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Microscopia – metodi, limiti, possibilità

Università Politecnica delle Marche, Facoltà di Agraria

C.d.L. Scienze Forestali e Ambientali, A.A. 2015/2016, Fisica

Incrementando di un fattore 10 la potenza dell’occhio umano tramite il suo telescopio, Galileo Galilei è riuscito a studiare la superficie della Luna e scoprire i satelliti di Jupiter.

15.02.1564 –08.01.1642



Primi microscopi:



Microscopio moderno:



Microscopio a fluorescenza

Questo tipo di microscopio utilizzaradiazioni ultraviolette, per ottenere, neipreparati in cui ciò è possibile, lafluorescenza.



Però c’è un limite!

La visione distinta di oggetti sempre più piccoli non può essere ottenutasolamente aumentando il potere di ingrandimento. La diffrazione pone unlimite inferiore alla distanza di separazione tra due punti in posizioni distinte.

Questa distanza minima è data da:

dmin = 1,2λ / 2n sinα (limite di Abbe)

dove λ è la lunghezza d'onda della luce che illumina l'oggetto, n l'indice dirifrazione del mezzo interposto tra oggetto e obiettivo, α il semi-angolo delcono di raggi utili che ha il vertice nel centro dell'obiettivo.

Luce nello spettro visibile: 380nm ≤ l ≤ 750nm; limite di Abbe ≈ 250nm



Il Microscopio Elettronico a

Scansione (SEM)

Il potere risolutivo cresce proporzionalmente aldecrescere della lunghezza d’onda della radiazioneimpiegata, infatti la scoperta che gli elettroni hannouna radiazione di bassissima lunghezza d’onda hasuggerito la possibilità di usare fasci di elettroni perottenere poteri risolutivi assai elevati.



Cosa è la Microscopia Elettronica

Tecnica che permettel’osservazione di campioni coningrandimenti e risoluzione fino a1000 volte superiore allamicroscopia ottica ordinaria.



Alcuni cenni storici

• 1897: J. Thomson scopre l’elettrone

• 1924: L. de Broglie propone la teoria ondulatoria della materia

• 1926: H. Busch dimostra che i campi elettrici e magnetici a

simmetria assiale si comportano come lenti per gli elettroni

Nascita dell’ottica elettronica



• 1934: E. Ruska primo prototipo di TEM

• 1938: von Ardenne primo prototipo STEM

• 1942 Zworykin realizza il primo prottipo di SEM capace di

analizzare campioni massivi.

• 1960 Everhart e Thornley introducono il loro rivelatore per

elettroni secondari, basato su scintillatore e tubo

fotomoltiplicatore

• 1965: Cambridge Instruments produce e commercializza il

primo SEM

• 1986: Ruska vince il Nobel



IL SEM

• In linea di principio un microscopio elettronico opera come

un normale microscopio ottico qualora si usasse luce con

lunghezza d’onda bassissima.

• Poiché però i normali dispositivi ottici non deviano gli

elettroni, si ricorre a lenti elettrostatiche o a lenti

magnetiche che, agendo sulla carica elettrica degli

elettroni, ne provocano la deviazione.



IL SEM

• Il Microscopio Elettronico a Scansione sfrutta la generazione di

un fascio elettronico ad alta energia nel vuoto.

• Il fascio viene focalizzato da un sistema di lenti e deflesso per

scandire una area del campione.

• L’interazione fascio-campione genera vari segnali che vengono

acquisiti da opportuni detectors e successivamente elaborati

fino a formare una immagine a livelli di grigio.



SEM moderno:



I pregi del SEM

Da indicazioni su:

• morfologia della superficie del campione

• composizione chimico fisica

• difettosità elettriche

• contaminazione delle superfici

• misura dei potenziali superficiali



• Alta risoluzione (limite 1nm)

• Alti ingrandimenti (fino a 100.000x)

• Alta profondità di campo

• Abbastanza facile preparazione del campione

La combinazione di alti ingrandimenti, alta risoluzione, largaampiezza del fuoco e facile preparazione e osservazione delcampione rende il SEM uno degli strumenti più affidabili e piùsemplici da utilizzare per lo studio della morfologia di vari campioni.



Confronto tra microscopieMO SEM TEM

Range di ingrandimento 1-1000 10-10000 1000-1000000

Risoluzione

Ordinaria 5mm 50nm 5nm

Per osservazioni accurate 0,2mm 5nm 0.5nm

Limite 0,1mm 1nm 0.1nm

Profondità di campo 0,1mm a 10x 10mm a 10x limitata allo spessore del film

1mm a 100x 1mm a 100x limitata allo spessore del film

Ambiente versatile richiede il vuoto (0,03Pa) richiede il vuoto (0,03Pa)



Grano di pepe (Piper nigrum)



tarantola messicana



Foglia di menta



Foglia di canapa indiana



Pollini di Compositae al microscopio elettronico a scansione



Creste delle cellule vegetali

Coccolithophore (alga) Emiliania huxleyi



Peli sul fusto di una pianta di tabacco

Tricomi sulla pianta Juglandales Juglandaceae



Tricoma sulla foglia di Arabidopsis thaliana

Fusto di bamboo



Microscopio elettronico a trasmissione

(TEM)



Caratteristiche del TEM

• Potere risolutivo altissimo (0,2 nm), dell’ordine delle molecole.

• Fino a 1.000.000 X.

• Richiede sezioni sottilissime, colorate solitamente con metalli e mantenute sotto vuoto: artefatti inevitabili.

• Non si possono osservare strutture viventi, né in 3D.



TEM

vs

SEM



Microscopio ottico

Microscopio a raggi X

Microscopi elettronici e ionici- Microscopio elettronico a scansione (SEM)- Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)- Microscopio elettronico a diffrazione- Microscopio elettronico ad emissione di campo- Microscopio ionico

Microscopi a scansione di sonda (SPM)- Microscopio a scansione per effetto tunnel (STM)- Microscopio ottico a scansione in campo prossimo (SNOM)- Microscopio a forza atomica (AFM)

Altre tipologie di microscopio- Microscopio acustico- Microscopio confocale + forza atomica + riflessione interna totale in fluorescenza



SEM – UNIVPM (Dipartimento SIMAU):

SEM PHILIPS

XL20 con EDS



Microscopio a forza atomica –Dipartimento Di.S.C.O.



Erythrocytes, contact modescan field 40 µm * 40 µm

z-range 0 – 2.1 µm

Superficie della castagna, tapping modescan field 30 µm * 30 µm

z-range 0 – 6 µm



Microtomografia computerizzata a raggi X o radiazione di

sincrotrone:

Strumento desktop Skyscan: risoluzione tipica nell’ordine dei micron.



www.esrf.

fr

European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), Grenoble, France



Schematic set up of microCTsystem installed at ID19 in

ESRF



ricostruzione 3D del legno

Visualizzare la struttura interna del legno utilizzando

microtomografia computerizzata



Radiografia neutronica:



Differenza tra una radiografia

neutronica e una a raggi X: i

liquidi vengono visualizzati

molto bene utilizzando

neutroni.



Tomografia neutronica:



L’assorbimento dell’acqua nelle piante

l’assorbimento di D2O in 5 min



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