MICROBIOLOGIA AMBIENTALE PANORAMA sulle TECNICHE CLASSICHE E MOLECOLARI.
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MICROBIOLOGIA AMBIENTALE
PANORAMA sulle TECNICHE
“CLASSICHE E MOLECOLARI”
http://en.wikipedia.org/wiki/Growth_medium
Diversità morfologica dei microrganismi
MORFOLOGIA CELLULARE OSSERVABILE AL MICROSCOPIO
Monotrico Anfitrico
Lofotrico Peritrico
Numero e disposizione dei flagelli in rapporto alla cellula
Flagello/i non visibile al microscopio!!!
Diversità morfologica dei microrganismi
MORFOLOGIA CELLULARE
Microscopia ottica ed elettronica
MICROSCOPIA = insieme delle tecniche legate all’osservazione di organismi microscopici
Microscopia ottica ed elettronica
Microscopia ottica ed elettronica
Fonte luminosa
Campione
Obiettivo
Oculare
Fascio di elettroni
Campione
Lente magnetica
Lente obiettivo
Lente proiettore
Immagine schermo fluorescente
Microscopia ottica
Microscopia elettronica a trasmissione(TEM)
Concetti chiave1. Ingrandimento
2. Potere risolutivo: capacità di mostrare due punti adiacenti come distinti.- occhio umano 75-100 m- microscopio ottico: 0.2 m (200 nm)- microscopio elettronico: 0.2-2 nm
Il potere risolutivo dipende dalla caratteristiche fisiche del mezzo (luce-fascio di elettroni)
Microscopia ottica ed elettronica
Schema: microscopio composto
Tubo metallico
OCULARE-
GENERALMENTE BINOCULARE !!
OBIETTIVO 10X
OBIETTIVO 40X
OBIETTIVO 100X
Ganci
CondensatoreDiaframma
Sorgente di luce
Braccio
TavolinoPorta campione
Vite macrometrica
Vite micrometrica
MESSA A FUOCO
Base microscopio
Ruota obiettivi
Principi di base: microscopio composto
Sistema di lenti convergenti:
1. Oculare ed 2. Obiettivo all’estremità di un tubo metallico (160 mm)
- Campione (oggetto) davanti l’ obiettivo → immagine reale-capovolta ed ingrandita
- Immagine reale, capovolta ed ingrandita davanti all’oculare →immagine virtuale, capovolta ed ingrandita
Principi di base: microscopio composto
OBIETTIVO ED OCULARELAVORANO INSIEME
PER RISOLVERE L’IMMAGINE
L’oculare “risolve” l’immagine “reale” risolta dall’obbiettivo
10X oculare
10X, 40X,100X obiettivi
INGRANDIMENTO
FISSO
Ingrandimento totale=
Ingr. oculare X Ingr. obiettivo
Microscopio composto: obiettivo 100X ad immersione
- L’obiettivo 100X è sempre ad immersione
- L’obiettivo 100X è retrattatile
- L’olio ha lo stesso indice di rifrazione del vetro dell’obiettivo
Microscopio composto: campo chiaro- scuro e a contrasto di fase
1. CAMPO CHIARO: più comune, basata sulla proprietà della celluna di assorbire o
disperdere la luce. Illuminazione dal basso ( condensatore).
Colorazione generalmente necessaria
2. CAMPO SCURO: ideale per l’osservazione di superfici. Illuminazione laterale. Colori
“falsi”.
3. CONTRASTO DI FASE : aumenta il contrasto tra cellule e mezzo circostante, sfruttando la
differenza di “ritardo” della luce che attraversa le cellule in osservazione. Ideale per
l’osservazione di campioni in vivo.
Campo scuro Contrasto di fase
Osservazione in vivo e le colorazioni1. Osservazione in vivo:
- vetrino + goccia campione+ coprioggetto
- vetrino + goccia campione + inchiostro di china+ coprioggetto
- vetrino + goccia campione+ coprioggetto
2. Le colorazioni. I coloranti sono composti organici con differenti affinità
per specifiche componenti cellulari.
Distinguiamo :
A: Coloranti cationici (basici) [ strutture cellulari cariche negativamente, acidi nucleici e
polisaccaridi acidi, COO-] : blu di metilene, safranina e cristal violetto
B. Coloranti anionici: (acidi )[ strutture
cellulari citoplasmatiche].
Eosina, Rosso congo, Fucsina acida.
Colorazione di Gram
1884 Hans Christian Gram-Tecnica basata sulle proprietà fisiche della pareta cellulare
Colorazione di Gram
Asciugare all’aria
Fissare alla fiamma
RISULTATO AL MICROSCOPIO?
Colorazione di Gram
Quali sono Gram positivi e quali Gram negativi?
Colorazione di Gram
…“ma…”
La colorazione di GRAM è molto utilizzata
in microbiologia clinica, ma poco
sfruttabile in microbiologia ambientale
Microscopia ad epifluorescenza
DAPI
SYBR-GREEN
Labels double
DNA strain
A simple-to-use fluorescent stain, 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), visualizes nuclear DNA in both living and fixed cells
Confocal microscope images of colonized glass beads. Diatoms (Navicula sp. 1) are seen by the red fluorescence of their chloroplast. Bacteria (P. haloplanktis) are stained with SYBR Green 1. (a) and (d) Diatoms alone; (b) and (e) P. haloplanktis added to the diatom(b) culture after 4 d; (c) and (f) P. haloplanktis added to diatom culture (c) at time zero. Upper panel magnification was 10006 × , lower panel(d) magnification was 23006 ×.
• COLTURE DI MICRORGANISMI
La coltivazione dei batteri in laboratorio richiedel'impiego dei cosiddetti "terreni" o "mezzi di coltura", con iquali si cerca di riprodurre artificialmente un ambiente in
grado di soddisfare le esigenze metaboliche del microrganismoche si desidera coltivare. Il terreno, prima della semina, deve
essere sterile e contenuto in recipienti sterili dotati di unsistema di chiusura che garantisca la sterilità del contenuto.
Tutte le operazioni relative alla semina devono essere condotteosservando precauzioni necessarie a evitare la contaminazione
del terreno ad opera dei batteri presenti nell'ambiente.
Colture di microrganismi
RIPRODUCENDO LE CARATTERISTICHE
DELL’AMBIENTE DI ORIGINE è POSSIBILE OTTENERE
DELLE COLTURE E MANTENERE I MICROOGANISMI IN
LABORATORIO PER STUDIARNE LE CARATTERISTICHE
FISIOLOGICHE, L’ATTIVITà ANCHE AL FINE PER
APPLICAZIONI BIOTECNOLOGICHE.
MEZZI (TERRENI) DI COLTURA
solido liquido
TERRENI DI COLTURA
Terreni sintetici o definiti :
COMPOSIZIONE ESATTA
Terreni complessi :
COMPOSIZIONE non nota, generalmente contengono
Peptoni, idrosilati di carne, caseina etc…
Estratti di carne: contenenti amminoacidi, proteini, peptidi,
nucleotidim vitamine
Estratti di lievito, ricchi di vitamine della famiglia B, essenziali
per il metabolismo cellulare.
Terreni selettivi
Terreni differenziali
Terreni di arricchimento
MEZZI (TERRENI) DI COLTURA
The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow. The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content.
The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow. The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content.
The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow. The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content.
The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow. The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content.
The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow. The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content.
Streptococcus agalactiae does not grow on MSA because of the high salt content. Staphylococcus epidermidis grows but
does not ferment mannitol.
Esempio di Terreno selettivo:
MANNITOL SALT AGARSelettivo per Staphylococcus spp. e Micrococcaceae;
TERRENO DI COLTURA: differenziale
Escherichia coli Formazione di colonie su Acetate Differential Slant. Incubazione in aerobiosi.24 h at 35°C
Shigella flexneri Inibito dall’ acetato.Assenza di crescita Acetate Differential Slant. Incubazione in aerobiosi . 24h a 35 °C
Sodium Chloride 5.0gm
Sodium Acetate 2.0gm
Monoammonium Phosphate
1.0gm
Dipotassium Phosphate
1.0gm
Magnesium Sulfate 0.1gm
Bromothymol Blue 0.08gm
Agar 20.0gm
Final pH 6.7 +/- 0.2 at 25 °C.
Diversità morfologica dei microrganismi
DIVERSITà MORFOLOGICA DELLE COLONIEIMPORTANZA DEI PIGMENTIE DEI MARGINI DELLE COLONIE
PANORAMA SULLA DIVERSITA MORFOLOGICA: LE COLONIE
DIVERSITà METABOLICA
DALLA COLONIA
Test biochimici identificativi
DIVERSITà METABOLICA
LA COLONNA DI WINOGRADSKY
SCHEMA di una colonna
Dettaglio batteri sulfurei rossi e verdi, lungo un gradiente di luce
PAROLA CHIAVE: GRADIENTE- DI OSSIGENO- DI LUCE- DI NUTRIENTI (per es ZOLFO)
CONTA DEI MICRORGANISMI
A demonstration of a decimal series of dilutions. The 100 sample is a concentrated solution of methylene blue. A 0.2 ml portion of this was added to 1.8 ml (1:9 ratio) of 0.85% saline to create the 1:10 dilution. After mixing, 0.2 ml of the 10-1 dilution was added to a second tube containing 1.8 ml to create the 10 -2 dilution.This was continued to generate the dilution series. (B) A series of pour plates demonstrating the appearance of a viable plate count. The 3 plates show a 10 -7, 10-8,
and 10-9 dilution of a natural sample. Note how the number of colony forming units decreases 10 fold between the plates.
CONTA DEI MICRORGANISMI
DAPI, syber green, arancio di acridiniSono colaranti utilizzati anchenella conta di microganismi medianteMicroscopia a fluorescenza
MISURA DELL’ATTIVITà DEI MICROORGANISMI
RESPIRAZIONE
Soil is incubated at the required temperature, moisture content, etc. in the main flask and air can be added
through the CO2 absorber in the tube on top of the main flask.
During incubation the CO2 produced by respiration is absorbed into the alkali in the side tube.
This is then titrated to discover the amount of alkali neutralized by the evolved CO2 More air can be added
and the alkali replaced to continue the process of analysis.
MISURA DELL’ATTIVITà DI MICROOGANISMI SPECIFICI
AMMONIO E NITRITO OSSIDANTI
METANO-OSSIDANTI = METANOTROFI E METILOTROFI
-Ricavano energia dall’ossidazione del metano e di altri composti inorganici del carbonio
CH4 + 2 O2 -----> CO2 + 2 H2O + energy
- enzima chiave metano-ossigenasi
Struttura primaria e
secondaria dell’ rRNA 16S di
E.coli
16S RNA RIBOSOMIALE
PANOROMA TECNICHE PER LO STUDIO DELLE COMUNITà MICROBICHE
CFU_ colony-forming unitUnità formante colonia
Biolog_example of commercial kit
PLFA: phospholipids fatty acid profile
FISH: Fuorescent in situ Hybridization technique
IS-PCR Intergenic Spacer-Polymerase Chain reaction
PLFA: phospholipids fatty acid profile
PLFA analysis is based on the extraction of "signature" lipid biomarkers from the cell membranes and walls of microorganisms. Organic solvents are used to extract the lipids from cells, then the lipids are concentrated and analyzed by GC/MS to identify individual lipids. Certain bacterial groups make "signature" fatty acids, so a profile of the PLFA in a sample can be used to characterize the microbial community according to which fatty acids are found and in what concentrations. Below is an example of the PLFA chromatogram from a typical soil sample and the signature fatty acids that indicate the presence of particular broad groups of organisms
reazione di polimerizzazione a catena
REAZIONE DI POLIMERIZZAZIONE A CATENTA (PCR)
Esempi di utilità della PCR :1. Fornisce una riposta sulla presenza-assenza di un determinato gene, specie,
genere,,etcc (microbiologia clinica)2. Aumenta la disponibilità di materiale genetico da studiare ( mare = ambiente
oligotrofico)
COMPONENTI
TEMPERATURA
REAZIONE DI POLIMERIZZAZIONE A CATENTA (PCR)
REAZIONE DI POLIMERIZZAZIONE A CATENTA (PCR)
AGAROSIO
PERCENTUALE dipendente
dalla lunghezza del frammento
da caricare
EBOLLIZIONE (microonde)
PREPARAZIONE Cassetta
“versamento”del gel nella
cassetta
ELETTROFORESI
ELETTROFORESI
CARICAMENTO CAMPIONI (aggiunta di Loading Buffer)
CORSA TRA ELETTRODI
Risultati PCR su gel
1 2 3 4 5 6 7
NUOVE TECNICHE: CITOMETRIA DI FLUSSO
NUOVE TECNICHE: molecolari
Microscopio ad epifluorescenza
Microscopio ad epifluorescenza
Schema sorgente di luce1. Globo di quarzo2. e 3. Catodo e Anodo4. Camera di combustione (contenente Hg)5. Arco voltaico
365 nm404434546577613
“linee del mercurio”
colorazione fluorescente: DAPI attraversa la membrana cellulare lunghezza d’onda 358 nm visualizzazione cellule vive o fissate microscopia a fluorescenza
[4',6-diamidino-2-phenylindole ]
Campione DAPI+
Microscopio a fluorescenza
“le colorazioni in” Ecologia microbica
Microscopio ad epifluorescenza: immagini
DAPI SYBR-GREEN
Microscopio ad epifluorescenza e FISH (Fluorescence in situ Hybridization)
Microscopio ad epifluorescenza e FISH
MICROSCOPIO CONFOCALE
MICROSCOPIO CONFOCALE
Osservazione ad alta risoluzione di un singolo piano del campione.
Intensità luminosa
Segnale elettrico
Digitalizzazione
1 punto = 1 pixel
Specchio dicroicoCoerenza-Alta intensità-Unica λ
MICROSCOPIO CONFOCALE
Spostamento verticale della sezione ottica
Sovrapposizione singoli piani
Ricostruzione 3D
Microbiologia : analisi delle acque
- Solo implicazioni di tipo sanitario, ricerca di germi indicatori di inquinamento
- Parametri chimici, fisici e microbiologici (batteriologici)
- Tra i microganismi (batteri e protisti, es. Giardia
intestinalis)
- Dai risultati delle analisi → Punteggio → Livelli di
inquinamentoParametro Livello 1 Livello 2 Livello 3 Livello 4 Livello 5
100- OD( % sat)
>10 <20 <30 <50 >50
BOD5 (O2 mg/L)
< 2.5 <4 <8 <15 >15
COD (O2 mg/L)
<5 <10 <15 <25 >25
NH4 (N mg/L) <0.03 <0.10 <0.50 <1.5 >1.5
NO3 (N mg/L) <0.3 <1.5 <5.0 <10.0 > 10
P (mg/L) <0.07 <0.15 <0.3 <0.6 >0.6
Escherichia coli (UFC/100 ml)
<100 >1.000 < 5.000 <20.000 > 20.000
Punteggio 80 40 20 10 5
Microbiologia : analisi delle acque
Microbiologia : analisi delle acque
- Conta dei coliformi totali (UFC/ml)
- Conta dei coliformi fecali (UFC/ ml)
- Conta delgi Streptococchi fecali
TERRENO DI COLTURA
T° INC. TEMPO INC.
CONTA BATTERICA
TOTALE
PCA (Plate Agar
Count)
22°C36°C
72h48h
COLIFORMI TOTALI
Membrane endo agar less
36°C 24h
COLIFORMI FECALI
Membrane faecal coliform
44°C 24h
STREPTOCOCCHI FECALI
KF streptococcus
36°C 48h
Microbiologia : Coliformi total. Chi sono e come si “cercano”-“Coliforme”: simile ad Escerichia coli, fam. Enterobacteriaceae.- Aerobi o anaerobi facoltativi, G-, non sporigeni, lattosio-fermentanti-“Organismi indicatori" e in genere non sono patogeni- Generi : Klebsiella, Enterobacter, Escherichia, Citrobacter spp.
-Colore rosso scuro, nel caso di riflesso metallico verdastro
- Escherichia coli….
Microbiologia : Coliformi fecali
- Sinonimo di Coliformi termoresistenti
- Fermentano il lattosio a 44.5-45 °C
Microbiologia : Streptococchi fecali
- Gram positivi
- Indicatori di inquinamento non recente (vita media>)
- Terreno KF
- Sodio azide (inibitore di altri microrganismi)
- Colonie rosse con alone chiaro attorno
Microbiologia : Streptococchi fecali
- Chi sono e come si “cercano”
Species Colonia rossa
Alone giallo
Enterococcus faecalis+ +
Enterococcus hirae+ (poor) +
Enterococcus equinus+ (poor) +
Streptococcus pyogenes- -
Streptococcus agalactiae - -
Lactobacillus plantarum- -
Escherichia coli
Enterobacter cloacae
Pseudomonas aeruginosa
Microbiologia : metodo delle membrane filtranti
Metodo delle membrane filtranti
N Colonie/100 ml = (N colonie contate/ volume campione filtrato) *100