Lezione 7 il test all'antiglobulina diretto positivo e aea

Il test all’antiglogulina diretto (TAD o Coombs diretto) positivo

Prima di iniziare, un’altro

alloanticorpo…

Caso 4

-

3+

2+

-

Caso 4

C

-

-

3+

2+

2+

3+

2+

2+

2+

2+

-

-

Caso 4

C F

- -

- -

3+ 3+

2+ 3+

2+ 3+

3+ 3+

2+ 3+

2+ 3+

2+ 3+

2+ 3+

- -

- -

Caso 4

Caso 4:

Gruppo e fenotipo del

paziente

0 Rh pos, CCDee

La probabile specificità anticorpale

è…….

2+

2+

2+

2+

Caso 5

Complemento

• Il sistema del complemento è costituito da più di 15

componenti la cui attivazione sequenziale e associazione

in elementi funzionale porta a 3 importanti effetti:

• Rilascio di peptidi attivi nell’infiammazione

• Deposito di C3b sulla superficie di membrana, un

sito di attacco per i fagociti (opsonina)

• Lisi cellulare

• Insieme giocano un importante ruolo nei confronti delle

infezioni

• siero: fase fluida

• superficie cellulare: luogo dove

avviene l’attivazione e la

‘costruzione’ delle unità funzionali

• l’attivazione del complemento può

avvenire come conseguenza del

riconoscimento nell’ambito della

immunità adattativa oppure innata

• VIA CLASSICA (adattativa). Iniziata

da una reazione Ag-Ab (IgG1, IgG3 o

IgM) sulla superficie cellulare

• VIA ALTERNATIVA: attivazione delle

componenti del complemento

direttamente da polisaccaridi o PRR sulla

superficie di alcuni batteri

• Ioni calcio e magnesio sono necessari

per alcune fasi dell’attivazione

• funzionamento con il

meccanismo a cascata: un

singolo evento di attivazione

può portare ad una serie di

eventi

• l’attivazione avviene solitamente sulla

superficie cellulare ed è limitata in quanto

i componenti hanno vita breve e sono

presenti inattivatori

• Via classica: Ag-Ab legano C1+C2+C4

• il complesso agisce come ‘convertasi’

che scinde C3

• C3 è l’elemento centrale di tutte le

reazioni del complemento

• C3a (piccolo frammento), C3b

(grande)

• una porzione del C3b si deposita

sulla membrana e funge da attacco

per fagociti

• C2a+C4b+C3b=convertasi per C5

• C5a anafilotossina

• C5b: inizia la costruzione del

complesso C6+C7+C8+C9 che porta

al Membrane Attack Complex

TAD

• Si esegue per determinare se i globuli rossi sono

sensibilizzati in vivo da:

immunoglobuline

complemento

entrambi

Condizioni in cui il TAD può essere +

• autoanticorpi contro i GR

• alloanticorpi contro GR trasfusi

• anticorpi contro farmaci adesi alla membrana dei GR

• anticorpi presenti in emocomponenti trasfusi che aderiscono ai

GR dei riceventi

• anticorpi prodotti da passenger lymphocytes presenti in organi o

tessuti trapiantati

• alloanticorpi materni che attraversano la placenta e aderiscono

alle membrane dei GR fetali

• globuline che aderiscono aspecificamente alla membrana dei GR

• fissazione del complemento sulle emazie che può essere dovuta

all’attivazione del complemento (alloAb, autoAb, farmaci, infezioni)

Il TAD + NON indica

necessariamente che i

GR sensibilizzati hanno

una sopravvivenza

ridotta

• I globuli rossi di soggetti sani hanno

da 5 a 90 molecole IgG adese/GR.

Hanno inoltre da 5 a 40 molecole di

C3d.

• Con questi numeri, il TAD è negativo

poiché il limite di sensibilità del test è

100 a 500 molecole di IgG/GR e 400 a

1.100 di C3d

• Da 1 a 15% dei pazienti ricoverati

in ospedale ha un TAD+

• la maggioranza dei pazienti con

TAD+ non ha segni di emolisi

• alcuni pazienti tuttavia presentano

un aumento della distruzione dei GR

TAD+ è associato a:

• anemia falciforme

• beta talassemia

• nefropatie

• malattie autoimmuni

• mieloma multiplo

• AIDS

TAD: note metodologiche

• campione di sangue in EDTA, per prevenire

la fissazione del complemento in vitro

• iniziare con un siero antiglobuline

polispecifico (AHG) in grado di rilevare sia le

IgG che il C3d

• se si esamina un campione di emazie del

cordone ombelicale è opportuno l’uso del

siero anti-IgG

• se positivo, procedere con reagenti

monospecifici per le IgG e C3d

TAD + : note metodologiche

• procedere con reagenti monospecifici per le IgG e

C3d

• esaminare i siero-plasma per rilevare e

identificare Ab significativi

• esaminare un eluato

• L’eluizione stacca gli Ab legati alle emazie

sensibilizzate che vengono quindi studiati

• quando un eluato reagisce con tutte le emazie del

pannello, si tratta probabilmente di un

autoanticorpo

TAD + : note metodologiche

• quando non sono presenti nel siero anticorpi

inattesi e se il paziente non è stato trasfuso di

recente, non è necessaria alcuna altra indagine

sull’autoanticorpo

TAD+

Informarsi con il curante in merito a:

• diagnosi

• farmaci recenti

• gravidanze in atto

• anamnesi trasfusionale

• segni di anemia emolitica

• trapianti

Emolisi immuno-mediata

• riduzione della sopravvivenza dei GR dovuta a

meccanismi effettori della risposta immune

• se il midollo osseo compensa la distruzione delle

emazie, non si verifica anemia

• non tutte le anemie emolitiche sono di natura

immune

• la diagnosi di anemia emolitica si basa sulla clinica

e su test di laboratorio (Hb-Ht, reticolociti, striscio di

sangue, bilirubina, aptoglobina, LDH) e talvolta su

test di sopravvivenza eritrocitaria

Tipi di emolisi

• INTRAVASCOLARE: rilascia Hb libera nello spazio

intravascolare (emoglobinemia e emoglobinuria)

• EXTRAVASCOLARE: più comune. Aumento della

bilirubinemia ma non c’è emoglobinemia ne

emoglobinuria

Tratto da: Technical manual AABB, 15° edizione

Anemia emolitica autoimmune (AEA) da anticorpi caldi 1

• E’ l’AEA più comune, associata ad anticorpi che reagiscono

a 37°C

• TAD con monospecifici: da IgG, da C3d oppure da entrambi

• SIERO:

• gli auto-Ab sono di classe IgG e spesso reagiscono

contro tutte i GR del pannello nel TAI

• se tutto l’Ab è auto-assorbito, nel siero può essere

evidenziato solo un basso titolo anticorpale

• L’auto-Ab diventerà evidente solo dopo aver ‘saturato’

tutti gli antigeni eritrocitari.

Anemia emolitica autoimmune da anticorpi caldi 2

• ELUATO: solitamente reagisce con tutti i GR del pannello,

con un incremento della reattività quando si utilizzano emazie

pretrattate

• Specificità anticorpali: complesse, frequentemente difficili da

risolvere. Talvolta nell’ambito del sistema Rh. In questo caso

l’Ab non reagisce con i GR D- - o Rh null.

• Sono stati riferiti auto-Ab nei confronti di Ag dei sistemi LW,

Diego, Duffy, Kidd e Kell

• Raramente è necessario determinare la specificità di un

auto-Ab ai fini trasfusionali


• TRASFUSIONE:

• i pazienti con sintomi moderati di emolisi tollerano bene

le trasfusioni

• Se l’auto-Ab è presente nel siero, può mascherare la

presenza contemporanea di un ALLO-Ab che è un

rischio aggiuntivo

• La trasfusione può stimolare la produzione di allo-Ab

• Nei pazienti con emolisi attiva, i GR trasfusi possono

essere distrutti più rapidamente dei GR del paziente e

ciò può portare ad una coagulazione intravascolare

disseminata (CID)


IgM

• Esiste una tipologia di AEA caratterizzata da agglutinine

calde di classe IgM che reagiscono a 37°C.

• Sono rare ma molto severe. I pazienti affetti hanno una

prognosi infausta

• difficile eseguire il TAD poiché le emazie tendono ad

agglutinare spontaneamente

• nel siero, IgM abbastanza deboli. Range termico ottimale tra

20 e 30°C

Sindrome da agglutinine fredde (SAF) 1

• 16-32% delle AEA

• forma acuta secondaria a malattie linfoproliferative o

infezione (Mycoplasma pneumoniae)

• forma acuta=pazienti anziani

• spesso le agglutinine interferiscono con la tipizzazione AB0

ed Rh. Per evitare questi problemi, è necessario tenere i

prelievi in EDTA a 37°C e lavare i GR con soluzione salina a

37°C prima di determinare il gruppo sanguigno

• TAD: in quasi tutti i casi si rileva complemento adeso ai GR


• L’autoagglutinina fredda è una IgM che agglutina i GR alle

temperature del circolo periferico e fa aderire C3 e C4

• quando i GR arrivano in aree dove la temperatura è più alta,

le IgM si staccano ma rimane adeso il complemento

• le emazie con adeso il complemento vengono fagocitate dai

macrofagi (che hanno il recettore per il C3b) del fegato

• SIERO: ci sono IgM reattive a freddo che possono provocare

emolisi anche a temperature > 32°C, quindi causano AEA

• ELUATO: non è utile poiché solitamente non ci sono

immunoglobuline adese ai GR


• Specificità: spesso anti-I, ma non ha un significato

diagnostico

• esami pre-trasfusionale: servono per verificare che non ci sia

un alloanticorpo oltre all’agglutinina

• autoassorbimento a freddo può allontanare gli autoanticorpi

e consentire la determinazione dell’eventuale alloanticorpo

• esiste un test in commercio che rimuove gli autoanticorpi

anti-I mediante l’utilizzo di stromi di coniglio

Anemia emolitica autoimmune (AEA) mista

• AEA da anticorpi caldi+autoagglutinine a freddo.

• Due tipi:

• pazienti con autoanticorpi freddi IgM ad alto titolo con

ampio range termico

• Pazienti con titolo normale ed ampio range termico

• TAD: IgG e C3d positivo

• Siero: IgG reattive a caldo+IgM

• Eluato: dovrebbe evidenziare un IgG reattiva a caldo

• Specificità: anti-I per l’Ab freddo. Difficilmente chiara

specificità per l’Ab caldo

Emoglobinuria parossistica a frigore 1

• Solitamente secondaria ad una infezione virale nell’età

pediatrica

• negli anziani forma cronica

• E’ causata da un auto-Ab IgG che reagisce a freddo e fissa

il complemento. Si comporta come l’IgM fredda, ovvero si

fissa ai GR quando questi circolano nelle zone più fredde del

corpo e poi si stacca quando i GR circolano in zone più calde,

lasciando però fissato il complemento

• TAD: positivo per i complemento (ma se si lavora a freddo, si

può evidenziare anche l’IgG

• Siero: EMOLISINA BIFASICA

Emoglobinuria parossistica a frigore 2

• ELUATO: quasi sempre negativi

• SPECIFICITA’: anti-P

• TRASFUSIONE: più frequente nei bambini. Il sangue P

negativo è rarissimo. Non aspettare la ricerca del sangue

compatibile

Anemia emolitica autoimmune (AEA) TAD negative

• Non si riece ad evidenziare l’auto-An ne sulla

superficie dei GR ne nel siero

• IgA o IgM?

• Ab a bassa affinità si staccano durante il lavaggio

• lavare con soluzione fredda o LISS freddo

• poche molecole anticorpali sulla superficie dei GR

Anemia emolitica da farmaci 1

• la somministrazione di farmaci talvolta induce la formazione

di autoanticorpi verso il farmaco o verso antigeni eritrocitari

intrinseci che possono:

• determinare un TAD +

• distruggere i GR

• Entrambe le situazioni

• gli Ab prodotti possono essere DIPENDENTI dal farmaco o

INDIPENDENTI

Tratto da Anemie emolitiche autoimmuni: diagnosi e terapia. W. Barcellini, M.A.

Villa, N. Revelli, A. Zanella. Inserti Cultura Ortho Diagnostic Systems

Anemia emolitica da farmaci 2

• TAD IgG nel 94% dei casi, IgG+C3 nel 6%

• IgG nell’eluato. Simile alle AEA da Ab caldi.

• Specificità nell’ambito del sistema Rh (spesso)

• A volte è necessario eseguire le ricerche di anticorpi in

presenza del farmaco

• L’elenco dei farmaci descritti come possibili cause di AE è

molto lungo e comprende analgesici, antipiretici,

antiinfiammatori, antitubercolari, antibatterici, antimicotici,

anibiotici, antistaminici, diuretici, antiipertensivi, inibitori

tiroidei, antineoplastici, sedativi, ipnoinduttori, epatoprotettivi,

antiaritmici, antidiabetici, immunosprressori ecc.

Tratto da Anemie emolitiche autoimmuni: diagnosi e terapia. W. Barcellini, M.A.

Villa, N. Revelli, A. Zanella. Inserti Cultura Ortho Diagnostic Systems

Lezione 7 il test all'antiglobulina diretto positivo e aea

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