Metodologie di embriologia sperimentale

Luca Del Giacco

luca.delgiacco@unimi.it

http://users.unimi.it/delgi/

sezione Functional and Reproductive

Biology

Torre B, piano 7

biologia dello sviluppo

La biologia dello sviluppo studia tutti i processi che

riguardano lo sviluppo, a partire dalla cellula uovo fecondata

fino alla nascita ed oltre.

differenziamento

Dal singolo uovo fecondato (lo zigote unicellulare) si origina

un n° enorme di diversi tipi cellulari con le più disparate

funzioni. Tutte queste cellule (a parte poche eccezioni)

contengono il medesimo patrimonio genetico.

morfogenesi

Le cellule che man mano si differenziano si organizzano in

tessuti ed organi piuttosto che essere distribuite in modo più

o meno casuale.

accrescimento

Le cellule che si stanno dividendo hanno perfettamente

presente quando smettere di farlo. La divisione cellulare è

strettamente regolata.

riproduzione

L’uovo e lo spermatozoo sono quelle cellule ad alta

specializzazione che garantiscono la trasmissione alla

generazione successiva delle informazioni per costruire un

nuovo organismo.

biologia dello sviluppo

biologiabiologia

dellodello

svilupposviluppo

embriologiaembriologiasperimentalesperimentale

biologiabiologiamolecolaremolecolare

geneticageneticadellodello

svilupposviluppo

embriologia sperimentale

Programmi di ricerca dell’embriologia sperimentale:

1.Come l’ambiente (le ‘forze esterne’) influenza lo sviluppo

dell’embrione

2.Come le ‘forze interne’ all’embrione determinano il

differenziamento delle cellule

3.Come le cellule si organizzano in tessuti ed organi

integrazione ambientaleL’ambiente influenza lo sviluppo

Alcohol

1.Come l’ambiente influenza lo sviluppo dell’embrione:

determinazione del sesso nel verme echiuroideo Bonellia

viridis

integrazione ambientale

integrazione ambientale

1.Come l’ambiente influenza lo sviluppo dell’embrione:

determinazione del sesso nel verme echiuroideo Bonellia

viridis

integrazione ambientale

L’aromatasi è prodotta sia dalle gonadi che dal cervello

dell’embrione. La attività aromatasica nelle gonadi rimane

costante, mentre nel cervello cambia drasticamente aumentando

di molto a temperature ‘femminilizzanti’

embriologia sperimentale

Nei rettili la determinazione primaria del sesso è ormone-

dipendente. Gli estrogeni, essenziali per lo sviluppo

dell’ovario, sono in grado di determinare lo sviluppo di

femmine anche a temperature mascolinizzanti. Viceversa, uova

trattate con inibitori della sintesi degli estrogeni danno

alta percentuale di maschi anche se incubate a temperature

‘femminili’.

La ‘link’ tra sesso, estrogeni e temperatura è l’enzima

aromatasi, che converte il testosterone in estrogeni

genetica dello sviluppoIl controllo esercitato dai geni sullo sviluppo dell’embrione.

La genetica dello sviluppo ha nello studio dei mutanti il suo

punto di forza. I notevoli passi avanti nel campo hanno messo

in evidenza come i geni che controllano le fasi precoci dello

sviluppo embrionale siano evolutivamente conservati

genetica dello sviluppo

mutante

eyeless

twin of

eyeless

Small eye

(Pax6)

Aniridia

genetica dello sviluppo

genetica dello sviluppo

genetica dello sviluppo

N -ethyl- N -nitrosourea (ENU) 

mutantiSLC24A5, uno scambiatore di cationi, influenza la pigmentazione in zf e uomo

embriologia sperimentale

• Cutting

• Pasting

• Paintin

g

L’embriologia sperimentale studia i meccanismi alla base dei

processi ontogenetici turbandone il naturale corso mediante

manipolazione degli embrioni

embriologia sperimentale

microiniezione

microiniezione

overespressione genica (pasting)

Agouti-related peptide (AgRP), un neuropeptide prodotto nel

nucleo arcuato dell’ipotalamo, aumenta l’appetito e diminuisce il

metabolismo.

overespressione genica (pasting)

pasting*

knock-DOWN genico (cutting)

•Antisense oligonucleotides•Designed as 25 mers•Resistant to digestion•Not RNAseH mediated

knock-DOWN genico (cutting)

•Antisense oligonucleotides•Designed as 25 mers•Resistant to digestion•Not RNAseH mediated

MO mimano mutazioni

embrioni “chimera”: le cellule di donatore e ricevente sono geneticamente (quindi fenotipicamente) differenti. Trapianto di cellule di quaglia in embrione di pollo.

painting

painting

thymidine kinase

topo knock-out

Differenziamento (espressione genica differenziale)

Dal singolo uovo fecondato (lo zigote unicellulare) si origina

un n° enorme di diversi tipi cellulari con le più disparate

funzioni.

1.tutte le cellule di un organismo (a parte poche eccezioni)

contengono il medesimo patrimonio genetico.

2.i geni non utilizzati vengono comunque conservati e possono

sempre venire espressi.

3.ogni cellula esprime solo una piccola percentuale del genoma

(es. cromosomi politenici di Drosophila).

espressione differenziale Cromosomi politenici.

biologia molecolareLa biologia molecolare studia i processi biologici a livello

dei meccanismi molecolari.

tecniche di biol molec

tecniche di biol molec

tecniche di biol molec

tecniche di biol molec

Ibridazione in situ con al sonda antisenso per Pax6 che mostra l’espressione del gene nell’occhio di topo in sviluppo. Pax6 è espresso sia nell’ectoderma del cristallino presuntivo che nel peduncolo ottico che formerà retina e nervo ottico.

9dd 10dd 15dd

tecniche di biol molec