“SORVEGLIANZA DELLE FIORITURE “SORVEGLIANZA DELLE FIORITURE DIDI CIANOBATTERI CIANOBATTERI NELLE ACQUE NELLE ACQUE DIDI BALNEAZIONE: APPROCCIO PER BALNEAZIONE: APPROCCIO PER

L’APPLICAZIONE DEL L’APPLICAZIONE DEL DL.vo DL.vo 30 MAGGIO 2008 N.116 IN 30 MAGGIO 2008 N.116 IN RECEPIMENTO DELLA DIRETTIVA 2006/7EC”RECEPIMENTO DELLA DIRETTIVA 2006/7EC”RECEPIMENTO DELLA DIRETTIVA 2006/7ECRECEPIMENTO DELLA DIRETTIVA 2006/7EC

MetodiMetodi immunoenzimaticiimmunoenzimatici per l’analisi delleper l’analisi delleMetodi Metodi immunoenzimaticiimmunoenzimatici per l’analisi delle per l’analisi delle cianotossinecianotossine

Mara Stefanelli

Istituto Superiore di Sanità – Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione PrimariaReparto Qualità degli Ambienti Acquatici e delle Acque di BalneazioneReparto Qualità degli Ambienti Acquatici e delle Acque di Balneazione

Roma 19 maggio 2009

Oltre ad una serie di metodi Oltre ad una serie di metodi fisicofisico--chimicichimici per l’identificazione e la per l’identificazione e la quantificazione di quantificazione di cianotossinecianotossine in un campione ambientale possono in un campione ambientale possono

essere impiegati:essere impiegati:

Metodi Metodi immunoenzimaticiimmunoenzimatici

Metodi biologiciMetodi biologici Metodi biochimiciMetodi biochimici

Screening di campioni ambientali

• Qualitativi e/o semiquantitativi• A risposta rapida• A risposta rapida• Non necessitano di standard analitici• Non discriminano tra le varie tossine• Livelli di sensibilità variabili a seconda del metodo usato

M t di bi l i i iM t di bi l i i i i ii iMetodi biologici: saggi Metodi biologici: saggi in vivoin vivo

Si avvalgono di animali da laboratorio

Vertebrati: Mouse BioAssay, MBA Invertebrati: Artemia salina

• Misura di tossicità totale del campione• In alcuni casi del tipo di tossina presente (in base ai sintomi o in seguito a necrosi)

Metodi biologici: MBAMetodi biologici: MBAMetodi biologici: MBAMetodi biologici: MBA

• Screening di campioni incogniti (identifica la presenza di qualsiasi tossina)

R l ti t l t• Relativamente veloce e poco costoso• Di facile applicazione• Fornisce indicazioni di tossicità

Estratto acidoEstratto acido di omogenati di tessuto Iniezione

intraperitoneale

60min/24hNo mortalità o segni di tossicità

Estratto di altro campionees. acqua

CAMPIONE NEGATIVO (no livelli (tossici di cianotossine)

Metodi biologici: MBAMetodi biologici: MBAMetodi biologici: MBAMetodi biologici: MBA

SVANTAGGI

• Bassa sensibilità • Utilizzo di un discreto numero di animali: problemi etici

SVANTAGGI

• Utilizzo di un discreto numero di animali: problemi etici • Metodo esclusivamente qualitativo• Preclude l’identificazione di effetti ritardati• Somministrazione poco rappresentativa della reale esposizione umana

• microcistine• nodularine

• cilindrospermopsina• saxitossine

RISPOSTA:

nodularine• anatossina-a• anatossina-a(s)

saxitossine• aplysiatossina•lyngbiatossina

Metodi biologici:Metodi biologici: ArtemiaArtemia salinasalinaMetodi biologici: Metodi biologici: ArtemiaArtemia salinasalina

• No problemi eticiFacile esecuzione• Facile esecuzione

Conta individui18/24h

Inizio saggio:

Conta individui morti/totale:

% di mobilizzazione

18/24h

Riattivazione cisti

Inizio saggio: 10 naupli in

ogni pozzetto Incubazione a

25°C

risultati espressi come LC50

Metodi biologici:Metodi biologici: ArtemiaArtemia salinasalinaMetodi biologici: Metodi biologici: ArtemiaArtemia salinasalina

SVANTAGGI

B ibili à (LD

SVANTAGGI

• Bassa sensibilità (LD50 = 5-10mg/L per le MC)• Assenza di specificità• Indicazioni di tossicità difficilmente estrapolabili ad unaIndicazioni di tossicità difficilmente estrapolabili ad unasituazione di rischio reale per mammiferi• No diversa suscettibilità di Artemia alle diverse cianotossine

RISPOSTA:

• microcistine• nodularine

QuestiQuesti metodimetodi sonosono sempresempre piùpiù spessospesso sostituitisostituiti dadaQuestiQuesti metodimetodi sonosono sempresempre piùpiù spessospesso sostituitisostituiti dadametodologiemetodologie biochimichebiochimiche ee immunoenzimaticheimmunoenzimatiche,,cheche risultanorisultano essereessere::

•• più sensibili (0,1più sensibili (0,1μμg/L per g/L per MCMC))

•• più veloci dei metodi chimicipiù veloci dei metodi chimici

•• meno costosimeno costosi•• meno costosi meno costosi

•• in grado di determinare la presenza di tossine,in grado di determinare la presenza di tossine,in grado di determinare la presenza di tossine, in grado di determinare la presenza di tossine, indipendentemente dalla disponibilità di standardindipendentemente dalla disponibilità di standard

Metodi Metodi ImmunoenzimaticiImmunoenzimatici::Ph h tPh h t I hibitiI hibiti AA ((PPiPPi))PhosphatasePhosphatase InhibitionInhibition AssayAssay ((PPiPPi))

PRINCIPIOPRINCIPIO

• Basato sulla capacità di alcune tossine (es. microcistine e nodularine)di inibire l’attività di enzimi quali le proteine (serina/treonina) fosfatasi,l ifi t i d iclassificate in due gruppi:

- Tipo 1: PP1- Tipo 2: PP2

• Livello di inibizione usato come misura della concentrazione di tossina

La quantificazione della inibizione può essere fatta con tre tecniche

Metodo colorimetrico: substrato usato p-nitrofenilfosfato

Test aspecifico, non discrimina tra loro i congeneri e non distingue tra MC e Nodularine;ma è comunque abbastanza sensibile (0,25-2,5 µg/L), rapido, di facile realizzazione epoco costoso

Metodo fluorimetrico: substrato usato 4-metil-umbelliferilfosfato

Alternativa valida del primo e almeno due volte più sensibile (0,1 µg/L)

M t d di t i b t t t t t 32PMetodo radiometrico: substrato usato sostanze marcate con 32P

Metodo più sensibile(0,1 µg/L), ma meno usato perché non è agevole lavorare conmateriale radioattivo e data la semivita del 32P,non è possibile utilizzare scorte, p

Metodi Metodi ImmunoenzimaticiImmunoenzimatici: : EE Li k dLi k d I b dI b d AAEnzymeEnzyme LinkedLinked ImmunosorbendImmunosorbend AssayAssay

S il ti ll’i i i i ’90 i di ti i li l li ti MC LR i l li t lSviluppati all’inizio anni ’90, prima con uso di anticorpi policlonali anti- MC-LR, poi monoclonali contro la stessa tossina con conseguente sviluppo di kit ELISA più specifici

PRINCIPIOPRINCIPIO• Il metodo utilizza anticorpi policlonali, immobilizzati sulle pareti di un sistema test, che possono

legare sia le microcistine che un coniugato enzima – microcistine

I i tt è t t tità t di ti i i bili ti i tt• In ogni pozzetto è contenuta una quantità nota di anticorpi immobilizzati, ciascun pozzettoriceve lo stesso numero di molecole coniugate di coniugato

• Un campione che contiene una bassa concentrazione di MCs permette all’anticorpo di legare unUn campione che contiene una bassa concentrazione di MCs permette all anticorpo di legare unaltro numero di molecole di coniugato

• Alte concentrazioni di MCs nel campione consentono ad un basso numero di molecole dii t di l i li ti iconiugato di legarsi agli anticorpi

• La rivelazione dei complessi si ha per via colorimetrica, con una relazione inversa che legaintensità di colore e concentrazione di MCs legateintensità di colore e concentrazione di MCs legate

• Il dosaggio si basa sulla lettura dell’assorbanza (450 nm)

Sono disponibili sul mercato diversi kit diagnostici per la sola presenza di microcistina ma anche per la nodularina lapresenza di microcistina, ma anche per la nodularina, la

cilindrospermopsina e le saxitossine

- Strips, in forma di piastre da 96 pozzetti,con anticorpo adeso sul fondocon anticorpo adeso sul fondo

- Controllo negativo- Calibratori a diverse concentrazioni

( b)(ppb)- Diluente- ConiugatoConiugato- Soluzione di lavaggio- Substrato- Soluzione Stop

ESEMPIO: determinazione di microcistine in campioni di acqua

preparazione del campionealiquota (es. 100 ml) sottoposta a congelamento/scongelamento & ultrasuoni: lisi cellulare e rilascio tossine

allestimento dei pozzetti:n. 2 pozzetti per ciascun campione e n. 2 pozzetti per ciascun materiale di riferimento; diluente in ciascun pozzetto; analita standard (antigene) immobilizzato sul supporto

reazione di competizionecampione inserito nel pozzetto insieme ad anticorpo specifico per l’analita antigene (campione) compete con l’antigene immobilizzato nel legare l’anticorpo; incubazione (t ambiente, 30 min); lavaggio: rimozione

legame del complesso marcato anticorpo-enzima

g g p ; ( , ); ggdei complessi antigene-anticorpo in soluzione

inserimento nel pozzetto di un anticorpo marcato con enzima che va a legarsi all’anticorpo primario;

reazione cromogenica

inserimento nel pozzetto di un anticorpo marcato con enzima che va a legarsi all anticorpo primario; lavaggio: rimozione dei complessi in soluzione

addizionato un reagente incolore che genera una reazione colorimetrica prodotta dall’enzima legato al

d i

addizionato un reagente incolore che genera una reazione colorimetrica prodotta dall enzima legato al complesso antigene-anticorpo immobilizzato sul substrato; incubazione (t ambiente, 30 min); reazione inibita mediante addizione di reagente acido

dosaggio

La quantificazione avviene per confronto/estrapolazione con

una curva standard, costruita con la MC-LR, nella quale si riportano in scalanella quale si riportano in scala

semilogaritmica le concentrazioni di MC-LR vs % della assorbanza dello standard rispetto alla p

assorbanza del controllo negativo (B0%)Conc. MC-LR (log)

• Il controllo negativo: soluzione non contenente MC-LR, il cui valore di B0%corrisponde al valore massimo (100%) di assorbanza ottenibilep ( )

• La curva deve essere costruita utilizzando un numero adeguati di punti: trattolineare ampio e ben definito

• Per una corretta estrapolazione il dato di assorbanza del campione dovrebbecadere nel tratto lineare della curva standard e non agli estremi, dove la risposta

è iù i l ll inon è più proporzionale alla concentrazione

Si dividono in:Si dividono in:Si dividono in:Si dividono in:

test pertest per test per test per test per test per competizione diretta competizione diretta

(anticorpi (anticorpi policlonalipoliclonali))

competizione competizione indiretta (anticorpi indiretta (anticorpi

monoclonali)monoclonali)

L’antigene viene direttamente L’antigene viene direttamente gadeso alla base solida (pozzetto)seguito da un anticorpo marcato

con un enzima

adeso alla base solida (pozzetto)seguito da un anticorpo primarionon marcato e da un anticorpo

d i t ifisecondario marcato specifico per il primario

RISULTATI DEI DUE METODI sono molto simili, anche se:

M d i di h ibili à l iù l• Metodo indiretto ha una sensibilità generalmente più elevata• I Kit dei metodi diretti sono meno costosi e più rapidi

QUINDI: la scelta dipende dalle finalità con cui un test viene eseguito

PER ENTRAMBE I CASI BISOGNA TENER PRESENTE

1. La preparazione del campione bisogna:p p p g

Usare solventi che non favoriscono lo sviluppo di colorazioni(concentrazioni di metanolo non > 10%)(concentrazioni di metanolo non > 10%)

Introdurre un passaggio di parziale purificazione per rimuoveret li i ti ( d il i l i C18)eventuali pigmenti (passando il campione su colonnina C18)

Evitare interferenze con la misura di assorbanza

2. Le caratteristiche del Kit

Affid bili à ibili à di ELISA di d d llAffidabilità e sensibilità di un test ELISA dipendono dalla naturadell’anticorpo e dalla sua cross-reattività con i vari congeneri di MCe con i suoi analoghi, inclusi i coniugati

Scarsa cross-reattività dell’anticorpo usato (monoclonali moltospecifici), dà informazioni accurate su un congenere specifico, map ), g p ,è poco utile per test di screening

Il Kit dovrebbe permettere

di rispondere alle esigenze dello sperimentatore

Il Kit dovrebbe permettere

p g p

di dare la giusta interpretazione dei risultati

La maggior parte dei Kit disponibili impiegano anticorpi sviluppati ingg p p p g p ppanimali contro uno specifico congenere (es. generalmente MC-LR)

La reattività massima sarà verso quella variante e le altre MCa ea à ass a sa à e so que a a a e e e a e Csaranno identificate con una sensibilità diversa (affinità antigene-anticorpo più bassa)

La quantificazione fatta attraverso una curva standard contenentesolo MC-LR non è accurata

I metodi immunoenzimatici sono considerati:

SEMIQUANTITATIVI

Molti kit ELISA riconoscono come antigene l’ADDA amminoacidoMolti kit ELISA riconoscono come antigene l’ADDA, amminoacidospecifico di MC e nodularine (buon grado di cross-reattività)

Essendo però l’ADDA il sito di riconoscimento per il legame, il kit èdiagnostico anche per i vari prodotti di degradazione ambientale checontengono tale aa e per i coniugati prodotti dalla detossificazione delleMC stesse

In un campione biologico, i kit disponibili non sono in grado didiscriminare tra le molecole parentali e i coniugati che però hannot i ità i

Questo è un aspetto rilevante per l’interpretazione di dati in termini di

tossicità minore

valutazione tossicologica, perché l’impossibilità di distinguere la tossinadai congeneri porta ad una sovrastima della concentrazione e dellapotenziale tossicità del campionepotenziale tossicità del campione

La possibilità di ottenere anticorpi monoclonali offre la possibilità di avere risposte da test ELISA con più alta sensibilità e maggiore specificità

(scarsa cross-reattività)(scarsa cross reattività)

Avere anticorpi monoclonali da testare sarebbe uno strumento di lavoro ideale MA i costi elevati non sarebbero compatibili con attività di

monitoraggio e/o routinegg

Nessuno dei diversi metodi singolarmente è in grado di dare indicazioni sul contenuto di tutte le tossine presenti in un campione e la sua potenziale tossicitàpotenziale tossicità

I diversi risultati che si ottengono dipendono semplicemente dal fatto

METODI CHIMICI lt ifi i id tifi t tt l

I diversi risultati che si ottengono dipendono semplicemente dal fatto che misurano cose diverse

METODI CHIMICI: molto specifici ma non identificano ancora tutte letossine (sottostima della contaminazione)

TEST ELISA: essendo aspecifici possono identificare la presenza di varietossine ma reagiscono anche con prodotti con scarsa e/o assente tossicità(sovrastima dei rischi)

SAGGI DI INIBIZIONE DELLA FOSFATASI: danno indicazioni sul potenziale diSAGGI DI INIBIZIONE DELLA FOSFATASI: danno indicazioni sul potenziale ditossicità ma non informazioni dal punto di vista quantitativo dei congeneripresenti

Se possibile in un piano di monitoraggio dovrebbero essere bi ti i di i t di i ti di i lcombinati i diversi metodi, in momenti diversi e almeno su

quei campioni risultati positivi con il metodi di primo screening sceltoscreening scelto

GRAZIE PER L’ATTENZIONE