Neuroni piramidali del SNC che stanno crescendo su una matrice di glia/fibroblasti

Attività elettrica dei neuroni

Voltage clamp Col metodo del “voltage clamp” la membrana viene portata ad un potenziale fisso prestabilito e si registrano le correnti necessarie a mantenerla “bloccata” (”clampata”) a quel potenziale.

Un amplificatore differenziale (A) inietta nella cellula una corrente Im, proporzionale alla differenza tra un potenziale di comando (applicato all’ingresso “+”) ed il potenziale di membrana Vm (applicato all’ingresso “-”) .

Due risultati utili:a) Vm viene quasi portato a coincidere col potenziale di comando;b) la variazione di Vm è praticamente istantanea, cosicché la corrente capacitiva

(Ic=C dV/dt), anche se molto intensa, dura per un tempo brevissimo.Da quel momento in poi verrà registrata (ad un potenziale prestabilito, che viene

mantenuto costante) solo la corrente ionica

Neurone piramidale con un elettrodo di vetro attaccato per la derivazione delle correnti ioniche transmembranarie mediante la tecnica del (patch-) voltage-clamp

amplificatore

La derivazione delle correnti ioniche transmembranarie

0 10 20 30 40-70

20

(mV

)

Tempo (ms)

0 10 20 30 40-60

-40

-20

0

20

40

60C

orre

nte

ioni

ca (n

A)

Tempo (ms)

La tecnica del voltage-clamp consiste nel bloccare il potenziale di membrana ad un valore costante nel tempo e nel registrare le correnti ioniche

transmembranarie generate a tale potenziale di membrana

Potenziale di riposo (Vr)

Potenziale di membrana finale (Vm) costante

Corrente transmembranaria generata dal passaggio di Vm da –70 mV a +20 mV

Vantaggi del voltage-clamp:

In genere, gm = f(V,t) ma,

1. Vm è bloccato ad un valore costante gm = f(t) soltanto e può essere dedotto dall’andamento della corrente ionica Ii

2. E’ possibile separare Ii da Ic. Infatti cm è caricata istantaneamente

0 10 20 30 40-70

20

Vol

tagg

io (m

V)

Tempo (ms)

0 10 20 30 40-60

-40

-20

0

20

40

60

Cor

rent

e io

nica

(nA

)

Tempo (ms)

INa+IK

+ TTX (IK)

+ TEA (INa)

Separazione farmacologica delle correnti IK e INa

Il modello della gate di H&H assume una reazione cinetica del 1o ordine tra gli stati aperto e chiuso della particella di gating

C

O

Quindi, la probabilità della particella di trovarsi nello stato aperto può essere descritta da:

(1-Po)

Po

Trattandosi di una cinetica del 1o ordine, sarà:

ooo PP

dtdP )1(

Allo stato stazionario (equilibrio) sarà:quindi,

0)1( ooo PP

dtdP

oP

Considerazioni teoricheStudio del gating allo stato stazionario

Cor

rent

e K

+ (n

A)

0 10 20 30 40-20

0

20

40

60

80

100

120

140

Tempo (ms)

0 10 20 30 40

-70

Vol

tagg

io (m

V)

Tempo (ms)

-30-20-10

0102030405060

-30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60-20

0

20

40

60

80

100

120

140

I(K+ ) m

ax (n

A)

Voltaggio (mV)

Con

dutta

nza

(μS

)

-30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Voltaggio (mV)

IK=gK• (V-EK)

gK = IK/(V-EK)

EK=-80 mV

Voltaggio-dipendenza dei canali Kv

0 1 2 3 4

-70

Vol

tagg

io (m

V)

Tempo (ms)

-50-40-30-20-10

010203040

60

0 1 2 3 4-7-6-5-4-3-2-10

I(Na)

(nA

)

Tempo (ms)

-5-4-3-2-10

I(Na)

(nA

)

0 1 2 3 4Tempo (ms)

-50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 60

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

I(Na)

pic

co (n

A)

Voltaggio (mV)

-50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 400.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

Voltaggio (mV)

Con

dutta

nza

(μS

)

INa=gNa• (V-ENa)

gNa = INa/(V-ENa)

ENa=+50 mV

Voltaggio-dipendenza dei canali Na

Separazione della fase di attivazione della corrente di Na dall’inattivazione

La pronasi rimuove l’inattivazione

-80 -60 -40 -20 0 20 40-800

-600

-400

-200

0

Cor

rent

e di

Na

(nA

)

Voltaggio (mV)

-1200

-1000

-800

-600

-400

-200

0

Cor

rent

e (n

A)

0 10 20 30 40

tempo (ms)

-90-80-70-60-50-40-30-20-10

010

203040

Vol

tagg

io (m

V)

0 10 20 30 40

tempo (ms)

-80 -60 -40 -20 0 20 40

0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Con

dutt

anza

(S

)m

Voltaggio (mV)

0

0.5

1

Pro

b. c

anal

e ap

erto

Come risalire dai valori di conduttanza allo stato stazionario alla probabilità di trovare una singola gate del canale aperta

Grafico della conduttanza g(V) allo stato stazionario

Nel caso di un canale inattivante, esso è stato ottenuto rimuovendo l’inattivazione

-80 -60 -40 -20 0 20 40

0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Con

dutt

anza

(S

)m

Voltaggio (mV)

0

0.5

1

Pro

b. c

anal

e ap

erto

maxGgPo

oPVg )(

Ipotesi: l’attivazione del canale è regolata da x gates n uguali e indipendenti.

Allora, se n∞ è la probabilità di avere la singola gate n aperta allo stato stazionario, la probabilità Po di trovare il canale aperto allo stato stazionario (in assenza di inattivazione) sarà:

Probabilità composta: n·n·n…. (x volte)

Quindi, dai valori di Po si può risalire ai valori di n∞:

xo nP

xoPn

Gmax

0 1 2 3 4 5 6 7-120

-100

-80

-60

-40

-20

0

Vm

(mV

)

Tempo (ms)

Studio dell’inattivazione allo stato stazionario

-1.2

-1.0

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

I Na (

nA)

Tempo (ms)0 1 2 3 4 5 6 7

-120 -100 -80 -60 -40 -20 0

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Pro

babi

lità

gate

h a

perta

Cor

rent

e di

Na

(nA

)

Potenziale di condiz. (mV)

0

1

0.5

0 mV

Se si ipotizza che il processo di inattivazione sia regolato da un’unica gate (h), i valori in grafico sono proporzionali alla probabilità di trovare tale gate aperta allo stato stazionario

Il modello della gate di H&H assume una reazione cinetica del 1o ordine tra gli stati aperto e chiuso della particella di gating

C

O

Quindi, la probabilità della particella di trovarsi nello stato aperto può essere descritta da:

(1-Po)

Po

Trattandosi di una cinetica del 1o ordine, sarà:

ooo PP

dtdP )1(

Tempo-dipendenza del gating

Allo stato stazionario (equilibrio) sarà:quindi,

0)1( ooo PP

dtdP

oP

Se p particelle di gating indipendenti sono coinvolte nel gating del canale, allora il canale seguirà il seguente andamento temporale: po

channo tPtP )()(

Po(t)

Pro

b. D

i Atti

vaz.

Tempo

[Po(t)]p

0 2 4 6 8

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1/()= rappresenta la costante di tempo dell’attivazione ed è un indice della velocità di attivazione della particella di gating.

Risolvendo l’equazione differenziale del 1o ordine e applicando la condizione al contorno , si ottiene:)0(0 tPP oo

toooo ePPPtP )(00 1)()(

chiuso-70mV

aperto+60mV

Ipotesi: una sola gatePo=n(t)=n∞-(n∞-n0)∙exp(-t/τ)

0 10 20 30 40-70

60

Vol

tagg

io (m

V)

Tempo (ms)

0 10 20 30 40-20

020406080

100120140160

I(K)

Tempo (ms)

0 10 20 30 40

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Pro

b. d

i ape

rtura

(Po)

Tempo (ms)

I=g∙(V-E) ; gPo I(t)n(t)∙(V-E)

I=g∙(V-E) ; gPo=n4 I(t)n4(t)∙(V-E)

chiuso aperto

Ipotesi: quattro gates identichePo= n∙n∙n∙n = n4

n4(t)=[n∞-(n∞-n0)∙exp(-t/τ)]4

Cinetica delle correnti di K+ del canale Kv

1 gate

4 gates

Cinetica delle correnti di Na+ voltaggio-dipendenti

0 10 20 30 40-70

20V

olt.

(mV

)

Tempo (ms)

0 10 20 30 40-25

-20

-15

-10

-5

0

I(Na)

Tempo (ms)

Chiuso-70mV

Aperto+20mV

Ipotesi: tre gates identichePo=m3(t)=[m∞-(m∞-m0)∙exp(-t/τ)]3

Chiuso-70mV

Aperto+20mV

Inattivato+20mV

Ipotesi:tre gates identiche di

attivazione+

una gate di inattivazionePo=m3(t)∙h(t)

0 10 20 30 400.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Pro

b. d

i ape

rtura

(Po)

Tempo (ms)

m(t)

m3(t)

h(t)

m3*h

Il gating dei canalivoltaggio-dipendenti

Come fa il voltaggio ad aprire i canali?

Il controllo dell’attività dei canali per mezzo del voltaggio è la chiave che sta alla base dell’eccitabilità neuronale e del signalling

ovvero

Canali ionici voltaggio-dipendentiFamiglia di canali a 6 domini transmembrana (TM)

Il poro è delineato da 4 subunità o pseudosubunitàCiascuna contiene 6 segmenti TM (S1-S6) e una regione H5 (loop P)

Vi appartengono:Canali voltaggio-dipendenti del Na+, Ca2+ e K+

Canali del K+ Ca2+-attivatiCanali cationici attivati dall’iperpolarizzazione, ecc.

Questa è una delle 4 (pseudo)subunità

H5

I canali ionici voltaggio-dipendenti contengono sensori del voltaggio intrinseci

Il segmento S4 corrisponde al sensore del voltaggio

S1 S2 S3 S4 S5 S6P++

++

OUTIN

N

S1 S2 S3 S4 S5 S6P++

++S1 S2 S3 S4 S5 S6

P++

++S1 S2 S3 S4 S5 S6

P++

++

C

Ca2+ channel

S1 S2 S3 S4 S5 S6P++

++

OUTIN

N

S1 S2 S3 S4 S5 S6P++

++S1 S2 S3 S4 S5 S6

P++

++S1 S2 S3 S4 S5 S6

P++

++

CNa+ channel

OUTIN

N C

S1 S2 S3 S4 S5 S6P++

++K+ channel X 4

Nel canale del K+ “Shaker”, ciascun segmento S4 contiene 7 residui basici regolarmente distribuiti ogni 3 aa.

Canale chiuso: la 2a Arg di S4 è seppellita nel bilayer

Canale aperto: la 2a Arg fuoriesce dal lato extracell., mentre il 4o e 5o residui basici si muovono dal citosol all’interno del bilayer

-

-

+

+

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-

In

V

-

- +

+

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-Out

Attiva la spirale

2

5

4

2

4

5

Mutazioni in S4 Riducono il Movimento di Carica

ILRVIRLVRVFRIFKLSRHSKGL420

-2-4

q/n(e- charges)

1 2 3 4 5 6 7

R KR neutral AA

R=arginina

K=lisina

ILRVIRLVRVFRIFKLSRHSKGL420

-2-4

q/n(e- charges)

1 2 3 4 5 6 7

R KR neutral AA

Mutazioni in S4 Riducono il Movimento di Carica

MacKinnon_Nature01473.pdfMacKinnon_Nature01580.pdfMacKinnon_Nature01581.pdf

-60 -40 -20 0 20 40 60

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Con

dutta

nza

g

Vm (mV)

Confronto della voltaggio-dipendenza di gK e gNa