LEZIONI 1 e 24/5 Marzo 2013

Prof. Catania

La microbiologia studia i microrganismi e quindi solo le entità biologiche non visibili adocchio nudo.Ma in ambito medico studia i microrganismi responsabili delle malattie. Tra i microrganismi riconosciamo:

- Strutture cellulari: batteri (procarioti) ; miceti e protozoi (eucarioti)- Strutture subcellulari: virus-viroidi-virusoidi ( con acidi nucleici) ; prioni (senza acidi

nucleici)

I batteri possono essere classificati in EUBACTIRIA (peptidoglicano; acido muramico) e ARCHEOBACTIRIA (pseudomureina; parete cellulare modificata senza acido muramico).I batteri sono gli esseri viventi con le maggiori capacità adattative; vanno a colonizzarenicchie impensabili per altri esseri viventi (basti pensare ai batteri termofili che colonizzanoluoghi ad altissime temperature come i crateri dei vulcani o i forni; oppure i batteri checolonizzano i fondali marini).L’albero filogenetico degli esseri viventi è occupato per la maggior parte da batteri. Ancheil nostro organismo è ormai pieno di batteri, questi più che batteri però sono celluleprocariote.

Il batterio è una cellula particolare poiché il nucleo non esiste come compartimento, ma ilgenoma c’è, ed è rappresentato da un unico filamento di DNA circolare.In genere i procarioti sono privi di compartimentalizzazione differentemente dalle cellule eucariote, ma non per questo sono più semplici e non svolgono meno funzioni. Non a caso la membrana plasmatica ha funzioni aggiuntive rispetto a quelladegli eucarioti e che quindi sarà organizzata diversamente, perché si invagina fornendo unsupporto fisico per tutto ciò che avviene.Nei procarioti non c’è nucleolo. Tutti i batteri hanno parete cellulare, molti con steroli,hanno strutture secondarie non fondamentali (i flagelli non sono come quelli degli eucariotima sono un’unica elica di flagellina).

Dal punto di vista morfologico si distinguono batteri più piccoli che non arrivano al micron di diametro e altri invece come E.coli di qualche micron.

I batteri possono essere:- Cocchi tondi- Bacilli lunghi- Vibrioni- Spirilli- Spirochete- Coccobacillo

Vi sono poi differenze proprie dei flagelli: mentre gli spirilli flagellati si dipartono nel mezzo,una spirocheta avrà movimenti serpentiformi per la continua contrazione ed il rilasciamento dei flagelli.

I batteri sono organismi unicellulari. L’unico esempio di multicellularità è datoda alcuni funghi filamentosi, il cui filamento può essere costituito da celluleuna dopo l’altra che danno luogo a un filamento lineare. (es. Aspergillus)

Un organismo pluricellulare, infatti, non è solo costituito da più cellule ma c’è anche un accenno di differenziazione.Anche se sono unicellulari i batteri possono formare degli aggregati:

- Diplococchi (coppia)- Streptococchi (catene)- Sarcina (grappolo)- Strafilococchi (misti)

Gli aggregati si formano per scissione binaria o semplice: la cellula si ingrandisce divolume e si divide semplicemente in 2. La membrana, più che seguire, dirige tale divisionedella parete. Nascono 2 cellule figlie con la propria parete, ma ancora tenute in contatto. Questa può essere anche una caratteristica propria di un batterio.Uno streptococco ad esempio formerà sempre lo stesso tipo di aggregato (a catenella).

Dal punto di vista strutturale la cellula batterica ha diverse componenti:- componenti essenziali ovvero quelle componenti che se si tolgono la cellula non è

più vitale- componenti accessorie che al contrario se vengono tolte le cellule sono ancora in

grado di replicarsi.Questo non significa che le componenti accessorie siano inutili, ma che semplicementenon compromettono la vitalità del batterio, anche se possono comprometterne la capacitàdi sopravvivere all’ambiente. La definizione di componente accessoria è valida inlaboratorio. Il batterio è vitale ma non riesce a rimanere nel proprio habitat e perciò neverrà eliminato e probabilmente morirà.

Tra le strutture essenziali vi sono:- la membrana plasmatica- il citoplasma- la parete cellulare- i cromosomi- i ribosomi - i mesosomi.

Citosol non è settorializzato, ma ricco di invaginazioni di membrana

Ribosomi sono presenti, ma sono diversi dal punto di vista della costituzione e ciò ne provoca differenze di composizione. Perciò gli antibiotici che agiscono sui batteri non agiscono sui ribosomi eucarioti

DNA anche nei procarioti è compattato, ma non ci sono istoni, c’è qualcosa di analogo che neutralizza le cariche negative permettendo la compattazione. La pro cessazione del DNA, invece, è uguale a quella degli eucarioti.

Membrana plasmatica Stessa organizzazione a doppio strato lipidico con proteine immerse. Qui però svolge funzione di:

- Divisione cellulare- Supporto per le reazioni

- Sede di sistemi di trasporto (la membrana procariotica è ricchissima di cassette ABC)- Filtro selettivo rispetto all’ambiente extracellulare

Parete cellulare Componente essenziale e peculiare della cellula batterica. I funghi sono eucarotici, i protozoi sono eucariotici, i virus non sono cellule (non hanno la membrana, non hanno il DNA perché hanno un solo tipo di genoma di DNA ). Quindi la parete cellulare ce l’hanno i batteri, i funghi e le cellule vegetali.La parete batterica serve a proteggere la cellula da lisi osmotica e le sue caratteristiche strutturali ci permettono di distinguere i batteri gram+ da quelli gram- e in acido-alcol resistenti (micobatteri).

Tra le componenti accessorie vi sono:- i pili- i flagelli- la capsula- i plasmidi- i granuli

I granuli di glicogeno comune come sostanza di riserva, granuli di poli-beta-butirrato o granuli a base di zolfo

I Lisosomi risultano essere invaginazioni a dito di guanto della membrana plasmatica. Ma se fosse solo così il batterio sarebbe semplice ed insufficiente per il ruolo che deve svolgere: le invaginazioni infatti sono complesse e fanno sì che i sistemi enzimatici necessari ai processi metabolici abbiano una base fisica su cui essere allocati.

La capsula è la principale fonte di virulenza e protegge il batterio dalla fagocitosi. Non è presente in tutti i batteri. Pochi batteri formano una capsula proteica (Bacillus Anthracis), la maggior parte hanno struttura polisaccaridica. Si tratta di un rivestimento più comune, un involucro ben definito che è attorno alla cellula uniformemente e con lo stesso spessore.BIOFILM è una pellicola costituita da cellule batteriche che si dispongono a formare una pellicola polisaccaridica unica. Questo strato di materiale polisaccaridico con i batteri inclusi ha maggiore capacità di intrappolare ulteriori microrganismi e pertanto è un fattore di virulenza. Tale biofilm è prodotto da un solo batterio e causa problemi agli antibiotici che possono attaccare solo i batteri in superficie, i quali sono metabolicamente inattivi e perciò poco attaccabili, visto che gli antibiotici classici attaccano batteri attivi metabolicamente.GLICOCALICE Si parla di esso quando lo spessore della capsula è più abbondante e non aderisce bene alla cellula.Per poter osservare la capsula al microscopio si utilizza una preparazione che nonattraversa la capsula, colora la cellula, ma la capsula rimane non colorata, tutto il resto diventa lilla.Invece uno STRATO MUCOSO che può essere superficiale alla cellula non è omogeneo.La capsula ha diverse funzioni:

- adesività: fatta da materiale appiccicoso che favorisce l’adesione- resistenza: a disidratazione e nei confronti di sostanze tossiche (materiale simile a

resine a scambio ionico che può assorbire antibiotici)

- virulenza: attività antifagocitaria, antigenica. Per alcuni è il principale fattore di virulenza.

Appendici cellulari, ovvero quelle parti cellulari che permettono il movimento. Tra queste appendici troviamo i flagelli i quali sono quelli per eccellenza deputati al movimento. Essi sono in numero variabile e possono avere anche una disposizione variabile sulla superficie della cellula batterica. Il movimento caratteristico del flagello è detto SWARMING che letteralmente tradotto significa “sciamaggio”, tipico del Proteus mirabilis. Struttura: fatto di flagellino, corpo basale e dischi proteici che lo ancorano alla membrana esterna o plasmatica. Il corpo basale ha 4 dischi: due interni, 2 esterni. L’energia viene da ATP e flusso proteico a seconda dei batteri, che così nuotano (chemiotassi), verso nutrienti o si allontanano da sostanze tossiche. Lo spirochete ha particolari flagelli definiti filamenti assiali: generano movimento serpentino (movimento snake-like).

Tra le altre appendici cellulari vi sono i PILI (o FIMBRIE). Sono più corte, ma più numerose dei flagelli. Sono fatti da PILINA e mediano l’adesione. Alla estremità presentano leptina, che lega recettori sulla mucosa su cui il batterio determina l’infezione. I batteri gram+ sono provvisti di pili, essi quando colonizzano entrano ad esempio a livello della naso faringe e possono arrivare a livello del ciclo ematico. Le fimbrie servono al batterio per aderire all’epitelio della nasofaringe, ma una volta arrivato in circolo le fimbrie non gli servono più, anzi, il batterio galleggia (espressione on-off dei pili). Quindi il batterio cosa sa fare? Sa esprimere, sa produrre le fimbrie quando deve rimanere adeso all’epitelio della naso faringe, ma non possiede più le fimbrie quando si trova nel circolo ematico. Questo si chiama VARIAZIONE DI FASE. Alcuni pili, come i pili sessuali, possono mediare il processo di trasferimento del materiale genetico da un batterio all’altro. Possono quindi fare da canale per la coniugazione: un batterio ricevente DNA da un batterio donatore perché c’è un contatto fisico il quale può avvenire perché si toccano i corpi cellulari, oppure può avvenire perché è un pilo sessuale che fa da ponte tra batterio donatore e batterio ricevente.Il batterio può trasferire DNA anche tramite una sorta di trasformazione (il batterio prende attraverso l’ambiente extracellulare pezzetti di DNA da un batterio donatore) oppure si può avere un tipo di trasduzione: un batterio riceve DNA di un altro batterio donatore, perché glielo porta un batteriofago.

Colorazione GRAM

La colorazione di gram, che deriva il nome da un microbiologo danese che ne miseappunto il procedimento, consiste in una colorazione differenziale: due coloranti diversi indue momenti diversi. Saper riconoscere un Gram+ da un Gram- è importante per la terapia medica, in generale la colorazione è importante anche a livello diagnostico e per l’osservazione.

1. I batteri devono restare attaccati al vetrino (FISSAZIONE). Questo procedimentoè fatto con il calore tramite una fiamma oppure chimicamente con metanolo.2. Si aggiunge il primo colorante: cristal-violetto.3. Risciacquo4. Si aggiunge iodio + K inorganico in acqua (LIQUIDO DI LUGOL) che è mordenzante,ovvero associa i legami del colorante con i componenti cellulari.5. Risciacquo6. Decolorazione con alcool- acetone, perché il micobatterio è un alcol acido. Dal punto di

vista della tempistica questa fase deve essere svolta in poco tempo (10-15 minuti),altrimenti si decolora tutto.7. Colorazione con fuxina o safranina8. Risciacquo9. Si aggiunge una gocciolina di olio perché il preparato deve essere osservato adimmersione10.Osservazione:Se un batterio non lega il cristal violetto, non lo rilascia e non legherà di conseguenza ilsecondo colorante, la safranina.I batteri con colorazione blu saranno gram+, quelli con colorazione rosso-fuxia sarannogram-

Il diverso comportamento alla colorazione dipende dalla diversa architettura dellaparete che risulta essere spessa nei gram+ e molto sottile invece nei gram-.

Altre differenze tra i due tipi di batteri gram si hanno esaminando la struttura chimica:

Il peptidoglicano è formato da 2 amminozuccheri: 1. acido-N-acetilmuramico (NAM)2. N-acetilglucosammina (NAG)

Il primo è legato ad una catena pentapeptidica usata per formare i legami. La catena penta peptidica è formata da:I posizione: L-alanina (può variare)II posizione: D-glutamato (può variare)III posizione: L-lisina (essenziale per la reticolazione della catena di peptidoglicano)IV posizione: D-alaninaV posizione: D-alanina

L’ultimo amminoacido della catena (la D-alanina) verrà tagliato, per cui nel peptidoglicano maturo l’ acido-N-acetilmuramico avrà una catena a quattro amminoacidi. La composizione della catena pentapeptidica è differente nei gram+ e nei gram-. Il peptidoglicano è come una rete che avvolge le cellule batteriche, i polimeri lineari sono formati da tante unità N-acetilmurammato e N-acetilglutammina che si legano tra loro tramite legami beta-1-4 glicosidici. Le connessioni tra le catene lineari avvengono tramite le catene pentapeptidiche (legami interpeptidici):

nei gram- questo legame avviene direttamente tra le catene (tra l’aminoacido alanina in posizione 4 di una catena e quello in posizione 10 dell’altra catena)

nei gram+ tramite un ponte di pentaglicina che fa da intermediario. Quelle che erano tante catene separate risulteranno unite tra loro: abbiamo ottenuto così una rete in cui però non è detto che tutte le catene pentapeptidiche partecipino alla formazione di un legame con una catena adiacente.Nei gram+ una elevata percentuale di catene è impegnata a fare legami (nello stafilococco questa percentuale si aggira attorno al 90 %) ; nei gram- invece solo una piccolissima percentuale di catene è impegnata nei legami. Non tutte le catene sono coinvolte nella formazione di ponti trasversali, ma tutte hanno tagliato l’ultimo residuo di D-alanina: quest’energia può servire anche per altri processi.

Quindi il peptidoglicano:

nei gram+ è una rete a maglie molto strette e perciò sarà una rete molto fitta. Inoltre la rete non è solo tra catene adiacenti, ma anche tra catene che sonodistanti tra loro. Quindi abbiamo una rete non solo a maglie più strette, ma anche moltocompattata. Ci sono anche molecole “adesive”di acido tecoico che si trovano nello spazio ridotto presente nella rete del peptidoglicano. Queste molecole però sono presenti solo nei gram+ e non nei gram- e questo è un ulteriore fattore importante di funzionalità e riconoscimento in sede di colorazione. Gli acidi tecoici sono polimeri a lunga catena polari. Quando il cristal violetto lega il liquido di Lugol, il complesso diventa stabile.Acidi tecoici ancorati al peptidoglicanoAcidi lipotecoici attraversano lo spazio tra la membrana plasmatica e il peptidoglicano e sono ancorati alla membrana

nei gram- è una rete sottile e a maglie larghe, ci sono pochi legami trasversali ed un diverso comportamento alla colorazione.

Caratteristiche dei GRAM-

I gram- hanno un involucro aggiuntivo. Procedendo dall'interno verso l'esterno ci sarà: la membrana cellulare, la parete cellulare e una membrana esterna aggiuntiva assente nei gram+.La membrana esterna è un doppio strato fosfolipidico contenente delle proteine,ciò che la caratterizza è l’asimmetria; infatti rispetto alla membrana plasmatica la membrana esterna è molto asimmetrica nel senso che ci sono molecole che sono disposte soltanto sul versante esterno (lipopolisaccaridi o recettori per batteriocine) o solo su quello interno (lipoproteine di Brown che ancorano la membrana esterna al peptidoglicano).Mancando dei sofisticati sistemi di trasporto attivo (come le pompe), questa membrana pertanto funge da filtro attraverso il quale possono passare solo molecole di circa 600 700 dalton, ma la selezione non è fatta sulla base del tipo di soluto.La parete cellulare non è un filtro di nessun tipo pertanto lo spazio che si viene a crearetra la membrana interna e quella esterna è detto spazio periplasmatico. La membrana plasmatica è un filtro per eccellenza, mentre la membrana esterna è un filtro di pesomolecolare, vuol dire che sono solo collocate all'interno di questo spazio periplasmicoquelle molecole che non sono sufficientemente piccole per oltrepassare la membranaesterna e pertanto quella sarà la loro collocazione stabile e definitiva.Quasi tutti i batteri Gram- vanno a localizzare nello spazio periplasmico deglienzimi che risultano utili perché sono attivi nei confronti di molecole antibiotiche.Infatti i gram- sono intrinsecamente resistenti ad alcune penicilline naturali perché hanno lo spazio periplasmico con betalattamasi. Questo enzima va a tagliare proprio l’antibioticoprima che esso raggiunga il suo bersaglio naturale.Le proteine della membrana esterna formano dei pori: sono porine che formano dei trimeriche costituiscono un poro di passaggio sulla base del peso molecolare attraverso la membrana esterna. A queste porine si aggiungono proteine con ruolo strutturale e che servono quindi a dare stabilità alla membrana esterna e poi sono state individuate proteine che funzionano come recettori per batteriocine. Queste sono veleni attivi nei confronti di altri batteri e prodotti dai batteri stessi per la sopravvivenza. Ad esempio nel cavo orale se uno streptococco ha un metabolismo che gli permette di colonizzarlo è chiaro che produca veleni anche contro gli streptococchi, anche se si tratta di batteri dello stesso genere, perché sono batteri colonizzatori che competono per una stessa nicchia vitale.

Un altro componente della membrana esterna è il lipopolisaccaride: esso ha sicuramente una porzione lipidica, lo dice il nome, e una porzione carboidratica.

- La porzione lipidica, detta LIPIDE A, è inserita nel doppio strato fosfolipidico dellamembrana esterna sul versante esterno e le catene che sporgono non sono distribuite inuguale misura sul versante rivolto al citoplasma e sul versante rivolto sull’ambienteextracellulare. Sono presenti soltanto sul versante rivolto verso l’esterno.Il lipide A è un dimero di glicosina-fosfato con catene laterali costituite da acidi grassi nellamaggior parte dei casi a 14-16 atomi di C. Se cambia la quantità di C (ad es. nell’helicobacter pilori) c’è qualche cambiamento nell’attività biologica del polisaccaride.

- Il lipide A è attaccato a tutta la porzione carboidratica che però a sua volta si distingue in due parti: il CORE (la parte centrale) e la parte esterna, l’ANTIGENE O detto anche ANTIGENE SOMATICO, nel senso che è l’antigene legato al soma, al corpo cellulare del batterio. Ci sono poi altri antigeni che sono flagellari,quindi non legati al soma ma ad una porzione accessoria. Sia il core che l’antigene O hanno una struttura saccaridica, però il core è costituito da poche unità saccaridiche (di solito 7-8), mentre l’antigene O è costituito da 4-5 zuccheri che cambiano non solo nell’ambito dello stesso genere, ma anche nell’ambito della stessa specie, addirittura.questi zuccheri sono ripetuti fino a 30 volte. Quindi il core è la parte saccaridica, l’antigene O è la parte polisaccaridica. Il lipide A è dotato di attività tossica, come vedremo rappresenta l’endotossina nei batteri gram-, è una molecola fondamentale per i batteri gram- perché:

1. Ne permette la classificazione2. Nel meccanismo patogenetico il polisaccaride col suo lipide A ha un ruolofondamentale.

Caratteristiche degli acido alcool resistenti

Abbiamo detto che solo i micobatteri sono acido alcool resistenti. Gli organismi acidoalcool resistenti hanno una parete che è ricca di glicolipidi, di polisaccaridi, ma soprattuttodi polisaccaridi legati a molecole lipidiche. Il peptidoglicano è legato a galattasi e soprattutto ad acidi mucolici (lipidi che il ritmo di replicazione che sarà più lento e la permeabilità dell’involucro, perciò sono detti acido-alcol resistenti).La colorazione di ZIEHL-NEELSEN è fatta con alcool e acido ed è specifica per i micobatteri ed infatti è usata solo se ad esempio in un espettorato si cercano i batteri.Questa è una colorazione differenziale: coloranti diversi somministrati in due momentidiversi e che danno colorazione diversa. Non è fatto con alcool e acetone, ma è fatto conalcool e acido, HCl, quindi un decolorante molto più forte. Inoltre bisogna lavorare inparticolare condizioni, infatti se non si opera a caldo la carbossifuxina in soluzione acidanon riesce a superare questo strato di acidi glicoici di cui i micobatteri sono dotati.

Cosa serve ad un batterio per crescere?

Un singolo batterio cresce se aumenta di volume, duplica i costituenti e poi va incontro a scissione. Quindi crescita di un batterio significa aumento del numero di cellule che costituiscono la popolazione batterica. Di cosa ha bisogno un batterio percrescere? Come le altre cellule ha bisogno di nutrienti fondamentali:

- Macromolecole organiche- ioni metallici (calcio,magnesio,manganese, cloro, potassio fondamentali per

l’equilibrio osmotico)- Acqua- Energia- Carbonio

Per quanto riguarda le fonti di energia e le fonti di carbonio, i batteri si rifanno a tutti e 4 i tipi di rifornimenti di energia e di rifornimenti di carbonio. Non dimenticate che i batteri colonizzano qualsiasi nicchia occupabile, e allora dal punto di vista strettamente energetico, il batterio può ricavarla dall’energia solare (nel caso dei batteri foto-sintetici) oppure può ricavarla dalla degradazione di una molecola chimica (batteri chemio-sintetici). Per quanto riguarda la fonte di carbonio, il batterio ha bisogno di carbonio già scomposto oppure di carbonio legato ad altri atomi? Dipende dal tipo di batterio! Le nostre cellule come si comportano per quanto riguarda la fonte di energia e di carbonio? Noi siamo eterotrofi perché abbiamo bisogno comunque di altre cellule! Poi ci sono batteri che utilizzano più fonti di energia e più fonti di carbonio.

Tra i fattori che influenzano la crescita di un batterio abbiamo:- Ph ottimale: neutrofili, acidofili, basofili. Gran parte dei batteri sono neutrofili

nell’uomo, ma ce ne sono anche di acidofili come il bacillo della parete vaginale, resa in età fertile acida, o basofili come il vibrio colerae coltivato a ph alcolico.

- Pressione ottimale. Di solito quella atmosferica, ma tra gli arche- ci sono alcuni che vivono al altissime pressioni.

- Pressione osmotica: richiedono gradiente isotonico- Atmosfera di incubazione- Concentrazione salina: fisiologica (0,7-0,85). Ci sono anche gli alofili o alotolleranti

(vivono in ambiente marino). - Temperatura ottimale: mesofili (20°-45°C), psicrofili (0-10°C), termofili (45-100°C)