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LA FIBROGENESI EPATICA: MARKERS PRECOCI E MECCANISMI

REGOLATORI

DOTT. SIMONE CAROTTI Dipartimento di Ricerca Biomedica (CIR), Università “Campus Bio-Medico” di Roma

DOTTORATO DI RICERCA IN EPATOLOGIA SPERIMENTALE E CLINICA

XIX CICLO

DIPARTIMENTO DI ANATOMIA UMANA UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI

ROMA “LA SAPIENZA”

DIRETTORE: PROF. EUGENIO GAUDIO

TUTORE SCIENTIFICO: PROF. SERGIO MORINI, Dipartimento di Ricerca Biomedica (CIR), Università “Campus Bio-Medico” di Roma

DOCENTI ESAMINATORI: PROF. DOMENICO ALVARO, Dipartimento di Medicina Clinica, Divisione di Gastroenterologia, Università di Roma “La Sapienza”;

PROF. SSA ADELAIDE CONTINEZA, PROF. GIUSEPPE RICCIARDI, Dipartimento di Scienze Chirurgiche, Università Statale, L’Aquila

ABSTRACT

Activated α-smooth muscle actin (αSMA)-positive hepatic stellate cells (HSCs) are pericytes responsible of fibrosis in chronic liver injury. The Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), expressed by astrocytes in SNC, in the liver is expressed in a subpopulation of quiescent stellate cells in vivo, with an increased expression in the response to injury and could be related to vascular remodelling. Angiogenesis is an important phenomenon implicated in both fibrogenesis and neoplastic degeneration and anti vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) treatment gives promising results in advanced hepatocellular carcinoma (HCC). However, previous reports of higher VEGF-A expression in the non-tumoral cirrhotic liver surrounding resectable HCC than in the tumor discourage the use of anti VEGF-A treatment also in non-advanced HCC. We investigated:

1) the utility of GFAP compared to α-SMA as immunohistochemical marker of early activated HSCs in chronic hepatitis C and correlated GFAP expression with the fibrosis progression and the vascular remodelling;

2) VEGF-A and VEGF-C tissutal expression in non-advanced HCC and in cirrhotic liver tissue sampled at distance from the tumour of patients submitted to liver transplantation (LT).

Using immunohistochemistry and a semi-quantitative scoring system, the expression of GFAP and α-SMA in HSCs and the microvessels density was analysed in liver biopsies from (1) normal livers obtained from cadaveric liver donors (DL) (n=31), (2) post-transplant recurrent HCV hepatitis (HCV-PTR) (n=17), (3) chronic HCV hepatitis (HCV-CH) (n=12) and (4) cirrhosis post-HCV hepatitis (HCV-C) (n=16). The percentage of αSMA-positive HSCs was significantly higher in the HCV-PTR, -CH and -C groups

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compared to the DL group (p<0.01). The percentage of GFAP-positive HSCs was significantly higher in the HCV-PTR group compared to the DL, HCV-C (p<0.01) and -CH (p<0.05) groups and in HCV-CH compared to DL groups (p<0.01), inversely correlating with fibrosis extent and microvessels density (p<0.01). In the HCV-PTR group the percentage of GFAP-positive HSCs correlated with fibrosis progression (p<0.01). Western blot analysis and immunohistochemistry were performed in both the tumour and in the non-tumoral cirrhotic tissue of 16 HCC patients, in 18 cirrhotic livers without HCC and in 7 organ donors obtained at LT. VEGF-A, but not VEGF-C, expression was significantly (P< 0.05) higher in HCC than in the non-tumoral cirrhotic tissue from the same patients. In the HCC patients with a serum alpha-fetoprotein (AFP) higher than 20 ng/ml, serum AFP and serum VEGF-A corrected for the platelet count positively correlated (P< 0.01) with the difference between VEGF-A protein expression in HCC tissue and in the corresponding non tumoral cirrhotic liver. In conclusion GFAP represents a more reliable marker of HSCs early activation in HCV chronic hepatitis compared to αSMA and precedes the angiogenetic switch in liver fibrogenesis. Moreover GFAP could predicts fibrosis progression in post-transplant recurrent HCV hepatitis. As regard VEGF expression, most non-advanced HCC have a higher VEGF-A expression than the remaining cirrhotic liver giving a rationale for anti-VEGF-A adjuvant treatment. Increased AFP serum concentrations can be used as surrogate of tissutal differential VEGF-A expression between HCC and the remaining cirrhotic liver.

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INTRODUZIONE

LA FIBROSI EPATICA

Fibrosi è un termine istopatologico che designa la presenza di un eccesso di matrice extracellulare. La fibrosi epatica rappresenta la risposta ad un danno epatico cronico indotto da una varietà di stimoli lesivi ripetuti nel tempo come si verifica nell’epatopatia alcolica, nelle epatiti virali, nella malattia colestatica e nell’emocromatosi. La risposta ad un danno tessutale, qualunque sia il tessuto coinvolto, comporta una serie di eventi costanti. Dapprima vengono reclutate le cellule coinvolte nei processi infiammatori per neutralizzare la noxa patogena e rimuovere il tessuto necrotico. Poi seguono la proliferazione e la migrazione delle cellule simil-miofibroblastiche che raggiungono la lesione e appongono matrice extracellulare. Infine questa viene rimodellata e possibilmente la rigenerazione delle cellule parenchimali ricostituisce la normale architettura del tessuto. In caso di un danno prolungato o cronico queste tre fasi si verificano simultaneamente e senza l’appropriata coordinazione risultando un’infiammazione cronica con danneggiamento della struttura e della funzione dell’organo. Un esito di questo tipo si può riscontrare nel fegato, allorquando nelle epatiti croniche virali o nell’abuso cronico di alcool la contemporanea presenza di infiammazione e di deposizione di matrice extracellulare insieme con un anomalo processo di rigenerazione portano dapprima alla fibrosi e quindi alla cirrosi. La struttura lobulare del fegato ha delle caratteristiche peculiari. Diversamente dagli altri tessuti in cui l’epitelio è separato dal compartimento vascolare da tessuto connettivo stromale, la superficie basale degli epatociti si trova quasi a diretto contatto con l’endotelio sinusoidale e lo stroma è costituito dallo spazio di Disse dove all’analisi immunoistochimica si rintracciano i componenti tipici delle membrane basali (fibronettina, laminina, collagene di tipo IV, VI, XIV e XVIII ed eparan solfato). Nel fegato normale è pure presente matrice extracellulare di tipo interstiziale o fibrillare costituita da collagene di tipo I, III, V e XIV, fibronettina e altre glicoproteine e localizzata nelle aree portali e sottoforma di tralci occasionali intralobulari. Reputata un tempo una sostanza relativamente inerte, la matrice extracellullare è ora considerata altamente plastica, localmente specializzata e in grado di esibire rapidi cambiamenti in risposta a insulti patogeni (Musso O, 1998; Berthiaume F, 1996). I complessi che costituiscono la matrice extracellulare sono biologicamente attivi e il processo della fibrosi interessa non solo la struttura lobulare ma anche la funzione di tutti i tipi cellulari presenti nel contesto dell’organo modulando loro basilari proprietà come la polarità e la proliferazione (Orrego H, 1979). Per questo motivo la composizione della matrice extracellulare e il sito della sua deposizione all’interno del lobulo rivestono un’importanza maggiore rispetto ai cambiamenti globali nella concentrazione di collagene. Ruolo delle cellule stellate nella fibrosi epatica Nelle epatopatie acute dell’uomo e nelle fibrosi sperimentali si verifica un aumento del collagene di tipo III, IV, V, VI e XIV e di molte glicoproteine associate e proteoglicani (Orrego H, 1979; Tsutsumi M, 1993). Man mano che il danno diventa cronico, predomina il collagene di tipo fibrillare, organizzato in bande di tessuto connettivo dove è preminente il collagene di tipo I. Di particolare interesse è quello che avviene a livello dello spazio di Disse dal momento che sembra influenzare drasticamente la funzione epatica (Orrego H,

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1979). Sullo spazio di Disse si affacciano gli epatociti, le cellule endoteliali e le cellule stellate e ciascuno di questi tre tipi cellulari elabora componenti specifiche della matrice extracellulare. Gli epatociti producono la glicoproteina laminina (Lietard J, 1998) e il collagene di tipo XVIII (Musso O, 1998). Le cellule endoteliali secernono la fibronettina e il collagene di tipo IV. Le cellule stellate producono tutte le componenti della matrice (Friedman SL, 1990; Sebestyen A, 2000) e sembrano svolgere un ruolo centrale nel sostenere i processi che determinano la fibrosi e culminano nella cirrosi (Friedman SL, 1993, 2000). La loro capacità di produrre matrice subendoteliale e la loro generale distribuzione nel contesto del lobulo attribuiscono ad esse infatti con ogni probabilità il compito più importante nella risposta al danno. Localizzate nell’interfaccia tra il rivestimento endoteliale e gli epatociti sembrano giocare una parte importante nel reclutare le cellule infiammatorie e indirizzarle verso gli epatociti danneggiati. Le cellule stellate sono cellule probabilmente di origine mesenchimale a funzione simil-pericitaria. Contengono una citocheratina chiamata desmina (Tsutsumi M, 1987) caratteristica del muscolo liscio. In comune con altri tipi cellulari, come gli astrociti cerebrali, contengono i filamenti intermedi neurali (Niki T, 1999) e la proteina fibrillare acida gliale (Buniatian G, 1996; Neubauer K, 1996). Inoltre fibre del sistema nervoso autonomo sembrano terminare su di loro (Bioulac-Sage P, 1990). Infine come la maggior parte dei periciti immagazzinano gli esteri della vitamina A, contenendo le sole cellule stellate circa il 90% dei retinoidi totali corporei (Friedman SL, 1993). Nel fegato normale le cellule stellate sono quiescenti mostrando alla microscopia elettronica scarsità di reticolo endoplasmatico rugoso e un piccolo apparato di Golgi. Esprimono solo moderati livelli di mRNA per le proteine collagene e le glicoproteine della matrice (principalmente laminina, entattina e fibronettina) (Maher JJ, 1990). Il danno induce cambiamenti rapidi e pleiotropici nella funzione della cellule stellate che interessano aspetti quali la proliferazione, la migrazione, la contrattilità e l’aumentata produzione di matrice, determinando alterazioni che nel complesso si designano con il termine di attivazione. Un aspetto saliente dell’attivazione delle cellule stellate è l’espressione de novo dell’isoforma muscolare-liscia dell’α-actina (α-SMA) che è stata utilizzata estesamente come marker di attivazione (Schmitt-Graff A, 1991). Tuttavia il fenotipo α-SMA-positivo non è esclusivo di questo tipo cellulare a livello epatico, dal momento che è presente nelle cellule muscolari lisce localizzate accanto ai duttuli biliari e alle venule, che si comportano come fibroblasti nel danno (Badid C, 2000). I filamenti neurali, la nestina, la proteina fibrillare acida gliale o la sinaptofisina potrebbero rappresentare markers di attivazione più specifici (Niki T, 1999; Buniatian G, 1996; Neubauer K, 1996). Le riserve di retinoidi diminuiscono rapidamente durante l’attivazione. Un altro aspetto importante nell’attivazione è rappresentato dalla regolazione dei recettori di superficie per fattori di crescita e citochine, come ad esempio i recettori per il PDGF che comparendo durante l’attivazione permettono la proliferazione, mediata dal PDGF (Wong L, 1994). Le subunità maggiori del recettore del TGF beta (tipo I e tipo II) pur essendo presenti anche nelle cellule quiescenti e di transizione cambiano il loro rapporto relativo a favore del tipo I nelle cellule pienamente attivate (Roulot D, 1999; Dooley S, 2000). Analogamente il rapporto tra i due recettori principali per l’endotelina , ETa e ETb, cambia a favore di ETb durante l’attivazione delle cellule stellate di cui l’endotelina, prodotta dalle cellule endoteliali, media la contrazione (Pinzani M, 1996; Gabriel A, 1999). Modificazioni si verificano anche a livello delle molecole di adesione cellulare. Aumentano infatti ICAM-1, VCAM-1 e NCAM-1 che interagendo con le integrine dei leucociti ne mediano la ferma adesione e la migrazione transendoteliale (Knittel T, 1996; Knittel T, 1999). A livello del citoscheletro oltre alla comparsa di α-SMA (Rockey DC,

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1992) si osserva l’aumento di nestina, desmina e vicentina e si modifica l’espressione della proteina fibrillare acida gliale (Niki T, 1999). Infine l’attivazione delle cellule stellate è caratterizzata dalla sintesi e dalla secrezione di proteine della matrice tra le quali il collagene di tipo I e III aumentano in misura prevalente (Friedman SL, 1990). Parallelamente alla secrezione di una matrice di tipo fibrillare, le cellule stellate producono metalloproteinasi (MMP) che degradano la matrice extracellulare simil-membrana basale con il risultato di una graduale sostituzione all’interno dello spazio di Disse della normale matrice extracellulare con tessuto di riparazione (Arthur MJ, 1989). Tra le citochine prodotte dalle cellule stellate vi sono l’endotelina (Rockey DC, 1998), il PDGF (Marra F, 1994), il CTGF (Abou-Shady M, 2000), il TGFbeta, il PAF e diverse chemochine peptidiche alcune delle quali esplicano un’azione autocrina, altre paracrina (Maher JJ, 1998; Sprenger H, 1999; Schwabe RF, 2001). Recenti evidenze inoltre hanno dimostrato che le cellule stellate attivate sono in grado di esprimere il fattore vascolare di origine endoteliale (VEGF) e i suoi recettori (VEGFR-1 e -2) (Ishikawa K, 1999; Ankoma-Sey V, 1998, 2000). E’ stato dimostrato che l’espressione del VEGF indotta dall’ipossia è associata con l’angiogenesi e la fibrogenesi epatica e in vitro in condizioni di ipossia le cellule stellate attivate incrementano la produzione del VEGFR-1, mentre il VEGFR-2 rimane costitutivamente iperespresso in condizioni di attivazione (Corpechot C, 2002; Ankoma-Sey V, 1998, 2000). Markers delle cellule stellate Negli ultimi anni molti sono stati i markers utilizzati per determinare le cellule stellate. Le cellule stellate hanno dimostrato di avere aspetti morfologici tipici del differenziamento neurale/neuroendocrino come l’espressione della molecola di adesione cellulare di origine neurale (N-CAM) (Knittel T, 1996; Nakatani K, 1996), della proteina fibrillare acida di origine gliale (GFAP) (Gard AL, 1985; Neubauer K, 1996; Niki T, 1996) e della nestina (Niki T, 1999), oltre a condividere molti marcatori con le cellule di origine mesenchimale come la desmina nel ratto (Yokoi Y, 1984), la vimentina nell’uomo e nel ratto (Takase S, 1988) , α-SMA nell’uomo e nel ratto in corso di attivazione (Schmitt Graff A, 1991). Alfa-SMA Cellule α-SMA positive si individuano raramente nel fegato normale nel contesto del lobulo ed hanno una predominante localizzazione periportale o nelle immediate vicinanze della vena centrolobulare (Enzan H, 1994). Alfa-SMA è presente nel citoplasma periferico e nei processi cellulari e le cellule α-SMA positive nel fegato normale non mostrano segni di differenziazione in senso miofibroblastico (Enzan H, 1994). Nelle epatopatie acute le cellule stellate si espandono attraverso lo spazio di Disse nelle aree di danno. Nella necrosi centrolobulare che segue l’insufficienza circolatoria, nella necrosi epatica massiva subacuta, nelle epatiti virali acute e nella necrosi indotta da paracetamolo si assiste all’incremento numerico delle cellule stellate, alla comparsa delle cellule di transizione e all’aumento della positività per α-SMA (Rubbia-Brandt L, 1997; Mathew J, 1994; Schmitt-Graff A, 1991). Non è chiaro in quale misura l’accumulo di cellule α-SMA positive risulti dalla proliferazione o dalla transizione di cellule stellate quiescenti e se la successiva scomparsa delle cellule sia causata dalla transizione retrograda a cellule quiescenti o dalla perdita di cellule attivate tramite apoptosi (Mathew J, 1994). Nell’infiammazione cronica del fegato le cellule stellate si trovano in prossimità delle cellule di Kupffer e di varie cellule infiammatorie. Le cellule stellate acquisiscono dapprima il fenotipo di transizione e poi quello miofibroblasto-simile, esprimono α-SMA e alcune anche desmina (Enzan H, 1994). Nell’epatopatia alcolica le cellule α-SMA positive si trovano principalmente nella

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zona perivenulare (Schmitt-Graff A, 1991). Nelle epatopatie alcoliche con fibrosi “chicken-wire” le cellule stellate α-SMA circondano gli epatociti e i processi cellulari negli spazi perisinusoidali si associano alla fibrosi net-like (Nakano M, 1982). Nella cirrosi alcolica diminuisce la quantità di cellule stellate quiescenti. Le bande di tessuto fibroso contengono cellule mesenchimali α-SMA positive (alcune coesprimono desmina) (Schmitt-Graff A, 1991). Queste cellule sono presenti nei setti in espansione o negli spazi perisinusoidali nelle cirrosi attive, mentre nelle cirrosi non attive sono confinate alla periferia dei noduli di rigenerazione (Schmitt-Graff A, 1991). Nelle epatiti virali croniche attive aumentano dimensioni, numero e intensità della positività per α-SMA delle cellule stellate nelle aree di piecemeal necrosis (Schmitt-Graff A, 1991). Le cellule α-SMA positive hanno l’aspetto di cellule similmiofibroblastiche (Nakano M, 1982). I riscontri nelle cirrosi post-virali sono paralleli a quelli nelle cirrosi alcoliche (Schmitt-Graff A, 1991). Nelle colestasi extraepatiche la popolazione di cellule stellate è aumentata. Nell’ostruzione cronica dei grandi dotti e negli stadi precoci della cirrosi biliare primitiva, le cellule stellate α-SMA positive, simil-miofiroblastiche si trovano localizzate soprattutto nelle aree periportali (Schmitt-Graff A, 1991). Nell’insufficienza cardiaca destra cronica le cellule stellate alfa-SMA positive si trovano attorno alle venule terminali e ai cordoni di epatociti atrofici adiacenti ai sinusoidi ingorgati (Schmitt-Graff A, 1991). Queste osservazioni sono consistenti con l’assunzione che l’espressione di α-SMA e desmina sia almeno in parte il risultato della modulazione fenotipica delle cellule stellate (Schmitt-Graff A, 1991). Recenti evidenze oltre a confermare che la popolazione di cellule stellate sia significativamente più rappresentata nei pazienti con epatite C virale e sia preminente nelle zone 1 e 3, hanno sottolineato come le cellule α-SMA positive (e GFAP positive) siano in numero maggiore nelle forme moderate/gravi rispetto che in quelle minime/lievi e come esista una correlazione positiva tra queste cellule e lo stadio di fibrosi e il grado di necroinfiammazione (Martinelli AL, 2004). Nei pazienti con epatite C l’attivazione delle cellule stellate (individuata dall’espressione di α-SMA) in aree di parenchima epatico con o senza attività necroinfiammatoria è stata riscontrata in diversi studi (Sakaida I, 1999; Guido M., 1996; Khan MA. 2001; Guido M. 1997). Dibattuta è la correlazione tra l’attivazione delle cellule stellate così misurata e l’attività necroinfiammatoria o lo stadio della fibrosi (Sakaida I, 1999; Clouston AD, 2001; Guido M., 1996; Khan MA. 2001; Levy MT 2002), anche se è descritta una diminuzione dell’attivazione delle HSCs coincidente con il miglioramento dell’indice di attività istologica nei pazienti che rispondono alla terapia con interferone (Sakaida I, 1999; Guido M., 1996; Khan MA. 2001). La recidiva di epatite C post trapianto oltre ad essere una situazione clinica di notevole interesse per la scelta dei pazienti a maggiore rischio di evoluzione cirrotica a cui riservare un trattamento aggressivo rappresenta anche una possibilità di osservare le fasi precoci del processo di fibrogenesi e di misurare la velocità della progressione della fibrosi. Studi effettuati su pazienti con epatite virale cronica con trapianto di fegato e recidiva ad evoluzione cirrotica hanno osservato che l’aumento della positività per α-SMA rappresenta un evento precoce in corso di epatiti virali ed è associato alla progressione verso la cirrosi (Guido M, 1997). È stato recentemente riscontrata una precoce e maggiore espressione di α-SMA da parte delle HSCs/miofibroblasti portali e/o setto-parenchimali in corso di recidiva post-trapianto rispetto alla popolazione generale con epatite C o nei casi a più rapida evoluzione cirrotica rispetto a quelli con evoluzione più lenta (Carpino G, 2005; Russo MW, 2005; Gawrieh S, 2005).

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GFAP I filamenti intermedi sono proteine del citoscheletro che formano filamenti dello spessore di 10nm. La proteina fibrillare acida gliale (GFAP), tradizionale marker di attivazione degli astrociti è stata descritta anche nelle HSC. Nel ratto GFAP è espressa da una sottopopolazione di HSC quiescenti e mostra un’aumentata espressione nella risposta acuta al danno e una diminuzione in cronico (Niki T, 1996) ed in coltura primaria l’espressione di GFAP diminuisce parallelamente all’attivazione delle HSC (Neubauer K, 1996). Nel fegato umano normale l’espressione di GFAP è limitata ad una piccola subpopolazione di cellule stellate localizzate ai confini o attorno ai tratti portali (Hautekeete ML, 1997). Nelle epatiti croniche C è stata riscontrata una lieve correlazione tra l’espressione di GFAP e il grado di fibrosi (Levy MT, 2002) e in cirrosi di diversa eziologia si osservano HSCs GFAP-positive al limite dei noduli di rigenerazione o raggruppate nei noduli (Hautekeete ML, 1997; Cassiman D, 2002). A livello astrocitario GFAP sembra essere essenziale per la formazione delle caratteristiche estensioni citoplasmatiche, per la risposta gliale al danno cerebrale (Laping N, 1994) e per l’induzione nelle cellule endoteliali di funzioni di barriera emato-encefalica (Pekny M, 1998). Gli astrociti attivati in risposta al danno cerebrale iperesprimono GFAP e esprimono il fattore di crescita vascolare di origine endoteliale (VEGF) supportando l’ipotesi che la neoangiogenesi associata con l’astrogliosi reattiva sia correlata ad un incremento dell’astrocitosi e dell’espressione di VEGF da parte degli astrociti (Salhia B., 2000). A livello delle HSC il ruolo di GFAP non è stato ancora ben definito anche se evidenze in modelli animali mostrano che l’assenza selettiva di GFAP non interferisce con la formazione dei filamenti intermedi caratteristici delle HSC del ratto (Geerts A, 2001). La morfologia e la posizione delle HSC, il fatto che siano cellule provviste di ramificati processi citoplasmatici subendoteliali, strettamente associate alla cellule sinusoidali e in stretta relazione anche con epatociti e terminazioni nervose (Wake K, 1980; Carpino F, 1981), suggeriscono che GFAP possa avere come negli astrociti un ruolo nella loro attivazione e nella modulazione delle funzioni dell’interfaccia vascolo-parenchimale. A livello delle HSC il ruolo di GFAP non è stato infatti ancora ben definito anche se evidenze in modelli animali mostrano che l’assenza selettiva di GFAP non interferisce con la formazione dei filamenti intermedi caratteristici delle HSC del ratto (Geerts A, 2001). Le cellule stellate di ratto contengono GFAP e la subpopolazione che esprime GFAP differisce parzialmente dalla subpopolazione che esprime desmina, dal momento che questa è espressa preferenzialmente nelle cellule stellate periportali mentre le cellule stellate GFAP positive sono distribuite all’interno del lobulo ma sono assenti in una stretta zona periportale (Niki T, 1996). L’espressione di GFAP diminuisce dopo esposizione cronica a CCl4 (Niki T, 1996). Nel fegato normale di ratto le cellule GFAP positive (e desmina positive) si individuano nell’area perisinusoidale (Neubauer K, 1996). Nei fegati con danno acuto la positività per GFAP si riscontra lungo i sinusoidi non danneggiati come nelle aree necrotiche (Neubauer K, 1996). Nei fegati sottoposti a danno cronico GFAP è più individuabile ai margini dei setti fibrotici e meno all’interno dei setti dove molte cellule desmina positive sono GFAP negative (Neubauer K, 1996). Tra le diverse subpopolazioni di cellule epatiche testate in vitro solo le cellule di Ito esprimono il gene per GFAP e all’immunoistochimica altre cellule fibroblastiche epatiche come le cellule delle pareti vascolari pur essendo desmina positive sono GFAP negative (Neubauer K, 1996). La forte immunoreattività delle cellule stellate per GFAP in corso di danno acuto potrebbe indicare che le cellule sono ad uno stadio di precoce attivazione senza essere ancora pienamente attivate e quindi non ancora sottoposte all’effetto di down-regulation dell’attivazione delle cellule di Ito sull’espressione del gene GFAP (Neubauer K, 1996). D’altra parte l’immunoreattività per la desmina nei fegati di ratto sottoposti a danno

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cronico è costantemente maggiore di quella per GFAP tanto che all’interno dei setti si possono osservare molte cellule desmina positive ma GFAP negative (Neubauer K, 1996). Questo in parte si può attribuire alla presenza di cellule di pareti vascolari neoformate ma può anche essere dovuto alla presenza di cellule di Ito ad uno stato tardivo di attivazione all’interno dei setti fibrosi (Neubauer K, 1996). Nei roditori le cellule stellate pericentrali contengono processi citoplasmatici più lunghi di quelle periportali, con numerose proiezioni (Wake K, 1980; Carpino F, 1981) e questo dato morfologico coincide con il riscontro di una maggiore espressione di GFAP a livello pericentrale rispetto che nella zona periportale con le cellule stellate che sono quindi simil-astrocitarie a livello pericentrale e più simil-muscolare lisce a livello periportale dove l’espressione della desmina assicurerebbe un apparato contrattile più forte. Questa eterogeneità all’interno del lobulo suggerisce la plasticità fenotipica delle cellule stellate e in accordo con il concetto di “streaming liver” le cellule stellate periportali sarebbero più giovani e meno differenziate rispetto alle cellule pericentrali (Arber N, 1988). Altri markers N-CAM è una glicoproteina di superficie appartenente alla famiglia delle immunoglobuline che media le interazioni cellula-cellula (omofiliche) e cellula-matrice (eterofiliche) durante lo sviluppo del sistema nervoso, dell’epitelio intestinale e respiratorio polmonare (McClain DA, 1982; Edelman GM, 1991). Nel fegato fetale N-CAM svolge un ruolo fondamentale nella realizzazione della transizione fenotipica dagli epatoblasti alle cellule della placca duttale (Van Eyken P, 1992). Nel fegato normale strutture N-CAM positive possono essere individuate lungo i tratti portali e attorno ai dotti biliari e probabilmente rappresentano fibre nervose (Fabris L, 2000). Nel fegato normale di ratto la maggior parte delle terminazioni nervose giungono negli spazi portali e poche si spingono all’interno del parenchima (Tiniakos DG , 1996). Le cellule stellate quiescenti di ratto non esprimono N-CAM (Knittel T, 1996). Nel fegato umano N-CAM è presente sulle terminazioni nervose che giungono nella zona di parenchima periportale e intermedia. Nakatani e coll. (1996) riportano che le cellule stellate in queste aree sono N-CAM positive. Non sono stati dimostrati siti di espressione di N-CAM sulla membrana plasmatica degli epatociti ma si possono osservare alcuni granuli intracitoplasmatici positivi per N-CAM (Fabris L, 2000). Cassiman e coll. (2002) segnalano l’immunoreattività per NCAM oltre che per α-SMA delle cellule stellate nei fegati umani cirrotici. Nel fegato fibrotico di ratti, N-CAM è fortemente espressa in una sottopopolazione di cellule simil-miofibroblastiche (Knittel T, 1996). Secondo Knittel e coll. (1996) solo una sottopopolazione di cellule stellate attivate nell’interfaccia setto-parenchimale esprime NCAM nelle epatopatie croniche. Sinaptofisina è una glicoproteina transmembrana che si trova nelle vescicole presinaptiche dei neuroni e nelle microvescicole simil-sinaptiche delle cellule neuroendocrine (Edelmann L, 1995). Sinaptofisina sembra implicata nel controllo dell’esocitosi e del rilascio dei neurotrasmettitori. La positività immunoistochomica per sinaptofisina è utilizzata per determinare l’origine o la differenziazione neuroendocrina dei tessuti normali e neoplastici dal momento che solo le cellule nervose e neuroendocrine esprimono sinaptofisina (Poola I, 1998). Cassiman e coll. (1999) hanno descritto una positività per sinaptofisina nelle HSC quiescenti e attivate dove sinaptofisina potrebbe avere un ruolo nella fusione delle membrane che porta all’esocitosi delle vescicole simil-sinaptiche che sono state riscontrate nelle HSC (Roskams T, 2004). L’interesse per l’espressione da parte delle HSC di markers tipici del differenziamento neurale/neuroendocrino è stato motivato dalla questione irrisolta dell’origine delle HSC.

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Sulla base dell’espressione di proteine come vimentina e α-SMA infatti le cellule stellate sono state a lungo considerate di indubbia origine mesenchimale. D’altra parte le osservazioni più recenti accanto all’ipotesi dell’origine mesenchimale delle HSC hanno fatto sostenere quella dell’origine neurale/neuroendocrina (Roskams T, 2004). Tuttavia studi embriologici in un modello animale non hanno riscontrato evidenze della provenienza dalla cresta neurale delle HSC rivalutando l’interpretazione dell’origine mesenchimale (Cassiman D, 2006). Rimane quindi tuttora aperta la discussione, perché in ogni caso è necessario spiegare come cellule di origine non-neurale possano esprimere markers tipici di questo differenziamento.

L’ANGIOGENESI EPATICA

L’angiogenesi, cioè la formazione di nuovi vasi da vasi preesistenti è un fenomeno che si verifica in diversi organi in molte situazioni patofisiologiche. L’angiogenesi epatica, anche se tradizionalmente è associata con processi tumorigenici, è stata osservata anche nel contesto di diverse condizioni infiammatorie, fibrotiche e ischemiche. Non è chiaro se l’angiogenesi rappresenta solo un meccanismo omeostatico volto ad assicurare un adeguato apporto di ossigeno o se invece svolge essa stessa un ruolo patogenetico nel contribuire al danno epatico(Carmeliet P, 2000). Se questa seconda ipotesi trovasse conferma l’angiogenesi potrebbe rappresentare un marker prognostico di progressione di malattia e un obiettivo terapeutico. L’ipossia è lo stimolo principale per l’angiogenesi tramite l’induzione di fattori di trascrizione specifici (Pugh CW, 2003) che innescano diversi processi sostenuti da effettori molecolari precisamente regolati. Il “budding” endoteliale è reso possibile dalla vasodilatazione, l’allentamento dei contatti interendoteliali e la permeabilizzazione dei vasi preesistenti che permette la fuoriuscita di proteine plasmatiche come il fibrinogeno e la fibrina che insieme con componenti della matrice extracellulare producono un’impalcatura di sostegno per le cellule endoteliali in migrazione. L’ossido nitrico, dalle note proprietà angiogenetiche (Murohara T, 1998) è il principale fattore responsabile della vasodilatazione mentre il fattore di crescita vascolare di origine endoteliale (VEGF) aumenta la permeabilità vascolare. La degradazione della membrana basale, soprattutto collagene IV e laminina e della matrice extracellulare (collagene I e elastina), necessaria per permettere la migrazione e la proliferazione delle cellule endoteliali avviene ad opera di proteinasi specializzate come l’attivatore del plasminogeno (uPA) e il suo inibitore (PAI-1), mettalloproteinasi (MMPs) e loro inibitori (TIMPs), eparinasi, triptasi e catepsine (Hiraoka N, 1998; Jackson C, 2002). La proteolisi della matrice extracellulare determina l’esposizione di siti criptici e la liberazione di fattori legati alla matrice che promuovono la migrazione e la proliferazione delle cellule endoteliali. Anche le integrine hanno un ruolo nella migrazione delle cellule endoteliali regolandone l’adesione e il distacco dalla matrice e rendendo possibile la comunicazione tra le cellule endoteliali e gli elementi circostanti (Hynes RO, 2002). Una proteolisi insufficiente o eccessiva ostacola l’angiogenesi, impedendo la migrazione delle cellule endoteliali o destabilizzando la struttura di sostegno che la rende possibile (Bajou K, 1998). Al rimodellamento della matrice extracellulare segue la proliferazione delle cellule endoteliali in risposta a fattori di crescita secreti da loro stesse o da cellule circostanti come le cellule stellate, gli epatociti, i leucociti e le cellule di Kupffer e in seguito la loro organizzazione in nuove strutture capillari. Tra i fattori di crescita il più caratterizzato è il VEGF, una proteina multifunzionale in grado di legare due recettori tirosin-chinasici: il “kinase insert domain receptor” (KDR) e il”fms-

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like tyrosine kinase receptor” (Flt-1) (Ferrara N, 2003). Il promoter del VEGF contiene sequenze che rispondono a fattori indotti dall’ipossia (HIF). Il VEGF svolge un ruolo cruciale in quasi tutte le situazioni patologiche nelle quali partecipa l’angiogenesi e sono attualmente allo studio strategie terapeutiche finalizzate a bloccarne il meccanismo d’azione. La proliferazione delle cellule endoteliali può essere anche stimolata da altri membri della famiglia del VEGF: il fattore di crescita placentare, in grado di potenziare gli effetti del VEGF, il VEGF-C e il VEGF-D che regolano soprattutto l’angiogenesi linfatica e il VEGF-B, che recentemente è stato descritto promuovere in vivo l’angiogenesi, in particolare nell’artrite infiammatoria (Mould AW, 2003). La proliferazione delle cellule endoteliali può essere inoltre stimolata anche da altri fattori di crescita come i fattori di crescita fibroblastici acido e basico (aFGF e bFGF), il fattore di crescita epatocitaria (HGF) e il “transforming growth factor” (TGF) a e b, il ruolo dei quali è tuttavia meno caratterizzato (Yancopoulos GD, 2000). Citochine, mediatori lipidici, ormoni e neuropeptidi promuovono la proliferazione endoteliale, mentre molecole come l’angiostatina (frammento del plasminogeno), l’endostatina (frammento del collagene di tipo XVIII), l’antitrombina III, l’interferon b e il “leukemia inhibitory factor” la sopprimono (Yancopoulos GD, 2000). E’ stato anche suggerito il ruolo pro- o anti-angiogenetico a livello delle cellule endoteliali di diverse chemochine (Bernardini G, 2003). Il VEGF inoltre oltre a stimolare la proliferazione è anche responsabile dell’organizzazione tridimensionale delle strutture tubulari dei capillari in formazione influenzandone direttamente diametro e lunghezza insieme ad angiotensina-1, le integrine avb3 e avb5 e al “myocyte enhancer-binding factor 2C transcription factor”, mentre la trombospondina inibisce la formazione del lume (Kalluri R, 2003). La formazione di una rete tridimensionale di vasi di calibro uniforme è assicurata da meccanismi che coinvolgono vie di segnale responsabili del “branching” (come efrine e neuropiline), della formazione di membrana basale e di componenti della membrana extra-cellulare (regolate da MMPs e TIMPs) e della migrazione e differenziamento cellulari. Per la maturazione definitiva dei vasi neo-formati è necessario il reclutamento di periciti che appongano nuova membrana basale e matrice extracellulare. Le cellule endoteliali si legano e stimolano la proliferazione di periciti che esprimano il recettore b per il PDGF attraverso il rilascio di PDGF-B (Hellstrom M, 2001). I periciti secernono l’angiotensina-1 che stabilizza i vasi neo-formati legando il recettore Tie-2 che a sua volta agendo sui complessi giunzionali (Thurston G, 2000) rende possibile la comunicazione tra le cellule endoteliali e le cellule murali (Carlson TR, 2001). Anche l’ angiotensina-2 svolge un ruolo in questa fase essendo in grado di esercitare effetti opposti: in assenza del VEGF agisce come antagonista dell’angiotensina–1 , destabilizzando i vasi e inducendo la morte delle cellule endoteliali così da far regredire le strutture vascolari, mentre in presenza di VEGF stimola la formazione di nuovi vasi (Visconti RP, 2002). Infine il TGF-b1 promuove la maturazione vascolare stimolando la formazione di matrice extracellulare e inducendo il differenziamento in periciti delle cellule mesenchimali (Goumans MJ, 2002). A livello epatico questi meccanismi innescano l’angiogenesi in un contesto cito-istologico peculiare. Infatti a livello epatico esistono due tipi di strutture microvascolari con due diversi endoteli, cioè i vasi degli spazi portali provvisti di un endotelio continuo e i sinusoidi dotati di endotelio fenestrato (McCuskey RS, 1993), e sono presenti cellule a funzione e posizione simil-pericitaria come le cellule stellate epatiche in grado probabilmente di contribuire al processo angiogenetico. La maggior parte delle epatopatie croniche è caratterizzata dalla presenza di fibrosi e infiammazione. Durante il processo fibrogenetico viene sintetizzato un eccesso di matrice

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extracellulare (Friedman SL, 2000) che producendo una resistenza al flusso ematico e al rilascio di ossigeno determina ipossia. La stimolazione di fattori indotti dall’ipossia “accende” la via dell’angiogenesi, up-regolando fattori pro-angiogenetici e portando alla formazione di nuovi vasi (Garcia-Monzon C, 1995). Infatti le strategie terapeutiche anti-angiogenetiche sperimentate in modelli animali si sono dimostrate in grado di arrestare lo sviluppo della fibrosi epatica (Wang YQ, 2000; Yoshiji H, 2003). Oltre alla fibrosi, concomita nelle epatopatie croniche una reazione infiammatoria locale per cui mediatori pro-infiammatori insieme ad altri stimoli non ipossici possono elicitare una risposta angiogenetica inducendo il fattore indotto dall’ipossia-1a e l’attività trascrizionale che da esso dipende e che include la produzione di VEGF (Richard DE, 2000). Anche la produzione di eicosanoidi pro-infiammatori da parte della cicloossigenasi-2 ha un ruolo nella neovascolarizzazione dal momento che la sua inibizione ad opera di antagonisti selettivi è in grado di bloccare l’angiogenesi sia in modelli animali che nell’uomo (Masferrer JL, 2000). Modificazioni del pattern microcircolatorio epatico come alterazioni a livello della microvascolatura dei noduli cirrotici (Rappaport 1983), la formazione di shunts pre-post sinusoidali, la costituzione del plesso perinodulare (Gaudio E, 1993) e il riarrangiamento microvascolare intralobulare (Onori P, 2000) sembrano giocare un ruolo chiave nel determinare il danno della funzione epatica che caratterizza la cirrosi. E’ verosimile che a causa della loro caratteristica posizione pericitaria le cellule stellate-miofibroblasti contribuiscano alla regolazione dei meccanismi angiogenetici e di rimodellamento endoteliale analogamente agli astrociti nel SNC, con i quali condividono l’espressione di GFAP. Gli astrociti infatti costituiscono il versante parenchimale dell’interfaccia gliovascolare e recenti linee di evidenza indicano che a livello della barriera ematoencefalica essi forniscono gli stimoli idonei alla formazione del muro di cellule endoteliali (Prat A. 2001) che a loro volta sembrano avere un ruolo nell’indurre la differenziazione astrocitaria (Mi H. 2001). I fattori di crescita vascolare nell’epatocarcinoma Le epatopatie ad eziologia virale (HCV e HBV) rappresentano nel mondo la causa più comune di fibrosi e cirrosi epatica (Friedman SL, 2003) e producono un aumento considerevole di rischio di sviluppare epatocarcinoma attraverso maccanismi ancora non del tutto chiariti (Takano S, 1995). L’angiogenesi è implicata nella cancerogenesi favorendo la progressione, la crescita e la metastatizzazione tumorale (Yancopoulos GD, 2000). Nelle epatopatie croniche ad eziologia virale sono state descritte a livello degli spazi portali strutture capillari neoformantisi (Garcia-Monzon, 1995) e l’angiogenesi epatica sembra correlare con l’infezione cronica da virus C più che con quella da virus B (Mazzanti R, 1997), rappresentando un fattore di rischio per la progressione ad epatocarcinoma nei pazienti con epatite cronica C (Ohmori S, 2001). L’epatocarcinoma è uno delle cinque più comuni neoplasie al mondo, la terza causa di morte per tumore e la sua incidenza è in aumento. L’HCC è un tumore ipervascolarizzato caratterizzato da neovascolarizzazione che gioca un ruolo importante nella sua crescita e progressione (Semela D, 2004). Attualmente non sono disponibili terapie efficaci per l’HCC e il trattamento anti-angiogenetico è un’opzione possibile anche sulla base dei risultati ottenuti in altri tumori. Infatti evidenze ottenute in studi condotti negli animali suggeriscono che la terapia antiangiogenetica sistemica o intratumorale indirizzata contro la via del VEGF , sola o in combinazione con altre terapie inibisce la crescita dell’HCC (Wu H, 2004; Yoysungnoen P, 2006) e dati preliminari ottenuti nell’uomo sono incoraggianti in questo senso (Zhu AX, 2006; Schwartz J, 2005). Tuttavia è stata descritta

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una percentuale variabile di noduli di HCC umano con un’espressione proteica del VEGF-A bassa o assente, che probabilmente non risponderebbero alla terapia anti-VEGF-A (El-Assal ON, 1998; Yamaguchi R, 1998). Inoltre il VEGF-A viene iperespresso, rispetto al fegato normale, nella cirrosi che è la causa più comune di HCC (El-Assal ON, 1998; Medina J, 2005). L’espressione del VEGF-A nel fegato cirrotico di pazienti con HCC valutata solo nel fegato cirrotico non tumorale circostante la neoplasia è risultata circa nel 45% dei casi maggiore nel tessuto non tumorale rispetto alla lesione (An FQ, 2000; Ng IOL, 2001; von Marschall Z, 2001) ma non ci sono dati che dimostrino che questa iperespressione interessa anche il resto del fegato. Nei pazienti con un’espressione del VEGF-A maggiore nel fegato cirrotico rispetto al tessuto tumorale il trattamento sistemico con anti-VEGF-A potrebbe essere dannoso inibendo la rigenerazione del fegato non neoplastico. Sarebbe quindi di utilità clinica individuare qualche variabile sierica che rispecchi l’espressione proteica del VEGF-A a livello del tessuto neoplastico e del fegato cirrotico non neoplastico dello stesso paziente in modo da selezionare i pazienti con una maggiore probabilità di risposta al trattamento anti VEGF-A. Le concentrazioni sieriche di VEGF-A e alfa-fetoproteina si sono rivelate avere una rilevanza prognostica nell’HCC (Pompili M, 2001; Chao Y, 2003). Inoltre l’espressione proteica del VEGF-C nell’HCC non è stata valutata.

OBIETTIVO I Valutare l’attivazione delle HSC e l’espressione fenotipica di GFAP e α-SMA in relazione ai fenomeni di fibrosi e angiogenesi in corso di epatite cronica allo scopo di individuare indicatori precoci e prognosticamente utili di fibrogenesi. E’ infatti di notevole interesse clinico poter individuare gli stadi precoci delle fibrosi o predirne la velocità di progressione per orientare opportunamente e con tempestività le strategie terapeutiche quando ancora il processo fibrogenetico è suscettibile di un certo grado di reversibilità.

MATERIALI E METODI Questo studio ha coinvolto 180 biopsie epatiche suddivise nei seguenti gruppi: cirrosi epatica post-virale ad eziologia B (HBV-C) (n=27) e C (HCV-C) (n=16), cirrosi epatica post-virale ad eziologia mista con HCC (HCC-C) (n=25) e senza HCC (nHCC-C) (n=50), epatite cronica stadio pre-cirrotico ad eziologia C (HCV-CH) (n=14), recidive post-trapianto ad eziologia C (HCV-R) (n=17), donatori di fegato sani (DL) (n=31). I campioni di tessuto epatico sono stati ottenuti da donatori di fegato cadaveri a cuore battente per via laparotomica per il gruppo DL, da fegati espiantati al momento del trapianto per i gruppi HBV-C, HCV-C, HCC-C e nHCC-C e da biopsie percutanee con istologia compatibile con recidiva post-trapianto di epatite C per il gruppo HCV-R, prese per fini diagnostici con il consenso informato dei pazienti. Immunoistochimica I frammenti di tessuto epatico sono stati fissati in formalina tamponata per 2-4 ore e inclusi in paraffina con punto di fusione a 55-57 °C. Sono state quindi effettuate sezioni dello spessore di 3-4 micrometri sulle quali stata effettuata la colorazione con ematossilina-eosina e la tricromica di Masson.

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Per gli studi di immunoistochimica le sezioni sono sate distese su vetrini sialinizzati. Dopo la sparaffinatura e il successivo bloccaggio dell’attività perossidasica endogena tramite incubazione con perossido di idrogeno al 3% per 20 min. si è bloccata la biotina endogena con il Biotin Blocking System (Dako, Milano, Italia). Le sezioni sono state poi sottoposte a tre lavaggi successivi in soluzione salina tamponata con il fosfato (PBS). Le sezioni sono state incubate con gli anticorpi monoclonali di origine murina anti α-SMA (Dako, clone 1A4) e anti CD-34 (Dako, clone QB End 10) per 1 ora a temperatura ambiente alla diluizione rispettivamente di 1:40 e 1:50, e con l’anticorpo anti GFAP (Neo Markers, clone GA-5) over-night alla diluizione di 1:100. Sono stati inoltre testati nell’individuazione delle HSC gli anticorpi monoclinali murini anti-sinaptofisina (Neo Markers, clone 27G12) alla diluizione di 1:80 per 1 ora, previo smascheramento termo-indotto e anti-NCAM alla diluizione di 1:50 over-night. Dopo ulteriori tre lavaggi in PBS le sezioni sono state incubate per 30 minuti con l’anticorpo secondario biotilinato marcato con Avidin-Biotin Complex (LSAB, Dako). La positività immunoistochimica è stata quindi messa in evidenza con 3-3’ diaminobenzidina e le sezioni sono state contrastate con ematossilina. I controlli negativi sono stati realizzati omettendo l’anticorpo primario e dimostrando la mancanza di immunoreazione. Istologia Nei gruppi delle recidive e delle epatiti croniche è stata valutata l’attività istologica attraverso l’histology activity index (HAI) di Knodell e coll. (Knodell RG, 1981) fornendo separatamente la valutazione delle necro-infiammazione e della fibrosi nell’intento di distinguere il sottostante processo epatitico dal rimodellamento in senso fibrotico. Nei gruppi delle cirrosi il grado di attività della cirrosi è stato definito in base all’osservazione di infiltrati infiammatori a livello dei setti fibrosi anche interessanti il circostante parenchima. Le cirrosi erano classificate inattive in mancanza di cospicui infiltrati e soprattutto in assenza di attività d’interfaccia. Valutazione delle cellule stellate Le cellule stellate sono state distinte dagli altri miofibroblasti epatici (portali, d’interfaccia e settali) grazie alla loro localizzazione all’interno del parenchima epatico (Cassiman D, 2002). Il numero delle cellule stellate α-SMA e GFAP positive e negative è stato valutato al microscopio ottico a 200X e sono state considerate solo le cellule il cui nucleo era visibile. Sono stati valutati per ogni vetrino almeno 7-10 campi scelti casualmente. La percentuale di cellule stellate positive è stata calcolata sul numero totale di cellule stellate contate su ogni vetrino. Valutazione della densità microvascolare La densità microvascolare di ogni campione è stata valutata secondo il metodo descritto da Weinder e coll. (Weinder N, 1991). Ogni cellula endoteliale o gruppo di cellule positivi a CD34 nettamente separati da strutture microvascolari adiacenti sono stati considerati come singole strutture vascolari. Dopo un’iniziale valutazione del campione effettuata a basso ingrandimento (40X) per individuare le aree con la più alta densità microvascolare sono state selezionate e valutate ad ingrandimento maggiore (100X) le tre aree a più alta densità. Il valore della densità microvascolare per ogni singolo campione è stato espresso come numero totale delle strutture vascolari positive a CD34 rapportato all’unità di superficie.

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Morfometria L’analisi quantitativa è stata effettuata su sezioni sulle quali è stata effettuata la colorazione tricromica di Masson come precedentemente descritto (Alvaro D, 2002). Per acquisire le immagini ci si è avvalsi di una videocamera (SPOT Insight; Diagnostic Instrment, Inc., Sterling Heights, MI) collegata a un microscopio ottico Olympus BX-51 (Olympus, Tokyo, Japan) e ad un Computer con softwer dedicato (Image Analysis System, Delta Sistemi, Roma, Italia). Il tessuto fibroso, incluso quello degli spazi portali o attorno alla vena centrale, è stato misurato come frazione di volume del tessuto totale del campione esaminato. E’stata successivamente determinata anche la frazione di volume occupata rispettivamente dagli elementi delle triadi portali (arterie, vene e dotti biliari). Analisi statistica I risultati sono stati presentati come medie±deviazione standard. Le differenze tra i gruppi in caso di veriabili continue sono state valutate tramite il test t di student o il Kruskal-Wallis test seguito dove necessario dal Mann-Whitney U test. In caso di variabili categoriali si è utilizzato il chi-square test. Le correlazioni sono state valutate tramite il test di Spearman. Tutti i test sono stati effettuati a due code e considerati significativi a p<0.05.

RISULTATI Istologia La diagnosi di cirrosi è stata confermata dall’esame istologico del fegato espiantato in tutti i casi nei gruppi HBV-C e HCV-C. Le biopsie collezionate nei gruppi HCV-R e HCV-CH sono state effettuate quando clinicamente indicate a una distanza media dall’infezione di 31 e 102 mesi nelle recidive e nelle epatiti croniche rispettivamente. I casi di HCV-R mostravano epatite cronica con grading e staging secondo Knodell non significativamente diversi dai casi di HCV-CH (6.9±3.6 e 1.2±1 vs 6.8±2.4 e 1.7±1, rispettivamente, P=ns). Immunoistochimica La tonaca media dei vasi degli spazi portali e delle diramazioni delle vene epatiche mostrava una forte positività immunoistochimica per α-SMA in tutti i gruppi studiati. Alcune cellule mesenchimali a livello degli spazi portali risultavano α-SMA-positive nei controlli. Nelle cirrosi le bande di tessuto fibroso attorno ai noduli di rigenerazione contenevano cellule mesenchimali α-SMA positive così come anche se meno intensamente i tratti portali e i setti in espansione nei gruppi delle recidive e soprattutto delle epatiti croniche. Anche alcune cellule endoteliali a livello degli spazi portali e dei setti fibrosi risultavano α-SMA-positive in tutti i gruppi esaminati anche se talvolta non si riusciva ad attestare con estrema sicurezza a causa dell’intensa reazione di back-ground nei siti non-parenchimali. L’immunoreazione per GFAP interessava le cellule stellate e alcune cellule fibroblastiche e fibre nervose degli spazi portali e dei setti e sembrava coinvolgere alcune cellule endoteliali. Cellule alfa-SMA-positive Per quanto riguarda la distribuzione delle cellule stellate α-SMA-positive nel gruppo dei donatori sani rare cellule stellate perisinusoidali risultavano α-SMA-positive ed erano prevalentemente localizzate in posizione immediatamente periportale o pericentrale attorno alla vena centrolobulare. Nei gruppi delle recidive e delle epatiti croniche le cellule stellate α-SMA-positive erano distribuite più omogeneamente all’interno del lobulo, localizzandosi

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particolarmente nei siti di necrosi “piecemeal” e nelle immediate vicinanze degli spazi portali ingranditi in corrispondenza degli infiltrati infiammatori (Fig.1 e 2). Nel gruppo delle cirrosi le cellule stellate intraparenchimali risultavano diffusamente e fortemente α-SMA-positive. In particolare a livello delle cirrosi attive molte cellule stellate α-SMA-positive erano presenti nei setti in espansione e negli spazi perisinusoidali del parenchima epatico residuo (Fig.3). La percentuale di HSC che esprimono α-SMA è risultata nei gruppi HCV-C, HCV-CH e HCV-R di 30±19%, 30±21% e 42±17% rispettivamente (p=ns), rispetto a 3±4% nel gruppo DL (p<0.05) (Fig. 4, Tab.1). Inoltre le cirrosi con HCC mostravano nel tessuto prelevato a distanza dalla lesione, una percentuale di cellule α-SMA-positive significativamente maggiore rispetto alle cirrosi senza (p<0.05) pur non presentando differenze significative per quanto riguarda i parametri morfometrici. Il gruppo delle cirrosi inoltre non mostrava differenze significative nella percentuale di cellule α-SMA-positive a seconda dell’eziologia virale (HBV-C vs HCV-C p=ns). Nei gruppi delle recidive, epatiti croniche e cirrosi, alcune cellule endoteliali dei vasi di piccolo e medio calibro a livello dei tratti portali e dei setti fibrosi erano α-SMA-positive. Cellule GFAP-positive Per quanto riguarda la distribuzione delle cellule stellate GFAP-positive nel gruppo dei donatori sani l’espressione di GFAP era principalmente confinata ad una piccola popolazione di cellule stellate localizzate al limite o attorno agli spazi portali. Una percentuale minima di cellule stellate GFAP-positive si ritrovava all’interno del lobulo. Occasionalmente apparivano GFAP-positive alcune cellule endoteliali dei vasi portali (Fig.5). Nei gruppi delle recidive e in misura minore in quello delle epatiti croniche le cellule stellate GFAP-positive risultavano maggiormente distribuite all’interno del lobulo (Fig.6 e 7). Alcune cellule endoteliali nella periferia dei tratti portali espansi e a livello dei setti in espansione apparivano GFAP-positive (Fig.8). Nel gruppo delle cirrosi le cellule stellate GFAP positive erano più rare e confinate alla periferia del parenchima epatico residuo a livello principalmente dell’interfaccia setto-parenchimale (Fig.9). Cellule endoteliali verosimilmente GFAP-positive si osservavano ai confini del tessuto fibroso (Fig.10). Per quanto riguarda il pattern di GFAP-positività delle cellule stellate, queste apparivano debolmente positive nel gruppo dei donatori, più immunoreattive negli altri gruppi con una positività che interessava anche i processi citoplasmatici nel gruppo delle recidive, meno diffusamente citoplasmatica nel gruppo delle epatiti croniche, principalmente ristretta al citoplasma perinucleare nel gruppo delle cirrosi (Fig.5, 6, 7 e 9). La percentuale di HSC che esprimevano GFAP è risultata significativamente differente nei gruppi HCV-C e HCV-R (9±11% e 35±20% rispettivamente, p<0.001), HCV-R e HCV-CH (35±20% e 18±17% rispettivamente, p<0.05) e nel gruppo DL (3±7%) rispetto ai gruppi HCV-R e HCV-CH (p<0.001 e p<0.05 rispettivamente) (Fig. 11, Tab1). Il gruppo delle cirrosi inoltre mostrava una differenza significativa nella percentuale di cellule GFAP-positive a seconda dell’eziologia virale (HBV-C vs HCV-C p<0.05) con una percentuale di HSC GFAP-positive minore nel gruppo HBV-C (2±7%)

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Fig. 1. Recidiva di epatite cronica dopo trapianto. Le cellule stellate α-SMA positive (frecce) sono distribuite diffusamente all’interno del lobulo e sono fortemente immunoreattive . O.M.: 200X

Fig. 2. Epatite cronica. Le cellule stellate α-SMA positive (frecce) sono distribuite diffusamente all’interno del lobulo. O.M.: 200X

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Fig. 3. Cirrosi. Le cellule stellate α-SMA positive (frecce) sono distribuite omogeneamente nel parenchima epatico residuo. O.M.: 200X

Fig. 4. Box plots della percentuale di cellule stellate α-SMA positive nel tessuto epatico di donatori sani, pazienti con recidiva di epatite cronica dopo trapianto epatico (recidive), pazienti con epatite cronica e cirrosi. ∗∗∗p<0,001 vs cirrosi, ∗∗p<0,001 vs epatiti croniche, ∗p<0,001 vs recidive.

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Fig. 5. Donatore sano. Le cellule stellate GFAP positive (frecce) sono rare, localizzate in prossimità degli spazi portali. La positività immunoistochimica interessa principalmente il citoplasma perinucleare. Rare cellule endoteliali all’interno dello spazio portale sono GFAP positive. O.M.: 200X

Fig. 6. Recidiva di epatite cronica dopo trapianto. Le cellule stellate GFAP-positive (frecce) presentano una distribuzione omogenea all’interno del lobulo ed esibiscono una positività immunoistochimica che interessa anche i processi citoplasmatici. O.M.: 200X

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Fig. 7. Epatite cronica. Le cellule stellate GFAP positive (frecce) sono distribuite all’interno del lobulo in maniera più eterogenea e la positività immunoistochimica è più lieve e non interessa tutto il citoplasma. O.M.: 200X

Fig. 8. Epatite cronica. Alcune cellule endoteliali a livello di questo setto in formazione appaiono GFAP-positive. O.M.: 400X

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Fig. 9.Cirrosi. Le cellule stellate GFAP positive (frecce) sono confinate alla periferia del parenchima epatico residuo e la positività immunoistochimica è principalmente localizzata nella zona perinucleare.. O.M.: 200X

Fig. 10. Cirrosi. Cellule endoteliali verosimilmente GFAP-positive si osservavano nella zona più esterna dei setti fibrosi. O.M.: 400X

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Fig. 11. Box plots della percentuale di cellule stellate GFAP positive nel tessuto epatico di donatori sani, pazienti con recidiva di epatite cronica dopo trapianto epatico (recidive), pazienti con epatite cronica e cirrosi. ∗∗∗p<0,001 vs cirrosi, ∗∗p<0,05 vs epatiti croniche, ∗p<0,001 vs recidive. Altri markers Sono stati testati altri markers per l’individuazione delle HSC, quali sinaptofisina e NCAM senza ottenere risultati soddisfacenti. Infatti nel gruppo delle cirrosi dove sono stati preliminarmente testati, non è stata riscontrata pressoché nessuna immunoreazione delle HSC per NCAM mentre per sinaptofisina si osservavano positività sporadiche (inferiori al 5%) a livello delle HSC e forti aspecificità (background epatocitario), nonostante i controlli positivi (fibre nervose e pancreas endocrino, rispettivamente per NCAM e sinaptofisina) mostrassero la specificità dell’immmunoreazione (Fig. 12). Densità microvascolare La densità microvascolare era significativamente maggiore in tutti i gruppi rispetto ai donatori sani. Le strutture endoteliali CD34-positive confinate principalmente agli spazi portali nei donatori sani, si estendeva gradualmente nelle recidive e nelle epatiti croniche a causa dell’espansione degli spazi stessi e interessava anche i setti neoformantisi e aree di parenchima sede di infiltrati infiammatori (Fig.13). Nelle cirrosi l’immunoreazione per CD-34 era molto più estesa e interessava non solo vasi localizzati all’interno delle zone fibrotiche ma coinvolgeva anche l’endotelio alla periferia del parenchima epatico residuo (Fig.12). La densità microvascolare (MVD/mm²) risultava 295.6±71.9, 231.8±24.8,

***

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***

*****

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**

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207.6±64.5, 124.6±55.7 in HCV-C, HCV-CH, HCV-R e DL rispettivamente (Fig. 14, Tab1).

Fig. 12. L’immunoreazione per NCAM era pressocchè nulla a livello delle HSC (A), mentre risultavano NCAM-positive le fibre nervose (B; O.M. 400X). Scarse erano le HSC sinaptofisina-positive e l’immunoreazione per la sinaptofisina era abbastanza aspecifica (C), mentre fortemente positive erano le cellule del pancreas endocrino (D). O.M. 200X Morfometria Nel gruppo dei donatori sani il tessuto fibroso era rappresentato solo dal tessuto connettivo dei tratti portali e della capsula di Glisson. La percentuale di fibrosi risultava minore nei donatori sani rispetto a tutti gli altri gruppi (p<0.05) all’interno dei quali recidive e epatiti croniche presentavano una percentuale di fibrosi inferiore rispetto alle cirrosi (p<0.05). La percentuale di fibrosi risultava 28.5±6.9%, 9.5±4.4%, 7±4.3%, 4.1±0.7% in HCV-C, HCV-CH, HCV-R e DL rispettivamente (Fig. 15, Tab1).

C D

A B

C D

A B

23

*

***** ****

****

Den

sità

mic

rova

scol

are

(vas

i CD

34-p

osit

ivi /

mm

2)

*

***** ****

****

Den

sità

mic

rova

scol

are

(vas

i CD

34-p

osit

ivi /

mm

2)

*

***** ****

****

*

******

***** ****

****

Den

sità

mic

rova

scol

are

(vas

i CD

34-p

osit

ivi /

mm

2)

Fig. 13. Le strutture endoteliali CD34-positive confinate principalmente negli spazi portali nei donatori sani (A), si localizzano anche nei setti neoformantisi e in aree di parenchima sede di infiltrati infiammatori nelle recidive (B) e nelle epatiti croniche (C). La CD-34 positività è molto più estesa e interessa non solo vasi localizzati all’interno delle zone fibrotiche ma anche l’endotelio alla periferia del parenchima epatico residuo nella cirrosi (D). O.M.: 100X

Fig. 14. Box plots della densità microvascolare (vasi

CD34-positivi/mm2) nel tessuto epatico di donatori sani, pazienti con recidiva di epatite cronica dopo trapianto epatico (recidive), pazienti con epatite cronica e cirrosi. ∗∗∗p<0,001 vs cirrosi, ∗∗∗∗ p<0,05 vs cirrosi, ∗∗p<0,005 vs epatiti croniche, ∗p<0,01 vs recidive.

A B

C D

24

Fig. 15. Box plots della percentuale di tessuto fibroso a livello del fegato di donatori sani, pazienti con recidiva di epatite cronica dopo trapianto epatico (recidive), pazienti con epatite cronica e cirrosi. ∗∗∗p<0,001 vs cirrosi, ∗∗p<0,001 vs epatiti croniche, ∗p<0,005 vs recidive.

Tab. 1. Parametri morfometrici, angiogenetici e immunoistochimici. *p<0,05 vs donatori; • p<0,05 vs epatiti croniche; ª p<0,05 vs cirrosi.

*

***** ***

***

Fib

rosi

(%)

*

***** ***

***

Fib

rosi

(%)

*

***** ***

***

*

******

***** ***

***

Fib

rosi

(%)

Recidive

Epatiti croniche

Cirrosi

Donatori

N. di soggetti

17

12

16

31

Percentuale fibrosi

± DS

7%* ª

(±4,3%)

9,5%* ª (±4,4%)

28,5%* (±6,9%)

4,1%

(±0,7%)

MVD (vasi CD34/mm2)

± DS

207,6* ª (±64,5)

231,8* ª (±24,8)

295,6* (±71,9)

124,6

(±55,8)

HSC α-SMA +

± DS

42%*

(±17%)

30%*

(±21%)

30%* (19%)

3%

(±4%)

HSC GFAP + ± DS

35%* ª • (±20%)

18%*

(±17%)

9%

(±11%)

3%

(±7%)

25

Correlazioni tra l’espressione immunoistochimica di �-SMA e di GFAP e i parametri morfometrici e immunoistocimici di fibrosi e rimodellamento vascolare. La percentuale di HSC GFAP-positive correlava inversamente con la percentuale di fibrosi (r=-0.436, p<0.01) (Tab. 2). La percentuale di HSC GFAP-positive correlava inversamente con la densità microvascolare (r=-0.366, p<0.05) (Tab. 2). La percentuale di fibrosi e la densità microvascolare correlavano direttamente (r=0.449, p<0.01) (Tab. 2). La percentuale di HSC α-SMA-positive non mostrava alcuna correlazione nè con la percentuale di fibrosi, né con la densità microvascolare (Tab. 2).

MVD

Fibrosis

GFAP

Alpha-SMA

ρ= 0.142

P=ns

ρ= -0.178

P=ns

ρ= 0.250

P=ns

GFAP

ρ= -0.366

P<0.05

ρ= -0.436

P<0.01

Fibrosis

ρ= 0.449

P<0.01

Tab. 2. La percentuale di HSC GFAP-positive correla inversamente con la percentuale di fibrosi (r=-0.436, p<0.01). La percentuale di HSC GFAP-positive correla inversamente con la densità microvascolare (r=-0.366, p<0.05). La percentuale di fibrosi e la densità microvascolare correlano direttamente (r=0.449, p<0.01). La percentuale di HSC α-SMA-positive non mostra alcuna correlazione nè con la percentuale di fibrosi, né con la densità microvascolare. Correlazioni tra l’espressione immunoistochimica di alfa-SMA e di GFAP, il tempo trascorso dal trapianto e la velocità di progressione della fibrosi nelle recidive. E’ stata riscontrata una correlazione inversa tra il tempo trascorso dal trapianto e la percentuale di HSC GFAP-positive nel tessuto epatico di pazienti con recidiva di epatite cronica (r=-0.600, p<0.05) (Fig. 16). Inoltre la velocità della progressione della fibrosi, calcolata come il rapporto tra la percentuale di tessuto fibrotico e i mesi trascorsi dal trapianto fino alla biopsia, mostrava una correlazione diretta con la percentuale di HSC GFAP-positive (r=0.600, p<0.05) (Fig.17), mentre non mostrava alcuna correlazione con la percentuale di HSC α-SMA-positive (r=0.180, p=ns) (Fig. 18).

26

Fig.16. Correlazione tra il tempo trascorso dal trapianto e la percentuale di HSC GFAP-positive nelle recidive (scala logaritmica). r=- 0.600; p<0.05.

Fig.17. Correlazione tra la velocità della progressione della fibrosi e la percentuale di HSC GFAP-positive. r=0.600, p<0.05.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

100 101 102 103

Time elapsed from transplantation months)

GF

AP

pos

itive

HS

C (

%)

0

20

40

60

80

0.00 0.60 1.20 1.80 2.40 3.00Fibrosis progression (per month)

GF

AP

pos

itive

HS

C (%

)

27

Fig. 18. Assenza di correlazione tra la velocità della progressione della fibrosi e la percentuale di HSC α-SMA -positive. r=0.180, p=n.s.

OBIETTIVO II Valutare il ruolo di altri fattori, come i fattori di crescita vascolare di origine endoteliale (VEGF), in grado di intervenire nella regolazione dei meccanismi che determinano la fibrosi per esempio agendo sul rimodellamento vascolare che accompagna la deposizione di tessuto fibroso. Tali mediatori come i fattori di proliferazione vascolare sono prodotti dalla HSC e dagli epatociti e lo studio della loro espressione potrebbe chiarire alcuni dei meccanismi che governano la progressione della cirrosi e l’insorgenza di alcune delle sue complicanze tardive come l’epatocarcinoma.

MATERIALI E METODI Questo studio ha coinvolto 34 pazienti sottoposti a trapianto di fegato. Tutti i pazienti erano cirrotici e 16 erano affetti da epatocarcinoma. I noduli di epatocarcinoma sono stati diagnosticati pre-operatoriamente e confermati istologicamente dopo il trapianto in tutti i casi. I dati clinico-patologici della popolazione dello studio sono mostrati in tabella (Tab. 3). Otto pazienti avevano una malattia multifocale e otto un nodulo singolo. Tutti gli otto pazienti con HCC multifocale sono stati sottoposti a chemoembolizzazione o ad alcolizzazione, almeno tre mesi prima del trapianto. I prelievi sono stati effettuati immediatamente dopo la rimozione del fegato al momento del trapianto e il tessuto di epatocarcinoma è stato prelevato dai noduli non trattati in caso di malattia multifocale. Aliquote del tessuto sono state immediatamente fissate in formalina per la conferma istologica della cirrosi o dell’HCC e per l’immunoistochimica, o congelate in azoto liquido per il Western blot. Nei pazienti affetti da HCC aliquote di tessuto cirrotico non tumorale sono state prelevate a 10 cm almeno di distanza dalla lesione per immunoistochimica e Western blot. Inoltre per confrontare a livello immunoistochimico la positività al VEGF-A e VEGF-C dell’HCC e del tessuto cirrotico all’interno dello stesso paziente sono state utilizzate sezioni che comprendevano la lesione e il tessuto non tumorale circostante. Il

0

20

40

60

80

0.00 0.60 1.20 1.80 2.40 3.00Fibrosis progression (per month)

alph

a-S

MA

pos

itive

HS

Cs

(%)

28

tessuto epatico normale è stato ottenuto da biopsie effettuate imediatamente prima dell’espianto in donatori di fegato deceduti a cuore battente (n=7; età 44.5±21.4 anni media±DS; uomini/donne 5/2). Tab. 3. Dati clinico-patologici della popolazione dello studio. Istologia e grading dell’HCC L’esame istologico è stato effettuato in tutti i casi e il grado di differenziamento della lesione è stato determinato secondo la classificazione di Edmonson-Steiner sulla base dell’esame di aree del tumore con il grado più alto. Western blot analysis Il Western blot è stato effettuato nel tessuto HCC e in quello cirrotico a distanza della lesione nello stesso paziente, nel tessuto cirrotico di pazienti senza HCC e in fegato normale di donatori. Il tessuto epatico è stato processato in ice-cold lysis buffer (15 mM TRIZMA base, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% IGEPAL, 2 ug/ml aprotinin, 1.5 mg/ml benzamidine, 34 ug/ml phenylmethylsulfonylfluoride). Dopo la centrifugazione per 2 minuti a 14,000 rpm, è stato collezionato il sopranatante e la concentrazione di proteine è stata determinata tramite Bio-Rad Protein Assay method (BIO-RAD, Munchen, Germany). I campioni sono stati diluiti e scaldati in un water bath per 4 minuti. Dopo una centrifugazione di 1 minuto a 14,000 rpm, i campioni sono stati allestiti in sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis (10% acrylamide) in un Bio-Rad miniature slab gel apparatus (Mini-Protean), con gli opportuni pesi molecolari standard di riferimento. I campioni di HCC e cirrosi non tumorale dello stesso paziente correvano adiacenti. Il trasferimento delle proteine dal gel alla nitrocellulosa è stato effettuato per 2 ore utilizzando voltaggi crescenti da 70 a 120 V nel Bio-Rad miniature transfer apparatus (Mini-Protean). Sono stati utilizzati i seguenti

---- 10 (63)HCC dimensione del nodulo > 2 cm

---- ----

----

10 (56) 8 (44)

----

15.1±3.8

12 (67)

53.8±5.4

Pazienti cirrotici senza HCC n=18

7 (44) 9 (56)

HCC grading Ben differenziato

Moderatamente/scarsamente differenziato

8 (50)HCC solitario n (%)

8 (50) 6 (38) 2 (13 )

Eziologia della cirrosi n ( %) HCV HBV Etanolo

12.0±2.8MELD score

13 (81)Sesso maschile, n (%)

55.7±7.8 Età, anni

Pazienti cirrotici con HCC n=16

29

anticorpi primari: (1) anticorpo monoclonale murino anti-VEGF-A (sc-7269, Santa Cruz, clone C1) alla diluizione di 1:1000, (2) anticorpo policlonale di coniglio anti-VEGF C, (Zymed) alla diluizione di 1:1000. Per la β-tubulin, è stato utilizzato un anticorpo monoclonale murino (Sigma) alla diluizione di 1:500. Sono stati utilizzati anticorpi secondari policlonali anti-mouse alla diluizione di 1:2000 e anti-rabbit alla diluizione di 1:8000 (Sigma). Il legame aspecifico dell’anticorpo alla nitrocellulosa è stato ridotto pre-incubando i filtri per un’ora a temperatura ambiente in soluzione tampone bloccante contenente 10 mmol/L Tris a pH 7.6, 150 mmol/L NaCl, 5% dry skim milk, and 0.1% Tween 20. I blot di nitrocellulosa sono stati incubati con gli anticorpi primari overnight a 4 °C, e sottoposti successivamente a 3 successivi lavaggi per 30 min. L’intensità delle bande è stata determinata tramite densitometria (Ultra Violet Products, Cambridge, England) ed espressa come unità arbitrarie (UA) normalizzate per l’espressione della β-tubulina. Immunoistochimica L’immunoistochimica è stata effettuata come precedentemente descritto utilizzando alla diluizione di 1:100 over-night, previo smascheramento termo-indotto, l’anticorpo monoclonale murino anti VEGF-A (Santa Cruz, clone C-1) e quello policlonale di coniglio anti VEGF-C (Zymed). Il grado dell’immunoreazione è stato valutato da due osservatori indipendenti, misurando l’estensione e l’intensità della colorazione immunoistochimica utilizzando un metodo semiquantitativo. La valutazione finale dell’immunoreattività è stata determinata sommando le valutazioni dell’estensione e dell’intensità come precedentemente descritto (Rahman A, 2001). L’intensità della colorazione è stata quantificata secondo una scala da 0 a 3 nella quale 0=assenza di colorazione, 1=colorazione debolmente positiva, 2=colorazione moderatamente positiva e 3=colorazione fortemente positiva. L’estensione della colorazione è stata quantificata secondo una scala da 0 a 4, nella quale 0=assenza di positività, 1=positività nell’1-25% di cellule, 2=positività nel 26-50%, 3=positività nel 51-75%, 4=positività nel 76-100%. E’ stato possibile valutare l’espressione immunoistochimica del VEGF-A e –C a livello del tumore, del tessuto adiacente al tumore e del tessuto a distanza dal tumore in 15 pazienti. Densità microvascolare La densità microvascolare è stata quantificata secondo il metodo precedentemente descritto, tramite colorazione immunoistochimica con anti CD34 (Dako, clone: QBEnd 10) alla diluizione di 1:50, a livello del tessuto di HCC e di quello cirrotico a distanza dalla lesione a livello dello stesso paziente e in tessuto epatico normale proveniente da donatori. VEGF-A, VEGF-C e alpha-fetoproteina sierici Prima del trapianto epatico le concentrzioni sieriche di VEGF-A e VEGF-C e alpha-fetoproteina sono state misurate a livello dei pazienti con o senza HCC nei quali era stata effettuata anche la quantificazione della concentrazione tessutale di VEGF-A e VEGF-C. Le concentrazioni sieriche di VEGF-A e VEGF-C sono state anche determinate in 8 controlli sani (età 48.4±9.9 anni media±DS; uomini/donne 4/4). Tutti i prelievi ematici sono stati centrifugati a 2000g per 15 minuti a 4°C e conservati a -80°C fino all’esecuzione del test. Le concentrazioni sieriche di VEGF-A (PierceBiotechnology, Inc Rockford IL), VEGF-C e alpha-fetoproteina (Zymed Laboratories, San Francisco CA) sono state misurate utilizzando kit disponibili in commercio, secondo le istruzioni del venditore. La densità ottica è stata determinata utilizzando un microtiter plate reader (ELISA-reader

30

multiscan bichromatic Labsystems Oy). Le concentrazioni sieriche di VEGF-A e VEGF-C sono state corrette per le variazioni nella conta piastrinica dividendo le concentrazioni di VEGF-A e VEGF-C (picogrammi/millilitri) per la conta piastrinica (x106/ml). Analisi statistica I risultati sono stati presentati come medie±deviazione standard. Le differenze tra i gruppi in caso di veriabili continue sono state valutate tramite il test t di student o il Kruskal-Wallis test seguito dove necessario dal Mann-Whitney U test. In caso di variabili categoriali si è utilizzato il chi-square test. Le correlazioni sono state valutate tramite il test di Spearman. Tutti i test sono stati effettuati a due code e considerati significativi a p<0.05.

RISULTATI

Espressione del VEGF-A in HCC, cirrosi e tessuto epatico normale L’espressione tessutale media del VEGF-A, valutata tramite western blot, nei 16 pazienti con HCC risultava significativamente maggiore (P<0.05) a livello della lesione rispetto al corrispondente tessuto cirrotico non tumorale a distanza (2.90±1.99 vs 1.85±1.18 unità arbitrarie; media±DS, rispettivamente) e al tessuto prelevato da donatori sani (1.49±0.39 unità arbitrarie; media±DS, rispettivamente). L’espressione tessutale media del VEGF-A non mostrava differenze significative nel tessuto cirrotico prelevato da pazienti con o senza HCC e da donatori e non differiva negli HCC moderatamente-scarsamente differenziati rispetto a quelli ben differenziati (3.30±2.32 vs 2.40±1.49 unità arbitrarie; media±DS, rispettivamente), così come non mostrava differenze a seconda dell’eziologia (HBV vs HCV), MELD, età e sesso (Fig. 19). La distribuzione dell’espressione del VEGF-A nell’HCC, nel tessuto cirrotico circostante alla lesione e a distanza è stata valutata tramite immunoistochimica. La positività immunoistochimica per il VEGF-A è stata osservata principalmente nel citoplasma degli epatociti e epatociti VEGF-A-positivi si trovavano sia a livello del tessuto neoplastico che del tessuto epatico adiacente e a distanza rispetto alla lesione neoplastica. VEGF-positivi risultavano anche i colangiociti e le cellule endoteliali. Il grado dell’immunoreazione era significativamente maggiore a livello della neoplasia e del tessuto epatico adiacente rispetto al tessuto epatico a distanza dal tumore (4.7±1.8, 4.7±1.7 and 2.8±2.6 rispettivamente; tessuto neoplastico vs tessuto epatico a distanza P< 0.05) (Fig.21). Espressione del VEGF-C in HCC, cirrosi e tessuto epatico normale L’espressione tessutale media del VEGF-C, valutata tramite western blot, nei 16 pazienti con HCC non presentava differenze a livello dell’HCC rispetto al corrispondente tessuto non tumorale a distanza (5.16±3.73 vs 5.55±4.09 unità arbitrarie; media±DS, rispettivamente) (Fig. 20). L’espressione tessutale media del VEGF-C nel tessuto epatico normale dei donatori (1.53±0.53 unità arbitrarie; media±DS) era significativamente minore rispetto all’HCC (P<0.001) e al tessuto cirrotico di pazienti con (P<0.05) e senza HCC (P<0.0001; 6.49±2.27 unità arbitrarie; media±DS) (Fig.20). L’espressione tessutale media del VEGF-C non mostrava differenze significative nel tessuto cirrotico prelevato da pazienti con o senza HCC e non differiva negli HCC moderatamente- scarsamente differenziati rispetto a quelli ben differenziati (4.23±3.67 vs

31

0

2

4

(n=18) (n=16)

a

VE

GF

-A/T

ubul

ina

Esp

ress

ion

e p

rote

ica

(U.A

.)

(n=16)

Tubulina

VEGF-A

Donatori cirrosi HCC cirrosi senza HCC con HCC

(n=7)0

2

4

(n=18) (n=16)

a

VE

GF

-A/T

ubul

ina

Esp

ress

ion

e p

rote

ica

(U.A

.)

(n=16)

Tubulina

VEGF-A

Donatori cirrosi HCC cirrosi senza HCC con HCC

(n=7)

6.36±3.71 unità arbitrarie; media±DS, rispettivamente), così come non mostrava differenze a seconda dell’eziologia (HBV vs HCV), MELD, età e sesso (Fig.20). La distribuzione dell’espressione del VEGF-C nell’HCC, nel tessuto cirrotico circostante alla lesione e a distanza è stata valutata tramite immunoistochimica. La positività immunoistochimica per il VEGF-C è stata osservata principalmente nel citoplasma degli epatociti e di cellule infiammatorie. Epatociti VEGF-C-positivi si trovavano sia a livello del tessuto neoplastico che del tessuto epatico adiacente e a distanza rispetto alla lesione neoplastica. Lievemente VEGF-C-positivi risultavano anche i colangiociti. Il grado dell’immunoreazione non mostrava differenze significative a livello della neoplasia, del tessuto epatico adiacente e del tessuto epatico a distanza dal tumore (5.1±1.4, 4.7±0.5 and 3.5±1.4 rispettivamente, P= ns) (Fig.21). Concentrazioni sieriche di VEGF-A e VEGF-C in pazienti cirrotici con o senza HCC e in controlli sani. Le concentrazioni sieriche medie del VEGF-A (452.7±305.9 vs 312.3±251.8 pg/ml; media±DS, rispettivamente) e del VEGF-C (3895.5±1774.4 vs 3866.9±1701.8 pg/ml; media±DS, rispettivamente), non differivano nei pazienti cirrotici con o senza HCC, neppure quando corrette per la conta piastrinica. I controlli sani mostravano una concentrazione sierica media del VEGF-A corretta per la conta piastrinica (2.36±0.88 pg/106 piastrine; media±DS) significativamente inferiore (P<0.05) rispetto ai pazienti cirrotici con e senza HCC. La concentrazione sierica media del VEGF-C nei controlli sani (3510.5±1473.7 pg/ml; media±DS) non differiva rispetto ai pazienti cirrotici con o senza HCC. I controlli sani mostravano una concentrazione sierica media del VEGF-C corretta per la conta piastrinica (14.78±5.39 pg/106 piastrine; media±DS) significativamente inferiore (P<0.001) rispetto ai pazienti cirrotici con e senza HCC.

Fig.19. L’espressione proteica di VEGF-A è maggiore nel tessuto di HCC rispetto al tessuto cirrotico a distanza dalla lesione (cirrosi con HCC), al tessuto cirrotico di pazienti non affetti da HCC e al tessuto epatico sano dei donatori. aP<0.05 vs cirrosi con HCC e vs donatori.

32

Fig.20. L’espressione proteica di VEGF-C non presenta differenze nel tessuto di HCC, nel tessuto cirrotico a distanza dalla lesione (cirrosi con HCC) e nel tessuto cirrotico di pazienti non affetti da HCC. E’ invece significativamente minore nel tessuto epatico sano dei donatori. aP<0.05, bP<0.001, cP<0.0001 vs donatori. Densità microvascolare in HCC, cirrosi e tessuto normale epatico Il valore medio della densità microvascolare nel tessuto HCC risultava significativamente maggiore (P< 0.05) rispetto al tessuto cirrotico prelevato a distanza dalla lesione. Il valore medio della densità microvascolare nel tessuto epatico sano ottenuto da donatori era significativamente inferiore (P<0.005) rispetto all’HCC e al tessuto cirrotico prelevato a distanza dalla lesione (Tab.4). La densità microvascolare era a livello degli HCC significativamente maggiore (P<0.05) nei moderatamente-scarsamente differenziati rispetto ai ben differenziati (411.6±59.3 vs 322.8±64.1 microvasi positivi/mm2; medie±DS, rispettivamente). Le strutture microvascolari CD34-positive erano eterogeneamente distribuite all’interno del tessuto HCC e in maniera più diffusa rispetto al tessuto cirrotico dove erano confinate in prossimità dei setti fibrosi (Fig.21). Correlazioni dei livelli sierici di VEGF-A, VEGF-C e alpha-fetoproteina con i parametri tessutali di angiogenesi. Le correlazioni sono state effettuate considerando l’intera popolazione di pazienti con HCC o dividendola in due sottogruppi a seconda del livello della concentrazione sierica di alpha-fetoproteina, utilizzando come cut-off il valore di 20 ng/ml, scelto sulla base delle linee guida dell’EASL. I pazienti con valori di alpha-fetoproteina superiori e inferiori a questa soglia non presentavano differenze per quanto concerneva l’età, il sesso, l’eziologia, il MELD score, il grading dell’HCC e il numero di noduli di HCC. Le concentrazioni sieriche di VEGF-A e VEGF-C divise per il numero di piastrine non correlavano con l’alpha-fetoproteina nè nella popolazione totale né all’interno dei due sottogruppi. Il

0

2

4

6

8

(n=18) (n=16)V

EG

F-C

/Tub

ulin

aE

spre

ssio

ne p

rote

ica

(U.A

.)(n=16)

Tubulina

VEGF-C

(n=8)

Donatori cirrosi HCC cirrosisenza HCC con HCC

abc

0

2

4

6

8

(n=18) (n=16)V

EG

F-C

/Tub

ulin

aE

spre

ssio

ne p

rote

ica

(U.A

.)(n=16)

Tubulina

VEGF-C

(n=8)

Donatori cirrosi HCC cirrosisenza HCC con HCC

abc

33

VEGF-A sierico diviso per il numero delle piastrine correlava positivamente con l’alpha-fetoproteina sierica considerando l’intera popolazione (r=0.732; P<0.01) e nei pazienti con valore di alpha-fetoproteina superiore a 20 ng/ml (r=0.881; P<0.01), ma non nei pazienti con alpha-fetoproteina inferiore a 20 ng/ml. L’espressione tessutale di VEGF-A nell’HCC valutata tramite western blot non correlava né con l’ alpha-fetoproteina né con il VEGF-A né con il VEGF-C (corretti per le piastrine) sierici considerando l’intera popolazione. Considerando invece solo i pazienti con alpha-fetoproteina superiore a 20 ng/ml il VEGF-A tessutale correlava positivamente sia con l’ alpha-fetoproteina (P< 0.01) che con il VEGF-A corretto per le piastrine (P< 0.001) (Fig.22). Analogamente la differenza tra l’espressione tessutale di VEGF-A a livello della lesione e a distanza correlava sia con l’ alpha-fetoproteina (P< 0.01) che con il VEGF-A corretto per le piastrine (P< 0.01) considerando solo i pazienti con alpha-fetoproteina superiore a 20 ng/ml (Fig.22). Né l’espressione tessutale di VEGF-C né la differenza dell’espressione tessutale tra HCC e fegato cirrotico a distanza correlavano con l’ alpha-fetoproteina o con il VEGF-C corretto per le piastrine, sia considerando l’intera popolazione che i sottogruppi di pazienti divisi a seconda dei livelli sierici di alpha-fetoproteina. L’espressione tessutale del VEGF-A e del VEGF-C nell’HCC, nel tessuto cirrotico a distanza e nel tessuto epatico normale non correlavano con la densità microvascolare.

Fig.21. L’espressione di VEGF-A è maggiore nell’HCC e nel tessuto cirrotico adiacente (A, HCC in basso a sinistra) rispetto alla cirrosi lontana (B). Il VEGF-C presenta un’ espressione simile a livello di HCC, tessuto cirrotico adiacente (C) e lontano (D). O.M. 40X. La positivià immunoistochimica per CD 34 mostra una densità microvascolare

A B

C D

E F

AA BB

CC DD

EE FF

34

maggiore nell’ epatocarcinoma (E) rispetto alla cirrosi (F). La capillarizzazione sinusoidale è presente a livello periferico e perisettale nella cirrosi, è invece diffusamente rappresentata nell’epatocarcinoma. O.M. 100X.

Tab.4. Densità microvascolare. a P<0.05 vs cirrosi a distanza dalla lesione; bP<0.005 vs fegato dei donatori.

Fig.22. Il VEGF-A tessutale correla positivamente con l’ alfa-fetoproteina (P< 0.01) nei pazienti con alfa-fetoproteina superiore a 20 ng/ml (A). La differenza tra l’espressione tessutale di VEGF-A a livello della lesione e a distanza correla con l’ alpha-fetoproteina (P< 0.01) nei pazienti con alfa-fetoproteina superiore a 20 ng/ml (B).

317.8±62.1b

Cirrosi a distanza

157.8±100.4 Fegato dei donatori

373.5±74.5a,b

HCC

Densità microvascolare (microvasi positivi/mm2)

R=0.857; P <0.01

0

200

400

600

800

0 2 4 6 8 10VEGF-A/tubulina (unità arbitrarie) [HCC]

Alfa

-feto

prot

eina

sie

rica

(ng/

ml) A R=0.905; P <0.01

0

200

400

600

800

-1 0 2 3 4VEGF-A/tubulina (unità abitrarie) [HCC-Cirrosi]

Alfa

-feto

prot

eina

sie

rica

(ng/

ml)

BR=0.857; P <0.01

0

200

400

600

800

0 2 4 6 8 10VEGF-A/tubulina (unità arbitrarie) [HCC]

Alfa

-feto

prot

eina

sie

rica

(ng/

ml) A R=0.905; P <0.01

0

200

400

600

800

-1 0 2 3 4VEGF-A/tubulina (unità abitrarie) [HCC-Cirrosi]

Alfa

-feto

prot

eina

sie

rica

(ng/

ml)

B

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DISCUSSIONE In condizioni normali le cellule stellate sono cellule quiescienti localizzate nello spazio di Disse in stretto rapporto con gli epatociti e le cellule endoteliali e che svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento dell’omeostasi della matrice extra-cellulare (Friedman SL, 1993; Geerts A, 2001). Il loro corpo cellulare si inserisce tra le porzioni apicali degli epatociti, rivolto verso il lume dello spazio di Disse e lunghi processi citoplasmatici abbracciano il lume sinusoidale rendendo possibili le interazioni tra le cellule stellate e le cellule circostanti. In condizioni patologiche come in caso di epatite cronica o cirrosi, le cellule stellate passano dal fenotipo quiesciente a quello attivato, caratterizzato da un numero inferiore di goccioline lipidiche nel citoplasma, un reticolo endoplasmatico più pronunciato e una morfologia più miofibroblasto-simile (Buniatian G, 1996). La co-espressione degli elementi del citoscheletro, come α-SMA e GFAP è finemente modulata a livello delle cellule stellate coinvolte nei meccanismi di rimaneggiamento tessutale (Niki 1996). Allo scopo di studiare l’espressione di diversi markers delle HSC in diverse fasi della progressione dell’epatite cronica abbiamo preso in considerazione tre diverse situazioni cliniche: recidiva di epatite cronica post-trapianto epatico, epatite cronica allo stadio pre-cirrotico e cirrosi. La recidiva di epatite cronica post-trapianto epatico rappresenta un valido modello delle fasi precoci di fibrosi (Guido M, 1997; Sakaida I, 1999) ed inoltre consente di conoscere con precisione il momento iniziale dell’infezione. Questo permette di correlare l’espressione immunoistochimica dei diversi markers di HSC con il tempo trascorso dalla re-infezione e con la velocità della progressione della fibrosi. L’espressione di α-SMA da parte delle cellule stellate, minima nei donatori, è risultata significativamente maggiore nei pazienti con epatite cronica HCV positiva, pur non mostrando differenze significative tra i gruppi considerati. In letteratura è controversa l’associazione tra le cellule stellate α-SMA positive e l’estensione della fibrosi dal momento che mentre alcuni studi non trovano correlazione tra la percentuale di HSC α-SMA positive e la gravità della fibrosi (Levy MT, 2002), altri riscontrano questa associazione (Carpino G, 2005; Martinelli ALC, 2004; Sakaida I, 1999). Diversi studi comunque sono concordi nell’individuare una diminuzione dell’attivazione delle HSC in seguito al miglioramento istologico riscontrato nei pazienti che rispondono alla terapia con interferone (Sakaida I, 1999; Guido M, 1996; Khan MA, 2001). Sulla base di questi dati è ragionevole dedurre che il differenziamento delle HSC in un fenotipo α-SMA–positivo non è sufficiente a determinare lo sviluppo della fibrosi. Infatti HSC α-SMA-positive si osservano in epatopatie non associate con lo sviluppo della fibrosi (Mathew J, 1994; Rubbia-Brandt L, 1997; Schmitt-Graff A, 1991). Inoltre nell’epatite cronica C, la maggior parte dei pazienti mostrano un significativo numero di HSC α-SMA-positive, ma solo una parte di loro sviluppa in seguito cirrosi (Schmitt-Graff A, 1991; Guido M, 1996). Negli ultimi anni sono stati individuati altri markers delle HSC che sembrano essere associati più strettamente alla presenza della fibrosi (Martinelli AL, 2004; Levy MT, 2002). In questo studio le HSC GFAP-positive sembrano essere in relazione con le fasi precoci della deposizione di tessuto fibroso. Infatti abbiamo riscontrato che la percentuale di HSC GFAP-positive, diversamente da quella di HSC α-SMA-positive, era maggiore nelle recidive post-trapianto di epatite C rispetto a epatiti croniche e cirrosi. Ad ulteriore

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conferma della precoce espressione di GFAP, il tempo medio trascorso dall’infezione era di 31 mesi nelle recidive, nelle quali si registrava una percentuale maggiore di HSC GFAP-positive, e di 102 mesi nelle epatiti croniche. Inoltre la percentuale di HSC GFAP-positive correlava inversamente con la percentuale di tessuto fibroso se si considerava l’intero gruppo dei pazienti. Le cellule stellate condividono diversi aspetti con gli astrociti come la contiguità con i capillari, la forma stellata (Wake K, 1980; Carpino F, 1981), contatti diretti con le fibre nervose (Feher E, 1992) e la capacità di rispondere ai danni tessutali (Blomhoff R, 1991). Il segno distintivo della gliosi reattiva nei danni che interessano il sistema nervoso centrale è rappresentato dalla caratteristica ipertrofia dei processi astrocitari con l’up-regolazione di GFAP e vimentina e la riespressione di nestina, tutte proteine coinvolte nella formazione della rete dei filamenti intermedi (Pekny M, 2005). GFAP gioca un ruolo cruciale nel processo dell’attivazione astrocitaria (Eliasson C, 1999) ed è presente soprattutto nei principali processi citoplasmatici e nel soma degli astrociti (Bushong EA 2002, 2004). Nei topi l’assenza dei filamenti intermedi astrocitari compromette la formazione della cicatrice gliale post-traumatica. (Pekny M, 1999). I filamenti intermedi sono strutture citoscheletrice dello spessore di 10 nm che formano una rete interconnessa all’interno del citoplasma cellulare. Sono costituiti da diverse proteine a seconda del tipo cellulare, dello stadio di sviluppo e in alcuni casi dello stadio funzionale di una data cellula (Fuchs e Cleveland, 1998). La funzione più conosciuta dei filamenti intermedi è quella di costituire una struttura di sostegno per mantenere l’integrità della cellula e del tessuto ed impartire una forza meccanica (Fuchs e Cleveland, 1998). Inoltre i filamenti intermedi hanno anche una funzione protettiva contro gli stress non meccanici e diminuiscono la suscettibilità all’apoptosi (Chen F, 2003). Nel fegato umano normale l’espressione di GFAP è limitata ad una popolazione ristretta di cellule stellate epatiche (Hautekeete ML, 1997). In questo studio le cellule stellate che esprimono GFAP aumentano diffusamente nelle recidive, mentre nelle epatiti croniche le cellule stellate che esprimono GFAP tendono a ridursi. Il differenziamento morfologico delle HSC da cellule quiescenti a cellule simil-fibroblastiche è stato ampiamente descritto (Schafer S, 1987) ed è risaputo che l’attivazione delle cellule stellate porta a modificazioni nella loro composizione antigenica (Schmitt-Graff A, 1991). Studi precedenti condotti negli animali hanno dimostrato che le cellule endoteliali contengono uno spettro molto ampio di proteine dei filamenti intermedi. Nello stato quiescente le cellule stellate esprimono desmina (Geerts A, 1991), GFAP (Niki T, 1996) e bassi livelli di vimentina (Niki T, 1996). In condizioni di attivazione l’espressione di GFAP diminuisce (Niki T, 1996), mentre i livelli di desmina e vimentina aumentano (Geerts A 1991; Niki T 1996). La diminuzione dell’espressione di GFAP negli stadi avanzati di fibrosi ha suggerito che GFAP potesse essere un marker delle cellule stellate quiescenti di roditore. Ma l’accumularsi di cellule stellate GFAP/desmina positive negli stadi precoci della fibrosi (Niki T, 1996), la proliferazione cellulare (Geerts A, 1991) e l’espressione di geni e proteine della matrice extracellulae (Mlani S, 1989; Nakatsukasa H, 1990, Ramadori G 1990) che sono segnali indicatori dell’attivazione delle cellule stellate suggeriscono che l’aumentata espressione di GFAP potrebbe essere in relazione alle loro modificazioni inziali. Dibattuto è se GFAP abbia nelle cellule stellate le stesse funzioni che ricopre negli astrociti, in relazione all’acquisizione e al mantenimento della forma della cellula (Buniatian G, 1996; Niki T, 1996). A ulteriore sostegno della precocità dell’espressione di GFAP a livello delle HSC abbiamo osservato che nei pazienti con recidiva di epatite C la percentuale delle HSC GFAP-positive, ma non di quelle α-SMA-positive, era maggiore quanto minore era il tempo

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trascorso dal trapianto. Il contemporaneo riscontro della correlazione positiva tra la percentuale di HSC GFAP-positive e la velocità di progressione della fibrosi inoltre suggerisce un significato predittivo dell’espressione di GFAP sulla evolutività della fibrosi. Recentemente sono stati effettuati diversi studi con lo scopo di identificare precocemente, tramite la valutazione dell’attivazione delle HSC mediante l’immunoreazione per α-SMA, i pazienti trapiantati destinati ad avere una recidiva di malattia più aggressiva. Russo e coll. (2005) hanno dimostrato che l’attivazione delle HSC determinata quattro mesi dopo il trapianto era associata con lo sviluppo di un grado avanzato di fibrosi entro due anni dal trapianto. Analogamente uno studio effettuato sempre in pazienti con recidiva di epatite C post-trapianto ha dimostrato che la precoce attivazione della HSC all’interno dei setti ma non delle HSC parenchimali era un indice di progressione della fibrosi (Gawrieh S, 2005). Anche in questo studio abbiamo osservato che la presenza precoce di HSC attivate nelle recidive correlava positivamente con la progressione della fibrosi. Inoltre l’immunopositività per GFAP ripetto a quella per α-SMA identificava un fenotipo più precoce di HSC, confermado il ruolo di GFAP come marker precoce di attivazione delle HSC anche nelle recidive. Infatti quanto più precocemente rispetto al trapianto insorgeva la recidiva, tanto più diffusa risultava la positività per GFAP. Interessante è il rapporto tra l’espressione di GFAP ed α-SMA. Infatti nel fegato umano le cellule stellate α-SMA positive, diversamente da quelle GFAP-positive, mostravano un comportamento di attivazione abbastanza omogeneo nei diversi gruppi di pazienti. Studi precedenti hanno dimostrato un’espressione reciproca di GFAP e α-SMA durante la trasformazione delle cellule stellate in coltura (Buniatian G, 1996). L’inizio dell’espressione di α-SMA e la simultanea perdita dell’immunoreattività per GFAP potrebbe essere un pre-requisito per la contrazione delle HSC in condizioni patologiche in vivo (Buniatian G, 1996). La diversa espressione dei due markers nella progressione dalla fibrosi alla cirrosi potrebbe suggerire un ruolo precoce di GFAP nelle cellule stellate in attivazione. Questo differente comportamento è probabilmente in relazione ad una associazione più stretta tra GFAP e le modificazioni cellulari morfologiche che precedono il fenotipo transdifferenziato α-SMA-positivo, dotato di proprietà contrattili e fibrogeniche. Le cellule stellate che esprimono GFAP nella cirrosi sono prevalentemente confinate alla periferia del lobulo o nodulo epatico, in contrasto con la distribuzione omogenea di quelle che esprimono α-SMA. Questo potrebbe indicare un ruolo di GFAP nelle aree di più intenso rimodellamento tessutale. Su queste basi si potrebbe postulare un ruolo regolatorio di GFAP nella fine modulazione dei processi citoscheletrici. Infatti la delezione genica del gene di GFAP nei topi non porta ad un accorciamento dei filamenti intermedi, mentre solo brevi fasci di filamenti si formano quando sono assenti sia vimentina che GFAP (Geerts A, 2001). Diversamente l’espressione di α-SMA, marker ben definito della differenziazione in senso miogenico, sembra essere associato con un fenotipo HSC definitivamente transdifferenziato. D’altra parte, le diverse caratteristiche temporali dell’espressione dei due markers potrebbero anche essere dovute all’esistenza di popolazioni differenti di HSC, diversamente rappresentate nelle varie fasi della fibrosi, in grado di esprimere diversamente α-SMA e GFAP. La presenza di diverse subpopolazioni di HSC è suggerita dall’eterogeneità dei marcatori immunoistochimici che si riscontrano a livello delle HSC nei fegati normali e patologici (Cassiman D, 2002; Ramadori G, 2004) Un altro risultato di questo studio riguarda il pattern di immunoreazione per GFAP che permette di discriminare tra tessuto epatico normale, cronico non-cirrotico e cirrotico. Nel fegato normale l’immunoreazione è lieve e confinata nella maggior parte dei casi all’area perinucleare. Nelle cellule stellate del tessuto epatico con recidiva e epatite cronica non cirrotica l’immunoreazione è intensa e si estende ai processi citoplasmatici, mentre nelle

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cirrosi l’espressione di GFAP sembra tornare a restringersi alla zona perinucleare. Osservazioni precedenti condotte nelle cellule stellate di ratto in coltura hanno mostrato che al sesto giorno di coltura la maggior parte delle cellule stellate era fortemente positiva per α –SMA ma solo debolmente per GFAP, esibendo il caratteristico pattern di colorazione per GFAP ristretto all’area perinucleare e alla periferia. (Buniatian G, 1996). Questo potrebbe suggerire una parziale regressione della componente dei fasci di filamenti intermedi rappresentata da GFAP, quando la morfologia cellulare è ormai stabilizzata, come nelle cirrosi. Il rapporto tra l’espressione di GFAP e il rimodellamento vascolare potrebbe essere in grado di precisare ulteriormente il significato di GFAP a livello epatico. Abbiamo osservato che la percentuale di HSC GFAP-positive correlava inversamente con la densità microvascolare determinata dalla positività vascolare per CD34. La capillarizzazione dei sinusoidi identificata dalla positività per CD34 è stata soprattutto osservata nell’HCC (Cui S, 1996; Ruck P, 1995). Tuttavia recenti studi hanno evidenziato la presenza di cellule endoteliali CD34-positive anche a livello delle epatopatie croniche nelle quali tendono a distribuirsi a livello sinusoidale in prossimità delle aree portali (Ohmori S, 2001). Con la progressione dell’epatopatia la CD34-positività delle cellule endoteliali diviene più intensa e si estende verso il centro del lobulo epatico (Ohmori S, 2001). In accordo con queste precedenti osservazioni abbiamo riscontrato un graduale incremento della densità microvascolare contemporaneo all’espansione della fibrosi. La neovascolarizzazione e il rimodellamento vascolare aumentano progressivamente in corso di fibrosi epatica come è stato riscontrato in studi condotti nell’uomo e in modelli animali (Onori P, 2000; Ohmori S, 2001; Corpechot C, 2002; Rosmorduc O, 1999). In questo studio nelle recidive le cellule endoteliali CD34-positive si individuavano soprattutto all’interno degli spazi portali espansi. Negli stessi campioni si riscontrava un’elevata percentuale di HSC GFAP-positive. Questa associazione suggerisce che l’attivazione precoce delle HSC a livello dell’interfaccia vascolo/parenchimale precede e accompagna le modificazioni angiogenetiche a livello dei sinusoidi. Nelle malattie croniche del fegato sperimentalmente indotte, le cellule endoteliali sinusoidali sono cronologicamente le prime cellule che vanno incontro a modificazioni patologiche (Nanji AA, 1996). E’ verosimile che le HSC in stretto contatto con le cellule endoteliali sinusoidali possano rispondere alle precoci modificazioni dell’endotelio regolando le proteine del citoscheletro come GFAP. Diverse linee di evidenza sottolineano il ruolo ricoperto dagli astrociti nel favorire la fomazione di giunzioni serrate endoteliali a livello del sistema nervoso centrale (Prat A, 2001). Inoltre l’espressione di GFAP è importante per il ripristino dopo danneggiamento della barriera emato-encefalica (Pekny M, 1998). Anche a livello epatico sono documentati i rapporti tra HSC e cellule endoteliali sinusoidali. E’ stato recentemente dimostrato in studi sperimentali che l’espressione di VEGF aumenta significativamente man mano che progredisce la fibrosi epatica e che il VEGF partecipa alla capillarizzazione sinusoidale (Corpechot C, 2002; Rosmorduc O, 1999; Torimura T, 1998). Inoltre durante l’attivazione, le HSC esprimono maggiormente il VEGF (Ishikawa K, 1999; Ankoma-Sey V, 2000). Le precoci modificazioni dei sinusoidi documentate nei modelli sperimentali di malattie epatiche croniche intervengono prima che le cellule sinusoidali endoteliali si capillarizzino ed esibiscano la positività per CD34 (Nanji AA, 1996). E’ in questa fase precoce, rappresentata in questo studio dal gruppo delle recidive, che le HSC cominciano ad attivarsi. La graduale acquisizione di aspetti miofibroblastici da parte delle HSC potrebbe consentire loro di istituire una barriera permeabile protettiva emato-tessutale in grado di coadiuvare la funzione delle cellule endoteliali (Buniatian GH, 2001). La transitoria iperespressione di GFAP potrebbe

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assicurare l’architettura citoscheletrica in grado di permettere alle HSC questo adattamento funzionale, analogamente a quello che succede a livello del sistema nervoso centrale nel rapporto tra astrociti attivati GFAP-positivi e barriera emato-encefalica. Il riscontro della maggiore espressione di GFAP nel gruppo delle cirrosi ad eziologia C rispetto a quelle ad eziologia B sembrerebbe ulteriormente confermare il legame di GFAP con il rimodellamento vascolare in accordo con i risultati di Mazzanti e coll. (1997) che riscontravano nelle epatiti croniche C una maggiore neoangiogenesi rispetto a quelle B. Anche le cellule endoteliali oltre alle cellule stellate sono in grado di esibire un fenotipo attivato (Carmeliet P, 2000). Sia l’alterazione dei sinusoidi pre-esistenti che l’angiogenesi, cioè lo sviluppo di nuovi vasi da quelli pre-esistenti, richiedono l’attivazione e la migrazione delle cellule endoteliali che per proliferare e migrare devono modificare la propria struttura citoscheletrica (Davis GE, 2002; Park YN, 1998). In questo studio le cellule endoteliali, soprattutto quelle localizzate nelle strutture vascolari dei setti in formazione o alla periferia dei noduli di rigenerazione mostrano una positività per GFAP. Precedenti studi non hanno riscontrato nelle cellule endoteliali l’espressione di GFAP a livello del fegato normale, con danno acuto o cronico (Neubauer K, 1996). Dal momento che i diversi tipi di filamenti intermedi sono caratterizzati da regioni altamente conservate nella loro sequenza, soprattutto nel caso di desmina, vimentina e GFAP (omologia 70-74%) (Neubauer K, 1996) non si può escludere una cross-reattività dell’anticorpo utilizzato anti GFAP. Comunque le cellule endoteliali sembrano in grado di modulare il loro pattern di espressione dei filamenti intermedi. Infatti in ratti trattati con CCl4 alcune cellule endoteliali sono positive per la nestina, una proteina dei filamenti intermedi espressa nelle cellule stellate attivate e negli astrociti (Niki T, 1999). Nel caso della nestina una cross-reattivatà con altre proteine dei filamenti intermedi è meno probabile dal momento che possiede molte meno analogie con la vicentina (Niki T, 1999). Quindi sulla base di queste osservazioni si può ipotizzare che le cellule endoteliali coinvolte in meccanismi angiogenetici possano modificare la propria espressione a livello dei filamenti intermedi, anche eventualmente esprimendo GFAP. Ulteriori studi, anche di biologia molecolare, sono necessari per confermare questa ipotesi. In conclusione in questa prima parte dello studio è stato dimostrato che GFAP è un marker più precoce di α-SMA, identificando una sottopopolazione di cellule stellate maggiormente associata con stadi iniziali di fibrosi nell’epatite cronica C. L’attivazione delle HSC GFAP-dipendente precede la deposizione di tessuto fibroso e mostra una correlazione inversa con la fibrosi e con il rimodellamento vascolare. L’espressione di GFAP da parte delle HSC potrebbe rappresentare uno dei fattori in grado di innescare l’angiogenesi epatica in corso di epatite cronica C, e un marker in grado di segnalare l’imminente processo fibrogenetico. Inoltre la percentuale delle HSC GFAP-positive correla con la progressione della fibrosi nelle recidive di epatite cronica post-trapianto suggerendo che il livello dell’espressione di GFAP nelle HSC in stato di precoce attivazione sia in relazione con la gravità della malattia. L’espressione di GFAP sembra quindi essere in relazione con l’acquisizione di proprietà contrattili e fibrogeniche da parte delle cellule stellate in corso di attivazione, delle quali potrebbe essere deputato a modulare i processi citoplasmatici. GFAP inoltre potrebbe essere implicato come a livello astrocitario nelle interazioni tra cellule stellate e vasi e la sua iperespressione indice precoce del rimodellamento vascolare che accompagna la fibrosi. Nella seconda parte dello studio inoltre è stata misurata l’espressione di VEGF-A attraverso il western blot a livello di HCC e nel tessuto cirrotico non tumorale a distanza dalla lesione all’interno dello stesso paziente sottoposto a trapianto di fegato. I risultati hanno mostrato che il VEGF-A è sempre espresso nell’HCC ed è meno espresso nel

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tessuto di HCC rispetto al tessuto cirrotico non tumorale corrispondente solo nel 12% dei casi, incoraggiando l’uso del trattamento anti VEGF-A anche negli HCC in stadio non avanzato. Infatti sebbene il trattamento con anti VEGF-A è stato già utilizzato in studi di fase II negli HCC avanzati con risultati incoraggianti (Wu H, 2004; Yoysungnoen P, 2006; Zhu AX, 2006) report preliminari ottenuti in HCC resecati suggeriscono di limitare il numero di pazienti con HCC non avanzato teoricamente elegibili ad un trattamento anti VEGF-A, sia perché con l’immunoistochimica vengono descritte percentuali variabili di HCC VEGF-A negativi (El-Assal ON, 1998; Yamaguchi R, 1998; An FQ, 2000; Ng IOL, 2001; von Marschall Z, 2001) sia perché in pazienti sottoposti a trapianto una buona parte è stata descritta sempre all’immunoistochimica con un espressione di VEGF-A a livello della lesione inferiore rispetto al fegato cirrotico circostante (El-Assal ON, 1998; Medina J, 2005). Dal momento che la terapia con anti VEGF-A potrebbe inibire la rigenerazione del fegato cirrotico, non sarebbe raccomandabile in HCC con un’espressione di VEGF-A minore a livello della lesione rispetto al restante tessuto cirrotico. La frequenza maggiore descritta in parte della letteratura di minore espressione di VEGF-A nella lesione rispetto alla cirrosi circostante può essere imputata, rispetto a questo studio nel quale il tessuto non tumorale è stato prelevato a distanza, ad una produzione di VEGF-A peritumorale secondaria alla compressione locale e allo stimolo ipossico indotti dalla crescita tumorale. I dati immunoistochimici sostengono questa ipotesi e confermano i risultati ottenuti tramite Western blot, dal momento che l’espressione immunoistochimica del VEGF-A diversamente da quella del VEGF-C risulta maggiore nel tessuto neoplastico rispetto al tessuto epatico prelevato a distanza rispetto alla neoplasia. Inoltre i dati immunoistochimici hanno mostrato che il tessuto cirrotico adiacente alla lesione neoplastica partecipa in misura importante alla produzione del VEGF-A, mostrando un’espressione immunoistochimica del VEGF-A simile alla neoplasia. In questo studio è stata pure trovata un’espressione di VEGF-A a livello del tessuto epatico proveniente da donatori significativamente inferiore rispetto all’HCC. Tuttavia in contrasto con altri studi l’espressione del VEGF-A nel fegato dei donatori non variava rispetto al fegato cirrotico di pazienti con o senza HCC. Questo potrebbe spiegarsi con un’espressione sopra-fisiologica del VEGF-A epatico nei donatori, a causa della compromessa situazione clinica generale e del massiccio trattamento farmacologico a cui sono stati sottoposti. Ad ulteriore conferma della specificità del VEGF-A per quanto riguarda le implicazioni terapeutiche nell’HCC abbiamo trovato che l’espressione del VEGF-C era maggiore nel tessuto tumorale rispetto al fegato cirrotico non tumorale solo nella metà dei casi. Un altro risultato rilevante ai fini clinici di tale studio è stato che in pazienti con livelli di alpha-fetoproteina sierica sopra il range di normalità, le concentrazioni sieriche di alpha-fetoproteina e di VEGF-A (corretta per il numero di piastrine) correlavano positivamente con la quantità di VEGF-A tessutale a livello dell’HCC e con la differenza tra l’espressione a livello del tessuto HCC e il tessuto cirrotico a distanza. Questi risultati suggeriscono che l’incremento delle concentrazioni sieriche di alpha-fetoproteina possa essere utilizzato come indice dell’espressione tessutale del VEGF-A fornendo un aiuto nella stratificazione dei pazienti in studi tesi a confrontare diversi trattamenti anti VEGF-A. Inoltre l’esistenza di una correlazione reciproca tra l’alpha-fetoproteina sierica e il VEGF-A sierico, corretto per le piastrine e tessutale, forniscono una spiegazione patofisiologica per i risultati di precedenti studi sul valore prognostico sia dell’alpha-fetoproteina che del VEGF-A sierici (Görög D, 2005; Pompili M, 2001). Abbiamo trovato che la densità microvascolare valutata tramite la positività immunoistichimica al CD34 aumentava progressivamente dai donatori alla cirrosi e all’HCC. Inoltre abbiamo rilevato che la positività CD34 era distribuita diffusamente a

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livello dell’HCC, confinata ad i setti ed al tessuto peri-settale nella cirrosi e limitata ai tratti portali nei donatori. Dal momento che le cellule endoteliali CD34 positive sono espressione del progressivo rimodellamento vascolare (Cui S, 1996) questi risultati non sono in contrasto con nostre precedenti osservazioni morfometriche di un ridotto rapporto sinusoido-epatocitario nelle cirrosi sperimentali rispetto al fegato normale (Onori P, 2000). Negli HCC moderatamente-scarsamente differenziati rispetto a quelli ben differenziati si riscontrava una densità microvascolare significativamente maggiore mentre non differivano per il contenuto tissutale di VEGF-A e VEGF-C. Quiesti risultati, e la mancanza di correlazione tra la densità microvascolare e il VEGF-A e VEGF-C tessutali e sierici suggeriscono che l’angiogenesi e la sua architettura spaziale siano regolate da diversi fattori. Inoltre, questo concetto è in accordo con il fatto che la densità microvascolare può non essere predittiva della risposta del tumore al trattamento anti-angiogenetico (Hlatky L, 2002). Inoltre, comparando l’espressione tessutale del VEGF-A a livello dell’HCC con quella a livello del tessuto cirrotico tumorale corrispondente prelevato a distanza dalla lesione abbiamo dimostrato che la maggior parte degli HCC non avanzati hanno una espressione del VEGF-A maggiore rispetto alla cirrosi, incoraggiando l’uso del trattamento anti-VEGF-A anche in questi pazienti. Inoltre, l’aumento delle concentrazioni sierica di alpha feto proteina può essere utilizzato come indice dell’espressione tessutale del VEGF-A aiutando a stratificare i pazienti per effettuare studi tesi a confrontare differenti trattamenti anti VEGF-A.

CONCLUSIONE L’assetto vascolare del fegato in grado di assicurare la normale funzione amficrina e metabolica dell’organo è di cruciale importanza anche nella determinazione delle alterazioni patologiche che insorgono nell’organo sia su base fibrotica che neoplastica. Lo studio della fibrogenesi, soprattutto delle sue fasi precoci non può prescindere dall’approfondimento delle relazioni che intercorrono tra questo fenomeno e quelli concomitanti di angiogenesi e rimodellamento vascolare. In particolare le HSC per la posizione strategica che occupano nello spazio di Disse rappresentano i registi naturali di questi fenomeni tra loro interconnessi e l’espressione di markers precoci di attivaione delle HSC, come GFAP, è ragionevole che abbia un ruolo in questa associazione. Ulteriori studi sono necessari sulla base di questi dati per precisare il ruolo prognostico di GFAP nella storia naturale dell’epatite cronica e in particolare per valutare il suo valore predittivo sull’evolutività della fibrosi in corso di recidiva post-trapianto quando è particolarmente importante individuare precocemente i pazienti a rischio maggiore di progressione della fibrosi. Le alterazioni vascolari sono allo stesso modo importanti nel determinare l’insorgenza di complicanze tardive della cirrosi epatica quale lo sviluppo di HCC. E’ soprattutto sull’espressione di fattori di crescita vascolare come il VEGF che si è concentrata ultimamente l’attenzione, motivata dall’introduzione di nuovi presidi terapeutici in grado di intervenire proprio nell’antagonismo dei meccanismi alla base dell’azione del VEGF. I dati di questo studio permettono di postulare un gradiente di espressione tessutale del VEGF-A dalla lesione neoplastica, dove è maggiormente espresso, alla cirrosi a distanza dove la sua espressione si attesta su valori inferiori. Inoltre la determinazione sierica dell’alfa-fetoproteina, offrendo un’indicazione indiretta del livello tessutale del VEGF potrebbe essere utile nella stratificazione dei pazienti con HCC da avviare a eventuali trattamenti sperimentali basati sull’antagonizzazione dei meccanismi angiogenetici.

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