MICROSCOPIO OTTICOin campo chiaro

- La base contiene una sorgente luminosa- Il braccio contiene due manopole per lamessa a fuoco

- Il condensatore focalizza sul vetrino un cono di luce - Gli Obiettivi contengono lenti di diverso potere di ingrandimento

INGRANDIMENTO: capacità di fornire un’immagine ingrandita dell’oggetto osservato

POTERE DI RISOLUZIONE:

capacità di distinguere come distinti due punti adiacenti

• l’ingrandimento dipende dall’obiettivo e dall’oculare e corrisponde al prodotto degli ingrandimenti delle singole lenti. E’ limitato dal potere di risoluzione

• il potere di risoluzione dipende dalle proprietà fisiche della luce (), l’apertura numerica dell’obiettivo e dall’indice di rifrazione del mezzo in cui è immersa la lente. Corrisponde a circa 200 nm

La distanza minima tra due oggetti (d) affinchè questi possano essere osservati al microscopio come entità separate è detta POTERE DI RISOLUZIONE ed è data dall'equazione di Abbè:

d = 0.5 Doveè la lunghezza d'onda della luce utilizzata n sin n sinè l'apertura numerica

la lunghezza d'onda è uno dei fattori che influenza di più il potere di risoluzione

Apertura numerica è la metà del cono di luce che entra nell’obiettivo dopo aver attraversato il condensatore

Se il cono ha un angolo stretto non si espande molto dopo aver lasciato il vetrino basso potere di risoluzione

quanto più l'angolo del cono di luce che entra nell'obiettivo è largo tanto maggiore sarà il potere di risoluzione(diminuisce d e quindi la distanza minima che consente di distinguere due punti adiacenti)

L’altro fattore che influenza il potere di risoluzione è l’apertura numerica (n sin

d = 0.5 n sin

l'angolo del cono di luce che entra nell'obiettivo dipende dall'obiettivo e dall' indice di rifrazione (n) del mezzo in cui si trova la lente

Quando la luce passa da un mezzo all’altro (aria-vetro) subisce il fenomeno di RIFRAZIONE, il raggio viene cioè deviato.

INDICE DI RIFRAZIONE è una misura del gradocon cui una sostanza rallenta la velocità della luce.

Un prisma devia la luce in quanto il vetro ha un indicedi rifrazione diverso dall’aria

il valore massimo di è 90° e sin90° = 1.00

sin può al max essere 1.00

Nessuna lente che funzioni all'aria può avere un'apertura numerica superiore a 1.00

aumentare l’apertura numerica (n sin ) numerica superiore aumentando l'indice di rifrazione n e cioè non operare all'aria.

l'uso di un olio per immersione con indice di rifrazione uguale a quello del vetro consente di aumentare l’apertura numerica rispetto a quella che si ha all’aria e quindi aumentare il potere di risoluzione

I raggi luminosi che non erano penetrati nell’obiettivo

vengono convogliati nell’obiettivo

n microscopio ottico ad immersione può al massimo avere un potere di risoluzione di 0.2 m

microscopia in campo scuro: grazie ad un diaframma solo i raggi di luce non riflessi o rifratti dal campione arrivano all'obiettivo. Il campione osservato risulta illuminato in un fondo scuro

microscopia ottica (m.o.) m.o. ad immersione

m.o. in campo scuro

microscopio a contrasto di fase: un diaframma anulare origina un cono di luce cavo.

quando un raggio di luce colpisce un campione viene ritardata rispetto ad un raggio che non colpisce il campione

i due raggi vengono rimessi in fase passando une lamina di fase e formeranno un'immagine definita

Microscopio a fluorescenza

il campione (naturalmente fluorescente o reso fluorescente) viene colpito da luce UV

l'energia accumulata viene poi rilasciata dal campione come luce a lunghezza d'onda più alta (visibile)

Cyanobacteria

m.o. in campo chiaro m.o. a fluorescenza dopoaver illuminato il campione con luce a una lunghezza d’ondadi 564nmIl colore rosso è dovuto ad autofluorescenzadi pigmenti fotosintetici

Visualizzazione →→ →→ microscopiaForma, Dimensioni, Disposizione, Caratteristiche tintoriali

FISSAZIONE

COLORAZIONE

OSSERVAZIONE

FISSAZIONE

• A CALORE preserva la morfologia ma non le strutture interne

• FISSAZIONE CHIMICA ETANOLOACIDO ACETICOCLORURO DI MERCURIOGLUTARALDEIDEFORMALDEIDEpreserva le strutture subcellulari

COLORAZIONE

Colorare i batteri consente di:

• vedere maggiore contrasto tra l’organismo e lo sfondo• differenziare vari tipi morfologici

• osservare determinate strutture subcellulari

COLORANTI ACIDI: la porzione colorata della molecola ha una carica negativa.Affinità per il materiale citoplasmatico.EOSINA, FUCSINA ACIDA, ROSSO CONGO, FLUORESCEINA, ACIDO PICRICO

COLORANTI BASICI: la porzione colorata della molecola ha una carica positiva.Affinità per le strutture nucleari della cellula.BLU DI METILENE, FUCSINA BASICA, SAFRANINA, CRISTAL VIOLETTO

COLORANTI COMPOSTI: si ottengono mescolando gli acidi e i (O NEUTRI) basici, colorano le strutture

cellulari in modo diverso a seconda se acidofile o basofile

I composti utilizzati per colorare i microrganismi:

- Contengono CROMOFORI (gruppi chimici che conferiscono alla sostanza il suo colore)- Si legano alle strutture cellulari mediante legami ionici, covalenti o idrofobici

SOSTANZE MORDENZANTI: aumentano l’efficienza della colorazione permettendo

al colorante di legarsi con maggiore affinità

SOSTANZE FLUORESCENTI: hanno la capacità di emettere luce se illuminate ad una determinata

lunghezza d’onda (visibile o UV).ARANCIO DI ACRIDINA, ACRIFLAVINA, FLUORESCEINA

Tecniche di colorazione

Colorazioni semplici: richiedono l’uso di un solo coloranteColorazioni complesse: applicazione successiva di più colorantiColorazioni differenziali: consentono di distinguere tra loro microrganismi diversi

FISSAZIONE

la fissazione può essere fatta al calore o con sostanze chimiche (etanolo, ac. acetico, formaldeide). Il calore preserva la morfologia cellulare ma può alterare le strutture interne. La fissazione chimica si usa per osservare le strutture intracellulari.

Colorazione semplicedopo la fissazione i campioni vengono colorati, lavati ed osservati

i coloranti devono avere un gruppo cromoforo e devono legarsi ai campioni

coloranti basici (blu di metilene, fucsina basica, cristal violetto) - composti cationici, carichi positivamente che legano strutture e molecole cariche negativamente (parete cellulare, DNA)

coloranti acidi (eosina, fucsina acida, rosa bengala) - composti anionici, carichi negativamente che legano strutture e molecole cariche positivamente

Colorazione differenzialepermette di classificare i batteri in base alla loro reazione alla colorazione

Colorazione per acido-resistenza (o di Ziehl-Neelsen)si usa per riconoscere batteri delle specie Mycobacterium tuberculosis e

Mycobacterium leprae

la colorazione viene fatta a caldo con fucsina basica e fenolo. dopo la colorazione le cellule vengono lavate con acido solforico e etanolo. tutte le cellule batteriche, tranne quelle di Mycobacterium, si decolorano.

soluzione mordenzante

Gram-negativiGram-positivi

Colorazione di Gramsi usa per classificare tutti i batteri in due gruppi, i Gram-positivi ed i Gram-negativi

• l’ingrandimento è limitato dal potere di risoluzione

• il potere di risoluzione dipende dalle proprietà fisiche della luce e corrisponde a circa 200 nm

Per aumentare l’ingrandimento bisogna aumentare il limite di risoluzione

SOSTITUZIONE DELLA LUCE CON GLI ELETTRONI

microscopio ottico microscopio elettronico

obiettivo

condensatore

oculare

oggetto

sorgente luminosa

lenti elettromagnetiche

sorgente di elettroni

lastra fotografica

occhio

Microscopia elettronica

Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)

il campione viene colpito da un fascio di elettroni (il sistema opera nel VUOTO)

questo aumenta il potere di risoluzione rispetto ad un microscopio ottico, infatti il potere di risoluzione aumenta al diminuire della lunghezza d'onda della luce (la lunghezza d'onda di un fascio di elettroni e circa 0.005 nm -100000 volte più bassa della luce visibile)

il potere di risoluzione del microscopio elettronico è circa 1000 volte superiore a quello del microscopio ottico e permette di distinguere due punti distanti tra loro 0.5 nm

i campioni devono essere fissati chimicamente (glutaraldeide o osmio e solventi organici) e poi inclusi in una resina inerte a formare un blocco

da questi blocchi vengono fatte fettine sottilissime con un ultramicrotomo

le fettine vengono "colorate" con metalli pesanti (piombo, uranile) che si legano alle strutture biologiche e ne aumentano il contrasto

alternativamente si fa una "colorazione negativa" (ombreggiatura) facendo depositare sulle cellule un velo di vapore di un metallo (platino)

una tecnica alternativa è quella del freeze-etching che prevede il congelamento del campione in azoto liquido (-196°C) ed il taglio con una lama preraffreddata

così le cellule si spezzano lungo le linee di minor resistenza (al centro della membrana)

le superfici esposte vengono ombreggiate con platino facendo un "calco" delle superfici che poi è osservato per TEM

microscopio elettronico a scansione(SEM) scanning electron microscope

il campione viene fissato e rivestito da uno strato metallico

una sonda effettua una scansione del campione tramite un fascio molto sottile di elettroni

quando il fascio di elettroni colpisce una cellula, gli atomi di superficie liberano elettroni (secondari) raccolti da un rivelatore

cellule batteriche osservate mediante TEM(ultrastuttura della cellula)

cellule batteriche osservate mediante SEM(superficie delle cellule, immagine tridimensionale)

Microscopia Confocale (CSLM Confocal Scanning Laser Microscope)

Diagramma del funzionamento di un microscopio laser a scansione confocale. Le linee gialle rappresentano la luce laser usata per illuminare il campione. Le linee rosse simbolizzano la luce che si diparte dal piano del fuoco; quelle blu, la luce proveniente da parti del campione al di sopra e al di sotto del piano del fuoco.

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Confocal microscope images of Pseudomonas syringae growing in the leaf intercellular spaces of the model plant Arabidopsis thaliana. The bacteria are marked with green fluorescent protein, which contrast with the red fluorescence of chloroplasts in plant cells.

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Bacteria (red fluorescence) show an intimate association with carbonate precipitates (blue autofluorescence). Sample is stained with propidium iodide; scale bar, 5m

il campione (reso fluorescente) colpito da un raggio laser focalizzato emette luce che viene concentrata da una lente in grado di bloccare la luce fuori fuoco con produzione di immagini di diverse sezioni ottiche

si possono osservare campioni di notevole spessore che (dopo elaborazione al computer) possono originare immagini tridimensionali

Microscopio a scansione di sonda(SPM Scanning Probe Microscope)

misura le strutture superficiali delle cellule grazie allo spostamento di una microsonda lungo la superficie dell'oggetto da osservare

microscopio elettronico a scansione a effetto tunnel

(STM Scanning Tunnelling Microscope)

microscopio a forza atomica(AFM Atomic Force Microscope)

potere di risoluzione molto elevato (100 milioni di volte);permette di visualizzare singoli atomi

usato per studiare le superfici di cellule

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High magnification AFM image of a single Pseudomonas putida bacterium on mica, scanned in air. Surface features on the bacterium are resolved. Bacterial flagellae can also be seen. Image size: 2 x 2 microns.

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Very high magnification AFM image of the surface of a single Pseudomonas putida bacterium showing clearly resolved features. Imaged on mica and scanned in air. Image size: 0.5 x 0.5 micron.

spore batteriche osservate mediante microscopia: TEM

AFM

ottica ad immersione

ottica a fluorescenza

SEM

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Dimensioni e forma della cellula procariotica

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batteri giganti 6000x800 nm(visibili a occhio nudo)

nanobatteri o ultramicrobatteri (UMB)con diametro tra 200 e 50 nm

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coppie

vibrioni

spirilli - spirochete

miceliQuickTime™ e undecompressore TIFF (Non compresso)sono necessari per visualizzare quest'immagine.

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batteri pleiomorfi = a morfologia variabile