Modellazione matematica e codici di simulazione per la proliferazione, crescita e differenziazione...
-
Upload
crs4-research-center-in-sardinia -
Category
Documents
-
view
1.260 -
download
5
description
Transcript of Modellazione matematica e codici di simulazione per la proliferazione, crescita e differenziazione...
Modellazione matematica e codici
di simulazione per la
proliferazione, crescita e
differenziazione in vitro di cellule
Massimo Pisu CRS4 - Programma Bioingegneria - Settore Biomedicina
• Breve introduzione all’Ingegneria tissutale
• Coltivazioni cellulari e bioreattori
• Modellazione matematica e simulazione
• Risultati ottenuti: alcuni esempi
• Potenziali applicazioni
Indice degli argomenti
«L’Ingegneria Tissutale è un campo interdisciplinare della bioingegneria che applica
diversi principi dell’ingegneria e delle scienze biologiche allo scopo di ripristinare, mantenere o
migliorare funzioni di tessuti o organi»
Ingegneria Tissutale: Definizione
R. Langer and J.P. Vacanti, Science (1993)
• L’organo/tessuto può essere danneggiato per patologie, anomalie congenite, incidenti, interventi chirurgici
• Attualmente, per la cura di questi difetti del tessuto, si procede col trapianto d’organo o inserimento di altro tessuto dello stesso paziente, inserimento di dispositivi artificiali e trattamento farmacologico
Causa patologie e terapie correnti
Paradigma dell’Ingegneria Tissutale
cellule
scaffold
coltivazione in vitro tessuto ingegnerizzato
Esempio di ingegneria tissutale
P. Bianco, Nature, 2001
Stato dell’arte
J. Vacanti, J. Pediatric Surgery, 2010
Stato dell’arte-2
Roberto Tozzi, PhD Thesis, 2010
Cellule: classificazione
Cellule per
impianto
Autologhe
Allogeniche
Xenogeniche
Singeniche
Tipi di cellule
Cellule
Specializzate
Condrociti
Osteoblasti
Endoteliali
Epatociti
……..
Non specializzate (Staminali)
• TOTIPOTENTI: in grado di differenziare in tutti i tipi di cellule.
• PLURIPOTENTI: possono specializzarsi in tutti i tipi di cellule che troviamo in un individuo adulto ma non in cellule che compongono i tessuti extra-embrionali.
• MULTIPOTENTI: sono in grado di specializzarsi unicamente in alcuni tipi di cellule.
• UNIPOTENTI: capaci di differenziarsi in un unico tipo cellulare.
Cellule staminali
Nei tessuti connettivi
• Glicoproteine
• Proteoglicani
• Acido ialuronico
• Minerali Proteine (collagene, elastina, fibrina), Glicosaminoglicani (GAG),
Minerali (idrossiapatite)
L’ECM può fungere da deposito di fattori di crescita. Svolge la funzione di supporto delle cellule e del loro ancoraggio e di divisione tra i diversi tessuti
Matrice extracellulare (ECM)
È un supporto (impalcatura) di tipo organico o inorganico, naturale o artificiale, polimerico o non.
Funzioni principali dello scaffold
• Conferire la forma 3D desiderata del tessuto
• Stimolare la proliferazione cellulare e quindi di ECM
• Mantenere le proprietà meccaniche del tessuto impiantato prima della biodegradazione in vivo.
Scaffold
Scaffold: caratteristiche ideali
Proprietà
Bio-compatibilità
Bio-degradabilità
in vivo controllata
Garantire adesione cellulare
Porosità
Scaffold: morfologia
Fibroso Spugnoso Gelatinoso
Fasi
• Prelievo (biopsia)
• Isolamento (washing, filtrazione, centrifuga)
• Seeding su scaffold
• Espansione/crescita/differenziazione
Analisi e caratterizzazione
• Preparazione cellule da analizzare (trypsina/EDTA)
• Conta cellulare attraverso Emocitometro (Camera di Burker)
• Distribuzione/conta cellulare con Coulter Counter
• Caratterizzazione del fenotipo con Citofluorimetro a flusso
Coltivazione in vitro
• Sistemi di espansione in statico (piatti di petri, well plates, flask)
• Sistemi di espansione in dinamico (bioreattori di vari tipi)
I bioreattori consentono il raggiungimento di alte densità cellulari (108/cm3) rispetto a quelle dei sistemi statici (106/cm3)
Sistemi di coltivazione in vitro
Un bioreattore consente di:
• Potenziare il trasporto dei nutrienti all’interno della coltura
• Produrre degli stimoli fisico-chimici necessari
• Monitorare e regolare i parametri fisico-chimici in tempo reale
• Produzione su larga scala di cellule e tessuti
Vantaggi di un bioreattore
Stirred Flask Bioreactor
Rotating wall Bioreactor
Direct Perfusion Bioreactor
Modellazione matematica
La modellazione matematica e la simulazione computazionale hanno lo scopo di:
• Riduzione dei costi della sperimentazione
• Progettazione di apparecchiature
• Ottimizzazione delle condizioni operative
Modellazione matematica-2
I modelli matematici e i codici di calcolo sviluppati dal Programma di Bioingegneria del CRS4 sono basati principalmente su:
• Principi di conservazione della massa (specie coinvolte, ossigeno, nutrienti, ECM, GFs)
• Bilancio di popolazione (sulle cellule)
- I bilanci descrivono l’evoluzione temporale/spaziale delle specie coinvolte
in termini di concentrazione, numero e dimensione delle cellule (massa / dimensione caratteristica / diametro).
- I bilanci contengono termini diffusionali, reattivi (consumo nutrienti, ossigeno, consumo o produzione di GFs), crescita e divisione cellulare, trasformazione (differenziazione)
Modellazione matematica-3
• Le equazioni del modello sono implementate in un codice di calcolo scritto in linguaggio FORTRAN
• La risoluzione numerica dei sistemi differenziali o algebrico-differenziali risultanti viene effettuata tramite librerie matematiche standard (esempio IMSL)
• Un singolo run di calcolo, in base alla complessità, può richiedere pochi minuti o parecchie ore.
• Il modello viene validato mediante confronto diretto con i dati sperimentali disponibili.
Sistemi investigati
• Espansione di condrociti e cartilagini ingegnerizzate;
• Espansione e differenziazione di MSC in condrociti e osteoblasti (tessuto connettivo/osseo);
• Espansione e differenziazione di CNSSC in astrociti (tessuto non connettivo);
• Espansione di MSC (cellule ovine);
• Espansione di condrociti ovini;
• Effetto di alcuni farmaci sull’espansione di HUVEC
Esempi di applicazione: I
Espansione di condrociti e cartilagini ingegnerizzate
Coltivazioni in sistema dinamico (bioreattore NASA commissionato per il MIT) , utilizzo di condrociti articolari bovini, scaffolds PGA, soluzione di nutrienti a base di Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)
Cartilagini ingegnerizzate
a
c
b
x
0
r
y
z
r
q
d/2
d/2
h/2
h/2
Culture
medium bulk
Culture
medium
Sterile gas
incubator
Culture
medium
d
d
Scaffolds
z
0
Cartilagini ingegnerizzate-2
Modello matematico
Cartilagini ingegnerizzate-3
Modello matematico-2
Cartilagini ingegnerizzate-4
PO2=80 mm hg
t=10 days
Cartilagini ingegnerizzate-5
PO2=40 mm hg
t=5 weeks
Cartilagini ingegnerizzate-6
Coltivazione su bioreattore con PO2=80 mm hg
Cartilagini ingegnerizzate-7
Sistema statico, flask, condrociti articolari bovini , DMEM, scaffolds PGA
Cartilagini ingegnerizzate-8
Sistema statico, well plates, condrociti articolari bovini,DMEM, scaffolds PGA/PLA
Esempi di applicazione: II
Espansione e differenziazione di MSC in condrociti e osteoblasti (tessuto connettivo/osseo)
Coltivazione in sistemi statici, petri dishes, cellule mesenchimali umane, soluzione di nutrienti DMEM, uso di fattori di crescita TGF-b superfamily, CDMP-1
Espansione e differenziazione di MSC
Espansione e differenziazione di MSC-2
Modello matematico
Espansione e differenziazione di MSC-3
Modello matematico-2
Espansione e differenziazione di MSC-4
Sistema statico, petri dishes, cellule mesenchimali umane, DMEM, TGF-b superfamily
Espansione e differenziazione di MSC-5
Sistema statico, petri dishes, cellule mesenchimali umane, DMEM, TGF-b1 e CDMP-1
t=21 days
Espansione e differenziazione di MSC-6
Simulazione qualitativa dell’evoluzione di una guarigione da frattura
Esempi di applicazione: III
Espansione e differenziazione di CNSSC in astrociti (tessuto non connettivo)
Coltivazione in sistemi statici, cellule CNSSC murine, aggiunta di LIF, Activin-A
Espansione e differenziazione di CNSSC
Espansione e differenziazione di CNSSC-2
Modello matematico
Espansione e differenziazione di CNSSC-4
Sistemi statici, CNSSC murine, aggiunta di LIF
Espansione e differenziazione di CNSSC-5
Coltivazione con aggiunta di LIF + Activin A
Espansione e differenziazione di CNSSC-6
Coltivazione con aggiunta di Activin A
t=3 days
Esempi di applicazione: IV
Espansione di MSC (cellule ovine)
Coltivazione in sistemi statici, petri dishes, cellule ovine, soluzione di nutrienti a base di MEM (Minimum Essential Medium Eagle)
Espansione di MSC (cellule ovine)
Modello matematico
Espansione di MSC (cellule ovine)-2
Sistema statico, petri dishes, medium Minimum Essential Medium Eagle (MEM)
Esempi di applicazione: V
Espansione di condrociti ovini
Coltivazione in sistemi statici, petri dishes, soluzione di nutrienti a base di DMEM
Espansione di condrociti ovini
Modello matematico
Espansione di condrociti ovini-2
Sistema statico, petri dishes, medium DMEM
Espansione di condrociti ovini-3
Esempi di applicazione: VI
Effetto di alcuni farmaci sull’espansione di HUVEC
Coltivazione in sistemi statici, petri dishes, soluzione di nutrienti a base di EBM (Endothelial Basal Medium) + EGM-2 (Endothelial Cell Growth Medium)
Effetto farmaci sull’espansione di HUVEC
Modello matematico
Effetto farmaci sull’espansione di HUVEC-2
Sistema statico, petri dishes, Endothelial Basal Medium (EBM) + Endothelial Cell
Growth Medium (EGM-2)
Effetto farmaci sull’espansione di HUVEC-3
Possibili campi di applicazione
L’approccio modellistico presentato può essere utilizzato in diversi campi della biomedicina:
• Ingegneria Tissutale;
• Medicina rigenerativa;
• Coltivazione cellulare per Terapia Genica;
• Studio dell’evoluzione di masse tumorali.
Riferimenti bibliografici
• R. Langer e J.P. Vacanti. Tissue engineering. Science, 260, 920-926, (1993).
• L.E. Freed e G. Vunjak-Novakovic. Tissue engineering of cartilage. In: J.D. Bronzino, ed. The Biomedical Engineering Handbook. New York: CRC Press, 1995, pp. 1788–1806, (1995).
• G. Vunjak-Novakovic, L.E. Freed, R.J. Biron e R. Langer. Effects of mixing on the composition and morphology of tissue engineered cartilage. AIChE J 42, 850, (1996).
• B. Obradovic, J.H. Meldon, L.E. Freed e G. Vunjak-Novakovic. Glycosaminoglycan deposition in engineered cartilage: experiments and mathematical model. A.I.Ch.E. Journal 46, 1860, (2000).
• M. Satoh, H. Sugino e T. Yoshida. Activin promotes astrocytic differentiation of a multipotent neural stem cell line and an astrocyte progenitor cell line from murine central nervous system. Neuroscience Letters 284, 143–146, (2000).
• P. Bianco. Stem cells in tissue engineering. Nature, 414,118-121, (2001).
Riferimenti bibliografici-2
• F. Barry, R.E. Boynton, B. Liu e J.M. Murphy. Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow: differentiation-dependent gene expression of matrix components. Exp. Cell Res. 268, 189–200, (2001).
• C.G. Wilson, L.J. Bonassar e S.S. Kohles. Modeling the dynamic composition of engineered cartilage. Arch. Biochem. Biophys. 408, 246, (2002).
• M. Pisu, N. Lai, A. Cincotti, F. Delogu e G. Cao. A simulation model for the growth of tissue engineered cartilage on polymeric scaffolds. Journal of Chemical Reaction Engineering, http://www.bepress.com/ijcre/vol1/A38, (2003).
• M. Pisu, N. Lai, A. Cincotti, A. Concas e G. Cao. Modeling of engineered cartilage growth in rotating bioreactors. Chemical Engineering Science, 59, 5035-5040, (2004).
• X. Bai, Z. Xiao, Y. Pan, J. Hu, J. Pohl, J. Wen e L. Li. Cartilage-derived morphogenetic protein-1 promotes the differentiation of mesenchymal stem cells into chondrocytes. Biochem, Biophys. Res. Commun. 325, 453–460, (2004).
Riferimenti bibliografici-3
• M. Pisu, A. Concas, N. Lai e G. Cao. A novel simulation model for engineered cartilage growth in static systems. Tissue Engineering, 12, 2311-2320, (2006).
• M. Pisu, A. Concas e G. Cao. A novel simulation model for stem cells differentiation. Journal of Biotechnology. 130, 171-182, (2007).
• M. Pisu, A. Concas, S. Fadda, A. Cincotti e G. Cao. A simulation model for stem cells differentiation into specialized cells of non-connective tissues, Journal of Computational Biology and Chemistry. 32, 338-344, (2008).
• L. Mancuso, M.I. Liuzzo, S. Fadda, M. Pisu, A. Cincotti, M. Arras, E. Desogus, F. Piras, G. Piga, G. La Nasa e G. Cao. Experimental analysis and modeling of in vitro mesenchymal stem cells proliferation. Cell Proliferation, 42,602-616 (2009).
• L. Mancuso, M.I. Liuzzo, S. Fadda, A. Cincotti, M. Pisu, A. Concas e G. Cao. Experimental analysis and modelling of bone marrow mesenchimal stem cells proliferation. Chemical Engineering Science, 65, 562-568 (2010).
Riferimenti bibliografici-4
• L. Mancuso, M.I. Liuzzo, S. Fadda, M. Pisu, A. Cincotti, M. Arras, G. La Nasa, A. Concas e G. Cao, In vitro ovine articular chondrocytes proliferation: experiments and modeling. Cell Proliferation, 43, 310-320 (2010).
• L. Mancuso, M. Scanu, M. Pisu, A. Concas e G. Cao. Experimental analysis and modeling of in vitro HUVECs proliferation in the presence of various types of drugs. Cell Proliferation, 43, 617-628 (2010).
• J. Vacanti. Tissue engineering and regenerative medicine: from first principles to state of the art, Journal of Pediatric Surgery, 45, 291–294, (2010).
• R. Tozzi. Nuovi Idrogeli per l'Ingegneria Tissutale ed il Drug Delivery, Dipartimento farmaceutico, Università di Parma. PhD Thesis, http://hdl.handle.net/1889/1437 (2010).