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Transgenesi dei Transgenesi dei mammiferimammiferi

25.09.09

Corso di Genetica Molecolare

Prof. Catello Polito Transgenesi dei mammiferi

25.09.091980

La Corte Suprema Americana, durante il processo S.A. Diamond vs. A. M. Chakrabarty, stabilì che:

“… tutto quello che esiste sotto il cielo, prodotto dalle mani dell’uomo, inclusi quindi gli organismi modificati con le biotecnologie, è brevettabile.”

Ciò consentì alla Exxon di brevettare un microrganismo che “mangia idrocarburi”



25.09.09

Phil Leder e Tim Stewart brevettarono il primo

organismo transgenico multicelluare, il topo

OncoMouse.

OncoMouse®

Sequenze LTR del virus del tumore mammario murino

(MMTV) e dell’oncogene umano myc, codificante

per un potente fattore di trascrizione umano.

1988



Mammiferi transgenici : come si producono?

1) Vettori retrovirali

2) Microiniezione del DNA

3) Manipolazione di Cellule ESGFP



25.09.09

Requisiti generali per la produzione di organismi transgenici

1) Una metodica che consenta fisicamente di far entrare in contatto il transgene con il DNA dell’organismo da trasformare.

2) Un sistema molecolare che consenta il trasferimento della molecola di DNA ricombinante nel genoma dell’organismo ospite.

3) Un marcatore molecolare che consenta di monitorare l’avvenuto trasferimento genico.

4) Un sistema di espressione del transgene appropriato all’organismo da modificare.

5) Un sistema che consenta la trasformazione di tutte le cellule dell’organismo bersaglio.

Animali PianteTrasformazione di cellule della linea

germinale

Propagazione clonale di cellule totipotenti



25.09.09

a) Ricombinazione omologa

b) Integrazione illegittima



25.09.09

Integrazione illegittima



1) I vettori retrovirali

• Il DNA lineare migra nel nucleo e viene integrato nel DNA della cellula ospite. Il DNA integrato è chiamato provirus.

•L’apparato della cellula ospite trascrive il provirus producendo RNA virali che fungono sia da mRNA che da genomi e saranno impaccati nei nuovi virioni.

• 2 copie di RNA genomico vengono inserite in ogni virione.

Ciclo vitale di un retrovirus

• Genoma a RNA, 2 copie.

• L’enzima trascrittasi inversa converte l’RNA in DNA a doppio filamento nel citoplasma della cellula infetta.



25.09.09

Struttura genomica ed espressione genica di un retrovirus

• Un tipico genoma retrovirale contiene 3 “regioni”:

– Gag (geni per componenti del core proteico del capside)– Pol (geni per trascrittasi inversa, integrasi e proteasi)– Env (geni per le proteine della superficie esterna)



25.09.09

Lunga sequenza terminale ripetuta (inserzione)

Regione Psi+ non codificante ma indispensabile. per confezionamento dell’RNA nel capside.

Proteine strutturali capside

Trascrittasi inversa e integrasi

Proteine per involucro

Genoma retrovirale

Vettore retrovirale

Inserito nelle cellule eucariotiche

con bassissima efficienza tramite

trasfezione o elettroporazione

Con alta efficienzaMediante

INFEZIONELunghezza massima: 8Kb



25.09.09



25.09.09Accoppiamento con maschio e prelievo di ovociti fecondati.

Infezione in cellule in divisione (i retrovirus infettano solo queste).

Impianto in una madre “adottiva”, resa pseudo - gravida dall’accoppiamento con un maschio vasectomizzato.

Selezione dei topi transgenici (Southern blot o PCR su frammento di coda). Per incroci successivi si può ottenere una linea transgenica pura.

1) V

ett o

ri ret ro

vira

l iCorso di Genetica Molecolare


25.09.09



25.09.09

Vettori Retrovirali

Vantaggi

Svantaggi

• Alta efficienza di trasduzione

• Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nell’ospite.

• Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma).

• Molecole di DNA di dimensioni limitate (8 Kb).• Reazioni immunitarie.• Costi elevati.



25.09.09

Gli organismi transgenici possono essere ottenuti modificando cellule embrionali totipotenti mediante iniezione di materiale genetico ricombinante.

2) Microiniezione di DNA

Iniezione di costrutti di espressione lineari, che si integrano spesso sotto forma di concatameri a partire dai primissimi stadi di sviluppo.

ATG *

Promotore Introne

1 2 3 4 5

poly-A

Pronucleo femminile

Pronucleo maschile



25.09.09

Stimolazione della ovulazione di femmine donatrici con iniezione di siero di cavalla gravida e, dopo 48h, di gonadotropina corionica umana. Si ottengono così fino a 35 ovuli per femmina.

Le femmine superovulate vengono accoppiate con maschi e poi sacrificate per la raccolta delle uova fecondate.

Prima della fusione dei nuclei si effettua la microiniezione del costrutto ricombinante nel pronucleo maschile, più grande e facile da localizzare.

Impianto delle uova iniettate in una madre “adottiva”, resa pseudo - gravida dall’accoppiamento con un maschio vasectomizzato.


2) M

icr oin

iez io

ne d

i DN

ACorso di Genetica Molecolare


25.09.09

Microiniezione di DNA

Vantaggi

Svantaggi

• Possibilità di integrare costrutti più grandi di 8Kb.• Costi relativamente bassi.

• Integrazione casuale del transgene.• Mutagenesi inserzionale. • Spesso integrazioni multiple e conseguente effetto tossico

per l’organismo accettore.• Bassa efficienza di integrazione (50 transgenici per 1000

uova iniettate).

Nonostante tutto è la metodica ad oggi più utilizzata per generare topi transgenici ed in generale mammiferi transgenici



25.09.09

Efficienza della microiniezione del DNA

Nei topi al massimo il 5% degli ovuli inoculati genera prole transgenica.



25.09.09Using the mammary gland as a bioreactor (see adjacent figure):

•Increase casein content in milk.•Express lactase in milk (to remove lactose).•Resistance to bacterial, viral, and parasitic diseases.

Some exogenous proteins that have been expressed in the mammary glands of transgenic animals:

•Erythropoietin•Factor IX•Factor VIII•Fibrinogen•Growth hormone•Hemoglobin•Insulin•Monoclonal antibodies•Tissue plasminogen activator (TPA)• α1-antitrypsin



25.09.09

Pesci transgenici

AquAdvantage Salmon

In normal salmon, the gene that controls the production of Growth Hormone is activated by light, so the fish generally grow only during the sunny summer months.

But by attaching a constitutive "promoter sequence", Aqua Bounty ended up with salmon that make growth hormone all year round.



25.09.09

3) Manipolazione di Cellule staminali embrionali (ES cells)



25.09.09

3) Manipolazione di Cellule staminali embrionali (ES cells)•Le cellule ES sono cellule embrionali pluripotenti, che possono dare origine a cellule di tutti i tessuti embrionali.

•Le cellule ES vengono prelevate dalla massa cellulare interna della blastocisti (cellula embrionale indifferenziata) e mantenute in coltura in presenza di cellule o fattori che ne impediscono il differenziamento.

•In queste condizioni le cellule ES mantengono intatta la loro capacità di differenziarsi in modo appropriato in qualunque tessuto, una volta reintrodotte in un embrione

Nodo embrionale



25.09.09

Come si coltivano le cellule ES?

Embrione

Cellule “nutrici”

Cloni di ES in coltura

•Le cellule del nodo embrionale si possono prelevare mediante l’utilizzo di un micromanipolatore e possono essere messe in coltura su piastre contenenti un mono-strato di cellule “nutrici”.

•Le cellule “nutrici” sono di solito cellule embrionali epidermiche, trattate in modo che non possano più dividersi. Tali cellule forniscono il substrato per l’adesione ed il rilascio di nutrienti per le cellule ES.

•Le cellule ES, a differenza di molte altre linee cellulari animali, possono essere mantenute in coltura per molte generazioni.

Blastocisti

Nodo embrionale



25.09.09

EritrocitiCardiomiocitiCellule β-

pancreatiche

Leukemia Inhibitory Factor (L. I. F.)

mesodermaendoderma

Muscolo liscio

Neuroni

neuroectoderma

Epidermide

BMP4

Cellule totipotenti

Serum free medium

1234567

Sox-1

Oct3/4, Fgf4, etc.

days



25.09.09

Accoppiamento con maschio e prelievo di ovociti fecondati. Prelievo cellule del nodo embrionale. Allestimento della coltura di cellule ES.

Trasformazione delle cellule ES mediante una delle tecniche convenzionali (Calcio Fosfato, Lipofezione o Elettroporazione. Arricchimento delle cellule trasformate mediante selezione (resistenza Neo).

Microiniezione delle cellule ES trasformate in una nuova blastocisti ricevente. Il topo transgenico che si svilupperà dalla blastocisti manipolata sarà una “chimera”.





25.09.09

Introduzione di cellule ES nella blastocisti

Cellule ES derivanti dalla “blastocisti” donatrice da

Topo nero (oppure ES trasformate contenenti un

transgene)

Blastocisti “ricevente” da topo albino (oppure da

topo wild-type)

Chimera transgenica (nel caso delle cellule ES

transgeniche l’effetto chimera potrebbe essere non

visibile)



25.09.09

Manipolazione di Cellule staminali embrionali (ES cells)

Vantaggi

Svantaggi

• Buona efficienza di integrazione

• Necessità di avere a disposizione delle linee cellulari ES.• Mutagenesi inserzionale (se si sfrutta il meccanismo

dell’inserzione illegittima).• Costi abbastanza elevati.

• Possibilità di utilizzare le metodiche di ricombinazione omologa e sito-specifica.



25.09.09 Types of Recombination

Homologous - occurs between sequences that are nearly identical (e.g., during meiosis).

Site-Specific - occurs between sequences with a limited stretch of similarity; involves specific sites.



25.09.09 Tipi di eventi di Ricombinazione



25.09.09 L’esistenza della ricombinazione e della possibilità di trasformare le cellule ES in coltura prima dell’impianto in una blastocisti rendono possibile le metodiche di Gene Targeting, cioè la sostituzione o l’inserimento in punti precisi del genoma di una molecola di DNA con un’altra.

Nel caso dei mammiferi con genoma completamente sequenziato tale metodica consente di scegliere il sito esatto di inserzione/sostituzione.

Questo consente di eliminare il problema dell’effetto di posizione e della mutagenesi inserzionale.

Come si produce un ceppo transgenico per Gene Targeting?



25.09.09

Sequenze di DNA per RICOMBINAZIONE OMOLOGA nel genoma bersaglio

TRANSGENE di interesse

Geni della Timidina Kinasi (virus herpes simplex). In presenza di GANCICLOVIR: MORTE

Gene che conferisce resistenza alla G418

Cost

rutt

o p

er

Gene T

arg

eti

ng in t

opi



25.09.09

ASPECIFICA

SPECIFICA



25.09.09

ASPECIFICA

SPECIFICA

1) Aggiunta di G418: SELEZIONE POSITIVA di cellule che hanno INTEGRATO il DNA2) Aggiunta di GANCICLOVIR: SELEZIONE NEGATIVA di cellule con INTEGRAZIONE ASPECIFICA

SELEZIONE POSITIVA e NEGATIVA



25.09.09

Accoppiamento con maschio e prelievo di ovociti fecondati. Prelievo cellule del nodo embrionale. Allestimento della coltura di cellule ES.

Trasformazione delle cellule ES mediante una delle tecniche convenzionali (Calcio Fosfato, Lipofezione o Elettroporazione. Arricchimento delle cellule trasformate mediante doppia selezione (resistenza Neo + TK).

Microiniezione delle cellule ES trasformate in una nuova blastocisti ricevente. Il topo transgenico che si svilupperà dalla blastocisti manipolata sarà una “chimera”.





25.09.09

Knock-In

Knock-Out



25.09.09

La ricombinazione sito-specifica: il sistema Cre-lox

Il limite principale dei topi transgenici Knock-Out (KO) per un

gene e’ la possibile mortalità degli omozigoti durante lo sviluppo.

Soluzione : l’induzione della mutazionein modalità tempo e tessuto specifica.



25.09.09

Il sistema Cre-lox

Sistema alla base della tecnica:

Meccanismo di ricombinazione del fago P1 con i siti Lox e la ricombinasi sito-specifica Cre.

Cre Recombinase

LoxP: locus di crossover (2 sequenze palindromiche di 13bp + regione centrale di 8bp)

LoxP “attira” la ricombinasi CRE la quale ricombina le sequenze di DNA adiacenti.



25.09.09

Il sistema Cre-lox

Sistema alla base della tecnica:

Meccanismo di ricombinazione del fago P1 con i siti Lox e la ricombinasi Cre.

Lox Lox

Lox

Lox

CRE Recombinase



25.09.09

Il sistema Cre-lox

Con questo sistema si possono ottenere dei mutanti che perdono una data regione solo attivando la ricombinasi Cre.

Per fare questo si devono costruire dei vettori con la regione genetica da eliminare fiancheggiata da siti Lox.

Con questa strategia si possono ottenere topi transgenici per geni che sono letali in fasi diverse e soprattutto, con l’espressione della ricombinasi Cre tessuto specifica, si può far avvenire il knock-out del gene solo in particolari tessuti dove si esprime o dove si induce Cre.



25.09.09

G418



25.09.09

I siti Lox derivano da fago P1 (non esistono nel genoma animale/vegetale)quindi non possibilità di ricombinazione in altri siti del genoma



25.09.09



25.09.09 Il SISTEMA Cre-Lox permette il controllo dell’espressione genicanello SPAZIO e nel TEMPO

Utilizzo di un PROMOTORETESSUTO SPECIFICO

Utilizzo di un PROMOTORE:

-dipendente dallo STADIO di SVILUPPO-INDUCIBILE



25.09.09



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Referenze

1)Curr Gene Ther. 2009 Dec;9(6):459-74.State-of-the-art lentiviral vectors for research use: risk assessment and biosafety recommendations.Pauwels K, Gijsbers R, Toelen J, Schambach A, Willard-Gallo K, Verheust C, Debyser Z, Herman P.

2)Proc Natl Acad Sci U S A. 1980 Dec;77(12):7380-4.Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.Gordon JW, Scangos GA, Plotkin DJ, Barbosa JA, Ruddle FH.

3)Cell. 1986 Feb 14;44(3):419-28.High frequency targeting of genes to specific sites in the mammalian genome.Thomas KR, Folger KR, Capecchi MR.

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5)Transgenic Res. 2010 Jun;19(3):363-71. Epub 2009 Sep 26.Zinc-finger nucleases: a powerful tool for genetic engineering of animals.Rémy S, Tesson L, Ménoret S, Usal C, Scharenberg AM, Anegon I.



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