Capitolo 2

2.1. ALLESTIMENTO DIPREPARATI A FRESCOOsservazione di preparati a frescoOsservazione di tessuti colorati con coloranti vitali

2.2. ALLESTIMENTO DIPREPARATI ISTOLOGICIFissazioneDisidratazione e diafanizzazioneInclusioneTaglioColorazioneMetacromasia

Contenuti

MICROSCOPIA E ALLESTIMENTO

DEI PREPARATI ISTOLOGICI

ALLESTIMENTO DI PREPARATI A FRESCONegli organismi pluricellulari le cellule rappresentanol’unità costituente fondamentale e solo l’organizza-zione in gruppi di cellule, con morfologia e funzionisimili, porta alla formazione di tessuti. Le piccole di-mensioni delle cellule impongono che per la loro os-servazione ci si debba avvalere dell’uso del microsco-pio ottico (a luce) (Fig. 2.1) e microscopio elettro-nico.

I due principali metodi utilizzati per l’analisimorfologica sono:

1) l’osservazione diretta di cellule e di tessuti viventi;

2) l’osservazione di cellule e di tessuti sottoposti a“trattamenti” finalizzati a stabilizzare e conservarele strutture il più possibile simili a quelle presentinelle cellule viventi.

Il primo metodo, che permette di osservare i tessuti afresco (tessuti non sottoposti a nessun trattamento che ne determini la stabilizzazione)o semplicemente processati con coloranti vitali, è in linea teorica da preferire in quantonon introduce artefatti nel campione. Tuttavia questo metodo presenta alcune limita-zioni quali: scarso contrasto, totale trasparenza se non viene effettuata la colorazione,ridotta visualizzazione al microscopio luce dei tessuti per il loro spessore, durata limi-tata poiché i tessuti o le singole cellule vanno facilmente incontro ad autolisi.

Osservazione di preparati a frescoLe cellule sono quasi completamente trasparenti alla luce e di conseguenza l’osserva-zione di preparati a fresco può essere condotta utilizzando particolari microscopi qualistereomicroscopio, microscopio invertito, microscopio a contrasto di fase. In que-sto modo, un discreto numero di particolari strutturali sono facilmente visibili. In alcunicasi può essere sfruttata l’autofluorescenza di alcune strutture biologiche che, se osser-vate al microscopio a fluorescenza, possono essere facilmente individuate, mentre al-tre strutture cellulari acquisiscono fluorescenza se trattate con particolari sostanze. Itessuti osservati a fresco, durante l’osservazione, devono essere immersi in una idoneasoluzione in modo da non alterarne la struttura ed evitare l’essiccazione. A questoscopo, generalmente, si ricorre all’uso di soluzioni fisiologiche, soluzioni saline isoto-niche contenenti ioni quali Mg2+ e Ca2+ in concentrazioni opportune.

Osservazione di tessuti colorati con coloranti vitaliLo scarso contrasto dovuto alla trasparenza delle cellule può essere risolto utilizzandoparticolari coloranti, detti vitali, che hanno la proprietà di essere assorbiti dalle celluleviventi senza risultare eccessivamente tossici, e quindi colorarne le strutture renden-dole visibili. Questo tipo di colorazione si adatta a quei tipi di cellule, spesso contenentivacuoli, in cui si concentra il colorante (cellula ad attività granulopessica) o ancheper colorazioni in toto di embrioni in sviluppo.

2.1

CAPITOLO 2 Microscopia e allestimento dei preparati istologici8

Figura 2.1 Microscopio

ottico.

È importante tener presente che solo frammenti molto sottili di tessuto ed organo ocellule isolate possono essere mantenute vivi per breve tempo durante l’osservazione.

I coloranti vitali, iniettati nell’animale intero, raggiungono i tessuti tramite la cir-colazione colorandoli. In questo caso si parla di colorazione vitale o intra vitam.

Si parla invece di colorazione sopravitale quando un pezzo di tessuto od organoappena prelevato dall’animale viene immerso nella soluzione colorante.

I coloranti vitali utilizzati possono essere suddivisi in tre categorie:

q coloranti neutri: es. rosso neutro, verde janus;

q coloranti basici: es. blu di metilene, blu di toluidina, azzurro di metilene;

q coloranti acidi: es. alizarina, trypan blu, blu pirrolo.

ALLESTIMENTO DI PREPARATI ISTOLOGICIL’impiego di coloranti e di tecniche che permettono di migliorare il contrasto riesceperò a soddisfare in minima parte le necessità delle analisi morfologiche e citologiche,soprattutto a causa dello spessore delle cellule.

In primo luogo, poiché la consistenza dei tessuti freschi impedisce di ottenere sezionisottili, i protocolli comunemente utilizzati in citologia ed istologia prevedono l’allesti-mento di preparati che risultino permanenti in modo da poterli studiare con l’ausilio delmicroscopio ottico. Il preparato ideale per un’analisi morfologica consiste in una se-zione (spessore di 5-10 mm) che possiede la stessa struttura ed organizzazione che avevanell’organismo.

L’approccio sperimentale deve quindi essere esclusivamente di tipo conservativo, equesto obiettivo può essere raggiunto processando il tessuto attraverso una serie di pas-saggi che servono ad arrestare le funzioni biologiche senza alterare l’organizzazionestrutturale delle diverse componenti (fissazione), a rimuovere dalla cellula la compo-nente acquosa (disidratazione) che risulta incompatibile con una buona osservazioneal microscopio ottico e alla sua sostituzione con il mezzo includente (inclusione). Ilcampione così processato viene sottoposto al taglio e successivamente colorato.

FissazioneLa fissazione è un procedimento che permette di bloccare l’autolisi cellulare, preser-vando così nel tempo la morfologia del tessuto o dell’organo in studio. Dopo l’espiantoil frammento di tessuto o di organo viene rapidamente fissato utilizzando metodi chi-mici o più raramente metodi fisici.

La fissazione chimica prevede l’impiego di agenti stabilizzanti in grado di instau-rare legami trasversali (cross-link) tra le proteine. Per facilitare la penetrazione del fis-sativo e garantire così una fissazione omogenea, il tessuto viene tagliato in piccoliframmenti dell’ordine di alcuni mm3. Nel caso invece in cui sia necessario fissare l’or-gano tale e quale, si procede con la perfusione dell’animale; in questo modo, tramite lacircolazione sanguigna, il fissativo arriva a tutte le cellule.

I fissativi chimici si suddividono in:

q fissativi che coagulano le proteine (alcool etilico, acido acetico, acido picrico…);

q fissativi che non coagulano le proteine (formalina neutra tamponata, fissativo di

2.2

2.2 Allestimento di preparati istologici 9

Bouin), in grado di formare legami crociati tra catene proteiche adiacenti in mododa bloccarle nella loro posizione.

Il congelamento in azoto liquido (–170°C), un esempio di fissazione fisica, rap-presenta un’alternativa all’impiego di fissativi chimici ed alcoli al fine di stabilizzare ilmateriale biologico, in funzione della rapidità e della maggior preservazione dell’anti-genicità del tessuto in esame. Il congelamento permette inoltre di mantenere nei tessutii depositi di lipidi che vengono altrimenti persi durante il processamento del campionecon i solventi organici, tappa che precede l’inclusione in paraffina.

Disidratazione e diafanizzazionePoiché le cellule sono formate principalmente da acqua, la sua rimozione è necessariaper una buona osservazione del campione al microscopio luce e per poter infiltrare iltessuto con la paraffina, materiale idrofobo. Si procede quindi alla disidratazione deltessuto immergendolo in una soluzione alcolica a concentrazione crescente (miscela diacqua e alcool), a partire da etanolo al 50% fino ad arrivare ad etanolo al 100%. Que-sto processo deve essere graduale per non provocare il raggrinzimento delle cellule.

In seguito il campione viene immerso in xilolo, solvente organico miscibile sia conl’etanolo che si è sostituito all’acqua, sia con la paraffina. Poiché lo xilolo è un solventediafanizzante, a fine infiltrazione il tessuto risulterà trasparente.

InclusioneIl tessuto così processato è pronto per essere infiltrato con un mezzo di inclusione che,dopo solidificazione, conferirà al tessuto la giusta consistenza per ottenere sezioni sot-tili. Per la microscopia ottica il mezzo di inclusione utilizzato è la paraffina, una mi-scela di idrocarburi saturi che diventa fluida se riscaldata (50°C-60°C), mentre solidi-fica a temperatura ambiente. Il campione viene immerso in paraffina fusa e completatala fase di infiltrazione, viene lasciato solidificare a temperatura ambiente. Il campionea questo punto presenta la consistenza idonea per essere tagliato al microtomo in se-zioni che hanno uno spessore compreso tra 5-10 mm (Fig. 2.2).

CAPITOLO 2 Microscopia e allestimento dei preparati istologici10

Figura 2.2 Blocchetti di paraffina in cui sono stati in-

clusi campioni biologici.

TaglioIl microtomo è uno strumento dotato di una lama e di un braccio su cui viene fissato ilblocchetto di paraffina contenente il campione che, avanzando verso la lama, permettedi ottenere sezioni sottili che vengono trasferite in un recipiente contenente acqua di-stillata per favorirne la distensione (Fig. 2.3).

In seguito le sezioni vengono raccolte etrasferite su un vetrino portaoggetti prece-dentemente trattato con materiale adesivo.Dopo averle fatte asciugare, per garantirneuna buona adesione al vetrino, le sezionivengono processate per la colorazione.

I campioni sottoposti a fissazione fisica(congelamento) vengono invece tagliati almicrotomo congelatore, che impiega unsistema di raffreddamento (–30°C) chepermette il congelamento del tessuto, ocon il più sofisticato criostato a congela-mento rapido, un microtomo posto in unacamera in cui viene mantenuta una bassatemperatura (–50°C), che permette di con-gelare direttamente il campione nell’appa-rato di taglio. Le sezioni ottenute ad unatemperatura compresa tra –10°C e –30°C

vengono trasferite su vetrini raffreddati che vengono poi portati a temperatura ambienteper poterli colorare o processare per colorazioni istochimiche o immunoistochimiche.Questi metodi sono particolarmente utilizzati per lo studio dei lipidi o per quei tessutidi cui si vuole preservare l’antigenicità.

Oltre alle tecniche sopra descritte, il metodo di congelamento-essicamento (freezedrying) consente di preservare il tessuto senza ricorrere all’uso di miscele chimiche, inquanto i processi di autolisi vengono annullati dalla completa disidratazione del cam-pione.

Il tessuto, dopo il prelievo, viene immediatamente congelato in azoto liquido(–170°C) per evitare la formazione di grossi cristalli di ghiaccio che potrebbero alterare

2.2 Allestimento di preparati istologici 11

per inclusione in paraffinan prelievo del tessuto

n fissazione in formalina o altro fissativo

n disidratazione con serie alcolica a concentrazione crescente (etanolo 50%, 70%, 95% ed assoluto)

n xilolo

n xilolo e paraffina

n paraffina fusa

Figura 2.3 Microtomo a rotazione.

SCHEMA RIASSUNTIVO

la morfologia delle cellule. In seguito viene posto sottovuoto alla temperatura di –40°Cin modo tale che il ghiaccio sublimi con conseguente disidratazione del tessuto. A que-sto punto il campione, estremamente fragile, viene immerso in paraffina fusa per favo-rirne l’infiltrazione. I pezzi così ottenuti saranno sottoposti al taglio utilizzando il mi-crotomo.

In alcuni casi, la particolare tipologia del campione biologico permette di allestirepreparati citologici senza ricorrere all’inclusione e al sezionamento. È il caso di tessutiliquidi come il sangue o derivati da lavaggi bronchiali, liquidi pleurici, peritoneali e pe-ricardici, scrapings di materiale citologico ottenuto per ago-aspirazione da noduli solidie cisti presenti nella mammella, linfonodi, tiroide, polmone, midollo e da altri organi.In questi casi, la riduzione dello spessore del campione biologico può essere ottenutastrisciando direttamente le cellule sul vetrino portaoggetti (striscio di sangue), oppurel’allestimento del preparato può avvenire per apposizione, ossia premendo il vetrinoportaoggetto sulla superficie del tessuto fresco (masse tumorali o tessuti bioptici). Que-sti metodi trovano applicazione nella pratica clinica allo scopo di evidenziare celluleneoplastiche o comunque alterate.

La tecnica dei preparati per erosione si applica a campioni di tessuto osseo com-patto non decalcificato che, dopo essere stato tagliato in sezioni longitudinali o trasver-sali dello spessore di 1 mm, vengono assottigliate mediante abrasione con un disco dicarta smeriglio rotante a bassa velocità. Con questa metodica si possono ottenere se-zioni di osso calcificato dello spessore di 20 mm.

ColorazioneIn ambito istologico e citologico vengono definite “coloranti” quelle sostanze chimi-che che si legano a componenti cellulari/tessutali aumentandone il contrasto. Nella mi-croscopia ottica l’effetto di risalto è dato da una caratteristica colorazione di quellestrutture che rivelano affinità con il colorante utilizzato.

I preparati per striscio, apposizione, erosione o le sezioni ottenute da materiale con-gelato non richiedono ulteriori trattamenti e possono essere immediatamente processatiper le analisi istologiche o istochimiche. Al contrario, le sezioni ottenute da tessuti in-clusi (es. paraffina) richiedono un trattamento per eliminare il mezzo di inclusione chepotrebbe interferire con la colorazione. Poiché nella microscopia luce la maggior partedei coloranti è idrosolubile, è necessario rimuovere la paraffina dal campione immer-gendo il vetrino nello xilolo. L’eliminazione dello xilolo, non miscibile in acqua, si ot-tiene immergendo le sezioni in etanolo assoluto; successivamente le sezioni vengonogradualmente idratate immergendole in una serie di alcoli a concentrazione decrescentefino ad arrivare all’acqua. A questo punto le sezioni vengono immerse nel colorantescelto.

Terminata la colorazione, dopo aver lavato le sezioni per allontanare il colorante ineccesso, si procede con il montaggio del vetrino. Questo procedimento consistenell’applicare sopra le sezioni un vetrino coprioggetto, che viene fatto aderire al vetrinoportaoggetti tramite una resina sintetica trasparente (Eukitt) non miscibile in acqua. Lecaratteristiche della resina richiedono la disidratazione delle sezioni che, ancora unavolta viene eseguita immergendo i vetrini nella serie di alcoli a concentrazione cre-scente fino ad arrivare all’etanolo assoluto, a cui fa seguito un passaggio in xilolo inquanto è eccellente solvente della resina utilizzata per il montaggio (Fig. 2.4).

CAPITOLO 2 Microscopia e allestimento dei preparati istologici12

Le tecniche di citochimica e istochimica, sfruttando le caratteristiche dei coloranti,permettono di trasformare in prodotti colorati i vari componenti di una cellula o di untessuto, in modo da poterli osservare con il microscopio luce. Infatti l’azione differen-ziale dei coloranti dipende principalmente da tre fattori: affinità chimica tra i compo-nenti cellulari/tessutali e i coloranti, concentrazione di tali componenti e loro permea-

bilità.I coloranti possono essere suddivisi fondamentalmente in:

q coloranti acidi (ad es. alizarina, trypan blu, blu pirrolo) colorano i componenti cel-lulari che presentano cariche positive e per questo vengono detti acidofili;

q coloranti basici (ad es. blu di toluidina, blu di metilene, ematossilina, azzurro B)colorano i gruppi cellulari che presentano cariche negative e per questo vengonodetti basofili;

q coloranti neutri (ad es. rosso neutro, verde janus);

q mordenzanti agiscono da intermediari tra il colorante e il tessuto. La maggior partedei mordenzanti impiegati nelle tecniche istologiche sono ioni metallici (ferro otungsteno) e/o ossidanti (acido cromico).

Di seguito vengono elencate le principali colorazioni che vengono utilizzate in isto-logia per visualizzare particolari componenti tessutali.

q EMATOSSILINA – EOSINA

È una delle tecniche di colorazione più utilizzate sia in campo istologico sia incampo patologico in quanto è applicabile praticamente con tutti i metodi fissativi,eccetto quelli che prevedono l’osmio, e permette di analizzare la morfologia del tes-suto.È una colorazione progressiva che prevede l’uso sequenziale di due soluzioni colo-ranti, l’ematossilina (colorante basico, colora i nuclei in violetto) e l’eosina (colo-rante acido, colora il citoplasma in rosa) (Figg. 2.5-2.8).

2.2 Allestimento di preparati istologici 13

Figura 2.4 Rappresentazione schematica del montaggio del cam-

pione biologico dopo la colorazione. La goccia di resina interposta tra ilcampione e il vetrino coprioggetto, rende il preparato stabile e duraturo neltempo.

Una tecnica di colorazione regressiva prevede l’utilizzo di ematossilina ferrica.Questo tipo di colorazione prevede una lenta sovracolorazione seguita da una aspor-tazione del colore in eccesso per differenziare la struttura in esame (Fig. 2.9).È comunemente utilizzata per lo studio delle mitosi data la particolare affinitàdell’ematossilina per i cromosomi, per evidenziare i centrioli, la striatura trasver-sale delle cellule muscolari e con alcune avvertenze si possono colorare anche i mi-tocondri.

CAPITOLO 2 Microscopia e allestimento dei preparati istologici14

Figura 2.6 Sezione di epitelio pavimentoso

pluristratificato cheratinizzato colorato con

ematossilina-eosina. Sono ben evidenti i nucleiin violetto, colorati dall’ematossilina, e il cito-plasma in rosa, colorato dall’eosina. Lo stratosuperficiale, detto corneo, è formato da chera-tina densa.

Figura 2.7 Sezione longitudinale di tessuto mu-

scolare striato scheletrico. La colorazione con ema-tossilina-eosina mette in evidenza i nuclei (in violetto)e il citoplasma (rosa).

Figura 2.8 Sezione di cartilagine ialina co-

lorata con ematossilina-eosina.

Figura 2.5 Sezione di epitelio pavimentoso plu-

ristratificato non cheratinizzato (molle) colorato

con ematossilina-eosina. Sono ben evidenti i nucleiin violetto, colorati dall’ematossilina e il citoplasmain rosa, colorato dall’eosina.

2.2 Allestimento di preparati istologici 17

n Colorazione di Verhoeff: le fibre vengono colorate con una soluzione alcolica diematossilina contenente cloruro ferrico, iodio e ioduro di potassio. Segue la diffe-renziazione con cloruro ferrico acquoso (Figg. 2.12 e 2.13).

q IMPREGNAZIONE ARGENTICA PER LE FIBRE RETICOLARI

Dal punto di vista istologico le fibre reticolari si distinguono da quelle collagenesia per la loro struttura esile sia perché non si colorano con i coloranti utilizzati perle fibre collagene (van Gieson, Mallory). Le fibre reticolari sono presenti nei tessuti connettivi o in alcuni organi come lamilza dove formano una sottile impalcatura reticolare che sostiene le singole cellulea differenza delle fibre collagene che, aggregandosi, formano una componente stro-male grossolana. La proprietà istochimica più importante delle fibre reticolari è la loro intensa argi-rofilia, ossia affinità di un substrato organico per i sali d’argento. In seguito a colo-

razione, le fibre assumonoun colore nero che le ren-dono facilmente visibili almicroscopio luce, mentregli altri elementi tessutaliassumono la colorazionedel colorante di contrasto(Figg. 2.14 e 2.15).

Figura 2.13 Sezione di arteria co-

lorata con resorcina e fucsina per

mettere in evidenza le fibre elastiche.

Figura 2.14 Sezione di linfonodo colorata con impre-

gnazione argentica per mettere in evidenza le fibre retico-

lari.

CAPITOLO 2 Microscopia e allestimento dei preparati istologici18

METODO NUCLEO COLLAGENE MUSCOLO ERITROCITI

Masson blu-nero blu o verde rosso rossi

Gomori grigio-blu verde rosso rossi

Lissamine rosso blu-nero giallo-rosso rossi

Azan rosso blu arancio-rosso rossi

q COLORAZIONE TRICROMICA

Questo tipo di colorazione, basandosi sull’utilizzo di tre coloranti, permette di evi-denziare nel tessuto in modo selettivo, specifici componenti. Generalmente il nu-cleo viene evidenziato da ematossilina ferrica, un colorante nucleare. I tessuti con-nettivo e muscolare vengono colorati in modo differente in quanto la diversa affi-nità del colorante verso gli elementi tessutali può essere influenzata dal pH della so-luzione di colorazione, dalla densità del tessuto e dall’uso di “coloranti incolori”quali l’acido fosfomolibdico e l’acido fosfotungstico. Questi due composti hanno unruolo complesso nella colorazione dei tessuti connettivi, ma fondamentalmente si ri-tiene che blocchino la reazione di una delle molecole coloranti con certi elementitessutali impedendone la colorazione. Poiché esistono diversi protocolli che si ba-sano su di una colorazione tricromica, qui di seguito vengono riportati i metodi piùutilizzati (Tabella 2.1).

j TABELLA 2.1

Figura 2.15 Sezioni di fegato colorate con impregnazione argentica per mettere in evidenza le

fibre reticolari. (b) In questa immagine è stato utilizzato un colorante di contrasto diverso rispettoall’immagine (a).

(a) (b)