Le colture cellulari

Il laboratorio adibito alla preparazione e propagazione delle colture cellulari deve

necessariamente essere situato in strutture tali da consentire la riduzione dei rischi di

contaminazioni esterne.

Idealmente, un laboratorio di questo tipo dovrebbe essere completamente isolato, quindi in ambienti in cui l’aria è filtrata con filtri ad elevata efficienza

(HEPA: high efficiency particulate air) ed in pressione positiva;

l’ingresso agli estranei dovrebbe essere limitato e il movimento del personale che in esso opera ridotto.

Nella realtà pratica, i laboratori di colture cellulari sono generalmente

provvisti solo parzialmente di quanto ritenuto ottimale e possono

supplire ad eventuali carenze strutturali mediante il ricorso a

particolari attrezzature e all’applicazione di norme igieniche

molto accurate.

VIE DI TRASMISSIONE

Le più frequenti vie di trasmissione durante l’attivitàdi laboratorio sono:

� l’ingestione accidentale (per via orale), � l’inalazione (per via aerea), � l’inoculazione (ferite con oggetti taglienti e punture accidentali), � la contaminazione della cute o delle mucose (cute con ferite o lesioni).

Per es. la presenza di animali di laboratorio può comportare un’esposizione attraverso tutte queste vie di trasmissione per passaggio degli agenti patogeni ai lavoratori, mediante sangue, urine, feci.

In ogni caso è buona norma:

� pulire i banchi di lavoro con adatte soluzioni detergenti e disinfettanti all’inizio ed al termine di ogni manipolazione di agenti biologici;� mantenere porte e finestre chiuse, ridurre al minimo gli spostamenti degli operatori e la presenza di eventuali visitatori durante la manipolazione delle culture;� evitare di pipettare con la bocca qualsiasi materiale biologico, utilizzando gli appositi sistemi di aspirazione automatici o manuali;� etichettare ogni singolo contenitore in modo da risalire con estrema facilità al suo contenuto anche a distanza di tempo;� utilizzare camici, guanti e proteggere viso ed occhi con appositi dispositivi di protezione individuale durante tutte le operazioni che possono in qualche modo provocare schizzi o produzione di aerosol;� prima di utilizzare ogni apparecchio leggere il manuale di istruzioni e non utilizzare apparecchiature elettriche non a norma;� in presenza di bombole di gas compresso assicurarsi che siano ben ancorate;� tenere distinti i camici dagli abiti comuni;� lavarsi le mani dopo aver manipolato materiale biologico o animali, anche se si sono indossati i guanti protettivi, prima di uscire dal laboratorio ed in ogni caso al cessare dell’attività lavorativa;� nell’aria di lavoro non si deve mangiare, bere, fumare, né applicarsi cosmetici;� conservare eventuali alimenti in frigoriferi appositamente dedicati e collocati al di fuori dell’area di lavoro;� tutte le soluzioni ed i rifiuti devono essere opportunamente decontaminati prima dell’eliminazione e devono essere smaltiti secondo le disposizioni vigenti in materia.

Inoltre:

•consultare le schede di sicurezza per valutare le caratteristiche chimico-fisiche della sostanza da utilizzare e stabilire le procedure più idonee per l’utilizzo in sicurezza delle sostanze e dei preparati presenti in laboratorio;•conservare in laboratorio solo i quantitativi di sostanze pericolose, necessari per l’attività giornaliera;•non lavorare mai soli in laboratorio, specialmente fuori dai normali orari di lavoro ed in caso di operazioni complesse e pericolose;•non lasciare mai senza controllo reazioni chimiche in corso;•usare sempre le sostanze pericolose sotto cappa con sufficiente aspirazione;•preparare ed usare sempre i quantitativi minimi necessari di sostanze e preparati, per evitare sprechi, rischi maggiori per chi lavora, inquinamento all’ambiente con lo smaltimento di quanto non si è utilizzato.

PERICOLOPERICOLO: la capacitàdi una sostanza o agente biologico di causare un danno

RISCHIORISCHIO: la probabilità che una sostanza o un agente biologico possano essere dannosi in circostanze specifiche

Sostanza esplosiva: sostanza che può andare incontro ad un violento cambiamento distato con rapidissima produzione di una grande quantità di calore e di gas. Sostanze esplosive sono ad esempio l'acido picrico e diversi composti organici nitrurati, la loro vendita è soggetta a controlli e restrizioni. Numerose sostanze infiammabili possono dare origine ad esplosivi se mescolate con sostanze comburenti.

Sostanza radioattiva: materiali contenenti isotopi radioattivi, cioè atomi che emettono particelle alfa o beta e raggi gamma. Esistono norme estremamente severe riguardanti la loro conservazione, manipolazione e smaltimento. Gli operatori devono essere muniti di opportuni dosimetri personali e gli ambienti in cui si opera devono essere attrezzati per evitare ogni eventuale fuga.

Sostanza tossica, può provocare la morte: sostanze che a seguito di ingestione, inalazione o contatto con la pelle possono provocare avvelenamenti gravi e /o mortali. Vanno maneggiate con molta cautela, quando non impiegate debbono essere conservate in ambienti chiusi a chiave, sui loro contenitori deve essere bene in vista l'indicazione della pericolosità.

Sostanza comburente od ossidante: sostanze che, a contatto con materiali infiammabili ne provocano o ne mantengono la combustione fornendo l'ossigeno necessario, ad esempio una miscela di zucchero e nitrato di potassio brucia in modo molto energico. In qualche caso possono anche formare miscele esplosive. Sono sostanze comburenti ad esempio: nitrati, clorati e perclorati, acido nitrico concentrato. Vanno conservate con cura, lontano da sostanze infiammabili, se si debbono mescolare con una di queste ultime bisogna procedere con la massima cautela.

Sostanza corrosiva: sostanze che esercitano azione distruttiva sui tessuti vivi e sulle attrezzature (acidi e basi forti concentrati, ad esempio). Evitare assolutamente il contatto con la pelle, gli occhi e la bocca. Nel caso usare occhiali e guanti protettivi, se si tratta di sostanze volatili operare sotto cappa aspirante.

Sostanza nociva (Xn): sostanze che ingerite o inalate provocano, nell'immediato, danni limitati, in alcuni casi però un'esposizione prolungata può provocare danni gravi od avere anche effetti letali (esempio: solventi clorurati). E' necessario seguire le prescrizioni riportate sulle etichette e seguire le indicazioni date per l'uso.

Sostanza irritante (Xj): sostanze che possono provocare reazioni infiammatorie od allergiche in seguito a contatto con la pelle. E' necessario seguire le prescrizioni riportate sulle etichette e seguire le indicazioni date per l'uso.

Sostanza infiammabile: sostanza che, in presenza di un comburente (solitamente l'ossigeno dell'aria) può dare origine ad una reazione di combustione più o meno violenta, in genere perché si sviluppi la combustione è necessaria oltre alla presenza della sostanza infiammabile (combustibile) e della sostanza che con essa reagisce (comburente) anche una piccola energia di attivazione che avvia la reazione. Le sostanze infiammabili vanno maneggiate in ambienti in cui non siano presenti fiamme libere o fonti di scintille elettriche.

Contaminazione biologica: pericolo di contaminazione da colture batteriche o cellulari, simbolo presente in laboratori di microbiologia,virologia e citologia. Da osservare che il pericolo di contaminazione è a doppio senso: l'operatore può essere contaminato da batteri o virus in coltura, d'altro canto il medesimo operatore può contaminare colture con i batteri presenti sulla proprio pelle o nel proprio fiato.

Le colture cellulari richiedono:

� ambiente sterile� elementi nutritivi di base (glucosio, aminoacidi, sali minerali)� fattori di adesione, presenti nel siero� fattori di crescita, presenti nel siero� stabilità di pH e temperatura

COLTURE CELLULARI:COME SI LAVORA?

Requisito indispensabile AMBIENTI STERILI

CAPPE BIOLOGICHE

� Ambienti isolati e separati per le singole attività: preparazione terreni, isolamento cellule, mantenimento cellule in coltura, ecc.� Procedure asettiche� Materiali sterili e mantenuti in condizioni sterili� Superfici non porose e facilmente lavabili� Rapida eliminazione dei rifiuti

MANTENIMENTO DI UN LABORATORIO PER COLTURE CELLULARI

Gestione dell'area sterile

� La pulizia e la perfetta efficienza dell'area sterile devono essere controllate costantemente.

� Si accede e si lavora indossando i dispositivi di protezione individuali (camice), i guanti protettivi (da cambiare spesso).

� I rifiuti biologici e chimici, solidi e liquidi prodotti nel laboratorio, devono essere raccolti, separati ed eliminati in modo corretto.

� I piani di lavoro devono essere mantenuti puliti, inoltre occorre controllare e mantenere la pulizia, il buon funzionamento e l'efficienza dei vari strumenti (microscopio, pipettatori automatici, cappe a flusso laminare, incubatori, bagno termostatato, frigorifero, ecc).

� Cappa a flusso laminare� Incubatore a CO2

� Microscopio ottico� Autoclave� Centrifuga� Bagno ad acqua� Frigo-congelatore� Bidone per azoto liquido

ATTREZZATURE PRINCIPALI

Laboratorio di Coltura Cellulare

• Spazio o area di lavoro

• Cappa a flusso laminare

• Abbigliamento da laboratorio

• Vetreria e plastica di laboratorio

• Reagenti colturali

� Flusso d’aria unidirezionale formato da filetti di aria sterili paralleli che si muovono alla stessa velocità in tutti i punti creando una corrente d’aria omogenea senza turbolenze� Fronte d’aria sterile che trascina lontano dalla zona di lavoro ogni contaminante creando un ambiente sterile� Si ottiene combinando un filtro assoluto (HEPA) con una massa d’aria che lo attraversa alla velocità costante di 0,45 m/sec

Filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air):

� è costituito da un sottile foglio a base di fibre di vetro submicroniche montato in un telaio di alluminio o di legno

� ha un efficienza del 99.999% su particelle di 0,3 micron

CAPPE BIOLOGICHE A FLUSSO LAMINARE

� Proteggere solo il campione dallacontaminazione: cappa a flusso laminare orizzontale

� Proteggere sia il campione chel’operatore: cappa a flusso laminareverticale

� Proteggere campione, operatore eambiente (mat. patogeno): cappe contro il rischio biologico (Biohazard)

Per le colture cellulari si utilizzano CAPPE A FLUSSO LAMINARE

VERTICALE

CAPPE BIOLOGICHE A FLUSSO LAMINARE

A, C, E Filtri HEPA

Cappa a flusso laminare di classe II

● Cappe biologiche di classe II: maggiormente impiegate in laboratori di ricerca e microbiologici, sono anche definite cappe di sicurezza microbiologiche.

● Cappe biologiche di classe III: caratterizzate da una chiusura totale ermetica, funzionano a pressione negativa; le manipolazioni all’interno della camera sono consentite da due o più guanti di gomma incorporati nella struttura della cappa.

I campioni, in contenitori chiusi, sono introdotti tramite un sistema di doppi sportelli. Hanno un filtro HEPA sull’aria in ingresso ed un doppio filtro HEPA

sull’aria in uscita

Protezione totale dell’operatore e dell’ambiente

Manipolazioni ad alto rischio biologico

All’interno dell’organismo, le funzioni vitali (nutrizione, controllo di pH, protezione,

mantenimento della temperatura,…) sono regolate nei tessuti da differenti sistemi di controllo.

Una volta che le cellule sono nel terreno di coltura, alcune funzioni devono essere mantenute

con l’aiuto di strumenti.

Mantenimento dellecondizioni fisico-chimiche di una coltura

Condizioni fisico-chimiche

● pH 7.2-7.4

● Sistema tampone (NaHCO3)

● Temperatura 35-37° C

● Anche se normalmente le cellule di mammifero si coltivano a 37° C, per certi tipi di cellule l’incubatore deve poter essere regolato in modo preciso anche a 30° C o 34° C.

● Le cellule coltivate richiedono un controllo di temperatura rigoroso almeno quanto quello dell’organismo vivente.

Condizioni fisico-chimiche

Condizioni fisico-chimiche

● Molte colture cellulari sono tamponate con bicarbonato per mantenere costante il pH

● Il pH del terreno dipende generalmente dalla % CO2

nell’incubatore

● La concentrazione di CO2 richiesta può andare da 0.5% a 8.5% in funzione del contenuto di NaHCO3 nel terreno utilizzato e del pH desiderato

Relazione tra [NaHCO3] e il pH

In alcuni casi si può incorporare nel medium di crescita un colorante sensibile al pH per avere un controllo visivo dello stato del pH durante

la crescita.

Condizioni fisico-chimiche

rosso-arancio a pH 7.3

rosso-viola a pH alcalino

giallo-arancio a pH acido

Rosso Fenolo

La pressione parziale (pCO2) di CO2 (5%) usata nella coltura delle cellule corrisponde alla pCO2

cellulare misurata all’interno dei tessuti (35-45 mmHg, equivalgono al 4.6 - 5.9% di CO2).

Così l’incubatore riproduce rigorosamente le naturali condizioni di sviluppo delle cellule.

�Mantenimento temperatura

� Mantenimento grado di umidità

� Mantenimento del pH

� Protezione dalle contaminazioni

INCUBATORE: FUNZIONI PRINCIPALI

Le cellule possono sopportare l’ipotermia (si conservano congelate), ma la loro attivitàmetabolica è notevolmente disturbata.

Le cellule non possono sopportare l’ipertermia: anche piccoli aumenti di temperatura per brevi

periodi possono causare la morte.

Temperatura costante di 37° C

MANTENIMENTO TEMPERATURA

L’obiettivo è limitare l’evaporazione dell’acqua contenuta nei terreni di coltura per non

provocare un aumento nella pressione osmotica incompatibile con la vita delle cellule.

In un incubatore a CO2 il parametro della temperatura è direttamente collegato con

l’umidità relativa (RH%).

Nei migliori incubatori RH >98%

MANTENIMENTO GRADO DI UMIDITA’

Il metabolismo attivo delle cellule in coltura produce grandi quantità di ioni H+ che provocano, in poche ore, una eccessiva acidificazione del terreno di coltura, se non viene aggiunto un

tampone (di solito carbonato/bicarbonato). Il sistema tampone interviene soltanto verso la conclusione del

periodo di coltura, quando il metabolismo delle cellule ha prodotto ioni H+ sufficienti a provocare la riduzione del pH.

La presenza della CO2 permette al sistema tampone del terreno di mantenere la sua efficacia (“potere tamponante”): infatti diminuendo la pressione della CO2 l’efficacia del tampone si

riduce del 75% in meno di 5 minuti (cambio di colore dell’indicatore presente nel terreno).

All’interno dell’incubatore c’è una pressione pCO2 pari al 5% che corrisponde alla pCO2 cellulare misurata all’interno dei tessuti.

MANTENIMENTO DEL pH

� Solo introduzione di contenitori in polistirene contenenti cellule in coltura

� Solo utilizzo di acqua sterile e trattatacon benzalconio cloruro

� Suo utilizzo solo dopo avere effettuato il ciclo di sterilizzazione interno che dura 24 ore

PROTEZIONE DA CONTAMINAZIONE DELL’INCUBATORE

CELLULE IN MONOSTRATO NECESSITANO DI UNA SUPERFICIE DI SUPPORTO PER ADERIRE E CRESCERE

� Capsule di Petri� Piastre multi-pozzetto (da 6, 12, 24 o 96 pozzetti)� Fiasche con tappo a vite (T-25, T-75 classificate in base alla loro area superficiale espressa in cm2)Esistono anche le fiasche con tappo a filtro (capacitàfiltrante fino a 0,2 micron) che regola gli scambi gassosi e protegge da contaminazioni batteriche e spore.

CONTENITORI IN POLISTIRENE (con superficie inerte o specificamente trattata): il polistirene è capace di legare i fattori di adesione presenti nel siero.L’adesione cellulare avviene tramite interazione tra recettori di membrana (integrine) con le proteine adesive adsorbite sulla superficie della piastra.

Plastica per coltura• Generalmente in polistirene:

- materiale rigido con superficie lucida

- buona resistenza chimica a soluzioni acquose

- limitata resistenza a solventi

- totale assenza di tossicità per le cellule in coltura

- trasparenza che consente una osservazione diretta al microscopio

- la superficie è trattata chimicamente per renderla idrofila e carica negativamente (per favorire i legami stabili con i fattori di adesione presenti nel siero)

Piastre da colturaIn commercio sono disponibili piastre per colture cellulari e piastre per

batteriologia (queste utilizzabili anche per la coltura di cellule in sospensione). Sono tutte in polistirene, ma la superficie delle piastre da coltura è trattata

chimicamente in modo da renderla idrofila e carica negativamente: il polistirene è, in tal modo, capace di legare i fattori di adesione.

Efficienza di semina

- Generalmente le cellule, al di sotto di una certa densità non crescono in modo efficiente

- Regola generale: densità > 104 cellule/cm2

Tempo di duplicazione- La popolazione cellulare cresce in modo esponenziale: il numero di cellule raddoppia ad ogni duplicazione- Il tempo impiegato per ogni duplicazione ècaratteristico di ogni linea cellulare: circa 20-24 ore per le cellule animali e 24-30 ore per le cellule umane

Piastre

Tipi di piastre

Diametro (mm)

Superficie (cm2)

Volume

(ml)

35 8 1-2

60 21 4-5

100 55 10-12

150 148 20-30

Multi-well

Tipi di multi-well

Multi-well Superficie (cm2)

Volume

(ml)

96 0,32 0,1-0,2

48 1,0 0,3-0,6

24 1,88 0,5-1,2

12 3,83 1,0-2,4

6 9,40 2.0-3,0

Fiasche

Tipi di fiasche

Fiasche Superficie (cm2)

Volume

(ml)

T-25 25 5-10

T-75 75 15-25

T-150 150 30-50

T-175 175 35-60

T-225 225 45-70

Preparazione del "cocktail" di coltura

Le cellule vengono coltivate in appositi substrati di coltura, che possono avere dimensioni differenti.

Ogni substrato è caratterizzato da un valore ottimale di densità cellulare, e pertanto, una volta

determinata la densità della sospensione iniziale di cellule, si calcola la diluizione da realizzare per

ottenere la densità desiderata.

Piastra cellule

90 mm 6x106

60 mm 3x106

20 mm 1x106

12 pz 5x105

24 pz 2.5x105

96 pz 8000/15000

TERRENI DI COLTURAMistura di:1.nutrienti: principalmente carboidrati, aminoacidi, vitamine, acidi grassi e lipidi, proteine e peptidi2.sali inorganici3.antibiotici a largo spettro: penicillina (inibisce l’ultima fase della sintesi della parete cellulare batterica) e streptomicina (blocca la sintesi proteica)4. sistema tampone: carbonato/bicarbonato; HEPES.

5. indicatore del pH (per monitorare lo stato del terreno): di solito ROSSO FENOLO rosso (normale): pH 7,2-7,4arancio: pH acidoviola: pH basico

6. Siero:

� funziona da tampone� favorisce l’adesione� fornisce nutrienti aggiuntivi, fattori di crescita e proteine plasmatiche� apporta circa 5 mg di proteine per ml (10% FBS)

Esistono diversi tipi di sieri:FBS siero bovinoFCS siero vitelloHS siero equino

Viene inattivato al calore= scomplementazione a 57°C per 30’

Percentuale di siero aggiunta ai terreni 1%-10%-20%

La crescita delle cellule in vitro viene assicurata dalla presenza di elementi nutritivi di base (glucosio, aminoacidi,

sali minerali) e fattori di crescita (presenti nel siero)

Terreni per colture� I terreni usati per le colture cellulari (BME; MEM; DMEM; …) differiscono tra loro per il contenuto in amminoacidi e sali, e per la concentrazione di glucosio. � La composizione esatta dei singoli terreni ed il tipo di terreno adatto per una data linea cellulare viene di solito specificato dalla ditta produttrice.� Per la crescita, le cellule richiedono un valore di pH del mezzo compreso tra 7.2 e 7.4.� Per mantenere costante tale valore di pH, si ricorre per lo più ad incubatori con una fase gassosa contenente il 5% di CO2 e terreni contenenti NaHCO3.� In soluzione acquosa il bicarbonato dissocia va incontro ad idrolisi (tende a riformare l’acido debole di partenza).� La CO2 presente nell’incubatore tende a controbilanciare questo aumento, mantenendo così il giusto pH del terreno.

Medium di coltura

● I terreni base disponibili in commercio contengono

tutti i componenti nutritivi necessari alla crescita delle cellule

● I più comuni terreni base di coltura:

- MEM: Minimum Essential Medium

- DMEM: Dulbecco’s modification of MEM

- RPMI: Roswell Park Memorial Institute

differiscono per la concentrazione in amminoacidi e sali e per la concentrazione di glucosio

Medium di colturaSali inorganici

▪ Cloruro di calcio anidro▪ Solfato di magnesio anidro▪ Cloruro di potassio▪ Nitrato di potassio▪ Cloruro di sodio▪ Fosfato di sodio bibasico▪ Bicarbonato di sodio

Essenziali per la crescita e il mantenimento delle funzioni cellulari e agiscono anche come tampone per le

fluttuazioni del pH dovute a variazioni ambientali o ai prodotti del catabolismo

Medium di colturaVitamine

� Biotina

� Pantotenato

� Acido folico

� Inositolo

� Nicotinamide

� Piridossina

� Riboflavina

� Tiamina

� Vitamina B12

Agiscono come catalizzatori o come substrati per facilitare o controllare alcune funzioni metaboliche

Medium di colturaAmminoacidi-isomeri L

� Alanina � Arginina� Asparagina� Acido aspartico� Cisteina� Glutamina� Acido glutamico� Glicina� Istidina� Isoleucina

� Leucina� Lisina� Metionina� Fenilalanina� Prolina� Serina� Treonina� Triptofano� Tirosina� Valina

Necessari per la sintesi delle proteine

Medium di colturaZuccheri

Rappresenta la principale fonte di energia o di carbonio per le biosintesi

Glucosio

Medium di coltura

• Il terreno base viene conservato a 4° C e, prima di essere utilizzato, viene completato con:

• Glutammina (aa essenziale molto labile)

• Antibiotici (penicillina/streptomicina)

• Siero (supplemento più comune delle colture cellulari)

SIEROMiscela complessa di proteine ed elementi fondamentali per la crescita in vitro della

maggior parte delle cellule

• Fattori di crescita: PDGF, EGF, IGF

• Fattori di adesione: fibronectina, vitronectina

• Altri elementi: trasferrina, albumina, colesterolo, acidi grassi, glucorticoidi, elementi minerali

Il siero di uso più comune è il siero fetale di bovino (FBS)

SIERO

Soluzioni saline bilanciate Formano la base dei terreni complessiPBSHanks BSSDPBS

Terreni baseMEM (Minimal essential medium) Colture primarie e cellule diploidiDMEM (Dulbecco’s modified MEM) Maggiori livelli di vitamine e aminoacidi supporta un gran numero di tipi cellulari

Terreni complessiRPMI1640 (Roswell Park Memorial Institute Medium) Inizialmente usato per cellule di leucemia supporta un gran numero di tipi cellulariIscoves DMEM Favorisce la crescita ad alta densitàLeibovitz L-15 Adatto per atmosfera a bassa CO2

Terreni senza sieroHam F10Ham F12 Necessitano dell’aggiunta di specifici supplementi (transferrina, insulina, EGF) e contengono HEPES

Principali terreni di coltura

Per osservare le cellule vive in vitro si utilizza comunemente

il microscopio ottico invertito:� obiettivi e oculari posti sotto il tavolino porta-oggetti� lampada di illuminazione e condensatore posti sopra

E’ possibile osservare così le cellule anche se queste sono all’interno di recipienti con pareti spesse

Espansione e Mantenimento

•Espansione: processo che porta all’aumento del numero di cellule disponibili con la perfetta conservazione delle caratteristiche bio-funzionali delle cellule. Dopo una fase di espansione è corretto considerare la cellule come archiviabili in una parte della cell bank.

•Mantenimento: processo che porta all’aumento del numero di cellule disponibili allo scopo di fornirle al gruppo di ricerca che le ha richieste. Il processo di mantenimento è unicamente finalizzato al sacrificio sperimentale delle cellule e non alla loro re-archiviazione. E’ pertanto consentito utilizzare procedure non convenzionali nella fase del mantenimento (divisioni meno frequenti oppure concentrazioni di siero più basse).

Espansione di linee cellulari aderenti� Quando le cellule raggiungono quasi il 90-100% di confluenza e sono in buono stato vengono staccate e divise in due aliquote edopportunamente ripiastrate in due nuove fiasche

� Le cellule, dopo 2 lavaggi in PBS sterile, possono essere staccate mediante:

� Tripsinizzazione: si incuba con tripsina (0.25%) per 2-5 min a 37° C. Le cellule vengono ulteriormente distaccate dal supporto manualmente, percuotendo la fiasca e la tripsina viene neutralizzata mediante aggiunta di terreno di coltura che contiene siero fetale bovino inattivato. La sospensione cellulare è divisa in 2 nuove fiasche.

� Aggiunta di EDTA 0.04%: si aggiunge EDTA, che chelando il Ca++ facilita il distacco manuale delle cellule. Dopo aggiunta di terreno di coltura e centrifugazione a 1000 rpm per 5 min il pellet è risospeso in terreno fresco e ripiastrato in 2 nuove fiasche.

Protocollo di tripsinizzazione

●Trasferire la sospensione in una provetta e centrifugare 5 min a 900-1000 giri al min

●Aspirare il sovranatante

●Aggiungere il terreno fresco e separare le cellule

●Distribuire nelle nuove piastre

Tutte le operazioni dovrebbero essere svolte con rapidità in modo da tenere le cellule

fuori dall’incubatore il minor tempo possibile

Raggiunta il 90% di confluenza le cellule devono essere raccolte e trasferite in nuove piastre (semina)

OPPUREdevono essere congelate (crioconservazione)

� la TRIPSINA è un enzima che distrugge le connessioni proteiche, sia fra le cellule sia fra le cellule e la superficie a cui sono adese

� l’EDTA è un chelante del calcio, talvolta, richiesto da alcune molecole di adesione le quali facilitano le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice

RACCOLTA E SEMINA DELLE CELLULE

Espansione di linee cellulari in sospensione

� Controllare al microscopio che le cellule siano in buona salute (quando le colture sono troppo concentrate il terreno appare giallo-arancio)

� Contare le cellule e calcolare una divisione tale che la concentrazione finale sia di 1-2 x 105 cellule/ml, a meno che la linea non richieda concentrazioni diverse

� Trasferire la coltura in fiasche più grandi, se ènecessario

� Incubare a 36-38°C per 2-3 giorni

PROCEDURA PER IL DISTACCO E LA SEMINA CELLULARE

�si aspira il terreno dalla fiasca�si effettuano 2-3 lavaggi con PBS senza calcio e magnesio (per rimuovere tracce di siero che inattivano la tripsina)�si aggiunge la soluzione di TRIPSINA/EDTA e si agita per alcuni secondi�si lascia in incubazione per 2-5 min a 37° C�si controlla al microscopio per vedere quando le celluleiniziano a diventare tondeggianti e a staccarsi (per evitare una sovraesposizione dannosa all’enzima)�si interrompe l’azione proteolitica dell’enzima aggiungendo terreno completo di siero che induce inattivazione�si raccoglie la sospensione

La tripsina è un enzima, appartenente alla classe delle idrolasi, che catalizza il taglio proteolitico con specificità per l'arginina e la lisina. Nel sito

attivo presenta una sequenza specifica che prende il nome di triade catalitica, ovvero Ser195-His57-Asp102. Questi residui amminoacidici, nonostante siano distanti nella struttura primaria, si trovano vicini nella struttura terziaria della proteina. Il substrato della tripsina è rappresentato da una proteina basica. Il pH ottimale per l'attività

catalitica della tripsina è in un range tra 7 e 9; in realtà ha attività catalitica anche ad altri pH ma l'idrolisi mediata da tale proteasi, a pH differenti

da quello ottimale, risulta più lenta.

Essenziale per una crescita ottimale

Densità di semina troppo bassa troppo tempo per arrivare a confluenza (possibile morte)Densità di semina troppo elevata si arriva a confluenza troppo rapidamente (risultati sperimentali non riproducibili perché la tripsina può alterare proteine di superficie, compresi i recettori per i farmaci, che hanno bisogno di tempo per rigenerarsi)

Si effettua con la CAMERA DI BURKER:vetro spesso in cui è ricavata una camera capillare grigliata costituita da 9 larghiquadrati delimitati da linee triple ciascunocontenente 16 quadrati piccoli

CONTA DELLE CELLULE

Conta cellulareDiversi metodi: contatori automatici

(contator coulter), ma un metodo semplice ed economico è l’uso dell’emocitometro o

camera di Burker

La camera è costituita da un vetro in cui èricavata una camera capillare; la parte

superiore della camera è costituita da un vetrino bloccato lateralmente.

Camera di Burker

Questa è costituita da un vetro spesso, in cui è ricavata una camera capillare, la parete superiore della camera è costituita da

un vetrino bloccato da due graffe laterali.Al microscopio diventano evidenti una serie di linee ortogonali tra

loro, che definiscono una serie di aree e, quindi, di volumi.

Camera di Burker

Conteggio delle cellulePer effettuare il conteggio:

dopo aver pulito la camera, montata correttamente, depositato un dato volume di cellule, al microscopio si contano le cellule presenti nei quadrati delimitati da una tripla barra e quelle presenti su due lati dello stesso quadrato (non si contano, invece, quelle su gli altri due lati).

cells/ml = (a+b+c)/3 x 104

a

b

c

Test di vitalità delle cellule

Per discriminare tra le cellule vive e quelle morte si ricorre all’uso di Tripan blue (colorante che viene

assunto solo dalle cellule morte).Le cellule vengono risospese in PBS, aggiunto il

colorante e lasciate qualche minuto a temperatura ambiente. Si contano in camera di Burker. In tal

modo si ricava la percentuale di cellule morte presenti nel campione esaminato.

� Ciascun quadrato dell'emocitometro o camera di Burker con il coprioggetto in posizione ha un volume di 0,1 mm3 o di 10-4 cm3.

� Essendo 1 cm3 = a 1 ml, la concentrazione di cellule per ml sarà determinata da:

Cellule/ml= conteggio medio per quadrato x 104 x fattore di diluizione

Punti crucialio Un’adeguata accuratezza della misura si ottiene contando almeno 100 cellule

o Il Trypan blue è tossico ed è un potenziale carcinogeno

o Le cellule devono essere ben distinte e uniformemente distribuite

o Evitare la presenza di bolle e detriti

o Non riempire eccessivamente la camera

o Se le cellule sono poche, operare una nuova centrifugazione e risospendere in meno terrreno

CENTRIFUGAZIONE

Una centrifuga è uno strumento progettato per produrre una forza centrifuga superiore alla forza di gravità terrestre.

Le particelle in soluzione se lasciate in condizioni di quiete tenderanno a sedimentare per effetto della gravità.

Per ogni particella la velocità alla quale essa sedimenta è proporzionale alla forza applicata, conseguentemente macromolecole in soluzione sedimentano più velocemente quando la forza applicata è maggiore di quella di gravitàesercitata dalla terra.

Scopo delle tecniche di separazione per centrifugazione

Esercitare una forza maggiore del campo gravitazionale terrestreaumentando la velocità di sedimentazione delle macromolecole, col fine di separare macromolecole che differiscono per densità, forma e dimensioni e quindi sedimentano con velocità diversa sotto l’influenza di un campo centrifugo applicato.

Una miscela di particelle eterogenee, approssimativamente sferiche,

può essere separata mediante centrifugazione, in base alla :

1. densità

2. dimensione delle particelle

3. tempo di sedimentazione

4. livello di sedimentazione raggiunto dopo un periodo di tempo definito

1. Centrifugazione preparativa

utilizzata principalmente per gli studi di macromolecole purificate o di complessi sovramolecolari isolati

2. Ultracentrifugazione analitica

permette di separare i vari elementi di un omogenato cellulare

Centrifughe preparative

Centrifughe da tavolo•Massimo volume di carico: 24 microprovette da ml 1,5/2.0 •Massima velocità (RPM): 13300 •Massima accelerazione centrifuga

Ultracentrifuga analitica

Puo’ operare a velocita’ di 700.000 rpm (500.000 g)

Il rotore e’ contenuto in una camera blindata, refrigerata e sottovuoto.

Il rotore è fatto in un materiale particolarmente resistenteEs. TITANIO

La sedimentazione è controllata da un sistema ottico per consentire l’osservazione del materiale che va sedimentandosi

Accelerazione centrifuga

L’ accelerazione centrifuga è definita campo centrifugo relativo (RCF)

RCF = 1.118r (n/1000)2 r = raggio di rotazionen = velocità del rotore definita come numero di rivoluzioni per minuto

r.p.m = 945.7√RCF/r

TIPI DI CENTRIFUGHE (refrigerate e non refrigerate)

Centrifughe a bassa velocità (max 3.000-6.000 g) si usano per raccogliere organelli di grandi dimensioni e precipitati grossolani.

Microcentrifughe (10.000 g) sono capaci di accelerazioni rapide.

Centrifughe a flusso continuo utili per raccogliere grandi volumi di cellule. Durante la centrifugazione le particelle sedimetano mentre il liquido scorre attraverso il rotore.

Centrifughe ad alta velocità (max 60.000 g) utili per frazionamento cellulare.

Ultracentrifughe (max 600.000 g) possiedono sistemi di vuoto e refrigerazione sofisticati e vengono usate per isolare piccoli organelli come i ribosomi e le vescicole di membrana.

Quando si riportano le condizioni di separazione di particelle è necessario specificare la velocità del rotore, le dimensioni del raggio e il tempo di centrifugazione.

La velocità di sedimentazione dipende comunque anche

1) dalla massa della particella; 2) dalla densità del mezzo; 3) dalla forma della particella.

Questi parametri pratici ovviamente modificano l’equazione teorica.

Coefficiente di sedimentazioneLa velocità di sedimentazione (v) di una particella può essere anche espressa in termini di velocità di sedimentazione per unità di campo

centrifugo applicato, più comunemente chiamato coefficiente di sedimentazione, s.

Il valore sperimentale per il coefficiente di sedimentazione è una funzione della

� temperatura, � viscosità e � densità della soluzione.

Centrifughe e loro utilizzo

Piccole centrifughe da banco

Generalmente la loro velocità massima è tra 4.000 e 6.000 rev min–1, per un campo centrifugo relativo variabile tra i 3.000 e i 7.000 g

Microcentrifughe

8.000-13.000 rev min–1 pari a 10.000 g

Centrifughe refrigerate a grande capacità

6.000 rev min–1

Centrifughe refrigerate ad alta velocità

25.000 rev min–1

Frazionamento cellulareLe cellule possono essere rotte in vario modo: shock

osmotico, ultrasuoni, frantumandole per omogeneizzazione. Questi procedimenti rompono molte membrane ma lasciano intatti gli organuli che possono

essere separati sulla base delle loro dimensioni e densità.

Metodi di separazione

Sedimentazione differenziale: la centrifugazione di una sospensione di particelle per un tempo determinato provoca la formazione di un sedimento e di un sovranatante

Centrifugazione in gradiente di densità

Si utilizza una soluzione la cui densità aumenta in gradiente

Continuo (a)Gradiente Discontinuo (b)

Una barriera di densità a gradino singolo per sedimentare selettivamente una particella (c)

Centrifugazione IsopicnicaSi basa sulla formazione di un gradiente ripido (molte sostanze come

saccarosio, ficoll, percoll, glicerolo, destrano, ecc., creano dei gradienti durante la centrifugazione).

Si mescola il campione da separare con la sostanza appropriata e si centrifuga per il tempo necessario per la formazione dei gradienti

Le particelle sedimentano in funzione della loro densità (si posizionano dove la loro densità è uguale a quella del mezzo)

Tipi di rotore

rotore basculante

Tipi di rotore

rotore ad angolo fisso

Rotore con provette verticali

Sono usati per la separazione isopicnica in gradiente di densità nelle centrifughe ad alta velocità e nelle ultracentrifughe

Non si possono utilizzare per particelle in sospensione perché non si forma sedimento

Centrifuga� Separare le cellule dal liquido�300-350 g x 5-10 minuti è l’accelerazione per

sedimentare le cellule senza danneggiarle

Raccomandazioni:� Localizzazione� Bilanciamento� Aereosol� Rottura delle provette

Nomogramma e formula di conversione

Criopreservazione

Le linee cellulari possono essere criopreservate in azoto liquido a -196° C

per oltre 10 anni senza significativi cambiamenti delle loro caratteristiche

biologiche

Le cellule vitali possono essere recuperate in qualsiasi momento

Le cellule (ancora in fase logaritmica) possono essere conservate, per un utilizzo successivo, mediante congelamento e stoccaggio in azoto liquido (-196°C)

Tale processo è noto come “Crioconservazione”

Il congelamento può provocare alterazioni letali all’interno delle cellule:

1) formazione di cristalli di ghiaccio2) cambiamenti nella concentrazione di elettroliti3) cambiamenti di pH

Per minimizzare i rischi: agente crioprotettivo= DMSO

DMSO (dimetil solfossido): abbassa il punto di congelamento prevenendo la formazione di cristalli

CRIOCONSERVAZIONE

Conservazione delle cellule in azoto liquido

Per la conservazione delle cellule per lunghi periodi si ricorre alla conservazione in azoto liquido (-196° C).

Il congelamento in azoto liquido mantiene le cellule vive in completa quiescenza per anni.

Tramite congelamento, quindi, si può costituire uno stock di cellule che mantengono le caratteristiche fisiologiche e biochimiche delle cellule di

partenza. Le reazioni enzimatiche cessano a –130° C circa.

Metodica di congelamento

● Le cellule vanno raccolte nella fase logaritmica di crescita

● Determinare il numero di cellule e la percentuale di vitalità

● Centrifugare la sospensione cellulare ed eliminare il sovranatante

● Medium di congelamento: Medium di coltura al 20% FBS + 10% DMSO

● Risospendere il pellet nel medium di congelamento rapidamente ed in ghiaccio

● Aliquotare in criovials opportunatamente siglate

Iniziare il processo di congelamento

LA CONSERVAZIONE DELLE CELLULE PERMETTE DI:

Creare banche di cellule

Ridurre il rischio di aberrazioni geniche e morfologiche

Ridurre il rischio di contaminazione microbica e di cross-contaminazione

Utilizzare materiale che sia di qualità costante

Condurre esperimenti usando colture dello stesso range di passaggi

Mantenere le cellule in coltura solo quando necessario con riduzione di costi e tempo

CRIOCONSERVAZIONE: PERCHE’?

Punti critici● Il congelamento e lo scongelamento non migliorano lo status quo delle cellule

● Agenti crioprotettivi: DMSO, glicerolo. Proteggono la cellule dai danni indotti dalla formazione di cristalli di ghiaccio durante il criocongelamento

● La lunga esposizione, a temperatura ambiente al DMSO può danneggiare irreversibilmente le cellule

● Non è necessario sterilizzare il DMSO, perché in forma pura èletale per i batteri

Punti criticiSe la velocità di raffreddamento è troppo bassa

La cellula è esposta a concentrazioni crescenti di soluti cellularidovute alla formazione di ghiaccio nel mezzo di soluzione

Alta concentrazione di soluti Disidratazione

Variazioni di pH Aumento della pressione osmotica

Punti criticiSe la velocità di raffreddamento è troppo alta

Formazione di nuclei di cristallizzazione sia nella soluzione che all’interno della cellula

Danno meccanico

Cristalli interni Cristalli esterni

Distruzione della membrana cellulare

Esiste la velocità ideale?● Il raffreddamento deve essere lento in modo tale da evitare la formazione di ghiaccio

● Il raffeddamento deve essere nello stesso tempo rapido per non danneggiare la cellula per disidratazione

Ottimizzazione della velocità: -1°C/minuto

-1°C/minuto

●Utilizzo di freezer meccanici programmabili, ma molto costosi

● Utilizzo di contenitori di polistirolo seguito da trasferimento prima a -20° C e poi a -80° C

● Utilizzo di contenitori criostep

Il congelamento deve essere lento: processo a stadi

ghiaccio -20° C -80° C azoto liquido

Lo scongelamento al contrario deve essere rapido:

• il campione viene trasferito in un bagnetto termostatato a 37° C per pochi minuti

• si allontana l’agente crioprotettivo, centrifugando erisospendendo le cellule in terreno fresco

CRIOCONSERVAZIONE: PROCEDURA

PROCEDURA DI SCONGELAMENTO

1. Mettere la vail criocongelata nel bagnetto a 37° C

2. Pulire l’esterno con alcool assoluto

3. Aprire la vial sotto cappa e trasferire il contenuto in una provetta sterile contenente 3-5 ml di mezzo completo

4. Centrifugare 5 min a circa 800-1000 g/min per eliminare il DMSO

5. Aspirare il sovranatante

6. Risospendere il pellet cellulare in terreno fresco

7. Seminare

Controllo contaminazionePur operando in condizioni di sterilità, lavorando con le colture

cellulari c’è sempre rischio di contaminazione da parte di batteri, funghi, micoplasmi e virus. Mentre la contaminazione da batteri e miceti è facilmente identificabile (provoca un intorbidimento del

terreno), quella da virus e da micoplasmi è più difficile da identificare (tranne che si riscontri un effetto citopatico).

Per ridurre il rischi di contaminazioni, perciò, vengono aggiunti ai terreni da coltura degli agenti antibiotici (penicillina,

streptomicina, kanamicina,…) e antimicotici (anfotericina B,…).

Procedure di sterilizzazione� Tutto il materiale utilizzato per l’isolamento e la coltura delle cellule deve essere sterile, al fine di evitare contaminazioni di batteri o muffe che possano danneggiare le colture.

� Le soluzioni usate sono preparate con acqua sterilizzata mediante autoclavaggio e sono quindi filtrate con filtri sterili da 0.2 µm.

� Il siero fetale viene inattivato tenendolo a una temperatura di56° C per 30’ e poi filtrato con filtri sterili da 0.2 µm.

� Il materiale di consumo (piastre, tubi da centrifuga, pipette, filtri, siringhe ecc.) è acquistato direttamente in confezioni sterili monouso.

� La steriltà della cappa è assicurata dall'irraggiamento con raggi UV, generalmente effettuato per tutta la notte precedente all’isolamento delle cellule.

LAVAGGIO E STERILIZZAZIONE

• LE PROCEDURE DI LAVAGGIO E STERILIZZAZIONE SONO OGGI RIDOTTE AL MINIMO INDISPENSABILE GRAZIE ALL’INTRODUZIONE DI PRODOTTI STERILI E DI MATERIALE MONOUSO

• E’ ASSOLUTAMENTE SCONSIGLIATO L’USO DI VETRERIA DA STERILIZZARE IN AUTOCLAVE (FIASCHE E PIPETTE)

• E’ CONSIGLIATO L’USO DI MATERIALE MONOUSO STERILE COME PIPETTE INCARTATE SINGOLE O FIASCHI E CAPSULE PETRI (SE CONSERVATE BEN CHIUSE DOPO L’APERTURA DELLA CONFEZIONE)

• I PRODOTTI FLUIDI SONO STERILIZZATI PER FILTRAZIONI CON MEMBRANE DA 0.22 µm

STERILITASTERILITA’’

data l’ubiquità dei microrganismi

Tecniche sterili o asettiche

• Per impedire la contaminazione accidentale dovuta a microbi provenienti da fonti esterne

• Per impedire la contaminazione di se stessi o di terzi

STERILITASTERILITA’’L’unico modo di ottenere uno stato sterile è mediante la

distruzione o rimozione dei microrganismi.

Esistono diverse metodologie

TRATTAMENTO CON CALORE

RADIAZIONI

AGENTI CHIMICI FILTRAZIONE

Metodi di sterilizzazione

• Sterilizzazione al calore rosso su fiamma

• Sterilizzazione al calore secco mediante l’utilizzo di un forno ad una temperatura di circa 160°C per almeno 2 ore.Particolarmente indicata per la vetreria di laboratorio

• Sterilizzazione al calore umido mediante l’utilizzo dell’autoclave a 121 °C per almeno 15 min. Particolarmente indicata per mezzi liquidi non sensibili al calore e per la vetreria di laboratorio dopo l’uso

Il trattamento con calore è il sistema più usato di sterilizzazione e comprende:

� sterilizzazione al calor rosso, ottenuta scaldando anse di metallo, pinze, aghi, ecc. su un fiamma Bunsen, poiché nessun microbo può sopravvivere anche a una breve esposizione a una fiamma libera.

� sterilizzazione al calore secco, dove si usa un forno ad aria calda a una temperatura di almeno 160°C per almeno 2 ore. Questo metodo si usa per la sterilizzazione di routine della vetreria di laboratorio.

� sterilizzazione al caldo umido, scelta per la maggior parte del materiale, compresa la maggior parte dei fluidi, esclusi i mezzi di coltura sensibili al calore. Viene anche usata per decontaminare mezzi liquidi e vetreria dopo l’uso. Per questi scopi si usa l’autoclave da laboratorio. In genere la maggior parte del materiale sarà sterile dopo 15 min a 121°C. La rapida azione battericida deriva dal calore latente di condensazione del vapore pressurizzato, rilasciato al contatto con il materiale freddo all’interno dell’autoclave.

Molti articoli monouso di plastica usati in microbiologia e in biologia cellulare vengono sterilizzati mediante esposizione a UV o a radiazioni ionizzanti. Questi sono forniti in pacchi sterili, pronti per l’uso. Le radiazioni ultraviolette hanno un uso limitato in

laboratorio, mentre le radiazioni ionizzanti (ad es. i raggi γγγγ) richiedono strutture industriali e non possono

essere utilizzate su scala di laboratorio.Le soluzioni labili al calore (ad esempio macromolecole complesse, comprese proteine, antibiotici, siero) sono particolarmente adatte alla sterilizzazione tramite

filtrazione. I filtri esistono in una varietà di forme, dimensioni e materiali, in genere con una dimensione

dei pori o di 0,2 µµµµm o di 0,45 µµµµm.

Gli agenti chimici sono noti come disinfettanti e sono usati più spesso per l’eliminazione di

oggetti contaminati dopo l’uso, ad es. vetrini e pipette. Vengono usati anche per trattare

versamenti. Il termine “disinfezione” implica la distruzione di cellule batteriche che provocano infezioni, anche se spore e virus non vengono sempre distrutti. I disinfettanti richiedono

tempo per esercitare il loro effetto battericida: qualunque versamento deve essere

coperto con un disinfettante appropriato e lasciato per almeno 10 min prima di asciugarlo.

TRATTAMENTO AL CALORE

Fiamma Bunsen Autoclave

RADIAZIONIMolti strumenti vengono sterilizzati mediante

raggi UV e ionizzanti; questi sono forniti commercialmente in pacchi sterili, pronti per l’uso

350 350 –– 800 nm800 nm

AGENTI CHIMICIUtilizzati, soprattutto, per ripulire oggetti contaminati dopo

l’uso, come vetrini e pipette.

Anche l’area di lavoro deve essere sterile, pulita ed ordinata

Precauzioni per la prevenzione delle contaminazioni

Per prevenire le contaminazioni occorre seguire alcune regole:

1) i terreni e le soluzioni che si usano devono essere tutti sterili;2) si aggiunge penicillina-streptomicina per evitare contaminazioni da batteri; anfotericina B (se non tossica per le cellule) contro i miceti;3) si destina un laboratorio solo alle colture cellulari;4) si opera sempre sotto cappa a flusso laminare;5) si utilizza solo materiale sterile (di vetro o di plastica);6) si utilizzano pipettatori elettrici;7) la cappa va pulita a inizio e fine lavoro;8) i filtri della cappa vanno periodicamente controllati;9) l’incubatore va pulito periodicamente.

Contaminazioni

Cross-contaminazione

Micoplasma

La morfologia è indicatore dello stato della cellula

Presenza di contaminazioni

LINEA A LINEA B

Durante la Stabilizzazione

LINEA A LINEA B

LINEA A LINEA B

Metodi per svelare una cross-contaminazione

• Morfologia e pattern di crescita

• Immunofenotipo

• Identificazione di marcatori molecolari

• DNA Fingerprinting

• Cariotipo e analisi citogenetica

Contaminazione da micoplasma

Rappresenta il secondo grande problema nel campo della ricerca biotecnologica che si avvale delle

colture cellulari

Micoplasmi

Rappresentano un grande gruppo di microorganismi caratterizzati tutti dalla mancanza di una parete cellulare rigida

“ MINIMUM CELL”

Membrane Ribosom i Cromosoma

CARATTERISTICHE SALIENTI

•Dimensioni estremamente ridotte: 0.3-0.8 µµµµm•Filtrabili a 0.45 µµµµm•Morfologicamente polimorfici

•Alta richiesta metabolica di vitamine, precursori di acidi nucleici, lipidi, acidi grassi ed aminoacidi

•Sono tutti commensali, parassiti oppure patogeni

•Le infezioni sono croniche e spesso difficili da diagnosticare

•La maggior parte formano colonie in agar

Frequenza della contaminazione

• 15-35% delle linee cellulari continue

• 5% delle colture cellulari a precoci passaggi

• 1% delle colture cellulari primarie

La presenza dei micoplasmi può passare del tutto inosservata all’operatore e può provocare

cambiamenti profondi nel metabolismo e nelle proprietà delle cellule

Cellule contaminate

Cellule colorate con Hoechst rivelano la presenza di micoplasmi

• Alterati livelli di sintesi di proteine, RNA e DNA• Alterazione del metabolismo cellulare• Induzione di aberrazioni cromosomiche• Alterazione del pattern immunofenotipico• Alterazione della morfologia cellulare• Induzione o soppressione di citochine• Interferenza con saggi biochimici e biologici• Influenza sulla trasduzione del segnale• Alterazione del pattern di crescita e della vitalità

Effetti della contaminazione

Graduale degenerazione PERDITA

Tassonomia dei micoplasmi

Classe Mollicutes

3 Ordini

Mycoplasmatales

Acholeplasmatales

Anaeroplasmatales

Generi

Anaeroplasma

Asteroleplasma GenereAcholeplasma

GeneriMycoplasmaUreaplasmaSpiroplasma

Comuni specie contaminanti

• M. Orale 20-40%• M. Fermentans 10-20%• M. Hominis 10-20%

• M. Hyorhinis 10-40%

• M. Arginini 20-30%• M. Laidlawii 5-20%

UOMO

BOVINO

MAIALE

Sorgenti di contaminazione

• M. Hyorhinis 10-40%

• M. Arginini 20-30%• M. Laidlawii 5-20% BOVINO

SIERO

MAIALE

Sorgente di contaminazione

• M. Orale• M. Fermentans• M. Hominis

Uomo

Personale del Laboratorio

Linee cellulari continue

Diventano la fonte principale di contaminazione grazie:

• alla generazione di minuscole gocce durante la manipolazione

• alla prolungata sopravvivenza del micoplasma in forma essiccata

• alla contaminazione dei reagenti utilizzati rappresentati soprattutto dal terreno colturale