METODICHE MOLECOLARI APPLICATE A CAMPIONI PARAFFINATI DI

TUMORI DELLA EWING FAMILY (EFT)

A. Parafioriti(1), S. Del Bianco(1), E. Armiraglio(1), S.Mapelli(2)

(1) U.O. Anatomia Patologica; (2) Centro di Chirurgia Ortopedica Oncologica

Istituto Ortopedico Gaetano Pini - Milano

Sarcoma di EwingTumore maligno dell’osso più comune in età pediatrica dopo l’osteosarcoma con prognosi legata a :• presentazione localizzata (70 % sopravvivenza)• metastatica (30% sopravvivenza)

FLI1 CD99

Descritto da J. Ewing nel 1920 e rimasto per decenni ad istogenesi incerta. Oggi sappiamo che ha origine neuroectodermica e che insieme al Tumore di Askin ed ai Tumori neuroectodermici primitivi (PNET) costituiscono un gruppo chiamato EFT con caratteristiche istologiche, immunofenotipiche, genetiche comuni.

Caratteristiche citogeneticheIl sarcoma di Ewing presenta delle traslocazioni cromosomiche peculiari:t(11;22) nel 70% dei casit(21;22) nel 10% dei casit(7;22) nel 5% dei casit(17;22) ed altre…

La traslocazione più frequente t(11;22)(q24;q12) produce un gene chimerico EWS/FLI1 che codifica per una proteina espressa nel 90% dei EFT.

Riscontro delle traslocazioni

L’identificazione delle traslocazioni è importante:

-per motivi diagnostici (diagnosi differenziale dei tumori a piccole cellule Ewing-like)-

- per motivi prognostici/predittivi (valutazione di malattia residua a livello midollare e plasmatico).

Scopo dello studio

Abbiamo applicato routinariamente la metodica RT-PCR che permette di rilevare la presenza dei trascritti di fusione più comuni EWS/FLI1 e EWS/ERG in sezioni tumorali paraffinate di pazienti portatori di EFT dello scheletro.

L’accurata scelta dei primers ha reso possibile, con un’unica amplificazione, la discriminazione tra i due sottotipi del trascritto EWS/FLI1.

Alcuni casi sono stati tipizzati anche con metodica di Real-Time PCR (qRT-PCR).

Metodi

L’analisi è stata condotta su 53 campioni di sarcoma EFT dell’osso.

• L’RNA è stato estratto da sezioni paraffinate con un kit commerciale

• Il risultato dell’estrazione è stato valutato allo spettrofotometro ottenendo valori di ratio e resa.

• Due microgrammi di RNA sono stati retrotrascritti in cDNA ed è stata effettuata una PCR sul gene housekeeping PGK per verificare la buona qualità del cDNA.

Metodi

• La PCR standard è stata condotta amplificando circa 200 ng di cDNA ed utilizzando una coppia di primers in grado di discriminare i due sottotipi di trascritto di fusione.

• Su 5 campioni di cui 3 risultati negativi in PCR standard è stata condotta un’analisi di Real-Time PCR utilizzando il metodo del SYBR green con la stessa coppia di primers usata in PCR standard.

Risultati

La tipizzazione dei pazienti per il trascritto di fusione EWS/FLI1 ha fornito i seguenti risultati:

EWS/FLI1 tipo 1 36

EWS/FLI1 tipo 2 6

Nessun trascritto 7

RNA degradato 4

Totale 53

Di 5 pazienti analizzati mediante q RT- PCR:

• 3 confermati negativi

• 2 positivi per EWS/FLI1

A B C D E F G

Lane A e D = trascritto EWS/FLI1 tipo 1

Lane B e E = trascritto EWS/FLI1 tipo 2

Lane C = nessun trascritto

Lane F = marcatore 25bp

Lane G = marcatore 100bp

PCR standard

Vantaggi della Real-Time PCR

La rilevazione dei trascritti di fusione tramite metodica di RT- PCR può essere utile come supporto alla diagnosi degli EFT• Accresce enormemente la sensibilità dell’analisi minimizzando il rischio di falsi positivi.

• Non richiede ulteriori indagini post-PCR per la visualizzazione dei risultati (elettroforesi su gel di agarosio) e la verifica della loro identità (sequenziamento).

Conclusioni

La caratterizzazione citogenetica dei tumori appartenenti alla EFT integra i dati morfologici ed immunofenotipici della diagnosi istopatologica, al fine di una classificazione sempre più accurata, della possibilità di identificare sottogruppi di pazienti con prognosi diversa o riprese di malattia altrimenti non ancora “detectable”.