lezione SNuPE 2

La più frequente malattia ereditaria cronica che colpisce indifferentemente i maschi e le femmine appartenenti prevalentemente alla razza bianca

La Fibrosi CisticaLa Fibrosi Cistica

Etnia Incidenza Freq.eterozigosi

Caucasici 1/2500 1/25 (4%)

Ebrei Ashkenazi 1/3300 1/29

Ispanici(America latina)

1/8000 1/46

Africani Americani 1/15000 1/65

Asiatici Americani 1/30000 1/150

Cenni storiciCenni storici• 1936: per la prima volta vengono messi in relazione disfunzioni pancreatiche e respiratorie• 1938: le prime osservazioni anatomo-patologiche in autopsia forniscono una prima descrizione della malattia

• 1953: rilevazione di eccessi di cloruro di sodio nel sudore

• 1983: osservazione dettagliata degli epiteli respiratori FC mediante microscopia

• 1989: individuazione della molecola che, se difettata, causa FC: CFTR

Proteina CFTRProteina CFTR““CCysticystic FFibrosis ibrosis TTransmembraneransmembrane RRegulatoregulator””

• Superfamiglia dei trasportatori ABC (ATP Binding Cassette) trasporto attivo primario

•Proteina trans membrana

• 1480 Aminoacidi

• Canale per il passaggio di ioni Cloro

• Presente negli epiteli secretori: ghiandole sudoripare, naso, bronchi, pancreas, intestino e dotti deferenti.

CFTR: strutturaCFTR: struttura““CCysticystic FFibrosis ibrosis TTransmembraneransmembrane RRegulatoregulator””

• MSD-1 e MSD2: porzioni trans membrana (alfa-eliche idrofobiche)

• NBD-1 e NBD-2: domini ATPasici

• R: dominio regolatore

CFTR: regolazioneCFTR: regolazione““CCysticystic FFibrosis ibrosis TTransmembraneransmembrane RRegulatoregulator””

1) Quando la proteina non lega i cofattori il canale è chiuso da R

2) Quando l’ATP si lega ai domini NBD e la PKA fosforila R il canale è aperto

Passaggio di ioni cloro dal lato citosolico a quello extracellulare delplasmalemma

CFTR e Fibrosi CisticaCFTR e Fibrosi Cistica

L’aumento della concentrazione di ioni sodio e cloro all’interno della cellula compromette

l’attività secretoria epiteliale

Principali sintomi FCPrincipali sintomi FC

Apparato respiratorio

(epitelio polmonare)

•Tosse frequente

•Catarro

•Stanchezza

•Infezioni respiratorie

Apparato digerente

(epitelio intestinale)

•Insufficienza pancreatica

•Maldigestione

•Malnutrizione

•Occlusioni intestinali

CFTR: mutazioniCFTR: mutazioni1200 mutazioni diverse, con incidenza variabile

La mutazione più diffusa nella popolazione caucasica è la ∆F508:

Popolaz. anglosassoni: 70%

Popolaz. mediterranea: 50%

Wild type

DNA GAA AAT ATC ATC TTT GGT GTT TCC

Proteina Glu Asn Ile Ile Phe Gly Val Ser

Posizione 504 505 506 507 508 509 510 511

Fibrosi cistica ∆F508

DNA GAA AAT ATC AT- --T GGT GTT TCC

Proteina Glu Asn Ile Ile Gly Val Ser

Posizione 504 505 506 507 508 509 510

CFTR: classi di mutazioniCFTR: classi di mutazioni

Classe I: sintesi assente della proteina

Classe II: compromissione del trasporto intracellulare

Classe III: difetti della regolazione (∆F508)

Classe IV: alterazioni a livello dei tratti transmembrana che riducono la conduttanza del canale

Classe V: mutazioni che non alterano la funzione della proteina ma ne riducono i livelli di sintesi

Gene CFTRGene CFTR““CCysticystic FFibrosis ibrosis TTransmembraneransmembrane RRegulatoregulator””

• 250.000 paia di basi

• localizzato sul cromosoma 7

Segue il modello dell’eredità mendeliana

EreditàEredità autosomicaautosomica recessivarecessiva

Allele CFTR wild type: dominante

Allele CFTR “mutato”: recessivo

Chi eredita due copie mutate (Omozigoti) manifesta i sintomi

Chi eredita una sola copia mutata (Eterozigoti) non ha nessun sintomo

(Portatore sano)

DiagnosiDiagnosi

valutazione di [Na+] e [Cl-] nel sudoreTest del sudore

Screening neonataleDeterminazione della tripsina nel sangue

lattasi nel meconio

Diagnosi: test del sudoreDiagnosi: test del sudore

Stimolazione della sudorazione mediante

inoforesi

Condizioni normali [Na+] e [Cl-] < 40 mEq/l

Fibrosi cistica [Na+] e [Cl-] > 70 mEq/l

Diagnosi: screening Diagnosi: screening neonataleneonatale

Saggio immunologico per rilevare la quantità di tripsina

Goccia di sangue prelevata in terza giornata

MeconioDeterminazione dei livelli di

lattasi

I livelli di entrambi questi enzimi risultano aumentati nei pazienti FC per la ridotta funzionalità

pancreatica

CFTR e Fibrosi CisticaCFTR e Fibrosi Cistica

L’aumento della concentrazione di ioni sodio e cloro all’interno della cellula compromette

l’attività secretoria epiteliale

Infezioni delle vie respiratorie causate da Infezioni delle vie respiratorie causate da patogeni opportunistipatogeni opportunisti

Principali responsabili delle infezioni croniche Principali responsabili delle infezioni croniche a carico dei pazienti FC:a carico dei pazienti FC:

Pseudomonas aeruginosaStaphylococcus aureus

Burkholderia cepacia complexHaemophilus influenzae

Ralstonia pickettiiBurkholderia gladioli

Alcaligenes xylosoxidans

Coenye et al, 2001

Principali responsabili delle infezioni croniche Principali responsabili delle infezioni croniche a carico dei pazienti FC:a carico dei pazienti FC:

Pseudomonas aeruginosaStaphylococcus aureus

Burkholderia cepacia complexHaemophilus influenzae

Ralstonia pickettiiBurkholderia gladioli

Alcaligenes xylosoxidans

Burkholderia: origineBurkholderia: origine

Clinica:polmone dei pazienti FC

Ambientale:Suolo

RizosferaAcqua

B. cepaciaB. cepacia complexcomplex: tassonomia: tassonomiaA causa dell’alto grado di omologia A causa dell’alto grado di omologia genomica genomica

l’l’identificazioneidentificazione di questi patogeni risulta di questi patogeni risulta molto difficoltosamolto difficoltosa

B. pyrrociniaIXB. anthinaVIIIB. ambifariaVIIB. dolosaVIB. vietnamiensisVB. stabilis IVB. cenocepaciaIIIB. multivoransIIB. cepaciaI

SpecieSpecieGenomovarGenomovar

III-AIII-BIII-CIII-D

Burkholderia cepaciaBurkholderia cepacia complex complex ((BccBcc))

La colonizzazione delle vie aeree da B. cepaciae la conseguente infezione polmonare

“sindrome da cepacia ” sono la più importante causa di malattia tra i pazienti affetti da

Fibrosi CisticaCoenye et al, 2001

Cura: Terapia antibiotica mirata

Identificazione tempestiva del Identificazione tempestiva del patogenopatogeno

ScopoSviluppo di un test diagnostico rapido per la discriminazione di

specie e genomovars di Burkholderia cepacia complex

nella routine clinica

Microbiologia del Bcc

Entrambi questi ospedali pediatrici ospitano un Centro

Fibrosi Cistica

Biologia molecolare applicata ai

microrganismi

Identificazione e/o tipizzazione

Identificazione e/o tipizzazione

PCR specifiche 16S PCR specifiche 16S rDNArDNA

Test Test fenotipicifenotipici

RFLP del gene RFLP del gene recArecA

Analisi del contenuto Analisi del contenuto in acidi grassiin acidi grassi

16S 16S rDNA rDNA RFLPRFLP

RAPDRAPDAFLPAFLP

Analisi del Analisi del proteomaproteoma

SDSSDS--PAGEPAGE

Analisi di restrizione di Analisi di restrizione di recArecA::•amplificazione via PCR di un tratto del gene recA:si ottiene un frammento di circa 1000 pb dai solibatteri del complex utilizzando i primer BCR1 e BCR2

Mahenthiralingam et al, 2000

Prodotto di amplificazione

Elettroforesi su gel di agarosio

Taglio con l’enzima di restrizione HaeIII ed elettroforesi su gel per visualizzare i profili ottenuti:


Gvr x Gvr zGvr y

Si ottengono profili di restrizione diversi per la presenza di polimorfismi puntiformi all’interno della

sequenza riconosciuta dall’enzima di restrizione.

LIMITI DELLA TECNICAL’uso del solo HaeIII non consente di distinguere ognigenomovar, ma solo di creare dei pattern di profili direstrizione


Necessità di confrontare un profilo con tutti i profilipossibili

Disponibilità di una banca di ceppi aggiornata

Tempi considerevoli per l’ottenimento dei risultati

Necessità che il polimorfismo puntiforme genomovarspecifico generi o faccia scomparire un sito direstrizione

SNuPESNuPESingle Nucleotide Primer Extension

1. Amplificazione via-PCR di un frammento genico2. Purificazione del templato di PCR3. Reazione di estensione del primer specifico con

dideossinucleotidi marcati con fluorocromi di colore e peso molecolare diversi

4. Purificazione del prodotto di reazione5. Elettroforesi capillare con identificazione di colore

e posizione del fluorocromo incorporato

STEP PRELIMINARI

Analisi delle sequenze del gene scelto alla ricerca di polimorfismi puntiformi (SNP):

CGCACTGAAGTTCTACTCGTCGGTGCGTCTCGATATCCGCCGGATTGGCTCGATCGCACTGAAGTTCTACTCGTCGGTGCGTCTCGATATCCGCCGGATAGGCTCGAT

CGCACTGAAGTTCTACTCGTCGGTGCGTCTCGATATCCGCCGGATCGGCTCGAT Specie xSpecie ySpecie z

Disegno di primer specifici sulla base degli SNP individuati

Amplificazione perPCR della regione contenente

il polimorfismo

T5’ 3’

A 5’3’

Il polimorfismo puntiforme precedentemente individuato, se genomovar-specifico, permette di discriminare tra loro i vari genomovar in base al

diverso fluorocromo incorporato

Denaturazione

T5’ 3’

A 5’3’Il polimorfismo puntiforme precedentemente

individuato, se genomovar-specifico, permette di discriminare tra loro i vari genomovar in base al


Annealing

T5’ 3’

A 5’3’Il polimorfismo puntiforme precedentemente

individuato, se genomovar-specifico, permette di discriminare tra loro i vari genomovar in base al


Primer extension effettuata sul prodotto di amplificazione

T5’ 3’

T5’

A3’

Il polimorfismo puntiforme precedentemente individuato, se genomovar-specifico, permette di discriminare tra loro i vari genomovar in base al


Elettroforesi capillareElettroforesi capillareSi visualizza così un picco di colore diverso a seconda del dideossinucleotide incorporato, di posizione nota in quanto è nota la lunghezza del frammento (primer specifico + 1 ddNTP)

GATATCCGCCGGATCGGCTCGATCGCACTG Specie x

Specie zGATATCCGCCGGATAGGCTCGATCGCACTG

GATATCCGCCGGATTGGCTCGATCGCACTG Specie y

I

posizione

I

posizione

I

posizione

Individuazione di più polimorfismiIndividuazione di più polimorfismi

0.2 0.4 0.6 10.8 1.2 1.4 1.6 2.01.8 2.42.2 Kbp

Specie 1 A C T G C

Specie 2 A G A C T

Specie 3 C A G T A

Specie 4 G T C A G

Specie 5 T A C G T

Progettazione di un set di Progettazione di un set di primerprimer

0.2 0.4 0.6 10.8 1.2 1.4 1.6 2.01.8 2.42.2 Kbp

Specie 1 A C T G C

Specie 2 A G A C T

Specie 3 C A G T A

Specie 4 G T C A G

Specie 5 T A C G T

Reazione Reazione SNuPE SNuPE in in MultiplexMultiplex

Specie 1

0.2 0.4 0.6 10.8 1.2 1.4 1.6 2.01.8 2.42.2 Kbp

A CGTC

AG T C G

0.2 0.4 0.6 10.8 1.2 1.4 1.6 2.01.8 2.42.2 Kbp

Specie 4

Elettroforesi capillareElettroforesi capillareI

posizione

I

posizione

A C T G C

G T C A GTGCATSpecie

5

GACTGSpecie 4

ATGACSpecie 3

TCAGASpecie 2

CGTCASpecie 1

Gene gyrB come marcatore molecolare

Ricerca delle sequenze disponibili nelle banche dati

Disponibilità di una sola sequenza dell’intero gene gyrB di B. cenocepacia, ceppo J2315

Score EAllineamento significativo prodotto dalla sequenza: (bits) Value

gi|52208053|emb|BX571965.1| Burkholderia pseudomallei strai... 2252 0.0 gi|52426793|gb|CP000010.1| Burkholderia mallei ATCC 23344 c... 2228 0.0 gi|19909532|dbj|AB014891.1| Burkholderia cepacia gyrB gene ... 1848 0.0 gi|19909684|dbj|AB014967.1| Burkholderia cepacia gyrB gene ... 1509 0.0 gi|19909686|dbj|AB014968.1| Burkholderia cepacia gyrB gene ... 1495 0.0

Progettazione dei Progettazione dei primerprimer per l’amplificazione per l’amplificazione del gene del gene gyrBgyrB

3 sequenze di B. cepacia prese da banche dati

25 sequenze di altri Proteobatteri quali Bordetella, E.coli, Neisseria, Nitrosomonas, Ralstonia, Salmonella, Xanthomonas

+

Dall’analisi del multiallineamento di queste sequenze sono state individuate le regioni conservate del gene

gyrB

Primer per l’amplificazione del gene gyrB

E’ STATO COSI’ POSSIBILE DISEGNARE UN SET DI 10 PRIMER.

FORWARD• gyr1

• PC2

• PC3

• PC4

REVERSE• PC5r

• PC6r

• PC7r

• PC8r

• PC9r

• PC10r

TEST DEI PRIMERTEST DEI PRIMER

2 4 5r7r

8r

10r

0.2 0.4 0.6 10.8 1.2 1.4 1.6 2.01.8 2.42.2

1 3 6r

9r

Kbp

gyrB

TEST DEI PRIMERTEST DEI PRIMERCeppo LMG 16654, B. cenocepacia III-B

PC5r PC6r PC8r PC9r

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M = Marker

1,5,9,13 = gyr1

2,6,10,14 = PC2

3,7,11,15 = PC3

4,8,12,16 = PC4

TEST DEI PRIMERTEST DEI PRIMER

2 4 5r7r

8r

10r

0.2 0.4 0.6 10.8 1.2 1.4 1.6 2.01.8 2.42.2

1 3 6r

9r

Kbp

1-5 +1-6 +

3-9 +

4-92-9

1-9 +

++

1-10 _

Coppia di primer gyr1-PC9r

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

7) Mi 5 gvr IV

8) TVV75 gvr V

9) LMG 18941 gvr VI

10) MCI 7 gvr VII

11) LMG 16670 gvr VIII

12) ATCC15958 gvr IX

1) LMG 1222 gvr I

2) LMG 18822 gvr II

3) LMG 16656 gvr III-A

4) LMG 16654 gvr III-B

5) LMG 19230 gvr III-C

6) So1 gvr III-D

OTTENIMENTO SEQUENZEOTTENIMENTO SEQUENZE

Abbiamo ottenuto 69 SEQUENZE del gene gyrB, della lunghezza di circa

1850bp

4FC + 2A6B. pyrrocinia2 A2B. anthina

1 FC +1 A2B. ambifaria2 FC2B. dolosa

1 FC + 2 A3B. vietnamiensis3 FC3B. stabilis8 FC8B. cenocepacia III-D

2 A2B. cenocepacia III-C

15 FC +2 A17B. cenocepacia III-B

6 FC6B. cenocepacia III-A

10 FC +1 A11B. multivorans4 FC + 2 A6B. cepacia

OrigineSequenze prodotte

Genomovar

LEGENDA:

FC = fibrosi cistica

A = ambientale

Analisi delle sequenze Analisi delle sequenze nucleotidiche nucleotidiche del gene del gene gyrBgyrB

gvrI 757 TTGGAAGAGTTCCTGCTTGAAACGCCGATCGACGCGAAGATTATTTGCGGGAAGATTGTT 816 gvrII 668 CTCGAGGAGTTCCTCCTCGAAACGCCGAACGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTC 727 gvrIII-A 767 CTCGAAGAGTTCCTGCTCGAAACGCCGATCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTT 826 gvrIII-B 658 CTGGAAGAGTTCCTGCTCGAAACGCCGATCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTC 717 gvrIII-C 751 CTGGAAGAGTTCCTGCTCGAGACGCCTATCGACGCAAAGATCATTTGCGGGAAGATCGTC 810 gvrIII-D 676 CTGGAAGAGTTCCTGCTGGAGACGCCGATCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTT 735 gvrIV 650 CTGGAAGAGTTCCTGCTCGAAACGCCGATCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATTGTT 709 gvrV 760 CTCGAAGAATTCCTGCTCGAAACGCCGACCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTC 819 gvrVI 748 CTCGAGGAGTTCCTGCTGGAAACGCCGATCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTC 807 gvrVII 763 CTGGAAGAGTTCCTGCTCGAAACGCCGCTCGATGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTC 822 gvrVIII 788 CTGGAAGAGTTCCTTTTGGAAACGCCGATCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTT 847 gvrIX 761 CTGGAAGAGTTCCTGCTGGAAACGCCGCTCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTC 820

Polimorfismo puntiforme genomovar specifico

Sono stati individuati più di 400 SNPs e di questi ne sono stati selezionati sei

Localizzazione dei Localizzazione dei SNPsSNPs scelti nella scelti nella sequenza del gene sequenza del gene gyrBgyrB

gyrBPosizione

Nomegyr1 PC6r PC9r

900508 989 1028 1068 1168

Profili Profili SNuPE SNuPE attesiattesi

gyrBPosizione

Nomegyr1 PC6r PC9r

900508 989 1028 1068 1168

GvrI G C G A C GGrvII G A A T C G GvrIIIa G A G A C GGvrIIIb G C G A C GGvrIIIc G T G A C GGvrIIId G A A A C GGvrIV A C G A C GGvrV G C G G C GGvrVI G C A T C GGvrVII G C A A C GGvrVIII G C G A T GGvrIX G C A A C C

Set di Set di primer primer per per SNuPESNuPE

Nome

Sequenza 5’-3’ Taglia (basi)

LF 1 TTGTCCTT(G/C)GT(T/C)TGCGAGCT 20 LF2 TTTTA(C/T)CGCGGCGTCGCGCAGGATCGCGTG 30 LF2(gvr6) TTTTATCGCGGCGTCGCGCAGAATCGGATT 30 LF 3 (11T)ACCTTCACGGA(G/C)AGCACGCACGACA 36 LF 4 (6T)CGACGATCTTCCCGCA(A/G)ATGATCTTCGCGTCG 38 LF 5 (12T)CGTGCTGTGCTTCACGAACAACATTCCGCAGCG 45 LF 6 (13T)ACAAGTACATC(A/G)CCGA(T/C)AACGAAATCGCGAA

GAAGGC 50

SNuPE SNuPE (simplex) (simplex) primer primer LF2LF2

Ceppo TVV75, gvr V Ceppo LMG16654, gvr III-B

NeroNeroC

Risultato ottenuto

Risultato atteso

Nucleotide incorporato

NeroNeroC

Risultato ottenuto

Risultato atteso


SNuPE SNuPE (simplex) (simplex) primerprimer LF4LF4

Ceppo TVV75, gvr V Ceppo LMG16654, gvr III-B

BluBluG

Risultato ottenuto

Risultato atteso


VerdeVerdeA

Risultato ottenuto

Risultato atteso


SNuPESNuPE ((MultiplexMultiplex))

LMG 1222 B-N-B-V-N-BB-N-B-V-N-BG-C-G-A-C-GMultiplexI

Risultato ottenutoRisultato attesoNucleotide incorporatoPrimergvrCeppo


LMG16656 B-V-B-V-N-BB-V-B-V-N-BG-A-G-A-C-GMultiplexIII-A



LMG16654 B-N-B-V-N-BB-N-B-V-N-BG-C-G-A-C-GMultiplexIII-B



So1 B-V-V-V-N-BB-V-V-V-N-BG-A-A-A-C-GMultiplexIII-D



LMG18942 B-N-V-R-N-BB-N-V-R-N-BG-C-A-T-C-GMultiplexVI



LMG19467 B-N-V-V-N-BB-N-V-V-N-BG-C-A-A-C-GMultiplexVII


ConclusioniConclusioni

I risultati ottenuti corrispondono a quelli attesi

Picchi inequivocabili, assenza di rumore di fondo

Applicabilità alla routine clinica

Ceppo LMG18942, gvr VI

lezione SNuPE 2

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