Valorizzazione di prodotti lattiero-caseari piemontesi: approcci molecolari per lo

studio dell’ecosistema microbico

Luca Cocolin

Di.Va.P.R.A., Microbiologia Agraria e Tecnologie Alimentari

Università di Torino

E-mail: lucasimone.cocolin@unito.it

Torino, 21 Settembre 2010

L’Italia è un paese estremamente ricco di prodotti tipici artigianali, le cui tecniche di produzione si tramandano di padre in figlio senza nessuna traccia scritta. La maggior parte di questi prodotti sono il risultato di un complesso processo di trasformazione microbica che molto spesso è eseguito da microrganismi naturalmente presenti

nelle materie prime. Da questo punto di vista rappresentano dei patrimoni unici da un punto di vista della biodiversità microbica.

Solo in Piemonte:- 369 Prodotti Artigianali Tipici (PAT, Regolamento della Regione Piemonte n. 173/98 e 350/99)- 12 Prodotti di Origine Protetta (DOP) e 5 Prodotti ad Indicazione di Orgine Protetta (IGP) (Regolamento Europeo n. 510/2006)

Fermentazioni naturali come fonte di biodiversità microbica

Approcci sperimentali per lo studio dell’ecologia microbica

Cultured bacteria

Isolation

Phenotypic characterization

Molecular characterization

Molecular identification

Fermented food

Cu

ltu

re-i

nd

ep

end

en

t m

eth

od

s Cu

lture-d

epen

den

t meth

od

s

Non-PCR based methods

PFGE

PCR-based methods

RAPD, Rep, Sau-PCR

Total bacteria

DNA and RNA extraction

PCR and RT-PCR

amplification

Pattern analysis DGGE, TGGE,

SSCP

Clone library cloning and sequencing

Bacterial diversity and activity, ecology and

phylogeny data

FISH analysis

Significato dei target molecolari utilizzati nelllo studio dell’ecologia microbica

DNARNA

Diversità AttivitàStati vitali non culturabili?

Approcci innovativi per la ricerca di produttori di batteriocine (Poster 17)

19 COLONIEalone di inibizione =

ACIDITA’98 COLONIE

alone di inibizione =BATTERIOCINE

42 COLONIEno riconferma alone

di inibizione

159 COLONIE159 COLONIEalone di inibizione

- 56 colonie inibiscono più di un ceppo patogeno (++ S. aureus e L. monocytogenes) - 42 colonie inibiscono un solo ceppo patogeno (++ Listeria monocytogenes)

Studio dell’ecologia microbica

Replica platingReplica plating®®

Salmonella enteritidis O:103Salmonella enteritidis O:103Escherichia coli Escherichia coli O157:H7O157:H7Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus ATCC® 6538™ATCC® 6538™Listeria monocytogenes 4bListeria monocytogenes 4bClostridium tyrobutyricum DSM 2637Clostridium tyrobutyricum DSM 2637 Brochotrix thermosphactaBrochotrix thermosphacta ATCC® 11509™ ATCC® 11509™

Progetto Regione Piemonte: CIPE 2006, BIOPRO

Dopo identificazione molecolare

55 ceppi di lattococchi, di cui:- 32, Lactococcus lactis- 13, Lactococcus lactis subsp. cremoris- 10, Lactococcus lactis subp. lactis

43 ceppi di enterococchi, di cui:- 32, Enterococcus faecium- 8, Enterococcus faecalis- 3, Enterococcus spp.

BatteriocineNisina A Nisina Z LcnB Lct481 LcnGα/ β LcnQα/ β NisA/ NisZ NisA/ Lcn481 Nis Z/ LcnB

L. lactis 10 21 4 1 3 3 7 1 0L. lactis subsp. lactis 0 0 0 0 0 0 0 0 0L. lactis subsp. cremoris 0 11 2 0 0 0 0 0 1

Enterocina A Enterocina P Ent A/ Ent P Cytolisina Enterolisina A Citol/ EnterolAE. faecium 21 5 4 10 10 10Enterococcus spp. 1 2 1 1 0 0E. faecalis 0 0 0 7 5 5

Batteriocine Batteriolisine

Approcci innovativi per la ricerca di produttori di batteriocine (Poster 17)

Metodi coltura indipendenti per lo studio dell’ecologia microbica in prodotti tradizionali: il Castelmagno DOP (Poster 65)

Metodi coltura indipendenti per lo studio dell’ecologia microbica in prodotti tradizionali: il Castelmagno DOP (Poster 65)

???

Sviluppo di starter autoctoni per prodotti caseari tradizionali: la Toma piemontese (Poster 18)

LATTE CAGLIATA FORMAGGIO

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Leuconostoc lactis

Leuconostoc mesenteroides

Lactobacilus plantarum

Lactobacillus paracasei

Enterococcus faecalis

Streptococcus sp.

Lactococcus garvie

Enterococcus gallinarum

Lactococcus lactis subsp.cremoris

Enterococcus durans

Streptococcus parauberis

Lactococcus lactis subsp. Lactis

Ceppi selezionati

L. lactis subsp. lactis

Ceppi selezionati

L. lactis subsp. cremoris

• I metodi molecolari possono essere utilizzati utilmente per una miglior comprensione della biodiversità microbica e per lo studio della complessità ecologica in prodotti lattiero caseari

• Alcuni concetti relativi alla funzione dei microrganismi durante le fermentazioni casearie devono essere riconsiderati ed è necessario investire in termini di ricerca scientifica a tale scopo

• La validazione della capacità degli starter microbici di condurre i processi trasformativi diventa fondamentale nel caso di ceppi autoctoni

• Lo studio delle ecologie microbiche deve essere condotto mediante un approccio multifasico in cui diverse metodologie si devono integrare per poter produrre una “fotografia” il più vicina possibile alla realtà !

Conclusioni

Ringraziamenti

• DIVAPRA:

- Kalliopi Rantsiou, Paola Dolci, Valentina Alessandra, Barbara Dal Bello, Marta Bertolino, Giuseppe Zeppa

• I partner di ricerca:

- UNITO (Dipartimento di Biologia Animale e dell’Uomo, Dipartimento di Patologia Animale), Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Liguria, Piemonte e Valle d’Aosta, UNIPM (Dipartimento di Scienze Chimiche, Alimentari, Farmaceutiche e Farmacologiche)

- Le aziende lattiero casearie

- Regione Piemonte per il sostegno economico

Grazie per l’attenzione !!!