L.S. in Scienze e tecnologie alimentariAnno Accademico 2008/2009

Corso integrato: Controllo delle modificazioni chimiche negli

alimenti (7 CFU)Modulo di:

Chimica analitica strumentale (4 CFU)Giorgio Bonaga

CROMATOGRAFIA LIQUIDA (LC)

(CAS-4c)Giorgio Bonaga

Giorgio Bonaga

RICHIAMO DI CHIMICAAUTODISSOCIAZIONE DELL’ACQUA

H3O+ -OH

?H2O H2O

Nell’acqua pura è molto piccola la percentuale di molecole dissociate in ioni ossonio e ioni ossidrile, secondo l’equilibrio:

H2O + H2O H3O+ + -OH

A 25°C, la costante di equilibrio è espressa dalla:

Kdis = = 1,8 . 10-16

Il valore della costante di equilibrio conferma che l’equilibrio è decisamente spostato verso sinistra, tanto che il termine relativo alla concentrazione dell’acqua all’equilibrio ([H2O] eq), - pari alla concentrazione iniziale dell’acqua ([H2O] iniz) meno la frazione x di molecole d’acqua che si dissociano ([H2O] iniz – x) - in realtà si può equiparare alla concentrazione iniziale dell’acqua ([H2O] eq = [H2O] iniz), perché l’approssimazione è ininfluente.

Tenendo conto che la concentrazione iniziale di 1 litro di acqua pura è, a temperatura costante, una costante:

[H2O] iniz = = = = 55,55 mol/litro

[H3O+] . [-OH][H2O] iniz

numero molivolume

peso acquamol wt.1 litro

1000 g181 l

Giorgio Bonaga

La Kdis può essere espressa da una nuova costante, detta prodotto ionico dell’acqua:

KW = = Kdis = 1,8 . 10-16 . 55,55 = 10-

14

In considerazione del fatto che da ogni molecola d’acqua dissociata si produce uno ione ossonio e uno ione ossidrile, è ovvio che la concentrazione di queste due specie ioniche è la medesima:

Si può scrivere che: = KW = 10-7 grammo-ioni/l

A 25°C, in un litro d’acqua pura (volume costante) sono presenti 10-7 (1/10.000.000) grammo-ioni (grammo-moli) ossonio e 10-7 (1/10.000.000) grammo-ioni (grammo-moli) ossidrile• soluzione neutra

• soluzione acida

• soluzione basica

Essendo una reazione endotermica la dissociazione dell’acqua - nel rispetto del principio di Le Chatelier - aumenta all’aumentare della temperatura e pertanto la neutralità, a temperature superiori a 25°C, si raggiunge con concentrazioni degli ioni ossonio e ossidrile leggermente superiori a 10-7 grammo-moli/litro.

. [H2O]iniz

[H3O+] = [-OH]

[H3O+] = [-OH]

[H3O+] > [-OH]

[H3O+] < [-OH]

[H3O+] = [-OH]

[H3O+] . [-OH]

Giorgio Bonaga

pH e pOH(pH = pondus hydrogenii = potenziale dell’idrogeno)(pOH = pondus oxidrilii = potenziale dell’ossidrile)

L’ordine di grandezza estremamente piccolo delle concentrazioni degli ioni ossonio ed ossidrile suggerisce l’introduzione di un operatore matematico che consenta una percezione immediata del carattere neutro, acido e basico delle soluzioni ed anche un calcolo più rapido nelle applicazioni quantitative di questi concetti. Questo operatore è il logaritmo negativo in base dieci (- log) che, come tutti i logaritmi, esprime “l’esponente da dare alla base per ottenere il numero”. Concettualmente l’introduzione del logaritmo capovolge l’obiettivo del calcolo matematico delle concentrazioni delle soluzioni.Infatti, se la simbologia [H3O+] = 10-6 indica che sono presento 10-6 grammo-ioni H3O+ in 1 litro di soluzione, il –log [H3O+] = pH = - log 10-6 = 6 individua invece l’esponente che bisogna dare alla base 10 per ottenere in quanti litri di soluzione è presente 1 grammo-ione H3O+, ovvero 106 litri.Il pH, pertanto, non definisce la concentrazione degli ioni ossonio della soluzione, ma invece la diluizione di una soluzione che contiene 1 grammo-ione di H3O+.Il discorso è del tutto analogo per il pOH. Giorgio Bonaga

Il cologaritmo in base dieci (-log) converte la concentrazione (volume costante e soluto variabile) in diluizione (soluto costante e volume variabile), ovvero esprime in quanti litri (diluizione) di acqua pura è presente 1 grammo-ione ossonio (o ossidrile) anziché quanti grammo-ioni di ossonio (o di ossidrile) sono presenti in 1 litro d’acqua pura (concentrazione) .

1/10.000.000 (10-7) grammo-ioni H3O+ in 100 litri d’acqua pura(CONCENTRAZIONE)

- log 10-7

Giorgio Bonaga

100 grammo-ione H3O+ in 10.000.000 (107) litri d’acqua

pura(DILUIZIONE)

Giorgio Bonaga

100

107

106

105

104

103

102

101

Giorgio Bonaga

Dal momento che nell’acqua pura

[H3O+] = [-OH] = 10-7

è intuitivo che nell’acqua pura:

pH = pOH = 7

ed anche che: pH + pOH = 14 da cui: pOH = 14 – pH e pH = 14 - pOH

Dal concetto stesso di pH si può dedurre che esso varia nell’intervallo 0-14 per soluzioni 1N, ma anche che il pH può assumere valori inferiori a 0 e superiori a 14 in soluzioni di concentrazione > 1N

ESEMPIOQual è il pH di una soluzione 10 N di HCl ?Essendo l’HCl un acido forte completamente dissociato, la N della soluzione fornisce direttamente la concentrazione di ioni ossonio:

[H3O+] = 10 = 101

pH = - log 101 = -1(è presente un grammo-ione H3O+ in 10-1 litro = 1/10 litro = 100 ml)

Giorgio Bonaga

[H3O+] pH [-OH] pOH10-15 15 101 -110-14 14 100 010-13 13 10-1 110-12 12 10-2 210-11 11 10-3 310-10 10 10-4 410-9 9 10-5 510-8 8 10-6 610-7 7 10-7 710-6 6 10-8 810-5 5 10-9 910-4 4 10-10 1010-3 3 10-11 1110-2 2 10-12 1210-1 1 10-13 13100 0 10-14 14101 -1 10-15 15

pka e pkbPer il calcolo del pH di soluzioni di acidi e basi deboli non è sufficiente conoscere la loro concentrazione iniziale, in quanto non sono completamente dissociati in soluzione acquosa. Per determinare quale concentrazione assumeranno gli ioni H3O+ (o -OH) è quindi necessario conoscere anche la loro costante di dissociazione.

1) Per un generico acido monoprotico HA, l'equilibrio di dissociazione è:

HA + H2O H3O+ + A-

La costante di equilibrio, detta costante di dissociazione acida (o kappa acida), è:

ka =

Analogamente al pH, anche la costante di dissociazione acida può essere convertita nella diluizione di ioni ossonio in soluzione, utilizzando il logaritmo negativo in base 10 della ka:

pka = – log ka

Più elevato è il valore del pka maggiore è la diluizione degli ioni ossonio, ovvero più elevato è il pka minore è la forza dell’acido.

Giorgio Bonaga

[H3O+] . [A-] [HA]

Per gli acidi deboli poliprotici ci sono tante costanti di dissociazione quanti sono gli atomi di idrogeno dissociabili: costante di prima dissociazione (kaI), costante di seconda dissociazione (kaII) , ecc., dalle quali si possono calcolare le corrispondenti pkaI, pkaII, ecc.

H2SO3 + H2O H3O+ + HSO3- kaI = = 1,54 . 10-2

HSO3

- + H2O H3O+ + SO3-- kaII =

= 1,02 . 10-7

Naturalmente l'acido cede più facilmente il primo protone H+, mentre il secondo protone H+, che deve staccarsi da uno ione negativo, è trattenuto con maggiore forza. Il primo equilibrio di dissociazione è quindi più spostato verso destra del secondo. È questo un comportamento generale: tutti gli acidi deboli poliprotici mostrano valori decrescenti delle ka successive alla prima e pertanto anche valori crescenti dei pka.

Giorgio Bonaga

[H3O+] . [HSO3-] [H2SO3]

[H3O+] . [SO3--] [HSO3-]

2) Per una generica base monossidrilica BOH, l'equilibrio di dissociazione è:

BOH B+ + - OH

La costante di equilibrio, detta costante di dissociazione basica (o kappa basica), è:

kb =

Anche la costante di dissociazione basica può essere convertita nella diluizione di ioni ossidrile in soluzione, utilizzando il logaritmo negativo in base 10 della kb:

pkb = – log kbPiù elevato è il valore del pkb maggiore è la diluizione degli ioni ossidrile, ovvero più elevato è il pkb minore è la forza della base.

Giorgio Bonaga

[B+] . [-OH] [BOH]

Per le basi deboli poliossidriliche ci sono tante costanti di dissociazione quanti sono gli ossidrili dissociabili: costante di prima dissociazione (kbI), costante di seconda dissociazione (kbII) , ecc., dalle quali si possono calcolare le corrispondenti pkbI, pkbII, ecc. Naturalmente la base cede più facilmente il primo ossidrile -OH, mentre il secondo ossidrile -OH, che deve staccarsi da uno ione positivo, è trattenuto con maggiore forza. È questo un comportamento generale: tutti le basi deboli poliossidriliche mostrano valori decrescenti delle kb successive alla prima e pertanto anche valori crescenti dei pkb.

C) CROMATOGRAFIA IONICA1) CROMATOGRAFIA DI SCAMBIO IONICO

(Ion Exchange Chromatography = IEC)

1. GENERALITA’È idonea alla separazione di composti ionici o ionizzabili (acidi e basi organiche) che possono interagire con gruppi ionici.FASE STAZIONARIA: polimeri o silice funzionalizzata a cui sono legati gruppi carichi: anioni sulfonil- (-SO3

-) o carbossil- (–COO-) come scambiatori di cationi; cationi dialchilammino- (-NHR2

+) o trialchilammino- (-NR3

+) come scambiatori di anioni.FASE MOBILE: contiene un controione di carica opposta al gruppo ionico della superficie, in uno stato di equilibrio per effetto della formazione di una coppia ionica. Lo scambio dipende dal pH della fase mobile, dalla forza ionica (selettività) degli ioni fissati sulla fase stazionaria e dalla forza ionica dello ione della fase mobile che con essi si scambia, dall’attività (concentrazione) dello ione della fase mobile, dalla temperatura.

Giorgio Bonaga

SCAMBIATORE CATIONICO: anioni sulfonil-

n

n

-O

O

CH2 CH

SO3

CH

--

-CH

O3SCH2 CH2 CH

SO3

CHCH2CH2CH

S O

CH

SO3

-

H+

Na+ Rb+

K+ Li+

Giorgio Bonaga

fase stazionariasilice scambiatrice

(anionica)

fase mobile(ionica)

CROMATOGRAFIA LIQUIDA DI SCAMBIO IONICOScambio cationico

+

+Na

+K

Giorgio Bonaga

Si

Si

Si

O

OS O-

O

OS O-

O

OS O-

+Cs

+Cs

SCAMBIATORE ANIONICO: cationi trimetilammino-

n

CH CH2 CH2

CH2CH

CH2CH

CHCH2CH2CH

N

CH

N

CH CH2

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

n

+

+

HO-

Cl-

Giorgio Bonaga

fase mobile(ionica)

fase stazionariasilice scambiatrice

(cationica)

CROMATOGRAFIA LIQUIDA DI SCAMBIO IONICOScambio anionico

+

-OH

-CN

-Cl

-CN

Giorgio Bonaga

Si

Si

Si

R

RN+ R

R

RN+ R

R

RN+ R

EQUILIBRI IONICI NELLA IEC

X+(sol) + Y+ -O3S-FS X+ -O3S-FS + Y+

(sol)

Kd = = k’

[X+ -O3S-FS][Y+(sol)]

[X+(sol)] [Y+ -O3S-FS]

VM

VS

X-(sol) + Y- +NR3-FS X- +NR3-FS + Y-

(sol)

Kd = = k’

[X- +NR3-FS] [Y-(sol)]

[X-(sol)] [Y- +NR3-FS]

VM

VS

scambio anionico

scambio cationico

La costante di equilibrio di distribuzione Kd (o coefficiente di distribuzione) determina il valore del fattore di capacità k’ di uno ione e quindi il suo tR. Giorgio Bonaga

ORDINE DI SELETTIVITA’La Kd è condizionata dal tipo di scambiatore e dall’attitudine dei due ioni a scambiarsi. Per un particolare scambiatore entrano in gioco due fattori:1. lo ione che viene fissato2. il controione che viene spostato

L’attitudine dei cationi e degli anioni ad essere fissati sui gruppi carichi della fase stazionaria è direttamente proporzionale al valore della loro Kd . Per i cationi e gli anioni si può indicare il rispettivo ordini di selettività:

scambio cationico: Ba++>Ca++>Ni++>Cu++>Mg+

+>Ag+>Rb+>Cs+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+

E’ facile comprendere che Na+ sposta Li+ dalla fase stazionaria, ma non viceversa. O meglio, affinchè Li+ sposti Na+ in modo significativo occorre aumentare l’attività (cioè la concentrazione ionica) di Li+ nella soluzione, in modo che l’equilibrio, per mantenere costante il valore della Kd, si sposti verso destra.

scambio anionico: HSO4->ClO3

->NO3->ClO2

->ClO->Br->CN->HSO3->NO2

->Cl->HCO3->

HCOO->RCOO->HO->F-

Giorgio Bonaga

I fattori che intervengono nello scambio ionico sono:

1. la posizione nell’ordine di selettività dello ione da fissare nella fase stazionaria;

2. la posizione nell’ordine di selettività degli ioni da spostare nella fase mobile;

3. le attività (concentrazioni ioniche) dello ione da fissare e degli ioni da spostare;

4. lo ione della fase mobile deve occupare una posizione nell’ordine di selettività non troppo lontano da quelle degli ioni da spostare.

Dopo aver fissato sullo scambiatore Na+ e K+ si può eluire con una soluzione di Li+Cl- ad opportuna concentrazione. Avviene lo scambio ionico e i due ioni da separare eluiscono con tR differenti: tRK+ > tRNa+ (in base alla loro posizione nella scala di selettività).

Giorgio Bonaga

Dopo aver fissato sullo scambiatore Ni++ e Ba++, l’eluizione con una soluzione di Li+Cl- non riuscirebbe a separare i due ioni, perché sono troppo lontani da Li+ nella scala della selettività (bisognerebbe eluire con un grande volume di fase mobile e per un tempo lungo). In questo caso si deve usare una fase mobile dotata di maggiore capacità eluente, ad esempio MgCl2.

2. FASE STAZIONARIAVi sono vari tipi di fasi stazionarie:a) POLIMERISono resine ottenute da copolimeri reticolati di stirene-divinilbenzene (8%) sulle quali vengono fissati i gruppi ionogeni positivi e negativi. La reticolazione ha lo scopo di rendere il polimero insolubile nei solventi e di conferirgli una stabilità strutturale alle pressioni di esercizio della colonna, in modo da non restringere troppo la dimensione dei pori. Il diametro delle particelle non deve essere superiore a 10 mm per ottimizzare il diametro dei pori.

b) SILICEViene utilizzata silice porosa e silice pellicolare.b1) Silice porosaCostituita da particelle sferiche o irregolari, viene funzionalizzata per silanizzazione allo scopo di fissare le catene ionogene sui gruppi silanolici e sulla superficie dei pori.

-CH2-CH2-COO - carbossietil- (debolmente acido) -CH2-CH2-SO3

- sulfoniletil- (fortemente acido)

Giorgio Bonaga

scambiocationico

-CH2-CH2-NH3 + amminoetil- (debolmente basico)-CH2-CH2-N(CH3)3

- trimetilamminoetil- (fortemente basico)

Giorgio Bonaga

scambioanionico

b2) Silice pellicolareCostituita da particelle sferiche più grandi, viene funzionalizzata solo sulla superficie esterna allo scopo di fissare le catene ionogene soltanto sui gruppi silanolici.

PROPRIETA’ SILICEPOROSA

SILICE PELLICOLARE

RESINAS-DVB

diametro (mm) 5-10 30-40 7-10capacita di scambio (meq/g) 0,5-2,0 0,01-0,1 3-5

rigidità strutturale molto buona eccellente scarsa

forma delle particelle sferica o irregolare sferica sferica

pressione di esercizio molto alta bassa altaefficienza alta modesta bassatecnica di impaccamento slurry a secco slurryintervallo di pH 2-8 2-8 0-14velocità di rigenerazione media alta bassa

La silice porosa è il materiale che consente le migliori separazioni perché riassume una serie di proprietà idonee a questo tipo di cromatografia:• ha una buona capacità di scambio;• è resistente alle elevate pressioni di esercizio;• ha elevata efficienza;• ha una buona capacità di rigenerazione;• ha però un limitato intervallo di pH di esercizio (2-8);• ha anche un costo elevato, sebbene inferiore a quello dei

polimeri.

In ogni caso la porosità ideale è quella che non ritarda troppo lo scambio tra la fase stazionaria e la fase mobile all’interno dei pori, porosità che richiede particelle con un diametro non superiore a 10 mm. poro piccolo poro grande +

d = 10 mm +

+

+

+

3. FASE MOBILELe principali caratteristiche della fase mobile sono:

a) EFFETTO TAMPONELe specie ioniche che stanno alla base dello scambio ionico possono derivare da elettroliti forti (sostanze inorganiche) e da elettroliti deboli (sostanze organiche). L’acido acetico e l’acido formico, ad esempio, possono essere dissociati o no in funzione del pH.Proprio per garantire che i soluti siano nella forma ionica, la fase mobile deve contenere un componente con capacità tamponante. Naturalmente per lo scambio anionico la fase mobile deve avere valori elevati di pH, mentre per lo scambio cationico deve avere valori sufficientemente bassi di pH.In pratica, la fase mobile deve avere un pH di almeno una unità superiore al pka del soluto nello scambio anionico e di almeno una unità inferiore al pka del soluto nello scambio cationico.

ESEMPIOacido acetico: pka = 4,75 la fase mobile deve avere pH = 5,75ione ammonio: pka = 9,0 la fase mobile deve avere pH = 8,0

Giorgio Bonaga

Si immagini di dover separare il sistema CH3COOH/CH3COO- (pka=4,75) e HCOOH/HCOO- (pka=3,5) con uno scambiatore anionico. a 4,75 < pH > 3,5 l’acido formico si dissocia e lo ione formiato

viene trattenuto, mentre l’acido acetico, non dissociato, eluisce.

a pH > 7,0 entrambi gli acidi sono dissociati e vengono trattenuti in modo differente dalla fase stazionaria (l’acido formico è più trattenuto, in base alla scala di selettività) .

• l’aumento di pH della fase mobile fa aumentare la dissociazione dei soluti nello scambio anionico, pertanto aumentano i loro tempi di ritenzione; la diminuzione di pH della fase mobile produce l’effetto contrario

• la diminuzione di pH della fase mobile fa aumentare la dissociazione dei soluti nello scambio cationico, pertanto aumentano i loro tempi di ritenzione; l’aumento di pH della fase mobile produce l’effetto contrario

I tempi di ritenzione dei soluti sono inversamente proporzionali alla concentrazione della soluzione tampone perché se è vero che i soluti del tampone mantengono costante il pH della fase mobile, è anche vero che essi stessi sono degli ioni che entrano in competizione con i soluti nello scambio ionico. Nello scambio anionico è la concentrazione dell’anione del tampone ad essere competitivo, nello scambio cationico è competitivo il catione del tampone.

Giorgio Bonaga

Quando il pH della fase mobile è minore di 2 o maggiore di 8, la silice non è più utilizzabile e bisogna ricorrere a fasi stazionarie costituite da polimeri. Il pH della fase mobile incide anche sulla scelta delle catene ionogene: mentre i gruppi sulfonile (-SO3

-) possono dare scambio cationico anche a pH nettamente acido perché hanno scarsa attitudine a protonarsi, i gruppi carbossile (-COO-) danno scambio cationico soltanto a pH neutro o basico, proprio per la loro facilità a protonarsi.

Giorgio Bonaga

TAMPONE pka pH fosfato pka(I)

pka(II)pka(III)

2,17,2

12,3

1,1 – 3,16,2 – 8,2

11,3 – 13,3

citrato pka(I)pka(II)pka(III)

3,14,75,4

3,1 – 4,13,7 – 5,74,4 – 6,4

formiato 3,8 2,8 – 4,8acetato 4,8 3,8 – 5,8tris(idrossimetil)-amminometano 8,3 7,3 – 9,3

borato 9,2 8,2 – 10,2

dietilammina 10,5 9,5 – 11,5

Giorgio Bonaga

CLASSI SEPARABILI PER IECCLASSE pka

ammidi 0-1pirroli 0,3solfossidi alifatici 1,5tiazoli 1-3ammine aromatiche 4-7amminoacidi (-COOH) 2-4amminoacidi (-NH2) 6-12acidi carbossilici 4-5tioli aromatici 6,5tioli alchilici 10,5fenoli 10-12ammine alifatiche 9-11carbazoli 12

Giorgio Bonaga

pirroloammide tiazolosolfossido alifatico

N

SH

++NH H

R CO

NH3+

+R S RO

O

H

+-

NH3+

CCOOH

H NH3+

RR C

O

OH

H+

SH

R SH

OH+RN

R

H

H

NH H+

ammina aromatica amminoacido acido carbossilico tiolo aromatico

tiolo alifatico fenolo ammina alifatica carbazolo

b) EFFETTO DELLA CONCENTRAZIONE SALINAPer modificare i tR dei soluti, senza modificare il pH della fase mobile, si può aggiungere un sale (es.: NaNO3). La concentrazione di questo sale, per effetto dell’azione competitiva degli ioni di cui è formato sullo scambio ionico, è un’altra variabile che agisce sui tR dei soluti.• l’aumento della concentrazione salina, a parità di pH, determina

la diminuzione della capacità della fase stazionaria di trattenere i soluti, pertanto si ha una riduzione dei loro tR;

• la diminuzione della concentrazione salina, a parità di pH, determina un aumento della capacità della fase stazionaria di trattenere i soluti, pertanto si ha una aumento dei loro tR.

Giorgio BonagaNaNO3 (molarità)0,1 0,5 1,0

10

20

5

Rite

nzio

ne re

lativ

a

0

a) EFFETTO DEI SOLVENTI ORGANICI NELLA FASE MOBILEL’aggiunta di solventi organici alla fase mobile non ha alcun effetto sui tR di cationi metallici e anioni inorganici, ma modifica sensibilmente i tR di cationi e anioni organici perché influenza le interazioni tra i soluti e la fase stazionaria e tra i soluti e la fase mobile.Uno scambiatore a base di silice funzionalizzata con tetralchilammonio, ad esempio, può dare sia scambio anionico che adsorbimento di molecole o ioni organici contenenti gruppi alchilici, per interazione idrofobica tra le catene alchiliche. Aggiungendo alla fase mobile un solvente organico le interazioni idrofobiche che stanno alla base dell’assorbimento vengono inibite.

Giorgio Bonaga

Si CH2CH2

CH2CH2

CH2CH2

CH2CH2

CH3CH2

CH2CH2

CH3-OOCCH3

CH2CH2

CH2CH2

COO-

adsorbimento scambio anionico

CH3CH2

CH2CH2

CH2COO-

CH3CH2

CH2CH2

CH2CH3

SiR

RN+ R

4. DETECTOR NELLA IECa) RIVELATORI ELETTROCHIMICIPoiché lo scopo della cromatografia ionica è la separazione e la determinazione di specie ioniche, il rivelatore più idoneo è quello conduttometrico, che misura la conduttanza della soluzione effluente.Le più moderne celle conduttometriche, con acquisizione digitale, permettono un ampio intervallo operativo senza necessità di variare manualmente il range di lavoro, entro un intervallo dinamico di rivelazione conduttimetrica molto esteso (da 0,1 nanosecondi a 15 millisecondi). Il trattamento del segnale digitale, comandato da microprocessore, rileva automaticamente le concentrazioni alte e basse dei soluti nel corso dell'esecuzione della medesima serie. Un aspetto importante è l'accuratezza del controllo della temperatura, che si realizza con sistemi di controllo integrati della colonna e del rivelatore. La cella può essere riscaldata in modo indipendente dagli altri componenti del cromatografo tra 35° e 55°C, per assicurare la massima accuratezza nel controllo di temperatura, eliminando in questo modo qualunque deriva dovuta a variazioni ambientali di temperatura. In altri casi, per assicurare una temperatura omogenea durante l'intero corso dell'analisi, il rivelatore viene inserito nel vano portacolonna, termostatato da 30° a 60°C.

Giorgio Bonaga

b) RIVELATORI SPETTROFOTOMETRICIIn genere i cromatografi ionici possono essere configurati con un qualsiasi rivelatore ottico tra quelli messi a disposizione dal mercato. Ad esempio, uno spettrofotometro a diode array (DAD) a matrice di 1024 fotodiodi ad alta risoluzione, caratterizzato da basso rumore di fondo e bassa deriva oppure un rivelatore UV-VIS con lampade al deuterio e al tungsteno per operare nel range 190-800 nm. L'uso di questi rivelatori è utile nella rivelazione di specie con cromoforo nell'UV, come ad esempio il nitrato, ma soprattutto trovano applicazioni in metodi, anche ufficiali, che prevedono la derivatizzazione post-colonna.

c) RIVELATORI MSLo spettrometro di massa con ionizzazione a pressione atmosferica (Atmospheric Pressure Ionization = API) si è rivelato un insostituibile rivelatore per la cromatografia liquida in generale e per la cromatografia ionica in particolare, grazie alla capacità di risolvere problemi analitici non superabili con le tecniche di rivelazione elettrochimica o spettrofotometrica. Sono disponibili sul mercato sistemi dedicati IC-MS, gestiti con un unico software. L'uso della soppressione a membrana prima dell'interfaccia API permette di modificare il pH della soluzione da analizzare ottimizzando così la fase di ionizzazione per elettrospray.

Giorgio Bonaga

La scelta dello spettrometro di massa come rivelatore per IC si basa sul principio di mettere a disposizione un rivelatore affidabile, robusto e di facile utilizzazione, anche per operatori non esperti. Per ottimizzare la sensibilità strumentale l’operatore deve agire solo su due parametri:

1) la temperatura del probe dell’elettrospray, in funzione del flusso e della composizione dell'eluente, ;

2) il potenziale della sorgente.

Un aumento del potenziale della sorgente produce una maggiore frammentazione delle molecole per effetto di collisioni indotte, generando frammenti diagnostici che aumentano la specificità dell'analisi e possono dare informazioni strutturali aggiuntive per l’identificazione dei soluti.Dal punto di vista spettrometrico la caratteristica più importante è la possibilità di ottimizzare la risposta dell'analizzatore nell'intervallo di masse basse, tipiche degli ioni inorganici. Questa tecnica detta ELMO (Enhanced Low Mass Option) permette di estendere il “mass range” al di sotto di m/z 19, con un aumento della sensibilità di 350 volte per lo ione m/z 18 e con una limitata perdita di risposta alle masse più alte. Questa opzione si ottiene mediante una modifica dell'hardware, ovvero con l'introduzione di una lente RF esapolare da 5 mm e di due generatori di radiofrequenza separati.

Giorgio Bonaga

IEC di un vino bianco (solfiti)

• Colonna analitica: 200 mm x 4 mm i.d., IonPac AS12A• Precolonna: 50 mm x 4 mm i.d., IonPac AG12A• Elettrolita di trasporto: NaOH 0,1 M• Flusso: 1,0 ml/min• Sample Loop: 20 ml. Giorgio Bonaga

SO3- -

0 7 3,0 9 6,0 9,0 12,0 min

IEC di un farmaco (analgesico, antinfiammatorio)

• Colonna analitica: scambiatore anionico• Fase mobile: acquosa a pH 5,5• Rivelatore: UV a 254 nm

Giorgio Bonaga

0 7 5,0 10 min

N

N N

NO

O

H3C

CH3

CH3

NCO

H3C

O

H

CH2CH3

NCO

H3CH

caffeina

fenacetina

acetanilide

Giorgio Bonaga

2) CROMATOGRAFIA IONICA CON SOPPRESSIONE(Suppressed Ion Chromatography = SIC)

1. SOPPRESSIONE A COLONNALa colonna analitica viene collegata ad una seconda colonna (colonna di soppressione) che elimina il contributo alla conducibilità dovuto alla fase mobile (solventi, tampone, sali), così che la conducibilità sia soltanto quella dei soluti che sono stati separati, anche se presenti in piccole concentrazioni.a)SOPPRESSIONE DI ANIONISe la fase mobile fosse costituita da NaOH (o NaHCO3), la fase stazionaria da una resina a scambio anionico e il campione da separare contenesse NaF, NaCl e NaBr, quali sarebbero i passaggi logici nella colonna analitica ?1. la colonna viene saturata con gli anioni –OH (o HCO3-) della fase mobile;2. caricando il campione la resina scambia gli –OH con gli ioni F-, Cl-

e Br-;3. al passaggio della fase mobile (eluizione) gli ioni F-, Cl- e Br- si

scambiano nuovamente con gli ioni –OH della fase mobile ed eluiscono in questo ordine, nel rispetto della scala di selettività;

4. all’uscita dalla colonna si ha la seguente composizione: fase mobile: NaOH (o NaHCO3) soluti separati: NaF, NaCl, NaBr

Giorgio Bonaga

La composizione dell’eluato richiede alcune considerazioni: la concentrazione e la conducibilità della fase mobile (NaOH o NaHCO3) è molto elevata mentre le concentrazioni e le conducibilità dei soluti sono talmente basse che non produrrebbero variazioni significative dei segnali del detector, con enorme riduzione della sensibilità strumentale.Questo limite può essere superato collocando tra la colonna analitica e il detector una colonna a scambio cationico saturata di ioni H+ (HCl). Gli ioni H+ vengono scambiati con gli ioni Na+ sia perché sono meno trattenuti dalla fase stazionaria (in accordo con la scala di selettività), sia perché reagiscono con gli ioni –OH (o HCO3-) con formazione di H2O (o H2CO3 = H2O+CO2).All’uscita dalla colonna di soppressione si ha la seguente composizione:fase mobile: H2O (o H2O + CO2)soluti separati: HF, HCl, HBr

Il risultato netto è che le nuove specie della fase mobile hanno una conducibilità minima, mentre le nuove specie dei soluti sono acidi con valori di “ka” che producono una conducibilità elevata.Naturalmente la colonna di soppressione si esaurisce e va rigenerata con una soluzione di HCl prima di essere reimpiegata.

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b) SOPPRESSIONE DI CATIONISe la fase mobile fosse costituita da HCl (o H2SO4), la fase stazionaria da una resina a scambio cationico e il campione da separare contenesse LiCl, NaCl e KCl, quali sarebbero i passaggi logici nella colonna analitica ?

1. la colonna viene saturata con gli anioni H + della fase mobile;2. caricando il campione la resina scambia gli H+ con gli ioni Li+, Na-

+e K+;3. al passaggio della fase mobile (eluizione) gli ioni Li+, Na-+e K+ si

scambiano nuovamente con gli ioni H+ della fase mobile ed eluiscono in questo ordine, nel rispetto della scala di selettività;

4. all’uscita dalla colonna si ha la seguente composizione: fase mobile: HCl (o H2SO4) soluti separati: LiCl, NaCl, KCl

La composizione dell’eluato richiede alcune considerazioni: la concentrazione e la conducibilità della fase mobile (HCl o H2SO4) è molto elevata mentre le concentrazioni e le conducibilità dei soluti sono talmente basse che non produrrebbero variazioni significative dei segnali del detector, con enorme riduzione della sensibilità strumentale.

Giorgio Bonaga

Questo limite può essere superato collocando tra la colonna analitica e il detector una colonna a scambio anionico saturata di ioni –OH (NaOH). Gli ioni -OH vengono scambiati con gli ioni Cl- perché sono meno trattenuti dalla fase stazionaria (in accordo con la scala di selettività), sia perché reagiscono con gli ioni H+ con formazione di H2O.All’uscita dalla colonna di soppressione si ha la seguente composizione: fase mobile: H2O soluti separati: LiOH, NaOH, KOH

Il risultato netto è che le nuove specie della fase mobile hanno una conducibilità minima, mentre le nuove specie dei soluti sono basi con valori di “kb” che producono una conducibilità elevata.Naturalmente la colonna di soppressione si esaurisce e va rigenerata con una soluzione di NaOH prima di essere reimpiegata.Nel caso della cromatografia ionica di metalli di transizione la soppressione produce degli idrossidi non dissociati o insolubili [Ni(OH)2, Cu(OH)2, ecc.] e pertanto anziché un detector conduttometrico si utilizza un rivelatore spettrofotometrico, previo trattamento della soluzione del campione - prima dell’eluizione in colonna analitica - con un indicatore metallocromico [ad es.: sale monosodico del 4-(2-piridilazo) resorcinolo o PAR] in grado di formare i cromofori necessari alla rivelazione UV-VIS.

NN

NHO

O- +Na

PAR

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SOPPRESSORE A COLONNA

colonna analitica

colonna di soppressione

pompa

cella conducimetrica

fase mobilecampione

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2. SOPPRESSIONE A FIBRA CAVAIl limite della colonna di soppressione è che si esaurisce e la sua rigenerazione non consente un processo in continuo. Un’alternativa è la soppressione a fibra cava, cioè una fibra cilindrica nel cui canale interno passa la soluzione eluente proveniente dalla colonna analitica e all’esterno, in controcorrente, viene fatta fluire la soluzione che deve provvedere alla soppressione degli ioni della fase mobile.a) SOPPRESSIONE DI ANIONILa fibra è permeabile ai cationi Na+ (in uscita) della fase mobile NaOH e H+ (in entrata) della soluzione di soppressione di HCl. Il risultato netto è la conversione degli ioni –OH della fase mobile in H2O e dei soluti NaF, NaCl e NaBr nei corrispondenti acidi HF, HCl e HBr.b) SOPPRESSIONE DI CATIONILa fibra è permeabile agli anioni Cl- (in uscita) della fase mobile HCl e -OH (in entrata) della soluzione di soppressione di NaOH. Il risultato netto è la conversione degli ioni +H della fase mobile in H2O e dei soluti LiCl, NaCl e KCl nei corrispondenti idrossidi LiOH, NaOH e KOH.Il limite della fibra cava è la limitata superficie della fibra, dovuta al fatto che per evitare l’allargamento dei picchi il diametro del canale interno dev’essere ridotto.

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FIBRA CAVAeluente

soluzione di soppressionesoluzione di soppressione

scambio cationicoo

scambio anionico

scambio cationicoo

scambio anionico

fibra permeabilea cationi o anioni

canale interno della

fibra

HBrHClH2OHF

NaBrNaClNaOHNaF

H+H+

H2OH2O H2O

H2O

Na+ Na+Na+

Na+

H+ H+

Cl – Cl –

H+

H+

Cl -

H+

Cl -

H+ H+

Cl -H+

Cl -

Na+

Cl -

Na+

Cl -

NaOH NaOHNaOH NaOH

Na+Na+

-OH

SOPPRESSORE A FIBRA - ANIONI

-OH -OH -OH

F - Cl - Br -

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SOPPRESSORE A FIBRA - CATIONI

KOHNaOHH2OLiOH

KClNaClHClLiCl

-OH-OH

H2OH2O

H2OH2O

Cl - Cl -Cl -

Cl -

-OH

Na+Na+

-OHNa+

-OHNa+

Na+

-OHNa+

-OH

Na+

Cl -

Na+

Cl -HCl HCl

HCl HCl

Cl -Cl -

H+H+ H+H+

-OH-OH

-OH

Li+ Na+ K+

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Giorgio Bonaga

c) SOPPRESSIONE A MEMBRANAÈ una soppressione che opera secondo gli stessi principi del soppressore a fibra cava, ma la permeabilità ai cationi o agli anioni è dovuta ad una membrana semipermeabile.Il soppressore a membrana è costituito da una camera laminare con tre schermi metallici scambiatori alternati con due membrane di scambio (struttura a “sandwich”).

Il soppressore a membrana non soltanto consente di operare in continuo, ma la maggiore superficie di contatto tra la soluzione di soppressione e la soluzione eluente, consente una soppressione più completa.

membrana discambio ionico

schermo scambiatore

soppressoreHCl

SOPPRESSORE A MEMBRANA

COLONNADETECTORNaBrNaCl

NaOHNaF

HBrHClH2OHF

H+

H+

Na+Cl -

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Na+

ELETTRODO

Na+

flussoeluente

SIC di acidi organici liberi

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SO4- -

0 79 8 16 min

mal

eico

mal

onico la

ttico fo

rmico

acet

icopr

opio

nico

SIC di amminoacidi liberi di un mangime

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0 7 30 9 60 min

Asp

Thr

Ser

Glu

Gly

Ala

Val

Cys

Met

Phe

IleLe

uTy

r

His Ly

s Arg

Giorgio Bonaga3) CROMATOGRAFIA DI COPPIA IONICA(Ion Pair Chromatography = IPC)

È una tecnica cromatografica nella quale viene soppressa la ionizzazione di soluti ionizzabili e le specie che si ottengono, dotate di carattere lipofilo, vengono separate su fase inversa.1. PREMESSASe un soluto con proprietà ioniche (elettrolita debole) viene eluito con una opportuna fase mobile, produce un picco cromatografico caratteristico, in funzione del pH della fase mobile, come risultato del suo equilibrio di protonazione. La prima frazione del soluto che eluisce è quella ionizzata, dunque poco trattenuta dalla fase inversa (non polare), mentre la seconda frazione è quella indissociata, affine alla fase inversa.Nel caso di un acido carbossilico:

R-COOH R-COO- + H+

a pH basico: prevale R-COO - il picco ha un tR molto basso a pH acido (< pka): prevale R-COOH il picco ha un tR più alto

pH basicopH acido

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Il risultato netto è un picco molto allargato e non risolto. Per evitare la formazione di specie indesiderate nella separazione di elettroliti deboli si può utilizzare un tampone che stabilizza il pH di esercizio. Naturalmente nel caso di elettroliti forti non soltanto il tampone non funziona, ma non si può neppure abbassare o alzare il pH della fase mobile fuori dall’intervallo di pH (2-8) entro il quale la silice funzionalizzata è stabile.

2. TECNICA IPCIl problema si può risolvere aggiungendo alla fase mobile un elettrolita costituito da uno ione (accoppiatore ionico) di dimensioni sufficientemente grandi e con carica opposta allo ione che si vuole “sopprimere”. Dal momento che il solvente organico della fase mobile produce un abbassamento della costante dielettrica, ci sono le condizioni affinché si formi una coppia ionica che, in un certo senso, si comporta come un soluto indissociato.

tR

R-COO- R-COOH

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ACCOPPIATORI PER CATIONI CATIONI ACCOPPIATORI

PER ANIONI ANIONI

ione perclorato tutti ione tetrabutilammonio (TBA)

tuttidodecilsolfato di sodio (SDS)

ammine protonate

tetrafenilborato di sodio (STPB) tutti

H3C O S

O

O- +Na

O

+

+H3C

NCH3

CH3

CH3

Cl

O

O O

O-

-B+ Na

Si

Si

-

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OR CO-

N+

OR C O H

Gli accoppiatori ionici del tipo SDS, che sono costituiti da una catena alchilica media, interagiscono con le catene alchiliche della silice funzionalizzata con C18 e la fase inversa diviene così uno scambiatore ionico per la presenza del gruppo –O-SO3

-.

Si

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fase mobile

fase stazionaria porosa

D) CROMATOGRAFIA DI ESCLUSIONE DIMENSIONALE(Size Exclusion Chromatography)

Utilizzando colonne impaccate con fase stazionaria costituita da materiale poroso a dimensione controllata dei pori, i soluti si possono separare in base alla loro dimensioni molecolari.

1. TEORIA GENERALE DELLA ESCLUSIONE DIMENSIONALEIl volume interno di una colonna di esclusione si può così suddividere:

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1. volume della fase mobile

che non occupa i pori (V0)

2. volume della fase stazionariaa) volume strutturale non disponibile per i soluti

(Vst)b) volume totale dei pori occupati dalla fase mobile

(Vp)

Vst

Vpmg

mmmp

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Le 3 molecole: piccola dimensione (mp), media dimensione (mm) e grande dimensione (mg) hanno destini diversi. La mp penetra completamente i pori, la mm li penetra parzialmente e la mg ne viene esclusa. La domanda è: qual è il volume a disposizione dei soluti che attraversano la colonna ?È intuitivo che il volume è diverso in funzione della dimensione della molecola:

mp = V0 + Vp

mm = V0 + Vp/x (Vp/x = parte di Vp)mg = V0

È possibile definire un coefficiente di distribuzione K che rappresenta la frazione di volume dei pori disponibile per le molecole di un determinato soluto A: K = (da cui VA = K . Vp)

dove VA = volume dei pori accessibile alle molecole del soluto A

Possiamo stabilire il valore di K in funzione della dimensione molecolare dei soluti:

VAVp

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mp K = 1mg K = 0mm 0 < K < 1

Il volume totale a disposizione delle molecole dei soluti, corrispondente al volume di ritenzione VR, sarà:

VR = V0 + VA

ovvero : VR = V0 + K . Vp

per: K = 0 VR = V0 esclusione totale

K = 1 VR = V0 + Vp permeazione totale

0 > K > 1 V0 < VR < V0 + Vp permeazione parziale

Si può anche affermare che l’intervallo di volume necessario per eluire tutti i soluti è compreso tra V0 e V0 + Vp (corrispondente all’intervallo del coefficiente di distribuzione K compreso tra 0 e 1) ed è pertanto necessario che la colonna sia molto efficiente.In conclusione, maggiore è il valore di K maggiore è la penetrazione e la permanenza delle molecole di soluto nei pori e, dunque, più elevato è il suo tR.

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Possiamo diagrammare i pesi molecolari dei soluti in funzione del volume di ritenzione VR, ovvero tracciare una curva di taratura (o di calibrazione):

Riportando su un cromatogramma teorico una miscela di soluti con valori differenti di K si può concludere che il soluto con K = 1 è escluso, il soluto con K = 1 è permeato totalmente e il soluto con K = 0,5 è permeato al 50%.

101

102

103

107

104

106

105

V0 Vp

intervallooperativodi mol wt

permeazionetotale: K=1

esclusionetotale: K=0

permeazioneselettiva: 0<K<1

mol wt

V0 + Vp

Giorgio Bonaga

101

102

103

107

104

106

105

V0 Vp

intervallooperativodi mol wt

permeazionetotale: K=1

esclusionetotale: K=0

permeazioneselettiva: 0<K<1

mol wt

K=0 K=0,5 K=1

V0 V0+1/2Vp V0+Vp

QUAL’E’ ILVALORE DI K ?

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I due asintoti della curva di taratura corrispondono a due limiti: quello della permeazione nulla (o esclusione totale) corrispondente a K = 0 e quello della permeazione totale (o esclusione nulla) corrispondente a K = 1.È ovvio che il tratto analiticamente utile della curva di taratura (intervallo operativo dei pesi molecolari dei soluti) è quello lineare, cioè quello compreso tra K = 0 e K = 1.I solventi utilizzati come fase mobile nella cromatografia di esclusione sono costituiti da molecole a basso peso molecolare, con K = 1, cioè con il più elevato tR. Essi, pertanto, eluiscono quando sono già eluiti tutti i soluti. Questa è la principale differenza tra la SEC e le altre tecniche di separazione cromatografica. Il compito del solvente è esclusivamente quello di essere un buon solvente dei soluti che devono essere separati, oltre ad essere inerte verso la fase stazionaria.L’efficienza di una colonna per cromatografia di esclusione dimensionale dipende da:

a) Lunghezza della colonnaÈ evidente che l’allungamento della colonna produce un aumento della sua efficienza, ma nel caso della SEC è più efficace connettere 2 colonne differenti (cromatografia bimodale) piuttosto che 1 colonna più lunga.

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b) Struttura della fase stazionaria• Se la fase stazionaria è costituita da materiale con diametro piccolo

dei pori il tratto lineare della curva di taratura si sposta verso il basso e interesserà soluti di piccole dimensioni. Se la fase stazionaria è costituita da materiale con diametro grande dei pori il tratto lineare si sposta verso l’alto e interesserà i soluti di grandi dimensioni.

101

102

103

107

104

106

105A

A: pori più grandi (intervallo operativo per mol wt elevati)B: pori più piccoli (intervallo operativo per mol wt meno elevati)

mol wt

B

VR (ml)

Giorgio Bonaga

• Alla maggiore o minore omogeneità della dimensione dei pori, invece, è correlata la pendenza della curva di taratura: l’angolo del tratto lineare è proporzionale alla disomogeneità dei pori. È ovvio che minore è la pendenza del tratto lineare e maggiore è l’efficienza e la selettività della colonna, naturalmente se i soluti hanno dimensioni comprese nel tratto lineare.

101

102

103

107

104

106

105

A

A: pori omogenei (alta selettività)B: pori disomogenei (bassa selettività)

mol wt

B

VR (ml)

Giorgio Bonaga

Se prendiamo in considerazione le curve di taratura di fasi stazionarie diverse si può notare che, seppure con andamenti diversi, l’incremento della dimensione dei pori sposta il tratto lineare delle curve di taratura verso l’alto (cioè verso pesi molecolari maggiori), sia con materiale polimerico sia con gel si silice.

101

102

103

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104

106

105

6 7 8 9 10 11 12 13 14

700 Å500 Å

400 Å300 Å

200 Å

100 Å

VR (ml)

CURVE DI TARATURA DI POLIMERI

600 Å

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101

102

103

107

104

106

105

1,6 2,0 2,4 2,8 3,2

CURVE DI TARATURA DI GEL DI SILICE

125 Å

300 Å

500 Å1000 Å

VR (ml)

Un problema concreto è quello della scelta della porosità più idonea alla separazione di due soluti di peso molecolare diverso.Tracciamo le curve di taratura di tre impaccamenti A, B e C di porosità diversa e individuiamo qual è quello più idoneo a separare il soluto 1 (~ 104) e il soluto 2 (~ 103).

Giorgio Bonaga

101

102

103

107

104

106

105

V0Vp

A

mol wt

VR

BC

DVA DVB DVC

Mentre con gli impaccamenti A e C i pesi molecolari sono fuori dal tatto lineare della curva, con l’impaccamento B sono compresi. Inoltre, la differenza dei volumi di ritenzione dell’impaccamento B (DVB) è maggiore di quella A (DVA) e di quella C (DVC) e pertanto la separazione sarà migliore.

soluto 1

soluto 2

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Dal punto di vista pratico conviene fare una cromatografia di “screening” con una colonna che ha una curva di taratura a pendenza elevata, cioè una curva il cui tratto lineare comprende un intervallo ampio di pesi molecolari. Individuato l’intervallo reale in cui rientrano i pesi molecolari dei soluti da nalizzare si potrà procedere utilizzando una colonna più selettiva, cioè con una curva di taratura a bassa pendenza del tratto lineare.

2. CROMATOGRAFIA DI ESCLUSIONE BIMODALECollegando due colonne impaccate con materiale a differente dimensione dei pori si amplia l’intervallo di pesi molecolari che rientrano nel tratto lineare della curva di taratura.

colonna 1pori grandi

colonna 2pori piccoli

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Ognuna delle due colonne esercita la sua funzione in un proprio intervallo di pesi molecolari e l’attraversamento dei soluti in una colonna non ha alcuna influenza sull’altra, perché i diversi soluti subiranno esclusione totale o permeazione totale. Normalmente la prima colonna è quella meno selettiva, cioè impaccata con materiale a dimensione dei pori maggiore.È evidente che se ogni singola colonna consente la separazione di 2 ordini di grandezza di pesi molecolari, l’accoppiamento di due colonne consentirà la separazione di 4 ordini di grandezza di pesi molecolari.

101

102

103

107

104

106

105

mol wt

A

BA

BVR (ml)

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0 10 min 0 10 20 min CROMATOGRAFIA CON 1 COLONNACON DIAMETRO DEI PORI = 60 Å

CROMATOGRAFIA CON 2 COLONNECON DIAMETRO DEI PORI = 60 Å

1

2

3

4

5

6

7

1

2

345

6

7

1 = polistirene20.0002 = polistirene 2.1003 = diottilftalato 3904 = dibutilftalato 2785 = dietilftalato 2226 = dimetilftalato 1947 = benzene (solvente) 78

3. FASE STAZIONARIALe fasi stazionarie nella cromatografia di esclusione dimensionale possono essere costituite da: Materiali rigidi, materiali semirigidi, materiali “soft”.

3.1. MATERIALI RIGIDIViene utilizzata gel di silice o silice vetrosa in granuli, con diametro compreso tra 5-10 mm e diametro dei pori compreso tra 60-10000 Å.La silice ha le seguenti proprietà:• sopporta alte pressioni senza variare di volume;• è compatibile con fasi mobili acquose e organiche;• è compatibile con una temperatura di esercizio di 60-80°C;• è idonea alla separazione di soluti polari;• è instabile a pH > 8 perché si scioglie nella fase mobile;• può dare interazioni (adsorbimento e scambio ionico) con i soluti.Per eliminare i fenomeni di adsorbimento si può funzionalizzare la silice con TMCS (trimeticlorosilano), ovvero si convertono i gruppi silanolici nei loro trimetilsiliderivati.Per eliminare lo scambio ionico dovuto all’acidità dei gruppi silanolici (pH ≈ 9) si può aggiungere alla fase mobile una sale donatore di anioni e cationi ai siti attivi della silice (ad es. una soluzione 0,1-0,01 M di tetrabutilammoniodiidrogenofosfato).

3.2. MATERIALI SEMIRIGIDIVengono utilizzati copolimeri stirene/divinilbenzene (PS-DVB), ma questi materiali variano il loro volume in funzione della pressione a cui sono sottoposti. La loro porosità può essere modulata variando l’entità della reticolazione, che è direttamente proporzionale alla percentuale di divinilbenzene (dal 2 al 12%, comunemente 8%). Non essendo bagnabile il copolimero non può consentire la Gel Permeation Chromatography, la tecnica che utilizza una fase mobile acquosa. I solventi più utilizzati in associazione con questi materiali sono: THF, toluene, cloroformio e decaidronaftalene.

3.3. MATERIALI “SOFT”Vengono utilizzati polisaccaridi (amido, poliagarosio, ecc.) che però hanno l’inconveniente di subire una notevole riduzione di volume a pressioni elevate. Il loro utilizzo comporta una pressione di esercizio non superiore a 10 atmosfere, ottenuta con pompe peristaltiche.

NCH2CH2CH2CH3

CH2CH2CH2CH3

CH3CH2CH2CH2

CH3CH2CH2CH2

+

PHO OH

O

O-

4. FASE MOBILELa fase mobile deve possedere alcuni requisiti:• buon solvente dei soluti da nalizzare;• compatibilità con la fase stazionaria (bagnabilità)• inerzia verso la fase stazionariaI “buoni” solventi di una fase mobile impiegata nella SEC devono solvatare fortemente i soluti, in modo da ridurre al massimo il VR.

In base al tipo di fase stazionaria e di fase mobile la SEC può essere così classificata:

d+

d-d+d-

d-d+

d+d-

d+

d-d-

d+

d+

TIPO DI SEC FASE STAZIONARIA FASE MOBILEGel Permeation Chromatography (GPC)

• silice• copolimeri • organica

Gel Filtration Chromatography (GFC) • silice • acquosa

5. TEMPERATURALa separazione dei soluti ad alto peso molecolare, cioè ad elevata viscosità, richiede un incremento di temperatura proprio per ridurre l’eccessiva viscosità della miscela da analizzare.Nella SEC si opera alla temperatura di 60-80°C, compatibilmente con il solvente utilizzato come fase mobile, perché comunque bisogna operare ad una temperatura inferiore di 30-40°C a quella di ebollizione del solvente.Il materiale di riempimento più idoneo è la silice, anche perché l’aumento della sua solubilità nella fase mobile all’aumentare della temperatura può essere ovviato predisponendo una precolonna di silice mantenuta alla stessa temperatura d’esercizio. In questo modo la fase mobile si satura di silice nella precolonna, garantendo l’inalterabilità della silice della colonna analitica.

precolonnasilice, 60-80°C

colonnasilice, 60-80°C

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101 102 103 107104 106105

• composti organici

• additivi per polimeri• plasticizzanti• resine epossidiche

6. IMPIEGHI DELLA SECLe sostanze che possono essere separate con la SEC e i relativi intervalli di peso molecolare sono indicati nello schema.

mol wt

• resine epossidiche• resine fenoliche

• peptidi• proteine globulari

• enzimi

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1. fibrinogeno 341.000

2. immunoglobulina 156.000

3. albunina 69.000

ESEMPIOSeparazione di proteine del plasma umano.

1

2

3

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• Colonna: copolimero S/DVB, pori 60 Å

• Fase mobile: THF• Flusso: 1 ml/min

1. n-dodecilbenzene 2182. n-ottilbenzene

1903. n-esilbenzene

1624. n-butilbenzene

1345. n-propilbenezene 1206. etilbenzene

106 7. toluene 928. benzene (solvente)

78

12

34

5

6

7

8

15 25 35 min

ESEMPIOSeparazione di alchilbenzeni.

ALTRE COMATOGRAFIEE) CROMATOGRAFIA DI AFFINITA’(Affinity Chromatography = AC)

È utilizzata per isolare composti biologicamente e/o chimicamente nobili, di costo elevato, il cui recupero è economicamente vantaggioso. È una tecnica cromatografica molto utilizzata nella separazione degli enzimi, perché sfrutta la specificità delle interazioni enzima/substrato.La colonna viene preparata con materiale fisicamente e chimicamente inerte (matrix), attivato con degli spaziatori flessibili (spacer arm), sui quali vengono immobilizzati dei ligandi (ligand), cioè dei siti attivi verso un enzima. Gli spaziatori hanno la funzione di evitare l’impedimento sterico tra i siti attivi e le molecole di enzima.

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matrix (agarosio)

ligand

spacer arm(Br-CN)

A+BC

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AFFINITA’

A B

C

Facendo eluire una miscela di enzimi, soltanto quello in grado di interagire (affinità) con i ligandi viene trattenuto, mentre gli altri eluiscono molto rapidamente. In un secondo tempo si fa fluire una fase mobile in grado di dissociare il complesso enzima/substrato, in genere variando il pH o la forza ionica della fase mobile.

F) CROMATOGRAFIA LIQUIDA CHIRALE(Chiral Liquid Chromatography = CLC)

Ha lo scopo di separare le miscele di enantiomeri (R e S), cioè isomeri che hanno le stesse proprietà chimiche e fisiche, ma diversa attività ottica (antipodi ottici). La cromatografia liquida chirale si può realizzare in due modi:1. FASE STAZIONARIA CHIRALE La fase stazionaria di silice viene funzionalizzata con gruppi contenenti centri chirali che determinano una enantioselettività dovuta alla formazione di addotti diasteroisomerici non permanenti. L’enantoseparazione avviene se i due enantiomeri differiscono nel numero di punti di attacco al centro chirale.Le interazioni temporanee sono:1. legami a idrogeno;2. interazioni dipolo-dipolo;3. interazioni di orbitali (p-p o d-metalli).

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Le tre interazioni che governano la stereoselettività sono note come “regola dei tre punti di Dalgliesh”.Si ottiene la separazione se uno dei due enantiomeri è ritenuto dalle tre interazioni e l’altro soltanto da due.

ESEMPIOPer ottenere la separazione di una miscela di enantiomeri R e S di alcuni amminoacidi (valina, alanina, treonina) si funzionalizza una fase stazionaria di silice con:

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(S)-N-(1-feniletil)-urea

O CNH

NH2

C CH3

H*

Gli enantiomeri R eluiscono prima perché formano soltanto 2 interazioni temporanee con i centri chirali S, mentre gli enantiomeri S ne realizzano 3.

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R

R

R

S

S

Streonina

alanina

valina

0 4 8 12 16 min

CCH3CNH2

H O

OH

CCCHNH2

H O

OH

H3C

H3C

CCCHNH2

H O

OH

H3C

HO

2. FASE MOBILE CHIRALE Alla fase mobile viene aggiunto un componente chirale, in grado di interagire (per complessazione, addizione, condensazione) in modo diverso con i due enantiomeri. In questo caso l’enantiomero affine al componente chirale della fase mobile eluisce per primo. Questo secondo tipo di cromatografia liquida chirale è poco diffuso.

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G) CROMATOGRAFIA CON SCAMBIO DI LEGANTE(Ligand Exchange Chromatography = LEC)

È una cromatografia di scambio cationico che utilizza un copolimero (comunemente stirene/divinilbenzene) funzionalizzato con gruppi –SO3

-, ma in più la fase stazionaria viene caricata con un controione metallico (ad es. Fe+++) capace di formare complessi con le sostanze da separare. Lo ione metallico non deve saturare tutti i siti attivi del copolimero, ma maggiore è il numero dei siti caricati con il controione maggiore è la capacità della colonna. È anche opportuno che la concentrazione dei soluti da separare non sia tanto elevata da determinare la rimozione del controione dal silicone. Il soluto è trattenuto tanto più a lungo dalla fase stazionaria quanto maggiore è la stabilità del complesso ione/soluto (con un conseguente aumento del suo tR), secondo l’equilibrio:

Copolimero-SO3- Fe+++ + HO-R Copolimero-SO3- Fe+++ -O-R + H+

Dopo la formazione dei complessi Fe+++/soluti, si impiega con una soluzione tampone a pH decrescente per avere l’eluizione selettiva dei soluti, secondo un ordine che dipende dalla stabilità del complesso ione /soluto e dalla basicità del soluto.

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a) A PARITA’ DI STABILITA’ DEI COMPLESSI IONE/SOLUTO: viene eluito prima il soluto più basico;b) A PARITA’ DI BASICITA’ DEI SOLUTI: viene eluito prima il soluto che forma il complesso ione/soluto meno stabile.

ESEMPIOSeparazione di fenoli monosostituiti.

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0 100 200 volume fase mobile 6 5 4 pH fase mobile

OH

Cl

OH

Br

OH

NO2 OH

CH3

H) CROMATOGRAFIA A FLUIDO SUPERCRITICO(Supercritical Fluid Chromatography = SFC)

Rispetto le altre LC, la cromatografia a fluido supercritico è più versatile, economicamente più vantaggiosa, di facile esecuzione, con una risoluzione migliore, non impiega solventi organici, comporta tempi di analisi più rapidi.1. TEORIA GENERALE DELLA SFCUn fluido supercritico può essere definito dal diagramma di fase di una sostanza pura, in cui sono indicate le regioni corrispondenti allo stato solido, liquido e gassoso.

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regionedel fluido

supercriticoSOLIDO LIQUIDO

VAPORE

temperatura critica

pressionecritica

puntotriplo .

Una sostanza può esistere in fase solida, liquida e gassosa in diverse combinazioni di temperatura e pressione. Per ogni sostanza, però, c’è una temperatura (temperatura critica) al di sopra della quale essa non può esistere allo stato liquido, indipendentemente dalla pressione a cui è sottoposta e c’è una pressione (pressione critica) al di sopra della quale essa non può esistere allo stato gassoso, indipendentemente dalla temperatura a cui è sottoposta.A questo punto il liquido e il vapore hanno la stessa densità e il fluido non può essere liquefatto per incremento della pressione. Sopra questo punto non avviene più nessun cambiamento di fase e la sostanza è un fluido supercritico.

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FLUIDOtemperatu

racritica (°C)

pressionecritica (bar)

anidride carbonica 31.0 73,8etilene 9,2 50,4propilene 91,8 46,0triclorometano 198,0 44,1ammoniaca 132,3 113,5acqua 374,1 221,2cicloesano 280,3 40,7toluene 318,6 41,0

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PROPRIETA’ gasfluido

supercritico

liquido

densità (g/cm) 0,6-2,0 x 10-3 0,2-0,5 0,6-2,0

coefficiente di diffusione (cm/s)

1,0-4,0 x 10-1 10-3- 10-4 0,2-2,0 x 10-

5

viscosità (g/cm . s) 1,0-4,0 x 10-4

0,6-2,0 x 10-3

0,2-3,0 x 10-2

La SFC è una tecnica cromatografica intermedia tra la GC e la LC nella quale la fase mobile è un fluido ottenuto per riscaldamento al di sopra della sua temperatura critica e compresso al di sopra della sua pressione critica. C’è una transizione continua da liquido a fluido supercritico per incremento della temperatura a pressione costante o da gas a fluido supercritico per incremento della pressione a temperatura costante.I fluidi supercritici hanno proprietà, intermedie tra quelle dello stato gassoso e dello stato liquido, proprietà che sono particolarmente utili nella cromatografica. Per la loro densità elevata sono in grado di dissolvere molecole ad alto peso molecolare, non volatili, termolabili, ma hanno anche un grande potere solvatante. Per il loro coefficiente di diffusione elevato consentono di usare colonne lunghe e di ridurre i tempi di analisi. Per la loro viscosità bassa riducono i fenomeni di caduta di pressione in colonna.

2. FASE MOBILENonostante siano disponibili numerosi fluidi, la SFC utilizza comunemente l’anidride carbonica e, a volte, l’acqua.a) CO2Non è infiammabile, non è tossica, è ecocompatibile, ha una temperatura critica bassa e una pressione critica modesta, è miscibile con molti solventi organici e facilmente recuperabile alla fine del processo. Le molecole di CO2, piccole e lineari, diffondono velocemente. b) H2OHa temperatura critica e pressione critica elevate a causa della sua notevole polarità. In condizioni supercritiche l’acqua cambia, da solvente di sole specie ioniche a solvente di paraffine, sostanze aromatiche, sali.

3. PRESSIONEIl potere solvatante di un fluido supercritico è proporzionale alla sua densità e la densità aumenta all’aumentare della pressione. La programmazione della pressione nella SFC corrisponde alla programmazione della temperatura nella GC e alla eluizione a gradiente nella HPLC. Giorgio Bonaga

4. STRUMENTAZIONE SFCÈ molto simile a quella HPLC, perché le temperature e le pressioni richieste per produrre il fluido supercritico si ottengono anche con uno strumento HPLC. Ci sono due differenze sostanziali:1) forno termostatato2) restrittorea) POMPE• colonne impaccate: pompe reciprocanti• colonne capillari: pompe a siringab) INIETTORI• colonne impaccate: tradizionali valvole di iniezione HPLC per grandi

volumi• colonne capillari: valvole pneumatiche per piccoli volumic) FORNOÈ necessario un forno termostatato con controllo accurato delle temperature, molto simile a quello della GC.d) COLONNENella SFC il notevole potere solvatante della fase mobile rende importante e delicata la scelta della fase stazionaria.• colonne impaccate: acciaio inox (3-25 cm) di allumina, silice, polistirene

e altre fasi insolubili nel fluido supercritico (diametro: 3-10 mm), anche legate (silice-C18, ecc.)

• colonne capillari: silice fusa (1-35 m), tipo WCOT (f.t.: 0,1-3,0 mm)Giorgio Bonaga

e) RESTRITTORE (back-pressure device)È un dispositivo, collocato tra l’estremità finale della colonna e il detector, che serve a mantenere la pressione desiderata nella colonna, mediante un diagramma di pressione variabile. f) DETECTORLa SFC è compatibile sia con i detector della HPLC e della GC (RI, PD, UV-VIS, LSD, FID, MS).La scelta del detector dipende da: composizione della fase mobile, velocità di flusso della fase mobile, tipo di colonna, abilità del detector di garantire le alte pressioni necessarie nella SFC.g) FLUIDI MODIFICATORILa CO2 non è un ottimo solvente per soluti ad alto peso molecolare, polari o ionici. Questo limite può essere superato per aggiunta di piccole quantità di un secondo fluido, completamente miscibile con la CO2 (alcol, eteri ciclici, acetonitrile, acqua, ecc), detto fluido modificatore. La sua funzione è di innalzare il potere solvatante della CO2, ma anche di incrementare la selettività (a) e la efficienza (HETP) della separazione attraverso la neutralizzazione di parte dei siti attivi della fase stazionaria.

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80 temperatura (°C) 250

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0 10 20 30 40 50 min

0 24 48 72 96 120 min

GC

SFC

0,225 densità (g/ml) 0,70

ULTRA PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (UPLC)

È basata su una nuova fase stazionaria, con particelle di diametro inferiore a 2 mm, che garantisce efficienza, risoluzione e sensibilità analitica oltre ad una riduzione dei tempi di analisi di quasi un fattore 10. La fase stazionaria è costituita da particelle, a fase inversa da 1,7 mm di tetraetossisilossano (TEOS) successivamente polimerizzato e derivatizzato con C18 (ottadecilsilil-), resistenti alle elevate pressioni di esercizio (15000 psi, pari a oltre 1000 atm). Le caratteristiche di questa fase consentono un ottimale interfacciamento della UPLC con la MS.

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HPLC TRADIZIONALE, FAST HPLC, UPLC

0 1 2 3 4 5 6 v (mm/sec)

HE

TP (m

m)

0

5

10

15

20

25

30

10 mm (1970)

5 mm (1980)

3 mm (2000)

1,7 mm (2004) UPLC

FAST HPLC

HPLC

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EFFETTI DELL’HETP SULL’EFFICIENZA E SUL TEMPO

0 2 4 6 8 10 18

300 200 100 rrr0 - 25

0 2 4 6 8 10 12

300 200 100 rrr0 - 25

HPLC

UPLC

mV

mV

t (min)

t (min)

1,8 minuti

18 minuti• flusso: 1,0 ml/min• colonna: 4,6 mm I.D. x 150

mm• fase stazionaria: C18 (5,0

mm)• fase mobile: H2O/CH3CN

(50/50)• lunghezza d’onda: 254 nm• campione (20 ml): 1. uracile 2. alcol benzilico 3. benzene 4. toluene 5. alcol etilico• flusso: 0,6 ml/min• colonna: 2,1 mm I.D. x 50 mm• fase stazionaria: C18 (1,8 mm)• fase mobile: H2O/CH3CN (50/50)• lunghezza d’onda: 254 nm• campione (1 ml): 1. uracile 2. alcol benzilico 3. benzene 4. toluene 5. alcol etilico

12

345

12

3 4 5

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SiEtOEtO

CH2

EtO CH2Si OEtOEt

OEtSiEtO

EtOOEt

EtO

4 +

EtOSi

CH2 CH2Si

OSi

OSi

EtO

OSiOEt

OSi

O OEtOEt

OEt

EtOO

tetraetossisilano(TEOS)

bis (trietossisililetano)(BTEE)polietossisilano

(BPEOS)

SiCOH . . . .

..

..

...

.... ..

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particelle capello umano particelle

da 5 mm 60 mm da 1,7 mm

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STRATEGIA HPLCCAMPIONAMENTO

SCELTA DEL METODOCROMATOGRAFICO

SCELTA DELLACOLONNA

1. LSC

2. LLC

3. IEC

4. SEC

RFC NPC IEC SIC GFC GPC

1. lunghezza colonna2. tipo di fase stazionaria3. dimensione delle particelle4. diametro dei pori

1. pressione2. temperatura3. eluizione isocratica o a gradiente4. column switching

N

k’a

SCELTA DELLAFASE MOBILE

1. composizione fase mobile2. forza dell’eluente3. indice di polarità eluente4. viscosità fase mobile

SCELTA DELLECONDIZIONI

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COLUMN SWITCHINGÈ un sistema costituito da due colonne di lunghezza diversa, ma riempite con lo stesso materiale d’impaccamento, collegate tra loro con una valvola a 3 vie. Agendo sulla valvola si può fare in modo che una parte della miscela eluisca in entrambe le colonne (la parte i cui soluti hanno tR non elevati) e una parte eluisca soltanto nella prima colonna (quella i cui soluti hanno tR molto elevati) perché “deviata” dalla valvola direttamente sul detector.

detector

colonna corta colonna lunga

valvolaa 3 vie

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detector

colonna a bassa capacità

colonna ad elevata capacità

valvolaa 3 vie

Un’alternativa è l’impiego di due colonne di lunghezza uguale, ma a diverso grado di funzionalizzazione della silice con catene C18 (RPC). La colonna meno funzionalizzata trattiene meno i soluti a tR elevati, che verranno deviati dalla valvola prima di entrare nella seconda colonna direttamente sul detector.

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colonna 1: 5,0 cm6

7

851+2+3+4

colonna 2: 15,0 cm

colonna 1 + colonna 2column switching

6

7

8

54

32

1

67

8543

2

10 15 30 min

DERIVATIZZAZIONI IN LCIl limite di rilevabilità di alcuni soluti può essere abbassato con reazioni di derivatizzazione che vanno scelte in relazione alla natura dei soluti e al tipo di rivelatore che è più opportuno utilizzare.Le reazioni possono essere fatte in due momenti diversi del processo cromatografico:a) POST-COLUMNTra la colonna e il detector si inserisce un tubo immerso in un bagno termostatico ed una pompa peristaltica che miscela i soluti già separati dalla colonna analitica con i reagenti necessari alla derivatizzazione.VANTAGGI• il campione non richiede preparazione e manipolazioni;• la reazione può essere automatizzata a vantaggio della riproducibilità;• non si formano artefatti perché i reagenti non attraversano la colonna

analitica.SVANTAGGI• è richiesta una apparecchiatura supplementare (bagno termostatico,

pompa, ecc.);• è compatibile soltanto con reazioni molto veloci (circa 30-40”) perché

tempi maggiori produrrebbero un allargamento dei picchi;

• il solvente di reazione deve essere compatibile con la fase mobile;• un eccesso di derivatizzazione produrre un background che disturba la

misura dei segnali dei soluti.

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b) PRE-COLUMNPrima dell’iniezione nella colonna analitica la miscela da separare viene sottoposta alla reazione di derivatizzazione.VANTAGGI• non ci sono incompatibilità tra solvente di reazione e fase mobile;• la velocità di reazione non è un fattore limitante;• è richiesto il “clean up” (filtrazione, estrazione, precipitazione) del

campione per evitare la formazione di artefatti, pertanto la separazione viene fatta su un campione obbligatoriamente “pulito”;

• non è richiesta una apparecchiatura supplementare, dal momento che è sufficiente una provetta con tappo a tenuta in un termostato;

SVANTAGGI• il campione reale che viene iniettato nella colonna analitica può essere

complesso per la presenza di solventi di reazione (ad esempio l’acetone, che assorbe nell’UV), catalizzatori, tamponi, ecc.;

• è necessario l’uso di uno standard interno quando la reazione di derivatizzazione non è quantitativa;

• la resa della reazione di derivatizzazione è spesso variabile, a spese della riproducibilità;

• molte volte i composti prodotti dalla derivatizzazione sono più difficili da separare dei loro precursori, per effetto di una riduzione delle differenze dei valori dei k’ di derivati che hanno nella molecola lo stesso gruppo funzionale introdotto.

Giorgio Bonaga

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In generale nella LC si usa prevalentemente la derivatizzazione pre-column, più raramente quella post-comumn (come nel caso dell’indicatore metallocromico nella IEC), abitualmente per rendere i soluti da separare capaci di assorbire nell’UV-VIS o di emettere radiazioni di fluorescenza.Le principali reazioni di derivatizzazione riguardano:

1. ACIDI2. AMMINE3. COMPOSTI CARBONILICI4. ZUCCHERI

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1. DERIVATIZZAZIONE DI ACIDI

DERIVATIZZANTE SISTEMA DI REAZIONE DETECTOR

1. bromuro di fenacile acetone, KHCO3, 18-crown-6 UV (254 nm)

2. bromometil-metossicumarina acetone bollente FD (ecc.: 330 nm, emis.: 380

nm)

3. metil-metossicumarina acetone bollente FD (ecc.: 330 nm, emis.: 380 nm)F F

FF

F

CO CH2Cl

1. 2. 3.

O

OO

O

OO

18-crown-6

O O

CH2Br

CH3O O O

CH3

CH3O

K+

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Cromatogramma di acidi carbossilici di un vino “Dolcetto”derivatizzati con bromuro di fenacile

0 5 10 15 min

acid

o gl

ioss

ilico

acet

one

acid

o su

ccin

ico

acid

o latti

coac

ido ac

etico

brom

uro

di

fena

cile

acid

o ta

rtaric

oac

ido

mal

ico

acid

o citric

o

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2. DERIVATIZZAZIONE DI AMMINE

DERIVATIZZANTE AMMINE DETECTOR1. cloruro di 2,4-dinitrobenzoile RNH2, R2NH UV (254 nm)

2. cloruro di dansile RNH2, R2NH FD (ecc.: 330 nm, emis.: 540 nm)

3. o-ftalaldeide RNH2FD (ecc.: 390 nm, emis.:

450 nm)

4. fluram RNH2FD (ecc.: 390 nm, emis.:

450 nm)5. cloruro di nitrobenzoossadiazolo RNH2, R2NH FD (ecc.: 480 nm, emis.:

650 nm)

NO2

ClCO

NO2 CH

O

CO

HO

OO

O

ON

N

Cl

NO2

1. 2. 3. 4. 5.

S O

N

O

CH3H3C

Cl

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Cromatogramma di dansil-derivati di ammine alifatiche• FASE STAZIONARIA: silice-C18 (porosa) 10 mm• FASE MOBILE: H2O/CH3CN con eluizione a gradiente da 40% a

75%

0 2 4 6 8 10 min

CH3CN (75%)

CH3CN (40%)

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3. DERVATIZZAZIONE DI COMPOSTI CARBONILICI E ZUCCHERI

DERIVATIZZANTE AMMINE DETECTOR1. 2,4- dinitrofenilidrazina aldeidi, chetoni VISIBILE

2. dansil-idrazina aldeidizuccheri

FD (ecc.: 350 nm, emis.: 500 nm)RID

NH

NO2

NO2

NH2

S O

N

O

CH3H3C

NHNH2 1.

2.

Negli zuccheri la danisil-idrazina produce un aumento della sensibilità del RID di un fattore 102, inoltre la minor polarità dei dansil-derivati consente la cromatografia a fase inversa.

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0 8 16 24 min Cromatogramma di dansil-

idrazoni di steroidi

20

300 400 500 600

40

60

80 eccitazione emissione

Spettri di eccitazione e di emissione

di fluorescenza dei dansil-derivati