PowerPoint PresentationCorso di Strutturistica degli acidi nucleici 2013
Lezione: Nanostrutture a DNA Obiettivo: mostrare esempi di nanostrutture di DNA ad architettura controllata che possono essere autoassemblate
mediante processi bottom-up
Autovalutazione: -
e la specificità
della formazione di
-conosci modalità
per creare strutture bidimensionali di DNA della dimensione dei micrometri con controllo della struttura nanometrica? E per creare strutture
monodimensionali?
Stabilità
nelle interazioni tra gli acidi nucleici
Svariate sono le tipologie di strutture secondarie che si possono formare per interazione sequenza specifica tra acidi nucleici: as
es. doppie eliche, triple eliche e complessi di invasione di strand
La particolarità
del modo di formazione dei complessi (nucleazione e zipping) e della struttura relativametne
elastica fa si che la presenza di mismatch
non sia un fenomeno drammatico per la stabilità
dei complessi che non sono troppo meno stabili di quelli ad accoppiamento perfetto. Il caso normalmente incontrato per le proteine (steric
fit
o induced
fit) è
assai diverso e poche variazioni dal perfetto appaiamento causano una drastica riduzione di stabilità
dei complessi.
Negli acidi nucleici una certa flessibilità
strutturale consente la stabilizzazione anche di complessi con mismatch, grazie all’estrusione delle basi dalla doppia elica o alla distorsione locale dell’elica. La formazione per nucleazione e zipping procede oltre il punto di distorsione.
Nel normale accoppiamento tra catene di DNA, spesso c’è
solo una finestra di condizioni molto stretta in cui solo il complesso perfettamente accoppiato si forma e contemporaneamente non si forma un quantitativo apprezzabile del complesso non perfettamente accoppiato. Necessità
di un numero sempre crescente di tecniche di analisi genica (analisi di SNPs, gene-
arrays, etc.) è
quello si allargare questa finestra in modo da disporre di condizioni più
flessibili di operazione. Bisogna spesso tenere conto di due condizioni contrapposte: riducendo la lunghezza delle sequenze complementari si riduce la stabilità
e si aumenta la specificità, poiché
un complesso con accoppiamento meno che perfetto è
molto più
instabile e non si forma. D’altro canto, spesso servono alte specificità
e sequenze di riconoscimento molto lunghe, per essere uniche per sequenze geniche di interesse.
Una delle soluzioni possibili è
spesso quella di usare accoppiamenti competitivi tra sequenze, in cui la sequenza “sonda”
partecipa già
ad una struttura stabile (o ha questa struttura internamente, come per i molecular
beacons): in tal caso, la formazione del complesso si ha solo nel caso di una stabilità
maggiore, quindi di un complesso perfettamente accoppiato. hairpin duplex duplex triplex
Un’altra soluzione è
quella di usare nuove tipologie o topologie di formazione dei complessi che siano intrinsecamente più
stabili
:DNA a quella DNA:DNA è
un modo per aumentare la differenza tra legame specifico e aspecifico. In modo analogo sembrano funzionare gli LNA, anche se le evidenze sperimentali sono più
scarse
Hairpin-like
triplex
forming
openers
Oligo
ramificati complementari
Similmente a questo caso funzionano i processi di riconoscimento tra DNA e oligonucleotidi supportarti su nanosfere
(lavori di Niemeyer
Non avviene la ligazione
non sono entrame
assembly
è
che i mattoni che permettono di fare nano- costruzioni utili o interessanti possano contenere già
le informazioni per
autoassemblarsi
se posti nelle condizioni adatte per farlo, senza un intervento dall’esterno da parte di qualche “agente”
di dimensioni più
grandi.
Strutture statiche basate sulla doppia elica lineare Sono strutture create in modo programmato o come risposta ad un possibile fenomeno di riconoscimento plurimolecolare. Sfruttano il normale appaiamento di Watson e Crick per “ricreare”
una doppia elica (completa o no) da parti
separate.
Per avere “valore”
queste tecniche attaccano per via chimica nuovi oggetti al DNA, potendo quindi assemblare oggetti che normalmente non assemblano: usano DNA funzionalizzato
chimicamente
Tomkins
et
modificati specifici per derivatizzare
proteine e la creazione di costruzioni. Sfruttando la streptavidina
tetravalente, è
molecole di oligonucleotide con la streptavidina
a ponte.
Si possono ottenere vari tipi di geometria, compresi i complessi contenenti solo un anello di DNA che si lega ad entrambi le parti su una streptavidina. In modo simile, la streptavidina
può essere
ancorata in modo specifico su posizioni precise di una catena di RNA, ad esempio, sfruttando il riconoscimento con l’oligo
ad essa attaccato.
Costruzioni sulle superfici La localizzazione su superfici rappresenta un modo facile per immobilizzare un nano-oggetto in una posizione precisa e fissata dello spazio, per poterlo utilizzare ma anche per poterlo studiare. La presenza stessa della superficie comporta delle alterazioni del comportamento delle molecole, che non sono più
libere di muoversi come nello
spazio della soluzione (effetti di volume escluso). In condizioni di equilibrio, la riduzione della dimensionalità
del sistema
dovuto alla presenza della superficie comporta un incremento drastico della concentrazione delle molecole reagenti. Ecco due esempi di uso del DNA per creare strati di proteine su superfici o per localizzare in modo specifico proteine per fare protein-chip.
La rivelazione della presenza di sequenze di DNA grazie alla formazione di addotti più
grandi a partire da particelle colloidali (laboratori di Mirkin
e Alivisatos)
di altre condizioni, dipende dalla loro dimensione (fenomeno della risonanza superficiale di plasmoni): particelle di oro di 10-20
nm
mentre aggregati più
grandi hanno colore apparente azzurrino. Questo può essere usato per fare un test colorimetrico della presenza di un tratto di DNA.
Scanometric
(Chad
Mirkin) Secondo lo stesso schema, sferette di oro colloidale possono essere attaccate ad una sequenza sonda legata alla superficie solo se in soluzione è
presente una sequenza di DNA con tratti complementari ad entrambi (l’oligo
sulla particella non è
complementare a quello sulla superficie). La presenza di particelle di diversa dimensione, legate precedentemente ad oligo
diversi propone un metodo colorimetrico per determinare quale sequenza è
presente (ad esempio permette di visualizzare su un singolo pozzetto polimorfismi del tratto di sequenza complementare a quella sulla nanoparticella).
In seguito al legame, è
possibile fare crescere di dimensioni le particelle d’oro, mediante riduzione di Ag+
in soluzione: lo strato di argento metallico cresce solo dove c’è
l’oro,
ingrossando la particella presente in corrispondenza della sequenza riconosciuta. Dopo opportuna crescita le particelle si fondono e creano una zona di colore scuro, visibile ad occhio nudo: è
un modo di leggere i
microarray mediante un semplice ed economico scanner ottico da computer!
DNA Computing: DNA vs. Silicon (http://arstechnica.com/reviews/2q00/dna/dna-2.html)
Transistor-based
computers
typically
handle
operations
von Neumann architecture
comes
from
and write
rate of
DNA. In
all, the replication
replicated
strand
of
the data rate jumps
being replicated
Adleman
1994: il primo esempio di calcolo con il DNA: la soluzione del cammino hamiltoniano
(problema del commesso viaggiatore)
partendo da A e finendo in E.
Le città
sono collegate da un set definito (non completo) di strade e il viaggiatore deve passare solo una volta per ogni città.
Il problema deve essere risolto per tentativi anche da un computer, per cui diventa presto molto impegnativo e richiede molto tempo per essere risolto. Il DNA presenta la possibilità
di eseguire il calcolo in modo altamente parallelo. La risposta arriva nel giro di pochi secondi (ci vogliono alcune ore/giorni per preparare i campioni ed estrarre la risposta)
CODIFICA: -Ogni città
(nodo) è
una catena di DNA di 20 nt, i primi 10 nt hanno sequenza corrispondente al cammino per arrivare alla città, gli altri 10 nt a quello per uscirne. Le sequenze sono scelte per essere uniche.
-Ogni strada è
una catena di DNA di 20 nt, con sequenze scelte per essere complementari alle parti delle città
che congiungono.
sono poi combinati per ibridizzare
e ligati. A questo punto la miscela contiene tutti i possibili cammini tra le città.
-Per ottenere la soluzione desiderata ora bisogna: 1) Amplificazione PCR con primer
corrispondenti alla città
A e E per selezionare i cammini che iniziano e finiscono dove desiderato; 2) separazione su gel elettroforesi dei cammini della lunghezza desiderata (ogni città
visitata solo una volta); 3) affinity
check: per scegliere il cammino in cui tutte le città
siano state visitate. Quelle catene che restano sono soluzione del problema.
Strutture statiche basate su forme ramificate
“DNA is every designer’s dream, being at the same time the blueprint of the structure and the structure itself”
[N.C. Seeman]
Una varietà
1
Structural
rigidity
(dopo averla bloccata) C
Costruire cose non naturali con mattoni naturali
“The nucleic-acid ‘system’ that operates in terrestrial life is optimized (through evolution) chemistry incarnate. Why not use it ... to allow human beings to sculpt something new, perhaps beautiful, perhaps useful, certainly unnatural.” Roald
Hoffmann, su American Scientist, 1994
Il DNA è
diametro, 3.4 nm
length, pienamente nel campo dei nanometri, come dimensioni e struttura.
La coesione delle sticky-ends
una significativa diversità
ends
(4N
per code lunghe N) e il prodotto formato nel punto di coesione è
la classica doppia elica. Inoltre, la convenienza della sintesi su supporto solido rende accessibile la programmazione di sequenze differenti di code coesive. In conclusione, le sticky
ends
permettono la previsione dell’associazione intermolecolare e il controllo della geometria al punto di coesione. PERCHÉ
GLI ACIDI NUCLEICI. È
possibile che si possa ottenere una simile affinità
utilizzando antigeni ed anticorpi, ma, a differenza del DNA, l’orientazione relativa di antigene e anticorpo dovrebbe essere determinata volta per volta. Per questo gli acidi nucleici sono unici, forniscono un sistema programmabile e
facilmente trattabile
nota per i complessi formati.
Perché
costruire con il DNA? (ma magari non con quello lineare)
Una via generale alla
cristallizzazione di molecole “refrattarie”
Dal DNA lineare a quello ramificato: la giunzione di Holliday
come elemento per nanocostruzioni
sotto forma di molecole lineari
La giunzione di Holliday, un intermedio della ricombinazione
J1 JUNCTION J1 = Holliday
sequenza modificata in modo da interrompere la simmetria che ne
causa la migrazione nei cromosomi omologhi.
STRUTTURA STABILE
Importante per:
2-
Nadrian
È
DNA Cube
DNA Truncated
Functionalized DNA Lattices
Costruzioni ottenibili ed ottenute a partire dalla J1 o giunzioni simili
Ligazione fisica
Ligazione informatizzata
C. Seeman
0 nm
3 nm
Assemblaggio controllato dalla temperatura
4 giunzioni a 4 braccia
60°
[M. Brucale, G. Zuccheri, B. Samorì, Trends in Biotechnology 2006, 24, 235-243]
7- 14
n m
•Gel non denaturante 10% poliacrilammide, 4°C
1.1+2+3+4+5+6 2.1+2+3+4+5 3.1+2+3+4 4.1+2+3 5.1+5 6.4 M. dig. pBR322 marker
434
123
Caratterizzazione
•Gel non denaturante 10%, RT
•Corsia 1-6 marcate rispettivamente le strands
1-6
Formazione di un array bidimensionale
1D –
0 nm
3 nm
λ(nm)
20 oC 25 oC 30 oC 35 oC 40 oC 45 oC 50 oC 55 oC
The self-assembly of derivatized oligonucleotides (as part of the tile) leads to a rigid functionalized tile. The mechanical coupling of the 4 junctions makes the structure rigid and practical for implementing designed molecular interactions
Una
possibile
applicazione
530 par Cy-5
Cy-3
A programmable molecular peg-board for 1D or 2D localization of functional elements on the nanoscale
Attainable
di DNA
(simplified depiction)
Supramolecular polymers
out of
DNA parallelograms
2 inter-tile
a lower hierarchy
100 nm
1 inter-tile
and geometry
[M. Brucale, G. Zuccheri, B. Samorì, Trends in Biotechnology 2006, 24, 235-243] [M. Brucale, G. Zuccheri
et al, Org. Biomol. Chem. 2006, 4, 3427–3434]
2 tiles
Cooling
on the assembly! (from
System dimensionality
structures (introdotte nel 1993): la progettazione e
realizzazione di tessere rigide per costruire mosaici di DNA a struttura regolare e progettabile. Queste strutture, trovate anche in natura come intermedi della meiosi, sono in pratica costituite da due doppie eliche affiancate, congiunte rigidamente tra loro dallo scambio di catene di DNA, che in un certo segmento sono parte di una doppia elica, mentre in un altro dopo uno scambio sono parte della doppia elica affiancata. Ci sono vari tipi di complessi DX in funzione della geometria dello scambio di strand
e della
topologia. Alcuni di questi costrutti, fattibili sulla carta, non sono sufficientemente stabili per essere utili, altri invece lo sono e possono essere usati per costruzioni mediante l’organizzazione delle sticky
ends
estremità, che dirigono l’assemblaggio di varie unità
DX.
Affiancando 3 doppie eliche e creando due scambi tra ognuna delle doppie eliche si possono formare le strutture TX (triple crossover), di estensione maggiore delle DX. Un’altra variazione sul tema delle DX è
la
centrale della DAE è sostituito da un hairpin. Questo è
disposto in
direzione perpendicolare al piano della DX, per cui protrude rispetto alla DX in direzione perpendicolare rispetto al piano delle due eliche.
Un altro schema di una TX
Mettendo insieme i DX attraverso opportune sticky-ends
si possono ottenere strutture periodiche dalla spaziatura controllata, addirittura tridimensionali (con estensioni fuori dal piano, non totalmente tridimensionali per ora) Le tessere possono essere associate in maniera “non computazionale”
per fare
strutture semplici e ripetitive, mediante un numero limitato di tessere diverse. Alternativamente, un numero generalmente maggiore di tessere possono essere associate in maniera “algoritmica”
facendo calcoli mentre si associano secondo
regole definite nella loro sequenza. È
questo un modo di fare calcoli intrinsecamente più
efficiente di quello proposto da Adleman, in
quanto la codifica opportuna (algoritmica) delle sticky
ends
delle tessere farà
si che solo
l’associazione che segue le regole dettate possa avvenire (mentre una miriade di prodotti si forma nel metodo originale). Una volta che le tessere sono state formate e associate in una struttura, queste sono ligate. La ligazione
genera
oligonucleotidi lunghi che contengono la soluzione del problema codificato (che poi si ottiene analizzando l’oligo).
Strutture di questo tipo si possono fare anche con i motivi TX. È
possibile eseguire assemblaggi algoritmici.
(di DNA) dipende
dalla connessione delle tessere:
una tessera (che nel suo piccolo può essere considerata un oggetto tridimensionale) costituisce un punto di una struttura polimerica più
grande. Il modo in
cui sono attaccato i singoli punti tra loro determina la dimensione topologica dell’oggetto: 0D per A, 1D per B e C, 2D per D ed E.
Geometricamente, l’oggetto E (un tubo) che ha connettività
2D è
o dimensione delle
tessere (0D sia un solo DX che uno smiley di Rothemund).
(Li et al. JACS 2003)
Un altro modo per fare degli array lineari molto sottili e a spessore costante
Questi costrutti lineari fatti di moduli triple- crossover (TX) possono essere funzionalizzati
in punti specifici e servire per localizzare proteine o nanoparticelle
in punti definiti ed
Se si usano coniugati oro-
streptavidina
d’oro molto ordinate
Un modo per fare tubi con le tessere di DNA
Dovuto al gruppo di Reif, l’assemblaggio di tessere TX con un angolo diedro diverso da 180°
induce una
curvatura che porta alla formazione di un tubo di DNA. (Reif, PNAS 2004)
Un modo alternativo per fare tubi di DNA (N. Seeman)
Un modo alternativo per fare tubi di DNA è
quello
di creare una grande tessera cilindrica cava e di assemblare tante di queste nella direzione dell’asse principale, mediante estremità
coesive (Seeman, 2005 NanoLetters).
La costruzione di nastri e reticoli 2D con la 4-by-4 junction
L’elemento base è
costituito da 5 oligo
costituita da 4
giunzioni J1 (una ogni segno cardinale) ed una strand centrale che partecipa a tutte le giunzioni.
Alle code della struttura sono messe delle sticky
ends, cosicché
A seconda di come sono organizzate le giunzioni, l’autoassemblaggio
forma delle strutture a nastro/tubo o degli array bidimensionali piatti: siccome è
possibile avere piccole curvature nel modulo, la giunzione di moduli nella stessa orientazione (A) somma tutte le deformazioni e si crea una curvature che limita la crescita della struttura. L’assemblaggio programmato del modulo in due modi alternati (B) cancella i contributi di curvatura e sono possibili reticoli di grande estensione
A
B
si possono disporre proteine in punti specifici (per fare nanocircuiti)
Biotine sono legate al centro dell’oligonucleotide comune alle 4 giunzioni (su tratti di T4
che non ibridizzano). In soluzione poi l’esposizione alla streptavidina
conduce al
posizionamento preferenziale delle proteine nei punti centrali dei moduli.
I nastri di DNA possono essere metallizzati (ad es. ricoperti con nanoparticelle
di argento
circa 40
e lunghezza di alcuni µm.
Un nastro ricoperto di argento posto sopra elettrodi per misurarne la conducibilità
DNA tetrahedrons A relatively
assemble
Un possibile impiego dei tetraedri di DNA: vettori o biosensori intracellulari Si riesce con una relativa facilità
a fare internalizzare
tetraedri autoassemblati
di DNA
nelle cellule.
Questo possono contenere sequenze in gradi di funzionare da sensori intracellulari, in modo da poter dare segnali i) su una singola cellula, ii) in tempo reale.
Walsh
et
(dopo 24 ore):
2)
3)
4)
5)
fatto di 1.7 kb
di DNA Una struttura formata da un tratto di DNA di 1669 nt che si autoassembla
assieme a
5 oligo
di 40 nt (azzurri) per dare una struttura ottaedrica. Di notevole interesse la dimensione della struttura risultante ed il fatto che il costituente fondamentale della struttura può essere amplificato con la DNA polimerasi non avendo alcun blocco topologico.
DX
Il folding
della struttura richiede la presenza di Mg2+, altrimenti le PX non si formano.
Resa dell’assemblaggio = 50 % circa
Potrebbe ospitare una sfera di 14 nm
di diametro, mentre dall’apertura delle sue facce potrebbe entrare una sfera di 8 nm
di diametro.
è
L’assemblaggio si realizza semplicemente denaturando termicamente la catena pesante in presenza di opportuno quantitativo di catene leggere, poi raffreddando lentamente. Prove dell’avvenuto assemblaggio si possono Ottenere con la cryo-EM
o con la gel-elettroforesi.
elettronica
È
un grande passo verso l’assemblaggio di strutture non polimeriche grandi in 3D
(Stemmer
et
plasmid
from
large
numbers
53 (1995).)
L’assemblaggio di un lungo gene partendo da molti oligonucleotidi: PCR-
assembly.
Nella prima fase (gene assembly) si ottengono frammenti a doppia elica progressivamente più
lunghi, fino al
estensione A’
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Un tessuto molecolare ottenuto mediante assemblaggio di crossover su un lungo DNA naturale, grazie all’aggiunta di oligo
di sintesi di sequenza
Folding long single-stranded DNA
The sequence of DNA provides unique addresses for each location. “Staple strands” bind locations together according to the design.
Folding long single-stranded DNA
The sequence of DNA provides unique addresses for each location. “Staple strands” bind locations together according to the design.
Folding long single-stranded DNA
The sequence of DNA provides unique addresses for each location. “Staple strands” bind locations together according to the design.
Creare un pattern raster
Sono stati sfatati radicalmente almeno due preconcetti: -È
necessaria una sequenza ben pianificata e controllata, senza struttura
secondaria -È
Si possono creare strutture monomeriche
o polimeriche, della forma desiderata, anche con motivi in rilievo.
I motivi in rilievo possono rappresentare una nanolitografia
con risoluzione nanometrica
(circa 6 nm
contemporaneamente di produrre una quantità
enorme di oggetti nanolitografati
ha prodotto in un colpo solo più
carte geografiche di quante ne siano state prodotte prima nella storia dell’umanità
(Erik Winfree)
Origami 3D e forme curve dal gruppo di Shih
Lo sviluppo di un software dedicato (caDNAno) aiuta nel design di strutture tridimensionali sempre più
complesse
È
delle nanostrutture. Queste possono avere proprietà
modulabili mediante
stimoli esterni, determinati dall’operatore o dalla presenza od assenza di reagenti che dipendono da altri processi.
Questa funzionalità
può servire per mettere in movimento parti di una nanostruttura
(per spostate nanooggetti
in una nanofabbrica o per
accendere o spegnere reazioni) o per permettere o vietare reazioni a carico di una struttura. È
fiorente la ricerca di interruttori molecolari di
nuovo tipo per applicazioni di nanoelettronica. Un’altra applicazione importante è
la sensoristica: avere strutture che si comportino in modo
diverso in presenza di una proteina o una sequenza di un acido nucleico è
un modo per rilevarli, l’amplificazione di un segnale biochimico può
essere ottenuta per via nanotecnologica.
Il principio dello strand-exchange
È
possibile sostituire uno strand
accoppiato in una doppia elica con un altro in soluzione lavorando a temperatura costante (al di sotto
della
temperatura di melting) e senza denaturanti.
Si sfrutta il fenomeno della nucleazione ed, in seguito, la reazione procede grazie alla spinta di una maggiore stabilità
termodinamica di
lunga (e più
stabile) che si forma. Serve che ci sia una coda spaiata che possa servire da sito di nucleazione
stabile termicamente
e Andrew Turberfield
(2000) Un motore costituito di oligonucleotidi che si riorganizzano in risposta all’introduzione di oligo
in soluzione, aprendo e chiudendo le punte di una pinzetta molecolare. Il movimento è
visualizzato mediante FRET. Il metodo per togliere un componente dalla struttura è
molto furbo ed efficiente: è
stato copiato da molti successori. Sfrutta la presenza di una coda a ssDNA
nell’oligo
poi da estrarre per fare nucleare una nuova catena ed estrarre l’oligo
(assieme a quello complementare) come dsDNA
a temperatura ambiente, senza dover disassemblare
niente altro: apertura sequenza specifica (anche nel caso della presenza di altri motori analoghi)
Svantaggi dei principali tipi di Macchine Molecolari basate sul DNA
1.
•
di molecole ingombranti
•
Progettazione di un nanomotore basato sulla triplex
Marco Brucale et
Assorbanza a 260 nm
analogo senza TFO (oligo
C non può ripiegare)
Caratterizzazioni dinamiche / 1
Emissione di fluorescenza di A+B* con pH alternante tra 5 e 9 • Intensità
dipendente esclusivamente dalla separazione della coppia E-Q
•
E
Q
il
medesimo
comportamento.
Seeman
e coll.: una macchina molecolare basata su una transizione B → Z. Un tratto di DNA di opportuna sequenza per effettuare la transizione da B a Z è
stato
e quencher). All’aggiunta
di un opportuno reagente, la transizione ha luogo, facendo ruotare le strutture DX tra loro e spostando i fluorofori Svantaggi: difficile eseguire il movimento avanti e indietro tante volte; tutte le sequenze presenti che possono fare B →Z lo fanno in quelle condizioni: poco specifico.
DNA nanomotors can apply
(Sherman
e Seeman, NanoLetters 2004)
Un modo per avere un accurato controllo spaziale della posizione e del moto di un nanomotore
semovente. Sfrutta il metodo di Yurke
e Turberfield
Ogni movimento o rilascio è
comandato dall’aggiunta di una catena di ssDNA. L’uso di bio-ssDNA
consente poi di purificare la miscela dalle catene di rifiuto che non servono usando microsfere magnetiche ricoperte di streptavidina.
[animazione]
c’è
taglia l’oligo
a RNA che legandosi ha esteso un braccio della struttura. Dopo il taglio i frammenti si staccano ed un nuovo oligo
può entrare: fino a che c’è
oligo
[ C. Mao et al, 2004]
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