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Metodi rapidi ed efficienti per l’estrazione di oli minerali (MO) da imballaggi di cartone e alimenti

Sabrina Moret, Marianna Scolaro, Laura Barp, Giorgia Purcaro, Lanfranco S. Conte

Dipartimento di Scienze degli Alimenti, Università degli Studi di Udine,

Via Sondrio 2A, 33100, Udine, Italia

26-28 giugno 2013

Desenzano del Garda

[email protected]

Si tratta di miscele complesse di idrocarburi che non possono essere separati

individualmente e che danno tipici tracciati cromatografici caratterizzati dalla

presenza di “colline” di picchi non risolti.

Prodotti ottenuti dalla distillazione

frazionata e raffinazione del petrolio

Oli minerali (MO)

E’ importante distinguere:

MOSH (mineral oil saturated hydrocarbons) che comprendono idrocarburi

lineari e ciclici (n-alcani, isoalcani e cicloalcani).

MOAH (mineral oil aromatic hydrocarbons) principalmente con 1-4 anelli,

alchilati

Oli minerali (MO) Oli minerali (MO)

La tossicità dei MOSH dipende dalla distribuzione dei PM.

Si accumulano in tessuti animali, latte e grasso umano.

A dosi comprese tra 0,01-20 mg/kg p.c. causano lo sviluppo di granulomi al

fegato e lesioni ai linfonodi mesenterici in ratti Fisher 344.

JECFA 2002

Oli minerali media e bassa viscosità (classe III)

tADI 0,01 mg/kg p.c.

SML (Specific Migration Limit) 0,6 mg/kg alimento

(60 kg p.c. e 1 kg/giorno)

JECFA 2012 : ritirata tADI per mancanza di dati

Opinione EFSA 2012:

• La presenza di oli minerali negli alimenti ha molteplici fonti

• Sono necessari ulteriori studi per valutare potenziale accumulo e tossicità MOSH

• Non dovrebbero essere presenti MOAH negli alimenti

Tossicità degli oli minerali

Limiti di legge

Nel 2008 UE stabilisce un limite di 50 mg/kg per olio girasole ucraino

BMELV

Maggio 2011: bozza ordinanza con limiti per MOSH e MOAH

migrati da imballaggi e altri materiali a contatto con alimenti prodotti con

carta riciclata:

MOSH C10-C25: < 0.6 mg/kg di alimento

MOAH C10-25: <0.15 mg/kg (non rilevabile)

Maggio 2013: nuova bozza ordinanza da applicare ad alimenti

confezionati in carta/cartone riciclato (no carta/cartone vergine)

• MOAH C10-25 non devono essere trasferiti agli alimenti

• Non viene specificato un limite

• Viene indicata necessità utilizzare materiali barriera

MOSH MOSH e MOAH

presentano tracciati

cromatografici con

“colline” di picchi non

risolti nello stesso

range di volatilità

MOAH

MOAH (15-25% dei MOSH): comprendono sospetti cancerogeni e genotossici

Possibili interferenti: olefine naturalmente presenti nel campione, POSH, PAO

MOSH rilevanti ai fini della migrazione in fase gassosa: C10-C25

MOSH rilevanti da un punto di vista tossicologico: C16-C35

Oli minerali (MO)

BfR: tADI 12 mg/persona/giorno per MOSH C10-C16

Principali fonti di contaminazione

• Oli minerali “food grade” trovano largo impiego nell’industria alimentare

(ingredienti, agenti anti-polvere, agenti distacco, lubrificanti, agenti

rivestimento per frutta, vegetali formaggi, etc.)

• Contaminazione ambientale: scarichi di autoviecoli (olio motore

incombusto), riscaldamento domestico, uso di alcuni pesticidi, raccolta

meccanizzata sono responsabile di contaminazione di fondo di vegetali e

prodotti derivati

Attenzione recentemente focalizzata su possibile migrazione da imballaggi in

cartone riciclato ad alimenti secchi in essi confezionati

Principali fonti di contaminazione

PURIFICAZIONE (rimozione del grasso) Frazionamento MOSH e MOAH

LC-GC-FID ON-LINE LC-GC-FID OFF-LINE SPE-GC-FID OFF-LINE

UNIVERSITY OF UDINE, ITALY

Opzionale (dipende da matrice, sensibilità richesta)

ESTRAZIONE

PRE-ARRICCHIMENTO Rimozione materiale interferente

Determinazione analitica

• MOSH e MOAH dello stesso intervallo di volatilità co-eluiscono da colonna GC

• Necessaria pre-separazione MOSH/MOAH prima dell’analisi GC

• Disponibili a questo scopo metodi off-line e on-line

DEPT. FOOD SCIENCE, UNIVERSITY OF UDINE, ITALY

LC-GC 9000

Metodo LC-GC on-line Metodo LC-GC on-line Metodo LC-GC on-line

“Fast Method”: 2.6 samples/h 62 samples/24h

“Reference Method”: 1.7 samples/h 40 samples/24h

"Reference

Method""Fast Method" Improvement

Run Time 35 min 23 min - 12 min or 34%

C6 volume 8 mL 5 mL - 3 mL or 23%

Cl2CH2 volume 4.5 mL 4.5 mL =

Metodo LC-GC on-line “veloce” Metodo LC-GC on-line “veloce” Metodo LC-GC on-line “veloce”

Barp et al., J. Sep. Sci. (in press)

Metodi SPE-GC off-line

reconcentration LVI – GC- FID

1mL C6 (dead volume)

1,5 mL C6 + 0,5mL C6/CH2Cl2 (1:1) MOSH

0,5mL C6/CH2Cl2 (1:1)

7mL C6/CH2Cl2 (1:1) MOAH

MOSH MOAH

250uL sample

1g silvered silica packed and conditioned

Metodo SPE-GC off-line Moret, et al., J. Chromatogr. A 2012, 1243, 1-5

Metodo SPE-GC off-line

• Estrazione classica con solvente

• Idrolisi acida

• Saponificazione

• Saponificazione assistita con le microonde (MAS)

• Estrazione assistita con le microonde (MAE)

• Estrazione liquida ad alta P e T (PLE)

Metodi tradizionali

Metodi innovativi

Estrazione Estrazione

Estrazione classica con solvente di MO dal cartone Metodo SE (Lorenzini et al., 2010)

1 g cartone (tagliato in piccoli pezzi) + IS

+ 10 mL esano/etanolo

(1:1) (2h at T amb)

3 mL estratto + 6 mL H2O

Vortex

Centifugazione

Iniezione

Lorenzini et al. 2010


Mineral oil in

food packaging

(cardboard, paper)

Sample preparation On-line LC-GC Results

PLE

HPLC HRGC

PUMP FID

1° cycle

2° cycle 3° cycle

2 cycles

1 cycle + wash

1° cycle

2 cycles

1 cycle + wash

3° cycle

2° cycle

MOAH

MOSH

2 cycles

1 cycle

3°cycle2° cycle

1 cycle + wash

3°cycle

2° cycle

2 cycles

1 cycle + wash

1 cycle

MOSH

MOAH


In cella da 10 mL: 2 barrette di acciaio (2 mL)

+ 1 g campione in strisce + IS

PLE

estratto pronto per l’iniezione

Speed extractor (Buchi)

Pressurized liquid extraction (PLE)

Metodo PLE cartone Condizioni testate

Condizioni testate:

• cella di estrazione: 10 mL

• solvente di estrazione: esano, esano/

etanolo (1/1), etanolo (1-2 cicli)

• temperatura estrazione: 30-50-60-100 °C

• pressione: 100 bar

• pre-riscaldamento: 1 min

• tempo di estrazione: 5-10 min

• scarico solvente: 2 min

• lavaggio con solvente: no

• flush con azoto: 1 min

Lo SpeedExtractor permette di processare

fino a 6 campioni in parallelo

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

C10 C12 C14 C16 C18 C20 C22 C24 C26 C28 C30 C32 C34 C36 C38 C40

REFERENCE

FLUSH 1'

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

C11 CyCy C13 Cho 5B 1-MN 2-MN TBB

REFERENCE

FLUSH 1'

Metodo PLE cartone Test di recupero su n-alcani e standard interni

Con un flush di azoto di 1 min (necessario a scaricare solvente residuo dalla cella)

non si osservano perdite né di n-alcani più volatili, né di standard interni.

Riferimento:

Iniezione diretta in LC-GC

Flush 1’:

Iniezione LC-GC dopo PLE (60 °C x 5’,

100 bar, flush con azoto 1’)

Standard interni e di verifica:

MOSH C11

CyCy (cicloesil cicloesano)

C13

CHO (colestano)

MOAH

5B (n-pentil benzene

1MN (1-metilnaftalene)

2MN (1-metilnaftalene)

TBB (tri-ter-butil benzene)

area

area

Ottimizzazione metodo PLE cartone Scelta del solvente di estrazione

Testati 3 diversi solventi

(1 ciclo, 60°C, 5 min):

• esano

• etanolo

• esano/etanolo (1:1)

Non si osservano differenze apprezzabili

per MOSH<C24 e per MOAH.

Il minore potere estraente dell’etanolo nei

confronti di MO basso bollenti, osservata

per il metodo Lorenzini non viene

confermata con il metodo PLE

possibilità di utilizzare solo esano (no

post trattamento campione)

Hexane/ethanol (1:1) ethanol hexane

Moret et al. Talanta 115 (2013) 246-252

Ottimizzazione metodo PLE cartone Scelta del solvente di estrazione

In figura sono riportati i

tracciati LC-GC ottenuti

estraendo un campione di

cartoncino riciclato non

stampato (viola) e stampato

(blu) con solo esano e con

miscela esano/etanolo (1:1).

I 2 solventi mostrano

selettività comparabili.


30 °C

60-70 °C

30 °C

60-70 °C

Ottimizzazione metodo PLE cartone Effetto temperatura e tempo di estrazione

MOAH MOSH

Le rese di estrazione (1 ciclo, esano, 5 min, 100 bar) aumentano con la T

passando da 30°C a 60°C (a 30°C vengono estratti circa 80% dei MOH presenti).

Non si osservano ulteriori incrementi della resa di estrazione tra 60°C e 70°C.

Non si osservano differenze apprezzabili aumentando tempo di estrazione da 5 a

10 min.

Testati 4 cartoncini diversi di cui 2 dello stesso tipo ma diverso spessore:

1 ciclo estrazione recuperi MOSH compresi tra 76 e 100%

2 cicli estrazione recuperi praticamente quantitativi per tutti e 4 i campioni.

Ottimizzazione metodo PLE cartone Numero cicli di estrazione e recupero

1° cycle

2° cycle 3° cycle

2 cycles

1 cycle + wash

1° cycle

2 cycles

1 cycle + wash

3° cycle

2° cycle

MOAH

MOSH

2 cycles

1 cycle

3°cycle2° cycle

1 cycle + wash

3°cycle

2° cycle

2 cycles

1 cycle + wash

1 cycle

MOSH

MOAH

La figura mostra i tracciati LC-GC

ottenuti per un campione con 2 cicli

consecutivi (blu), 1 ciclo (viola), 2° ciclo

separato (verde), 3° ciclo separato

(marrone), 1 ciclo + lavaggio con esano

(nero).

Per ottenere rese quantitative e

indipendenti dal tipo di cartoncino sono

necessari 2 cicli di estrazione

Le rese di estrazione con 1 ciclo sono

influenzate dallo spessore del

cartoncino.


Ottimizzazione metodo PLE cartone Ripetibilità (n=8)

RSD<5% sia per MOSH che per MOAH (8 repliche effettuate su campione

cartone riciclato non stampato)

MOSH MOAH

Metodo PLE cartone Confronto con metodo SE

I profili LC-GC ottenuti

con PLE ottimizzato

risultano perfettamente

sovrapponibili a quelli

ottenuti con metodo SE

(Lorenzini et al., 2010)


Metodo PLE cartone Applicazione metodo PLE e confronto con metodo SE


Metodo PLE cartone Condizioni ottimizzate

Vantaggi metodo PLE:

• minor manipolazione campione, risparmio tempo (6 campioni in

parallelo in meno di 30 min)

• non è necessario alcun post-trattamento dell’estratto prima

dell’iniezione

Estrazione da alimenti secchi a basso contenuto di grasso confezionati in imballaggi di cartone

• I MO migrati dall’imballaggio tendono a rimanere in superficie per cui risultano

facilmente estraibili con solvente apolare

• la contaminazione pre-esistente (che può avere diverse origini) risulta più

fortemente inclusa nella matrice e quindi più difficilmente estraibile (necessità di

utilizzare idonea miscela di solventi)

Sono stati ottimizzati 2 metodi PLE

1) PLE-A: per estrazione MO migrati dall’

imballaggio

2) PLE-B per estrazione MO totali da diverse

fonti di contaminazione

Metodo PLE-A (MO migrati dal packaging)

Preparazione del campione

Pastina, riso o altri cereali in grani (circa 8 g) vengono caricati direttamente

in cella di estrazione da 10 mL cell (non si utilizzano agenti disperdenti).

Pasta di formato più grande deve essere ridotta in pezzi grossolani.

Condizioni testate

• Solvente di estrazione: esano (1-2 cicli)

• Temperatura di estrazione: 80-100-120 °C

• Pressione: 100 bar

• “Heat up”: 1 min

• Tempo di estrazione (hold time): 5-10 min

• Scarico: 2 min

• Lavaggio con solvente: no - si (2 mL/min x 180’’)

• Lavaggio con azoto: 2 min

Metodo PLE-A Ottimizzazione dei parametri di estrazione

Tracciati LC-GC ottenuti a 80, 100 and 120 °C for 5

min e a 100 °C for 10 min (1 ciclo)

Non si osservano differenze di estrazione

significative al variare della temperatura

(80-100-120°C) e del tempo di estrazione

(5-10 min).

I recuperi ottenuti con 1 ciclo di

estrazione (5 min a100 °C) non

sono quantitativi.

Un lavaggio con esano effettuato

alle fine dell’estrazione permette

di ottenere recuperi praticamente

quantitativi

Metodo PLE-A

1 ciclo esano +

lavaggio con

solvente

2° ciclo di

estrazione

Pasta semola dopo 3

mesi di contatto con

cartone riciclato

Metodo PLE-A (Ripetibilità n=6)

MOAH MOSH

Sopraposizione di 6 repliche di analisi dello stesso campione di pasta dopo contatto (9

mesi) con cartone riciclato

RSD<5%

Metodo PLE-A (Ripetibilità n=6)

Il metodo PLE-A permette

estrazione quantitativa degli

idrocarburi migrati

dall’imballaggio ad alimenti

secchi a basso contenuto di

grasso (pasta semola, riso,

cereali in grani).

L’estratto può essere iniettato

direttamente previa eventuale

centrifugazione

Per ottenere estrazioni

quantitative di MOSH e MOAH

da campioni di pasta

all’uovo è necessario allungare

i tempi di estrazione

Metodo PLE-A

Condizioni ottimizzate metodo PLE-A

Speed Extractor E-916 (6 positions)

Temperature 100 °C

Pressure 100 bar

Cells (volume) 10 mL

Solvent hexane

Cycles (number) 1

- Heat up 1 min

- Hold time 5 min

- Discharge 2 min

Flush with solvent 180’’ at 2 mL min-1

Flush with gas (N2) 1 min

Total solvent consumption 13 mL

Total extraction time < 20 min (wash included)

Metodo PLE-A

Moret et al., 2013 (submitted)

Estrazione di MO totali

Metodi disponibili a questo scopo:

Metodo Biedermann-Brem e Grob (2010): trattamento con acqua calda (1h a 80°C)

seguito da estrazione con etanolo (1h) e poi con esano (overnight) lavaggio

estratti combinati con acqua (applicata a pasta)

Idrolisi acida (applicata a latte in polvere)

Saponificazione (tradizionale)

L’estrazione di MO totali dagli alimenti può risultare più o meno difficoltosa in

funzione della natura dell’alimento

Questi metodi richiedono lunghi tempi di estrazione ed elevati consumi di

solvente

La PLE rappresenta una interessante alternativa

Metodo PLE-B (MO totali)

Preparazione del campione:

Campione finemente macinato. La cella di estrazione viene riempita (dal

basso) con un letto di sabbia (5 g), 2 g di campione mescolato a sabbia (6

g), addizionato con IS e riempito di sabbia lasciando in testa alla cella un

volume vuoto di circa 1 mL.

Condizioni testate

• Solvente di estrazione: esano, etanolo, acetone, esano/etanolo (1:1),

esano/acetone (1-2-3 cicli)

• temperatura di estrazione: 100-120 °C

• Pressione: 100 bar

• Heat up: 1 min

• tempo di estrazione: 5-10 min

• Scarico: 2 min

• Lavaggio con solvente: si/no

• Flush con azoto: 2 min

Metodo PLE-B (MO totali) Scelta del solvente di estrazione

La miscela esano/etanolo da le rese di estrazione più elevate.

8 12 min

hexane

hexane/acetone (1:1)

acetone

hexane/ethanol (1:1)

Moret et al, 2013 (submitted)

Metodo PLE-B (MO totali) Temperatura di estrazione

100 -120°C

150°C

A 150 °C si osserva un imbrunimento del campione e una leggera

diminuzione della resa di estrazione.

Metodo PLE-B (MO totali) Numero cicli ed efficienza di estrazione

1° cycle

2° cycle

3° cycle

4

8 12 min12 min8 12 minMoret et al, 2013 (submitted)

Per ottenere rese quantitative è necessario effettuare 2 cicli di estrazione.

Prove effettuate in triplice su 3 campioni con diversi profili di contaminazione

hanno evidenziato recuperi superiori al 95%

Metodo PLE-B (MO totali) Numero cicli ed efficienza di estrazione

Metodo PLE-B (MO totali) Confronto metodo PLE-B – estrazione classica con solvente

Il metodo PLE-B da risultati confrontabili a quelli ottenuti con metodo

proposto da Biedermann-Brem e Grob, e permette di ridurre tempi di analisi,

consumo di solventi e manipolazione campione

soaking with hot water +

ethanol extraction (1h)

hexane extraction overnight

hexane extraction

overnight

4 8 12 16 min

PLE method B

hexane/ethanol 1:1

4 84 1284Moret et al., 2013 (submitted)

Metodo PLE-B (MO totali) Confronto metodo PLE-B – estrazione classica con solvente

Metodo PLE-B (MO totali) Ripetibilità

6 repliche effettuate con il metodo ottimizzato su 2 campioni con diverso livello di

contaminazione pre-esistente: livello basso (0.8 mg/kg) e livello alto (13.7 mg/kg)

hanno evidenziato una buona ripetibilità (RSD< 6%)

0.8 mg/kg 13.7 mg/kg

Metodo PLE-B (MO totali) Ripetibilità

Condizioni ottimizzate metodo PLE-B

Speed Extractor E-916 (6 positions)

Temperature 100 °C

Pressure 100 bar

Cells (volume) 10 mL

Solvent Hexane/ethanol 1:1 (v/v)

Cycles (number) 2

- Heat up 1 min

- Hold time 5 min

- Discharge 2 min

Flush with solvent no

Flush with gas (N2) 1 min

Total solvent consumption 15 mL

Total extraction time 28 min

L’estratto raccolto in vial (da 60

mL) viene addizionato di acqua

per allontanare l’etanolo. Una

sosta di 15-20 min a -20 °C

permette di evitare la

centrifugazione per separare la

fase esano (che può essere

iniettata direttamente o previa

concentrazione)

Post-trattamento campione

Metodo PLE-B


MOSH MOAH

Esempio di applicazione metodo PLE cartone e metodo PLE-A

3 diversi alimenti, stesso formato (riso, riso parboiled, pastina semola) a contatto

con 2 diversi cartoni (6 settimane a T ambiente) livelli di migrazione comparabili

per le 2 tipologie di riso, sensibilmente più bassi per pastina semola

4 8 12 8 12 min

a

c d

b

T9

T0

T1

T0

T1

T9

T0

T1T9

T0T1

T9

PLE A

PLE B (total contamination) PLE B after PLE A

MOAH

MOSH MOSH

MOSH

PLE A

Pre-existing

contamination

Migrated from

packaging


Esempio di applicazione combinata dei metodi PLE-A e PLE-B (1)

PLE-A permette di

estrarre selettivamente

MO migrati da

packaging

PLE-B estrae MO totali

Applicando in

successione PLE-A e

PLE-B (su campione

previamente macinato)

è possibile evidenziare

contaminazione pre-

esistente anche in

presenza di

contaminazione da

imballaggio

Esempio di applicazione combinata dei metodi PLE-A e PLE-B in campioni pasta semola


Microwave Assisted Saponification (MAS)

5g campione macinato + 10 mL KOH in CH3OH

+ 10 mL esano

120 °C x 20 min

Lavaggio con acqua dell’estratto esanico

5g campione macinato + 10 mL esano/etanolo 1:1

Microwave Assisted Extraction (MAE)

Estrazione con le microonde Estrazione con le microonde Estrazione con le microonde

LC-GC-FID on-line SPE GC-FID off-line

US4F- MAE_2 EtOH/C6 – 19 MAGGIO

US4F PLE C6/EtOH (2 cicli) - 20 LUGLIO

US4F MAS – 5 LUGLIO

Confronto metodi: PLE-B / MAS / MAE in campioni di pasta di semola

PLE-B MAS MAE

Confronto metodi: PLE-B / MAS / MAE in campioni di pasta di semola

Latte in polvere

Biscotto 1

Biscotto 2

Il metodo MAS rappresenta

la scelta migliore per

l’estrazione di MO da

alimenti ad elevato

contenuto di grasso.

Migliorano limiti di

rilevabilità, si allungano i

tempi di vita delle colonne

Omogenizzato al formaggio

Applicazione metodo MAS a campioni con elevato contenuto di grasso

Applicazione metodo MAS a campioni con elevato contenuto di grasso

L’estrazione degli analiti dal campione rappresenta una fase

importante della determinazione analitica e va opportunamente

ottimizzata in funzione della natura della matrice e delle finalità da

raggiungere

Recentemente sono stati sviluppati diversi metodi di estrazione

basati sull’impiego di tecniche innovative (PLE, MAE, MAS)

In particolare sono stati sviluppati e applicati un metodo PLE per

estrazione MOSH e MOAH da carta e cartone, un metodo PLE per

estrazione selettiva di MOSH e MOAH da alimenti secchi a basso

contenuto di grasso, un metodo PLE per l’estrazione MOSH e

MOAH totali e un metodo MAS particolarmente idoneo al trattamento

di campioni con un elevato contenuto di grasso

Conclusioni Conclusioni


Grazie per l’attenzione

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