato. Ho quindi eseguito questi controlli ed il loro valore risultava nell’ambito fornito dal produttore [allegato IV].

Appurato che l’apparecchio funziona in modo corretto, ho ritirato i test dalla cella frigorifera portandoli a temperatura ambiente e scongelato i campioni iniziando così le misurazioni di NGAL.

Il procedimento seguito per eseguire l’analisi è riportato nell’allegato V.

Nella tabella 2 sono riportati i risultati ottenuti per NGAL, quelli ricercati nel sistema informatico dell’ente ospedaliero riguardanti la creatinina ed il BNP (quest’ultimo utile per le considerazioni del medico) ed il valore della velocità di filtrazione glomerulare ottenuto con la formula MDRD.

I dati sono stati suddivisi in base alla creatinina (normale o patologica), in quanto essa è il metodo di riferimento attuale.

Si possono vedere in verde i risultati normali ed in rosso i valori patologici.



Tabella 2: risultati completi

CREATININA NORMALE CREATININA AUMENTATA

NGAL ng/mL

CREA µmol/L

GFR MDRD

BNP ng/L

NGAL ng/mL

CREA µmol/L

GFR MDRD

BNP ng/L

102 39 134 76 106 96 47 163

77 55 92 1520 109 105 44 377

<60 66 74 - 147 113 53 1290

< 60 66 79 104 < 60 117 54 579

143 68 71 1080 86 117 52 77

72 70 68 111 130 128 34 112

98 72 94 234 68 173 25 1710

< 60 73 67 51 136 177 32 1650

119 75 64 40 148 180 34 1160

72 80 83 170 143 188 23 747

112 88 53 117 180 106 42 395

89 105 61 1770 313 140 31 422

209 56 90 724 274 147 40 639

450 68 101 94 402 150 40 301

227 88 70 280 201 165 35 340

190 95 69 212 274 176 25 45

251 106 59 384 259 186 23 726

Valori di riferimento: - creatinina (EOLAB): uomo: < 106 µmol/L donna: < 90 µmol/L - MDRD (EOLAB): > 60 ml/min/1,73 m2 - BNP (EOLAB): < 78 ng/L - NGAL (produttore): < 149 ng/mL

375 190 22 325

760 194 29 588

399 197 22 504

437 212 25 1360

330 214 19 669

294 216 19 117

300 216 19 1120

634 229 24 1010

342 240 17 1040

278 249 16 1210

251 278 15 -

667 460 11 -

I risultati sono stati analizzati in modo statistico e tramite il parere del medico consulente.



4.1 ELABORAZIONE STATISTICA

I risultati ottenuti sono stati analizzati tramite diversi test statistici per ottenere diverse informazioni. Sono stati eseguiti con il software Analyse-it (versione 2.20) in uso presso l’ente ospedaliero cantonale.

4.1.1 CORRELAZIONE DI SPEARMAN

NGAL e creatinina sono indicatori di un danno renale, per vedere in che relazione si pongono i due parametri è stata eseguita la correlazione secondo Spearman.

Per eseguirlo sono stati scartati i quattro risultati in cui NGAL è risultato inferiore a 60 ng/mL, in quanto questa misura non è accettata dal programma grafico e potrebbe comunque rappresentare qualsiasi valore.

Grafico 1: correlazione secondo Spearman - dati grezzi

Dal grafico 1 si osserva un coefficiente di correlazione R di 0.63 con una p inferiore a 0.0001, quindi si può dire che esiste una significativa relazione tra i due parametri.



outlier scartato (scostato dalla mediana di più di 3 volte la distanza interquartile)

valori fuori limite (scostamento dalla mediana tra 1.5 e 3 volte la distanza interquartile, ancora considerati nella norma)

valore adiacente superiore

quartile superiore (Q3)

mediana quartile inferiore (Q1)

valore adiacente inferiore

Tramite l’analisi box and whiskers plot ho analizzato, con l’aiuto del docente di statistica, i dati per verificare se vi erano degli eventuali outliers, questi sono dei valori anomali rispetto agli altri dati della distribuzione (si discostano dalla mediana di più di 3 volte la distanza interquartile) e possono avere una grande rilevanza. Si è trovato un dato posto in questa situazione (coordinata 194:760). Rifacendo la correlazione secondo Spearman senza questo dato il coefficiente di correlazione ed il valore p non sono cambiati, quindi, in questo caso, il valore anomalo non ha conseguenze sulla distribuzione ottenuta.

Grafico 2: analisi dei dati tramite box and whiskers plot

Grafico 3: correlazione secondo Spearman – senza dato anomalo (outlier)



Ho inoltre provato ad osservare, sempre tramite la correlazione di Spearman, la relazione tra i valori di NGAL e quelli della velocità di filtrazione glomerulare secondo MDRD. In questo caso la dispersione risulta inversa rispetto a prima, in quanto il valore della GFR diminuisce all’acuirsi della patologia, per questo motivo il coefficiente di correlazione risulta negativo.

Il coefficiente di correlazione R risulta minore rispetto al grafico in cui si sono analizzati creatinina ed NGAL, ma si può comunque dire che anche in questo caso i due parametri sono correlati in modo piuttosto significativo.

Grafico 4: correlazione secondo Spearman - relazione tra GFR MDRD ed NGAL

4.1.2 KAPPA DI COHEN

La Kappa di Cohen è un indice di concordanza, in uno schema vengono messi a confronto i risultati normali e patologici risultanti da entrambi i parametri e tramite un calcolo si determina la Kappa che dà l’indicazione sulla concordanza (più è vicina a 1 e più i parametri concordano).

Ho analizzato in questo modo le due varianti (crea/NGAL e GFR/NGAL) ed in entrambi i casi il valore di Kappa è risultato di 0.34, quindi i dati concordano tra loro solo in modo mediocre. Tabella 3: concordanza tramite Kappa di Cohen



4.2 VALUTAZIONE ODIERNA E CASI DI MISURE SERIALI

Dopo circa due mesi dalle misurazioni, ho ricercato i pazienti dove i risultati di creatinina ed NGAL non concordavano ed ho osservato come si è evoluta nel tempo la loro situazione. In tutti i casi i pazienti non hanno sviluppato danni renali, quindi anche nei casi dove NGAL risultava aumentato rispetto alla creatinina non si è manifestato nessun problema renale.

Casualmente, tra i campioni presi in considerazione, c’è stata una paziente degente a cui si è misurato in diversi momenti il BNP e quindi ogni prelievo è stato conservato anche per NGAL.

Questo è l’unico caso con più di due misurazioni ed è stato reputato interessante anche da parte del medico.

Dalla tabella 4 e dal grafico 5 si vede l’andamento nel tempo dei vari parametri, si nota come lo scompenso cardiaco oscilli molto nel tempo, mentre i parametri renali rimangono piuttosto stabili anche se aumentati rispetto alla normalità:

Tabella 4: risultati riguardanti la stessa paziente in giorni diversi

DATA NGAL ng/mL CREA µmol/L GFR MDRD BNP ng/L

16.2. 143 188 23 747

20.3. 330 214 19 669

8.4. 259 186 23 726

12.4. 300 216 19 1120

15.4. 342 240 17 1040

19.4. 278 249 16 1210

grafico 5: andamento dei valori su più misurazioni nella stessa paziente

Paziente SF, 21.5.1935

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

16.2. 20.3 8.4. 12.4. 15.4. 19.4.

date misurazioni

valo

ri d

ei p

aram

etri

NGAL

CREA

BNP

GFR



Nel grafico 6 è rappresentato un secondo paziente molto interessante, ci sono solo due misurazioni, ma si vede bene come la creatinina rimanga stabile mentre NGAL aumenta seguendo l’andamento del BNP. Questo paziente è conosciuto dal medico e soffre di un’insufficienza renale cronica ed è anche in terapia per lo scompenso cardiaco. In questo caso si può presupporre la presenza di un danno renale acuto rilevato da NGAL, ma non ancora dalla creatinina.

Grafico 6: andamento dei parametri nel corso del tempo per il paziente LA

Paziente LA, 28.09.1935

0

200

400

600

800

1000

1200

8.3 21.3

date misurazioni

valo

ri d

ei p

aram

etri

NGAL

CREA

BNP

GFR

5 DISCUSSIONE

Le misurazioni tramite il Triage® Meter non hanno dato nessun problema essendo l’apparecchio di facile utilizzo ed intuitivo. L’apparecchio viene già usato per l’analisi di BNP ed è quindi un’attrezzatura già conosciuta e a disposizione del laboratorio.

In seguito a questo studio, ho potuto notare che per valutare un nuovo parametro bisogna tenere conto di molti fattori, soprattutto il fatto che sia nuovo può essere una limitazione, in quanto i valori attesi sono dati dal produttore e non risalgono ad una storia passata come invece succede per la creatinina. Quest’ultima viene misurata tramite il metodo Jaffé da più di 100 anni, quindi è molto ben rodata e conosciuta. Probabilmente una conoscenza più approfondita di NGAL porterà a nuove informazioni, a valori di riferimento più precisi e quindi anche ad un migliore uso di questa analisi.

Nella letteratura odierna [8] si parla molto di NGAL, gli studi in corso prendono in considerazione dei pazienti che presentano delle condizioni a rischio di danno renale acuto, come ad esempio quelli sottoposti ad interventi cardiaci. Questi pazienti vengono poi seguiti con una tempistica ben definita proprio per sorvegliare l’andamento dei parametri nel tempo e trovare quello più precoce nella diagnosi di danno renale acuto. NGAL risulta un parametro promettente per il futuro.



Nel mio caso, il numero ridotto dei campioni analizzati non permette di confermare l’utilità del nuovo parametro nel determinare precocemente il danno renale acuto come descritto in letteratura. In alcuni casi il risultato di NGAL sembra comunque promettente (vedi grafici 5 e 6 nelle pagine precedenti), per cui studi futuri dovranno prevedere misure seriali, su un numero maggiore di campioni e su pazienti scelti (prendere esempio dagli studi già eseguiti).

I prelievi sequenziali sono stati da me proposti già in questo studio, ma discutendo con il medico consulente ho scoperto che per fare ciò bisogna rispettare una serie di condizioni, come la presentazione di un protocollo al Comitato Etico Cantonale ed inoltre avere il consenso scritto del paziente, in quanto gli verrebbe prelevato del sangue puramente per motivi di studio. Questa parte burocratica dovrà venire presa in considerazione in eventuali studi futuri, in quanto sono un tassello importante per valutare il nuovo parametro.

Anche la selezione dei pazienti doveva avvenire in modo più accurato, in quanto già leggendo la letteratura e parlando con il medico se ne era capita l’importanza. Però, per finire, i campioni sono stati raccolti in modo casuale, questo perché il tempo era limitato e la raccolta selezionata non ha funzionato all’interno dell’ospedale (probabilmente per la poca comunicazione, lo scarso interesse dalle persone non direttamente coinvolte ed anche perché io svolgevo il mio lavoro quotidiano all’ospedale regionale di Bellinzona e Valli, quindi non potevo avere sotto controllo e dedicare il tempo necessario a colmare queste lacune sul posto). Questo è stato un peccato, perché si sarebbe già potuti giungere a conclusioni più concrete.

Anche il medico consulente di questo lavoro di diploma ha confermato che la scelta dei pazienti doveva avvenire in modo selettivo, in quanto questo nuovo marker potrebbe essere molto utile anche nel monitoraggio dei pazienti con scompenso cardiaco trattati con diuretici, in quanto si arriva in una fase delicata in cui si deve trovare il giusto equilibrio nella dose di farmaco assunta dal paziente per controllare l’insufficienza cardiaca ma non provocare/peggiorare un’insufficienza renale. Attualmente il dosaggio del farmaco avviene in modo empirico, si decide la dose in base al peso del paziente e a seconda dell’esperienza del medico, quindi sarebbe molto utile avere un parametro che dia il più in fretta possibile delle informazioni sul danno renale per poter correggere al più presto la terapia.

Per quanto riguarda il mio studio, dopo aver analizzato i risultati come riportato nelle pagine precedenti si può dire che c’è una correlazione significativa, ma una scarsa concordanza tra i due parametri in esame. Questo risultato non deve però sorprendere, in quanto i due parametri sono entrambi indicatori di danno renale (e quindi correlati tra loro) ma comunque sostanzialmente diversi, visto che NGAL dovrebbe reagire più rapidamente a danni renali acuti rispetto alla creatinina. Questo spiega probabilmente la scarsa concordanza tra i due analiti, ma è anche il motivo per cui si è alla ricerca di un nuovo marker.

Sarebbe molto interessante effettuare anche un campionamento della popolazione sana per studiare e trovare i valori di riferimento giusti per NGAL, questo perché le diversità di sesso, razza, età, ecc… possono influenzarli e magari quello stabilito dal produttore americano non è in linea con la nostra popolazione.



6 CONCLUSIONE

In conclusione, dopo aver effettuato le misurazioni ed aver discusso con il dr. med. Hans Stricker ed il mio responsabile dott. Roberto Della Bruna, si può dire che NGAL e creatinina correlano in modo significativo, ma la concordanza tra i due risulta debole.

Al momento rimane il dubbio sull’efficienza di NGAL.

Questo studio ha messo le fondamenta su come proseguire nella valutazione di questo parametro in futuro, in quanto il prossimo eventuale passo dovrà obbligatoriamente tenere presente il reclutamento selettivo dei pazienti e le misure sequenziali per monitorarne l’andamento nel tempo. Inoltre la valutazione dovrà avvenire su un campione più ampio dei dati per avere più informazioni possibili.

Inoltre, in futuro, bisognerà anche valutare gli aspetti economici. In questo lavoro non sono stati considerati in quanto quest’analisi non è ancora presente nel tariffario nazionale.

7 RINGRAZIAMENTI

Ringrazio per la collaborazione nella raccolta dei campioni tutto il laboratorio dell’ospedale regionale di Locarno, in special modo la capo laboratorio Germana Tosi.

Ringrazio il dott. R. Della Bruna per la collaborazione nell’analisi statistica, per aver letto il mio lavoro ed avermi dato feedback per correzioni e miglioramenti.

Inoltre voglio ringraziare il dr. med. Hans Stricker per la collaborazione nel valutare il senso di NGAL nel quadro clinico riguardante il paziente e per la sua opinione a riguardo di questo nuovo parametro.

Ringrazio il direttore della scuola superiore medico tecnica A. Boffini ed il docente C. Naiaretti per le nozioni ed i consigli dati a livello metodologico, così come il docente G. Togni per avere anche lui letto il lavoro dandomi feedback e correzioni a riguardo. Per finire ringrazio il docente G. Pioda per i suggerimenti dati sull’analisi statistica e la docente S. Gilbert per le correzioni riguardanti la parte in inglese.



8 BIBLIOGRAFIA

[1] Bolignano D, Coppolino G, Lacquaniti A, Buemi M. From kidney to cardiovascular diseases: NGAL as a biomarker beyond the confines of nephrology. Eur J Clin Invest. 2010 Mar; 40(3):273-6.

[2] Bettinzoli F. Anatomia e fisiologia del sistema urinario (dispense scolastiche). 2008/2009

[3] Congresso nazionale ELAS, Bologna, 23-25 novembre 2009 relatore Claudio Galli, Abbott Diagnostic Italia

http://www.elasitalia.it/files/Bologna2009/05.pdf consultazione: 3.11.2010

[4] Unilabs, laboratorio d’analisi mediche: http://www.unilabs.ch/fileadmin/sites/unilabsch/files/infos_scientifiques/

2I%20InfosScientif%20Nr2%20InsuffRenale%20FINALE%202010%20IT.pdf consultazione: 5.2.2011

[5] Flo TH, Smith KD, Sato S, Rodriguez DJ, Holmes MA, Strong RK, Akira S, Aderem A. Lipocalin 2 mediates an innate immune response to bacterial infection by sequestrating iron. Nature 432, 2004 Dec. 16, 917-21.

[6] Klimmel M. Frühdiagnose des akuten Nirenversagens durch NGAL. Abbott Times, Nr. 2/2009, 16-9.

[7] Società Italiana di Farmacologia: http://www.farmacovigilanza.org/corsi/050915-06.asp consultazione: 29.4.2011

[8] Devarajan P. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL): a new marker of kidney. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 2008; 241: 89–94.

McCullough P, El-Ghoroury M, Yamasaki H. Early Detection of acute kidney Injury with Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin. J Am Coll Cardiol. 2011 Apr 26;57(17):1762-4.

Haase M, Devarajan P, Haase-Fielitz A, Bellomo R, Cruz DN, Wagener G, et al. The outcome of neutrophil gelatinase-associated lipocalin-positive subclinical acute kidney injury a multicenter pooled analysis of prospective studies. J Am Coll Cardiol. 2011 Apr 26;57(17):1752-61.

8.1 INDICE DELLE FIGURE

Titolo: dispositivo NGAL http://www.biosite.com/products/triage.aspx

Figura 1: localizzazione dei reni http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/imagepages/19615.htm

Figura 2: disegno riassuntivo sulla filtrazione renale http://library.thinkquest.org/08aug/00763/circ_sys.html

Figura 3: dispositivo NGAL e Triage® Meter http://www.biosite.com/products/triage.aspx



9 ALLEGATI

9.1 ALLEGATO I

Triage® NGAL Test, foglio illustrativo fornito nel kit, formato ridotto

tipo di materiale e conservazione

pagina 5:



9.2 ALLEGATO II


pagina 13:

pagina 15:



9.3 ALLEGATO III


pagina 1:

pagina 2:



9.4 ALLEGATO IV

controlli di qualità

valori ottenuti:

5.4.2011: 149 ng/mL

21.4.2011: 121 ng/mL

valori ottenuti:

5.4.2011: 773 ng/mL

21.4.2011: 733 ng/mL



9.5 ALLEGATO V


pagine 6 e 7:

NGAL: il nuovo macatore per il danno renale acuto · monitoraggio dei pazienti con scompenso...

Documents

Transcript of NGAL: il nuovo macatore per il danno renale acuto · monitoraggio dei pazienti con scompenso...