Paolo Del Monte - Dello Socrate FornaciariMassimo Pittano - Marzio Monari

Dosaggi immunoenzimatici: determinazionequantitativa degli estrogeni e dei progestinici

CUPA.centroricerche,produzionianimalir/ggìo finilio

Dosaggi immunoenzimatici:determinazione quantitativadegli estrogeni e deiprogestinicfPaolo Del MonteIst. di Allevamenti Zootecnici (Direttore: prof. Vincenzo Russo) - Facoltà di Agraria - Università di Bologna - Corso di Laurea in Scienze dellaProduzione Animale - Reggio Emilia

Dello Socrate Fornaciari - Massimo Pittano - Marzio MonariCentro Ricerche Produzioni animali - Reggio Emilia

OBIETTIVO - La recente disponibilità di metodi immunoenzimaticipermette di dosare con precisione erapidità antigeni, apteni o anticorpi.Tra i composti ad azione aptenica visono anche gli ormoni steroidei ed inparticolare quelli estrogeni e proge-stinici. Scopo della rassegna è di fornire un quadro critico del dosaggioimmunoenzimatico degli ormoniestrogeni e progestinici, mettendonein risalto gli aspetti favorevoli.

PAROLE CHIAVE: Immunoenzi-mologia, E.L.I.S.A., estrogeni, progestinici, ormoni, laboratorio clinico,apteni steroidei, proteine di trasporto.

Premesse

L'uso analitico delle reazioni antigene-anticorpo ha recentemente trovato una nuova linea di sviluppo conl'adozione di antigeni e anticorpi

(') Ricerca promossa dal Centro RicercheProduzioni Animali di Reggio Emilia con finanziamento della Regione Emilia-Romagna- II Dipartimento Agricoltura e Alimentazione.

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marcati. Le sostanze usate per marcare i reagenti immunologici possono essere di vario tipo; tra esse sipossono ricordare:

A) i coloranti fluorescenti, comefluorescina e rodanina legati ad antigeni, ma soprattutto ad anticorpi,vengono usati in lavori di istologia ecitologia e anche per analisi di tipoquantitativo;

B) i radioisotopi possono essereaccoppiati sia al composto ad attivitàantigenica che all'anticorpo. Questatecnica è alla base dei dosaggi radioimmunologici (radio-immunoassay:R.I.A.) che uniscono una elevatasensibilità ad una notevole specificità permettendo il dosaggio di molticomposti biologicamente importantie presenti a concentrazioni moltobasse (15-16-24-25). Un campo notevole di applicazione di questo tipodi dosaggio è la determinazione degliormoni effettuabile, un tempo, conmetodiche di tipo biologico relativamente difficoltose, lunghe e caratterizzate da un'alta imprecisione;

C) gli enzimi sono stati usati comeagenti marcanti per l'identificazionee la localizzazione di immunorea-

genti in preparazioni istologiche e dibande di precipitazione nelle tecniche di immunodiffusione ed immu-noelettroforesi. Vengono anche usatiper marcare antigeni, apteni e anticorpi e utilizzati nei dosaggi immunoenzimatici (27). Le determinazioniimmunoenzimatiche (Enzyme-im-munoassays: E.I.A.) sono metodianalitici per identificare e/o quantificare antigeni, apteni o anticorpi influidi biologici, facendo uso di marcanti enzimatici e usando appunto lamisura dell'attività enzimatica comeamplificatore di reazione. Infatti unamole di enzima è in grado di avereuna resa in prodotto idrolizzato superiore a IO5 molecole per minu-to(18). L'E.I.A. può essere di due tipi:

C-I) E.I.A. omogeneo. L'enzima,una volta legato all'immunoreagenteda dosare, rimane attivo se il composto da esso marcato è libero; vieneal contrario inattivato dall'avvenutaunione tra composto marcato e controparte immunitaria (vedi fig. 1).

Si può in questo caso misurarel'attività enzimatica dell'enzimamarcante direttamente sulla miscela

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m

Fig. 1 - Principio dell'I- .1.A. omogeneo; A, anticorpo; Ea, enzima attivo; Ei, enzima inibito;H, aptene.

di reazione(31). L'E.I.A. omogeneoviene anche denominato dosaggioimmunologico a inibizione d'enzimae lo si può trovare indicato con lasigla E.M.I.T. (Enzyme MultipliedImmunoassay Technique).

C-2) E.I.A. eterogeneo. L'enzimain questo caso rimane attivo sia che ilcomposto da esso marcato resti libero, sia che venga fissato dalla suacontroparte immunitaria (Fig. 2).Per determinare l'attività enzimaticaè allora necessario separare fisicamente la parte di molecole enzimatiche unite, tramite l'immunorea-gente da dosare, all'anticorpo (frazione legata) dalle molecole di enzima non legate (frazione libera)(3-20-22-27- 31-32).

<^L*0*lEr-()<g)

tica sull'uso del dosaggio immu-noenzimatico per la determinazionedi una particolare classe di compostiad azione aptenica: gli ormoni steroidei con particolare riferimentoagli estrogeni e progestenici( 19-26).A questo proposito si premette cheverranno considerati solo i dosaggiimmunoenzimatici di tipo eterogeneo a causa della loro sensibilità eprecisione notevolmente più elevaterispetto ai dosaggi immunoenzimatici in fase omogenea (vedi tabella n.l)(3-27).

Struttura e caratteristicheantigeniche degli Steroidi

Gli steroidi hanno la seguenteformula generale:

indicati con una linea continua. I legami disposti sotto il piano del fogliosono invece di tipo a, e vengono indicati con una linea tratteggiata.Prendiamo per esempio la seguentestruttura parziale:

Fig. 4

essa rappresenta unvdiolo 3/?, 6a.Inoltre si avrà che i gruppi -H e -OHnelle posizioni 5 e 6 sono cis tra loro.

.. *"«' i.

A»

? R*Mt.

«■♦le jTt)>* i

15 '—-—!£-C ^d\

;r M *Y>ì A / B 9

y$'——-•u

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4 <

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Fig. 3

Lco*T*

^fcD*ra*fiH>3

o

Fig. 2 - Principio dell'I' .1.A. eterogeneo con doppio anticorpo in fase solida: a, primo anticorpo;SA', secondo anticorpo in fase solida; E, enzima, H, aptene.

ma trans rispetto all'-OH in 3. Acausa della struttura molto rigida,negli steroidi gli effetti conformazio-nali sono particolarmente marcati,permettendo una individuazioneben definita dei vari derivati dellastruttura base. Il peso molecolare ècomunque troppo basso perché gliormoni steroidei possano avere proprietà immunogene( 14-20).

Immunogeno è quel compostoche, se iniettato in un animale, provoca una risposta immunitaria. Antigene è qualsiasi sostanza capace dilegarsi specificamente agli anticorpi.Tutti gli immunogeni sono perciòantigeni. Gli ormoni steroidei liberinon provocano la formazione di anticorpi quando vengono iniettati, masi legano in modo altamente specifico agli anticorpi formati contro i coniugati dello steroide con una proteina. Lo steroide libero è perciò unantigene, ma non un immunogeno, esi comporta come aptene, è infatti ingrado di provocare una risposta immunitaria specifica per la sua struttura una volta che sia stato coniugatoad un carrier proteico(28-29). I car-riers proteici o proteine di trasportopossono essere frazioni globuliniche,siero albumine di varie specie,

L'esempio riportato in fig. 2 puòessere anche denominato con la siglaE.L.I.S.A. (Enzyme Linked Immuno-sorbent Assay).

La presente ricerca di tipo compilativo vuole essere una rassegna cri-

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gli anelli sono di solito alifatici e inposizione 18 e 19 si trovano gruppimetilici angolari. Per quanto riguarda la stereochimica, i legami dispostisopra il piano del foglio (verso l'osservatore) sono di tipo /?, e vengono

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ovoalbumina, ureoglobulina, fibrinogeno e anche polipeptidi sintetici.Come proteina -di trasporto per gliormoni steroidei una delle più usateè la siero-albumina bovina (B.S.A.).

Infatti essa resiste bene alla denaturazione da parte dei solventi organici necessari per le reazioni di coniugazione, inoltre i coniugati ottenuti sono caratterizzati da una elevata solubilità e si possono ottenerepiù facilmente per l'abbondanza degli aminogruppi dei residui lisinicidisponibili, e infine la B.S.A. è facilmente reperibile a relativamentebasso costo sul mercato(ll). La relativa abbondanza di aminogruppidisponibili che caratterizza la B.S.A.,come detto sopra, permette di ottenere anche una buona densità epito-pìca. La densità epitopica, cioè ilnumero di residui aptenici uniti allamolecola proteica, condiziona l'ottimizzazione della risposta anticorpa-le(7-30). Tale numero deve essere nétroppo basso né troppo elevato e nelcaso dei coniugati tra steroidi eB.S.A. è compreso tra 8 e 25(9-10-11-21).

Per la preparazione del coniugatosi sceglie sulla molecola ormonale unpunto di attacco tale da evitare impedimenti sterici con i gruppi funzionali che individualizzano l'ormone e in quel punto si attacca un radicale contenente un gruppo carbossi-lico per reazione con anidride succi-nica. La successiva unione con laproteina viene realizzata con il metodo dell'anidride mista (9-10). Questa è una procedura semplice e diretta che non richiede la preparazione e l'isolamento di derivati inter

medi e che dà come risultato un coniugato contenente da 15 a 25 gruppiaptenici per molecola di B.S.A. Riportiamo come esempio la formazione dell'I 1-a-idrossiprogestero-ne-11-emisuccinato e la sua coniugazione con un aminogruppo proteico (Fig. 5).

!

CH,I 3

C-0

diimide meto-p-toluensolfonato, lareazione può essere effettuata in soluzione acquosa per semplice agitazione (21). Tuttavia i risultati di questo metodo non sono costanti inoltrepossonocausare alterazioni alla proteina di trasporto.

L'avvenuta unione tra proteina e

CH,

MOOC-[CHj-C-(X

| OHN-6-(CHa)2-C-0. oo RO-C-0-C-(Cr^-C-Q

ROH+CO^ ♦>H 9-9.5

1 11 l-or-Idrossiprogesierone. 5) Derivato acilico intermedio2)Anidridesuccinica. dena reazione tra 3 e 4.3) 1l-n-Idrossiprogesterone-11-F.misuccinato. 6) Coniugato proteina progesterone.4) Isobutile cloroformiato.

Fig. 5.

Un altro metodo di coniugazionesemplice e diretta aptene-proteina èquello che utilizza la carbodiimmide.Con l'aiuto di questi composti organici idrosolubili, ad esempio la1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) car-bodiimide cloridrato, oppure la 1-ci-cloesil-3-(2-morfolinil-4-etil) carbo-

Tabella 1•Confronto fra E.I.A. omogeneo edeterogeneo, R.I.A. e Immunofluorescenza.

Sensibilità •• Bassa

Specificità " Dipendente sopratPrecisione BuonaDifficoltàdi analisi BassaTempo richiesto MinutiAutorizzazionilegali necessarie NoAttrezzatura Fotometro e

termocuvettaPossibilità Moltodi automazione elevataEsperienzanecessaria MediaStabilità reagenti Elevata

aptene è controllabile grazie al fattoche generalmente il gruppoaptenicoha uno spettro di assorbimento diverso da quello della proteina di trasporto si procede cioè a compararetra di loro per via spettrofotometricail coniugato aptene-proteina e laproteina libera(9-10).

Scelta del marcante enzimatico

Premesso che, per l'uso in ogni tipo concepibile di dosaggio enzimatico, non esiste un enzima che sicomporti in maniera ideale, esistonotuttavia alcuni criteri su cui basarsiper determinare se un enzima è piùadatto di un altro.

Si dovranno prendere in considerazione:

1) il numero di turnover, cioè ilnumero di molecole di substratoconvertite nel prodotto finale perunità di tempo da una singola molecola enzimatica (o da un singolo sitoattivo) quando l'enzima è il fattoreche limita la velocità di trasformazione (18);

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Elevata Elevata Elevatauno dalla qualità dell'antisieroBuona Buona Bassa

MediaOre

No

Fotometro

Elevata

MediaElevata

Media

Ore

Si

Contatoreisotopi

Elevata

ElevataBassa

Elevata

Ore

No

Microscopioa fluorescenza

Bassa

Elevata

Variabile

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2) la purezza della preparazioneenzimatica;

3) la sensibilità della determinazione del prodotto dell'attività enzimatica;

4) facilità e velocità di determinazione della reazione enzimatica;

5) assenza nel fluido da esaminaredi fattori interferenti con attività simile a quella dell'enzima usato;

6) la presenza nell'enzima digruppi potenzialmente reattivi chepermettano la coniugazionecon altremolecole senza danneggiare sostanzialmente l'attività enzimatica;

7) la stabilità dell'enzima e deisuoi coniugati;

8) il costo e la disponibilità deglienzimi.

I primi tre criteri sono relativi allasensibilità della determinazione. Ingenerale quanto più è piccola laquantità di enzima marcante che puòessere dosata, tanto più risulta sensibile il relativo metodo di dosaggio.Perquanto riguarda il quarto criteriodi scelta, si può avere un metodo didosaggio sensibile non solo scegliendo enzimi altamente purificati connumero di turnover molto elevato,ma anche adottando al posto di substrati cromogeni, un substrato fluorescente o radioattivo (27). D'altraparte la scelta suddetta influisce poisulla effettuabilità del sistema, dalmomento che una misura di fluorescenza o radioattività richiede piùattenzione e un'apparecchiatura piùsofisticata di una misura colorime-trica.

L'eventuale presenza di sostanzeinterferenti con l'attività anzimatica(quinto criterio) è un problema chepuò essere evitato adottando metodiche opportune al momento dell'estrazione della sostanza che interessadal campione da analizzare.

In relazione al sesto e al settimocriterio, gli enzimi più usati nel-l'E.I.A. in fase eterogenea sono i seguenti: Perossidasi (EC 1.11.1.7)estratta dalla barbaforte (Armoraciarusticana), /?-D-Galattosidasi (EC3.2.1.23) estratta da E. coli, Fosfatasialcalina (EC 3.1.3.1) estratta da E.coli oppure dalla molecola intestinale di vitello, Glucoso-ossidasi (EC1.1.3.4) estratta da Aspergillus o Pe-nicillium.

I substrati su cui agiscono gli enzimi suddetti possono essere di vario

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tipo e il prodotto della reazione enzimatica viene di solito rivelato pervia colorimetrica.

Per quanto riguarda la stabilitàminima degli enzimisuddetti si hanno i seguenti dati:

Perossidasi: 18 mesi a temperaturaambiente se liofilizzato;

/5-D-Galattosidasi: 12 mesi a 4°Cin soluzione;

Fosfatasi alcalina: 12 mesi a 4°Cin soluzione;

Glucoso-ossidasi: 6 mesi a 4°C insoluzione.

Di quelli sopra ricordati, un enzima che si presta bene alla coniugazione con gli ormoni steroidei è la/?-D-Galattosidasi, che soddisfa icriteri esposti (4-5-6-8-12-17).

Infatti ad esempio la molecolaproteica della perossidasi, enzimadotato di stabilità superiore, riesce alegare solo un numero basso di residui ormonali a causa del limitatonumero di amino-gruppi disponibili,mentre una singola molecola di/?-D-galattosidasi può facilmente legare 10 molecole apteniche con ilmetodo dell'anidride mista (2-27).

Tale proprietà, in questo caso, èdeterminante perché, a causa delledimensioni ridotte dell'aptene ste-roideo, è meglio coniugare all'enzima marcante il maggior numeropossibile di molecole apteniche inmodo da avere una reattività immu-nologica completa del coniugato(11).

Si dimostra che quando 2,4, 6.5, e10 molecole di collisolo sono unitead una molecola di /?-D-Galattosi-dasi, si ha un'attività enzimatica legata al relativo antisiero usato in eccesso pari al 30%, 45%, 66% e maggiore del 95% rispettivamente(27).

Accoppiamento aptene-enzimae sua purificazione

Una delle tecniche più usate e piùsoddisfacenti è quella precedentemente descritta dell'anidride mi-sta(l 1-5). In questa tecnica l'aptenesteroideo contenente un gruppo car-bossilico viene trasformato in un'anidride mista con isobutileclorofor-miato in solvente organico, mentrel'enzima viene aggiunto in soluzioneacquosa, consentendo all'aptene diformare un legame peptidico con unaminogruppo enzimatico. In questo

modo si riesce facilmente a legarealmeno 10 gruppi aptenici steroideiper mole di jS-D-galattosidasi. Unaltro metodo consigliabile, anche senon dà gli stessi risultati dell'anidride mista, è la tecnica che utilizza lecarbodimmidi, tecnica questa checonsente una resa in enzima attivoche si aggira su valori ottimali pari al90% dell'attività anzimatica primadella reazione. Purtroppo però soloun quarto del coniugato riesce a legarsi agli anticorpi antisteroidei(8-27). Le reazioni di accoppiamentodevono essere seguite dalle fasi dipurificazione del prodotto ottenuto.La parte di aptene che non ha reagitoincide infatti negativamente, se nonviene allontanata, sulla sensibilitàdel dosaggio, mentre le moli di enzima non coniugate incrementano decisamente il valore del bianco. Letecniche di purificazione più comunemente adottate utilizzano una prima fase di dialisi seguita da gel-fil-trazione(5-8-13-23).

Cenni sulla tecnica per competizionenell'E.I.A. eterogeneo (E.L.I.S.A.)

La tecnica è analoga a quella ra-dioimmunologica (R.I.A.). Il composto (vedi fig. 2) di cui si deve misurare la concentrazione, entra incompetizione con lo stesso tipo dicomposto enzimaticamente marcatoper legarsi all'anticorpo dosato inmodo che i suoi siti di combinazionerisultino in difetto rispetto agli antigeni presenti in soluzione. In praticasi sceglie una diluizione dell'anticorpo tale che l'antigene marcato vengalegato in ragione del 40-60% in assenza dell'antigene non marcato. Aseguito della reazione immunologicasuddetta, si avrà una frazione antigenica legata all'anticorpo e una frazione antigenica libera.

L'attività enzimatica può esseredeterminata a scelta sulla frazionelibera o su quella legata. La separazione della frazione libera da quellalegata viene effettuata precipitandol'immunocomplesso con un secondoanticorpo specifico per gli anticorpidella frazione legata. La scelta dellafrazione libera ha alcuni svantaggitra cui la necessità di usare una seconda provetta di reazione, la possibilità di interferenza nella reazioneenzimatica di componenti indesiderati del campione da analizzare e la

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necessità di una purificazione moltospinta del coniugato enzimatico. Lamaggioranza degli E.I.A. descrittinella letteratura vengono realizzaticon una fase solida che serve dasupporto al secondo anticorpo(D.A.S.P.: Doublé Antibody SolidPhase). Oppure può essere lo stessosecondo anticorpo a funzionare dafase solida dopo essere stato polime-rizzato per trattamento con etilclo-roformiato( 1-5-8). Si dovrà poi mettere particolare cura nel lavaggiodella fase solida.

L'attività enzimatica viene determinata senza reazioni cinetiche, mamisurando semplicemente la risposta colorimetrica di una reazione atermine. Per ogni campione è dunque necessaria una sola misurazione,il che permette l'analisi di un grandenumero di campioni.

Conclusioni

Il dosaggio immunoenzimatico sipone come valida alternativa al dosaggio radioimmunologico per le seguenti ragioni :

— la normativa sempre più restrittiva, concernente la preparazione, il trasporto, l'uso e la disponibilità degli isotopi radioattivi che inevitabilmente condurrà a dei costisempre più elevati;

— l'attrezzatura di laboratorio e ilpersonale comportano livelli di sofisticazione sempre più elevati, il cheha ancora come risultato costi sempre più elevati;

— l'uso saltuario del dosaggio radioimmunologico è antieconomico acausa della durata limitata della vitadegli isotopi radioattivi.

D'altro canto la messa a punto deldosaggio immunoenzimatico è perfezionabile, data la relativa novitàdel metodo, soprattutto nei seguentipunti:

— ottimizzazione e caratterizzazione della preparazione dei coniugati;

— standardizzazione;

— controllo di qualità dei reagenti;

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— confronto con altre metodichein relazione alla sensibilità, precisione ed effettuabilità;

— automazione.

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Estratto da . OBIETTIVI E DOCUMENTI VETERINARI - -Anno III - n. 10 - ottobre 1982