Meccanismi d’azione del fitocromo

•Regolazione espressione genica:-Componenti del “photosynthetic machinery” sono regolati dalla luce, spesso tramite Phy-Attivazione di geni targets, mediante interazione con TFs, quali PIF3, HY5, DOF...

R

FR darklight

Percezione segnale

Trasduzionesegnale

Network trascrizionale

Variazioniespressione Fotomorfogenesi

I Pathways attivati da phyA/B.........

Identificazione delle molecole poste a valle di phyA/B:• approccio genetico• approccio cellulare/biochimico

Approccio Genetico screening per mutanti nel/i fitocromo/i e nel signalling del/i fitocromo/i identificazione di 2 classi di mutanti:

•cop/det/fus (constitutive photomorphogenic/deetiolate/fusca)

•hy (long hypocotyl)

cop/det/fus (constitutive photomorphogenic/deetiolate/fusca):

hy (long hypocotyl):

LUCE BUIO

wtcop wtcop

LUCE

wthy

cop/det/fus (constitutive photomorphogenic/deetiolate/fusca):

mutanti deeziolati anche se cresciuti al buio,risposte al segnale luminoso costitutivamente

accese mutazioni recessive

le proteine Wt sono regolatori negativi che agiscono al buio x reprimere la fotomorfogenesihy (long hypocotyl):

fenotipo alla luce ≈ plantula cresciuta al buio,risposte al segnale luminoso ridotte o nulle

Mutanti nel cromoforo: •ipocotile allungato in luce W•ipocotile allungato in condizioni di luce -specifiche Mutanti in uno specifico fitocromo:•ipocotile allungato in luce W•ipocotile allungato in condizioni di luce -specifiche Mutanti in un regolatore positivo (hy5):•ipocotile allungato in luce W, R. FR, blu

Effetti fenotipici delle mutazioni cop/det

Fenotipo al buioGerminazione Phy-mediatedLungh.ipocotileEspansione cotiledoniSviluppo foglieDifferenz. CloroplastiAccumulo antocianiInduzione geni luce-regolati

Fenotipo alla luceFiorituraAltezza pianta

+ - ? + +lungo corto corto corto corto

- + + + +- + - - -- + - + +

- + + + +- ++ ++ ++ ++

normale normale ritardato anticipato letale

normale nano nano nano max4 fog.

WT det1 det2 cop1 cop9

Fattori nucleari coinvolti nel pathway fitocromo

• COP1: funziona da E3 ubiquitin-protein ligasi, targeting proteine specifiche per la degradazione mediante ubiquitinazione. Agisce come repressore, antagonista di HY5• COP9: “signalosome complex” (11 fattori) responsabile della degradazione di proteine ubiquitinate• HY5: bZip TF, target 1°ario di questo pathway; lega le G-box sui promotori luce-regolati. Il livello steady-state del suo mRNA è mantenuto basso al buio mediante ubiquitinazione (COP1) e azione del complesso COP9

• DET2: putativo fattore di remodeling della cromatina

• DET1: elemento di biosintesi dei Brassinosteroidi, ormoni steroidei vegetali, che mimano parte degli effetti mediati dalla luce

• PIF3: fattore di trascrizione bHLH, localizzato costitutivamente nel nucleo, lega in modo luce-dipendente e Phy-dipendente, i promotori di geni luce regolati • interagisce sia con PhyA che con PhyB, ma l’interazione è 10x > con PhyA• poc1: mutante knock-on nel promotore di PIF3, aumentata risposta a luce R• PIF4: altro fattore di trascrizione, PIF3-like, interagisce con PhyB Pfr

•Regolazione intercellulare phy-mediata:-Alcune risposte di crescita/sviluppo sono molto rapide e probabilmente mediate da variazioni inter-intracellulari di ioni/metaboliti (meccanismo citosolico di crescita/omeostasi)

Meccanismi d’azione del fitocromo

Single-cell assays:•Microiniezione in cellule WT & del mutante aurea (phyA-, tomato)•Aurea manca di PhyA attivo mentre PhyB è normale•Cellule dell’ipocotile di aurea non sviluppano cloroplasti ne’ antociani in risposta alla luce a differenza del WT•Mutante aurea complementato da microiniezione di PhyA esogeno: sviluppo cloroplasti, sintesi antociani e induzione di un gene reporter fotoregolato (Pr.light/GUS)

Approccio Cellulare-Biochimico

Reazioni controllate da Phy a livello cellulare:•Regolazione genica•Sviluppo dei cloroplasti (PSII, PSI)•Biosintesi degli antociani

Agonisti:GTPS (GTP analogo), subunità A di cholera toxin (GTP analogo), 8Br-cGMP (cGMP analogo), Calcium, CaMAntagonisti:GTPS, Rp-8Br-cGMPS

cGMP attiva espressione di chs in cellule WT al buio

ATP syn

Cyt.b6f

0 1 2 3 5 7 9 11

Luce (ore)

cab

fnr

atp

rieske

rbcS

chs

PSII

antho

PSI

stroma

Complessifotosintetici

0 1 3 7 10 1 3 7 10 1 3 7 10

Dark8Br-cGMP Rp-8Br-cGMPS-

Analogo cGMPattivo

Analogo cGMPinattivo

phyA PSIICyt.b6f

Ca2+

CGMP

G

CaM

Anthocyanin(chs)

PSILHCI/IIATPsynth.RUBISCO

Choloroplast development

G: heterotrimeric G proteins, switch molecolari che cambiano conformazione da una forma attiva GTP-legata ad una GDP-legata inattiva

• Il sistema agisce modulando l’espressione di geni a livello nucleare FTs attivati da Ca2+, caM, cGMP, • i due segnali sono generati separatamente• i targets dei 2 pathways sono geni distinti• anche i prodotti finali (outputs) sono distinti

Pfr Ca2+

G protein

Pr

PK pathway

Pfr Pfr*

DET/COPPIF3

LIGHT

PKS