1|P a g e

Lez.1-LastrumentazioneinlaboratorioIlcomportamentodatenereinlaboratorioèilseguente:

• Nonsidevemangiare,bereofumare in laboratorio;nonsidevononemmenoportarebevandeocibi;

• Lavarsilemaniprimadiusciredallaboratorio;• Noningombrareicorridoieleviedifugadellaboratorio;• Nonsedersimaisuibanchidilaboratorio.• Raccogliere,separareedeliminareinmodocorrettoirifiutichimici,biologicieradioattivi,solidie

liquidiprodottineilaboratori;èvietatoscaricarliinfognaeneicassonetti.• Primadilasciareillaboratorioaccertarsicheilpropriopostodilavorosiapulitoedinordineeche

tuttigliapparecchi,eccettoquellinecessari,sianospenti.Togliereilcamiceeidispositiviindividualidiprotezioneall'uscitadeilaboratori.

• Scriveresulcontenitore,perognisoluzioneocompostopreparatoladescrizione,ilvostronomeeladata.

Per dispositivo di protezione individuale (DPI) si intende qualsiasi attrezzatura destinata ad essereindossataalloscopodiproteggereillavoratorecontrounoopiùrischiperlasicurezzaolasaluteduranteillavoro. In laboratorio si deve sempre indossare il camice. In particolare, ci sono i guanti (monouso dimateriale compatibile con le sostanzemanipolateedimaterialeanallergico; in cotone (sottoguanti);peraltetemperature;percriogeni)eleprotezioniperpiedi(capriscarpe;calzaturedalavoroanorma).

Informarsisempredellapericolositàetossicitàdeiprodottichimicicheutilizzate.Nontoccareconlemaniireattivi. In casodi contaminazione, lavare accuratamente lemani conmolta acqua.Mai portare lemanisporcheallaboccaeagliocchi.Usaregliappositiaspiratoriperprelevareliquidiconlepipette.

Perquantoriguardalecappe(chimicheebiologiche),bisogna:

• Accertarsichelacappasiainfunzioneechel'aspirazionefunzioni;• Evitaredicrearecorrentid'ariainprossimitàdiunacappainfunzione;• Ilmaterialeinusodeveesseretenutoversoilfondodellacappa;• Mantenerepulitoedordinatoilpianodilavoro;• Teneresottocappasoloilmaterialestrettamentenecessario;• Quandolacappanonèinuso,spegnerel'aspirazione.

Le cappe agiscono come barriere per minimizzare il rischio di infezioni per via aerea, impedendo lafuoriuscita di questi aerosol nell'ambiente di laboratorio e la loro inalazione da parte dei lavoratori.Esistonotretipidicappedisicurezzabiologica:

A. Classe I: è una cappa ventilata aperta frontalmente progettata per la protezione dell'operatoretramiteunflussod'ariaentrantechenonvienerimandataincircolo.E'dotatadiunfiltroHEPAalloscaricoperproteggerel'ambientedallafuoriuscitadimicroorganismi.LecappediclasseIpossonoessereusateconagentibiologicichepresentinounrischiobassoomoderato(gruppidirischio2e3); proteggono l'operatore da contaminanti presenti nella cappa, ma non proteggono dallacontaminazioneimaterialisituatiall'internodellacappastessa(lasterilitànonègarantita!).

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B. ClasseII:unacappaventilataapertafrontalmente eprogettataper laprotezionedell'operatore,dei prodotti al suo interno e dell'ambiente circostante. E' caratterizzata da un flusso d'aria iningressoeconfiltrazionesiadell'ariaaspiratachediquellaespulsa;ilflussolaminare,provenientedal sovrastante filtro HEPA, scende perpendicolarmente al piano di lavoro evitando di investirel'operatore; l'aria espulsa deve essere filtrata da un secondo filtro HEPA e, se ricircolata nellostesso locale,daunfiltrosupplementareacarboneattivopostoavalledell'HEPA,pertrattenereeventualifrazionigassose.

C. ClasseIII:unacappaventilatatotalmentechiusacheèatenutad'ariaedèmantenutaapressionenegativa.L'ariainingressopassaperunfiltroHEPAequellainuscitapassaperduefiltriHEPApostiinserie.Il lavorovienesvoltoconguantiamanicaingommaattaccatiallacappa.Sonousateperlavorareconagentibiologiciadaltorischio(gruppodirischio4)efornisconounabarrieratotaletral'operatoreeillavoro.

Lecappepossonoessereaflussoverticaleoaflussoorizzontale.

Ilrischiolegatoall’utilizzodiunasostanzadipendedallecaratteristichetossicologichedellasostanzastessae, in funzione di queste, dalle modalità del contatto che si realizza nel corso dell’attività lavorativa. Laclassificazionedelle sostanze viene fatta in base alla pericolosità. La pericolosità delle sostanze chimicheviene classificata in funzione delle proprietà chimico-fisiche, eco-tossicologiche e tossicologiche. Talicaratteristichesonoschematicamenterappresentatedalsimbolostandarddipericoloopittogramma.

Infunzionedeglieffettispecificisullasalutedell’uomo,lesostanzetossichesonosuddiviseulteriormentein:

• Cancerogeni:sostanzeepreparatichepossonoprovocaretumori;• Mutageni:sostanzeepreparatichepossonointerferirenellasintesidelDNA;• Teratogeni:sostanzeepreparaticapacididareeffettidannosisullecapacitàriproduttiveedifetti

geneticiereditari.

Tali sostanze non hanno pittogramma,ma possono essere indicate con quelli delle sostanze “nocive” e“tossiche”econlerelative:

• Frasi di rischio (H, ex R): descrivono in maniera sintetica i rischi connessi all’uso e allamanipolazione di sostanze pericolose e sono identificabili da una sigla costituita dalla lettera Hseguitadaunnumero.

• Frasidiprudenza(P,exS):descrivonobrevementeleproceduredisicurezzadamettereinattoalfine di minimizzare i rischi connessi all’uso e alla manipolazione di sostanze pericolose. SonoidentificabilidaunasiglacostituitadallaletteraPseguitadaunnumero.

3|P a g e

La scheda di sicurezza (MSDS) rappresenta una guida all’utilizzo, allamanipolazione e allo smaltimentodellasostanzacompreseleproceduredaadottareincasodiimprevistioemergenze.E’fornitasurichiestadelconsumatore,maèreperibilesuInternet.

Irifiutiprodottidevonoesserecontenutiinimballaggiconleseguenticaratteristiche:

• confezionatiechiusiinmododaimpedirefuoriuscitedelcontenuto;• costituiti da materiali inattaccabili dal contenuto e non suscettibili a formare con questo

combinazioninociveopericolose;• solidità e resistenza tali da garantire la sicurezza in tutte le fasi di manipolazione, raccolta e

trasporto.

Irifiutiprodottivengonoraccoltiin:

• TanicheomologateUNinHDPEda20L(raccoltaliquidi);• FusticonghieraomologatiUNinHDPEda60L.

Per quanto riguarda le procedure di raccolta dei rifiuti chimici, bisogna seguire le seguentiraccomandazioni:

• Nondevonoesseremescolatirifiutisolidiconrifiutiliquidi;• Tenere separati i COMPOSTI ALOGENATI (concentrazione di alogeni > 0.5%) da quelli NON

ALOGENATI;• LesostanzeconferitenellostessocontenitoreNONdevonoessereCHIMICAMENTEINCOMPATIBLI

(reazioniincontrollate);• Riportaresuciascuncontenitoreinomidellesostanzesversate(NONsigleoabbreviazioni);• Incasodimisceleriportarel’elencocompletodellesostanzedipartenza;• I rifiuti solidi quali puntali, cuvette, vials, ecc., contaminati da sostanze chimiche NON vanno

conferiti nello stesso contenitore di carta, guanti, cartine/navicella da pesata, ecc., a loro voltacontaminati.

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Perquantoriguardairifiutisanitaripericolosi,vannoseguiteleseguentiraccomandazioni:

• Nessun rifiuto sanitario pericoloso deve essere scaricato nella fognatura o smaltito con i rifiutiurbani;

• Tuttiquestimaterialipericolosidevonoessereappropriatamenteidentificati,contenutiinmanierasicuraedeliminatiattraversoadeguateproceduredismaltimento;

• IlmaterialebiologicocontaminatodasostanzechimichepericoloseDEVEinveceessereSMALTITOcomerifiutochimico;

• Il materiale biologico contaminato da sostanze radioattive DEVE essere SMALTITO come rifiutoradioattivo.

• Ilmaterialedeveesseresmaltitoneicontenitorispeciali (perrifiutiospedalieri infetti,maxpeso6kg)dotatidisaccogiallo.

Materialedasmaltireneicontenitorispeciali:

• materialemonouso(piastre,fiasche,provette,pipette,garze,ecc.)venutoacontattoconcelluleoaltropreparatobiologico;

• isecchiellidiplasticacontenentiaghie/omaterialitaglienticontaminaticonmaterialebiologico.

Lebilancevengonoutilizzateper lamisuradellemasse.Lebilancescientifichesidistinguonotra loroperportataesensibilità.Laportataèilpesomassimochelabilanciapuòsopportare,effettuandoancoraunamisuracorretta.Lasensibilità, invece,èilpesominimochequestariesceapesareinmanieracorretta.Inparticolare, labilancia analitica consente di apprezzare fino al decimo o al centesimo dimg;mentre labilanciatecnicapresentaunasensibilitàdi0,001g(cioèdi1mg).

Quando si ha la necessità di preparare spesso una soluzione dello stesso composto (a volte anche aconcentrazioni differenti) è utile partire da una soluzione stock, cioè una soluzione più concentrata diquelle da preparare che poi si diluisce al momento dell'uso. La concentrazione dello stock può essereindicatain:

• Valoreassoluto:molarità,%w/vol,%vol/vol;• Valore relativo alla concentrazione d'uso: quante volte lo stock è più concentrato rispetto alla

concentrazioned'uso;

Lanotazione relativaèparticolarmenteutilequandosiutilizzanosoluzioniapiù componentiper lequalinonhasensodefinirelaconcentrazioneassoluta.Perpreparareunaseriedisoluzionidellostessosolutoaconcentrazionidiversaèutile,alfinedigarantirelamassimaaccuratezza,effettuaredellediluizioniseriali.Lediluizioni seriali prevedono lapreparazionedi soluzioni a concentrazionedecrescente, separatedaunrapportodidiluizionecostanteapartiredaun'unicasoluzionestock.

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Lez.2-LamisuradelpHIl pH dà l'indicazione numerica dell'acidità o della basicità di una soluzione. Le variazioni di pH possonospesso promuovere reazioni chimiche spesso indesiderate. Fortunatamente esistono dei modi perproteggere in maniera efficace i sistemi dalle variazioni di pH. Scegliendo opportunamente i soluti, èpossibile preparare soluzioni che non vanno incontro a variazioni apprezzabili di pH, anche quando vi siaggiungonopiccole quantità di acidi o di basi forti.Queste soluzioni vengono chiamate tamponi proprioperchésonoingradoditamponareilsistemarispettoadunavariazionedipH.Perpoteragire,untamponedeveessereingradodineutralizzarel'aggiuntasiadiunacidofortesiadiunabaseforte,neutralizzandogliioniH+oOH-chevengonoaggiuntialsistema:

Questa espressione, conosciuta comeequazionediHenderson-Hasselbach, permettedi ricavare il pHdisoluzionicostituitedaunacidodeboleconlasuabaseconiugata.IlprimofattorecheinfluenzailpHèlaKadell'acido debole; il secondo è il rapporto fra le concentrazioni molari dei due membri della coppiaconiugataacido-base.Quandoleconcentrazionideiduecomponentisonouguali,ilsistemahalamassimaefficienza e pH = pKa. Di conseguenza, il fattore principale che determina il pH al quale la soluzionetamponeagiscepiùefficacementeèilvalorepKadell'acidodebole.

Se dovessimo preparare una soluzione tampone con un valore di pH intorno a 5, la coppia acido-baseconiugatasceltapotrebbeesserequellacostituitadaacidoaceticoedacetatodisodio.

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L’efficacia di un tampone dipende dai valori assoluti delle concentrazioni dell’acido e della sua baseconiugata, ed è massima quando il rapporto delle due concentrazioni è uguale all’unità. Prepareremoquindi la soluzione tampone inmodoche leconcentrazionidiCH3COOHeCH3COO-nella soluzione finalesianopressochéuguali.

IlpHdiuntamponenoncambiase l’interosistemavienediluito (oconcentrato).Ladiluizionedeterminaunavariazionedivolumedellasoluzionemanonmodifica ilnumerodimolideisoluti: il rapporto inmolirimanepertantocostante.Per le soluzioni tampone,possiamousare indifferentemente le concentrazionimolari o lemoli per rappresentare le quantità delle due sostanze che costituiscono la coppia coniugataacido-base.Ladiluizionedeterminainveceunavariazionedellacapacitàtamponante,cioèdellaquantitàdiacidoobasefortecheilsistemaèingradodiassorbireprimacheilsuoeffettosiaesaurito.

PerprepararelesoluzionitamponeutilizzeremounpHmetrodabanco.LaprimaoperazionesaràquelladieseguirelacalibrazionedelpHmetro.Tuttelesoluzionidovrebberoesseremiscelatequandosieffettuaunamisura,alfinedigarantirelarappresentativitàdelvaloremisurato.Lacalibrazionesieseguenelseguentemodo:

1. Lavareaccuratamentelapuntadell’elettrodo;2. Inserire l’elettrodo nella soluzione di taratura a pH 7.00, agitandola leggermente, fino alla

stabilizzazione;3. Sollevarel’elettrodoesciacquarloabbondantementeconacquadistillata;4. Inserire l’elettrodo nella soluzione di taratura a pH 4.00, agitandola leggermente, fino alla

stabilizzazione;5. SelacalibrazioneèOK,sciacquarel’elettrodoconacquadistillataeiniziarelemisure.

Risultautileseguireleseguentiindicazioni:

• Per ottenere dei risultati estremamente precisi, occorre prestare molta attenzione ai metodi ditaraturadeglistrumenti.

• E’buonanormacambiarefrequentementetuttelesoluzionistandard.• Tuttelesoluzionidevonoesseremantenuteallastessatemperatura.• Traunamisurazioneel’altraèbuonanormalavarel’elettrodoconacquadistillata.• Nelmomentodellacalibrazione, lasciare l’elettrodo immersoperuntemposufficienteaffinché la

letturasistabilizzi.

Ogniamminoacido(eccettolaprolina)possiedeuncarboniocentrale,chiamatocarbonioα,alqualesonolegatiquattrodifferentigruppi:

• Ungruppoamminicobasico(-NH2);• Ungruppocarbossilicoacido(-COOH);• Unatomodiidrogeno(-H);• Unacatenalaterale,diversaperciascunamminoacido(-R).

Gli amminoacidi naturali differiscono per la catena laterale che conferisce proprietà diverse a ciascunamminoacido.Tuttigliamminoacidi(trannelaglicina)hannol’atomodicarbonioαlegatoaquattrogruppidiversi:ilcarbonioα(asimmetrico)èquindiuncentrochiralicoootticamenteattivo.

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Quando un amminoacido viene sciolto in H2O diventa uno ione dipolare (zwitterione) che può agire siacome acido (donatore di protoni) che come base (accettore di protoni). Le sostanze che hanno questadoppianaturasidefinisconoanfòtereoanfoliti.AlpHfisiologico(valoreattornoa7.4)tuttigliamminoacidihanno:

• Ilgruppocarbossilicodissociato(-COO-);• Ilgruppoamminicoprotonato(-NH3

+).

Gli amminoacidi possono essere considerati acidi diprotici. Ciascuno dei due equilibri comporta lapossibilitàchel'amminoacidofunzionidatampone:

Il punto isoelettrico (pI) è il valore di pH al quale un amminoacido ha carica netta pari a 0, cioè èelettricamenteneutro.IlpIèunacaratteristicadiognisingoloamminoacido.

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PercalcolareilpIsiutilizzaunartifiziomatematico,cheportaallaseguenteequazione:

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Lez.3-LisicellulareecentrifugazioneIlprimopassaggiodellapurificazionediunaproteinaè larotturadellecelluleche lacontengono.Questaprocedura, detta frazionamento (o lisi) cellulare, deve avvenire in un opportunomezzo che preservi lastrutturanativadelleproteine,ossiauna soluzione tamponeconprecise caratteristiche. I tessutidevonoessereinizialmenteomogeneizzatitramitemetodimeccanici,ossiasottopostiadunprocessochedisintegrailtessuto,trasformandoloinunmaterialeomogeneo(omogenato).Imetodidirotturadellecellulepossonoinvece esseremeccanici o non meccanici, sono vari e dipendono dalla presenza o meno della paretecellulareedallanaturachimicadiquesta:

• Digestioneenzimatica(nonmeccanico):adesempio,laparetecellularedeibatteriedeilievitipuòesseredigeritaconenzimilitici(lisozimaeliticasi,rispettivamente)chevannodiscioltineltamponeincuisonosospeselecellule;

• Shock osmotico (non meccanico): si crea una differenza di pressione osmotica tra l'ambienteintracellulareequelloextracellularechecausal'entratadiacquanellacellulaeilsuoconseguenterigonfiamentofinoall'esplosione;

• Sonicazione(meccanico):gliultrasuoniadaltafrequenzasonousatiperromperecellulebattericheedilievito.Nellasospensionecellularevieneimmersalasondametallicadiunsonicatore,cheèingrado di emettere onde sonore ad altissima frequenza. Le cellule vengono rotte dalle elevatepressioni locali indotte da queste onde. Lo svantaggio principale di questa tecnica è il notevolesurriscaldamentoalqualepuòandareincontrolasospensionecellulare.

• French press (meccanico): è una tecnica applicabile a microorganismi quali batteri e lieviti. Lasospensionecellularevienemessainunacameradicompressionediacciaioinox,dotatadipistoneechiusadaunavalvolaaspillo.Sirimuovetuttal'ariadallacamerae,medianteunpistone,vieneapplicata sulla sospensione cellulare una pressione idraulica molto elevata. Dopodiché si aprelentamente lavalvolaa spillo, così che lecellulepossano fuoriusciredallavalvola stessa.Acausadella repentina variazione dei valori di pressione cui sono sottoposte uscendo dalla valvola, lecellulescoppianoesifrantumano.

• Omogenizzazione: lemembranesono rottedalle forze frizionali cheunpestello in teflonovetro(potter),disolitotenutoincostanterotazionegrazieaduncollegamentoconunmotoreelettrico,esercitacontro leparetidiunospessotubodivetro(incuiècontenuta lasospensionecellulare),chedeveavereundiametro leggermentesuperioreaquellodelpestello.Leforzefrizionalichesigenerano sono sufficienti per rompere la membrana delle cellule animali, ma non le cellulebattericheovegetali.

• Macinazione:siapplica inparticolarmodoatessutiocellulevegetali,chevengonomescolaticonparticelle abrasive (ad esempio granelli di sabbia) e triturati con un pestello a mano al fine diromperelepareticellularitramitel'effettoabrasivodelleparticelle.

Questiprocedimentiromponomoltemembranemalascianointattigliorganulichepossonoessereseparatisullabasedellelorodimensioniedensità.

Unsemplicemetododiseparazionedeicomponentidispersiinunliquido,cheabbiamoottenutoattraversoilfrazionamentocellulare,consistenelfarlisedimentare.Inunmiscugliodiparticelleocomponentidiversi,infatti, le velocità di sedimentazione sotto l'effetto della gravità, sono diverse da componente acomponente,ilchedarebbelapossibilità,conopportuniaccorgimenti,diottenerliseparatil'unodall'altro.

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Lavelocitàdisedimentazioneè facilmentecalcolabilepartendodalla leggediStokes, laqualediceche laforzaFdiattritocheunliquidodiviscositàηopponealmotodiunasferettadiraggioRchescorreinesso,èdirettamente proporzionale alla velocità della sferetta, al suo raggio e al coefficiente di viscosità η delliquido.Sihacioèinmodulo

Si osserva cheun corpo che cade inun liquido viscosodopoqualche tempo simuovedimoto rettilineouniforme. Prendiamo in esameuna sfera di raggioR e densità ρ che venga lasciata cadere in un liquidoviscosodidensitàρ0echestiascendendoinessoconmotorettilineouniforme.Inquestecondizionideveesserenecessariamentenullalarisultantedelleforzeagentisudiessacomevuoleilprincipiod'inerzia.LaforzaF1,direttaversoilbassoecausadelmotoèequilibratadellaforzaviscosaFchesiopponealmoto.Fèpertantodirettaverso l'altoe il suomoduloèdatodalla leggediStokes. IlmodulodiF1sipuòcalcolarefacilmenteosservandocheessoèdatodalladifferenzatralaforzapesodellasferetta

ediquelladovutaallaspintadiArchimede

Sihacioèinmodulo

Eguagliandola(7.44)ela(7.47)siottiene:

dacuisiricavafacilmente:

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Ilcoefficientedisedimentazionedipendedallatemperatura,dalladensitàedallaviscositàdellasoluzione.Poiché gli studi di velocità di sedimentazione vengono condotti impiegando svariati sistemi soluto-solvente,perconvenzionesiusacorreggereilcoefficientedisedimentazionetrovatosperimentalmenteinquelvalorechesiotterrebbe inunmezzo lacuidensitàeviscosità fossepariaquellodell'acquaa20°C:coefficientedisedimentazionestandardos20,w.S=Svedberg=10-13sec.

Le velocità di sedimentazione dei componenti cellulari sono molto piccole ed è per accelerare questoprocesso che si ricorre alla centrifugazione, che consenta di ottenere gli stessi risultati in tempinotevolmentepiùbrevi.

3.1LacentrifugazioneLacentrifugazioneèunadelleprincipalimetodologieseparativeutilizzatedell’indaginebiochimicainsiemealla dialisi, alla filtrazione, alla cromatografia o all'elettroforesi, in quanto permette la separazionemeccanicainunmezzoliquidodimaterialisolididalliquidoedimaterialisoliditralorosottoponendoliaduna forzacentrifuga.Questaoperazionerichiede l'usodimacchinededicate, lecentrifugheperprovette,che fondamentalmente sono costituite da unmotorea velocità variabile, al cui asse viene ancorato unrotorecheportaglialloggiamentiperleprovetteedèconfinatoinunacamerachiusa.

Lo scopoè quello di applicareun campogravitazionale artificiale attraverso la rotazione ad alta velocità(Campo centrifugo), in quanto le particelle possono essere separate poiché sedimentano con velocitàdiversaasecondadellediversecaratteristichedidensità,dimensioneeforma.

L'equazione fondamentale che descrive la velocità di sedimentazione di una particella in sospensione,sottopostaaduncampocentrifugoG,èlaseguente:

G=ω2r

incuirèladistanzaradialedellaparticelladall'assedellarotazioneespressaincm,mentreωèlavelocitàangolare del rotore espressa in angoli radianti/sec. Un angolo radiante rappresenta il rapporto tra lalunghezzadell'arcodicirconferenzaspazzatodall'angoloelalunghezzadelraggioditalecirconferenza.Piùfrequentemente lavelocitàangolaredelrotorevieneespressa interminidirivoluzioniperminuto (rpm),doveunarivoluzione(ungiro)delrotoreèparia2πrad.Quindiωpuòessereespressacome:

Percui,sostituendoilvalorediωall'equazionesiottiene:

G=!!!(!"#)!!!"##

Il campo centrifugo G può anche essere espresso in multipli dell'accelerazione gravitazionale terrestre(ossiag,paria981cm/sec2),cioècomerapportotrailpesodellaparticellasottopostaalcampocentrifugoeilpesodellaparticella inpresenzadellasolaforzadigravità. Inquestocaso,quindi,Gvieneespressointerminidicampocentrifugorelativo(RCF)o,piùcomunemente,comenumerodig.

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chediventa:

RCF=1.11x10-5·(RPM)2·r

Perdescrivere lamodalitàdicentrifugazione inmanieracompletabisognapertanto indicareo laRCFo lavelocitàdirotazione(rpm)insiemealraggiodelsistema.Ilnormogrammaserveperconvertireig inrpmquandoènotoilrotorechesideveadoperareequindisiconoscer.

Il materiale biologico sottoposto ad una separazionemediante centrifugazione è sempre sospeso in unsolvente. Quindi la velocità di sedimentazione di una particella non dipende solo dal campo centrifugoapplicato,maanchedallecaratteristichefisiche(dimensione,peso,densitàeforma)dellaparticellastessaedalla viscosità del solvente in cui si trova. Secondo la legge di Stokes, che tiene conto di tutti questiparametri,lavelocitàdisedimentazionediunaparticellasfericaèlaseguente:

Lavelocitàdisedimentazionepuòesseredivisaperilcampocentrifugoapplicato,ottenendoilcoefficientedisedimentazione(s),ossia:

s= 𝒗𝝎𝟐𝒓

Il coefficientedi sedimentazioneèespresso insecondiedipendedalla temperatura,dalladensitàedallaviscositàdellasoluzione.Proprioperquestomotivo,poichéglistudidivelocitàdisedimentazionevengonocondottiimpiegandosoluzionidiverse,perconvenzionesiusacorreggereilcoefficientedisedimentazionetrovatosperimentalmentenelvalorechesiotterrebbeinunmezzolacuidensitàeviscositàfosseropariaquelladell'acquaa20°C.Ilvalorecosìtrovatovienequindiespressocomecoefficientedisedimentazionestandard. Valori tipici di s, per le diverse molecole biologiche, sono nell'ordine di 10-13 secondi, perciòquestaquantitàèstatadefinita1unitàSvedberg(S).

In generale le tecniche centrifugative possono essere suddivise in preparative e analitiche. Lacentrifugazione preparativa permette di separare e raccogliere cellule intere, o organelli subcellulari emacromolecole biologiche, come acidi nucleici o proteine. Nella centrifugazione preparativa è possibilelavorare con grandi quantità di materiale e a bassa velocità. La centrifugazione analitica viene inveceutilizzata per studiare le caratteristiche di sedimentazione di un campione e per determinare il grado dipurezza o la massa molecolare. Pertanto si lavora ad alta velocità e a volumi inferiori di materiale daanalizzare. Le tecnichedicentrifugazionepreparativa comprendono la centrifugazionedifferenzialee lacentrifugazioneingradientedidensità.

Nellacentrifugazionedifferenziale ilmaterialedafrazionareèsottopostoacentrifugazionisequenziali, incui in ogni passaggio successivo si aumenta il valore del campo centrifugo applicato. Per ognicentrifugazione si ottiene sempre un sedimento e un sopranatante, cioè una soluzione contenente ilmaterialechenonèsedimentato. Inognipassaggio,allafinedellacentrifugazione,sisepara ilsedimentodalsopranatanteeilsedimentovienelavatopiùvolte,risospendendoloneltamponediomogeneizzazione

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e centrifugandolo nuovamente nelle stesse condizioni. In questo modo si migliora la separazione e siottiene una preparazione purificata delmateriale presente nel sedimento,ma inevitabilmente si ha unariduzionedellaresa.Lafrazionedelsopranatantevienesottopostaadaltripassaggidicentrifugazione,convaloridivelocitàeditempomaggiori,perottenerelasedimentazionedegliorganellipiùpiccoli.Inquestatecnica siutilizzandocampicentrifughi finoa75000g, cheperònonsonosufficientiper sedimentare lemacromolecoleinsoluzione(cherimangononelsopranatante).

Pervalutarel'efficaciadiunfrazionamentosubcellulare,vieneanalizzatalapresenzanellediversefrazionidi enzimi o proteine (marcatori o marker), che sono localizzati in modo specifico in un determinatocompartimentocellulare,esivalutalaloroattivitàspecificamediantesaggidiattivitàenzimaticaoanalisielettroforetiche.

Attivitàspecifica(inU/mgdiproteine)= !""#$#"à !"#$%&'$(& (!" !/!")!"#$%#&'()*"#% !"!#$% !" !"#$%&'% (!" !"/!")

Se la centrifugazione è stata efficace l’attività specifica nella frazione purificata è maggiore dell’attivitàspecificadipartenza.

Lacentrifugazioneingradientedidensitàrichiedelapresenzadiunacolonnadi liquidolacuidensitàsiacrescentemanmano che si raggiunge il fondodella provettada centrifuga.Questopuòessereottenutostratificando nella provetta piccole quantità di soluzioni a concentrazione decrescente, dal fondo versol'imboccaturadellaprovetta(gradientediscontinuo),oppureutilizzandounpiccoloapparatomescolatorecheconsentelaformazionediungradientecontinuo,dallaconcentrazionemaggioreaquellaminore.Unavolta formato il gradiente, si stratifica il campione da centrifugare sopra la miscela e, durante lacentrifugazione, leparticellesiseparerannosecondoi lorocoefficientidisedimentazione,formandodellebandediscrete.Lecaratteristicheidealideimaterialipergradientisonoleseguenti:

• Ampiointervalloditossicità;• Bassapressioneosmotica;

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• Bassaviscosità;• Nessunatossicità;• Compatibilitàconmaterialibiologici;• Incapacitàdipenetrarelemembrane.

Lacentrifugazionezonaleconsistenellasedimentazionedelleparticelleinzonediscreteedèusataperlaseparazione di particelle di densità simile ma di massa diversa. Trattandosi di un metodo dinamico, ladurata della centrifugazione deve essere sufficiente a determinare la separazione delle componenti,mainferiore al tempo necessario alla completa sedimentazione al fondo della provetta. Dal punto di vistaoperativosiprocedecomeappenadescrittonellacentrifugazioneagradientedidensità.

Adifferenzadella centrifugazione zonale, la centrifugazione isopicnica (oall'equilibriodi densità) è unacentrifugazione all'equilibrio, che consiste nel portare ogni componente della miscela ad un livellocorrispondenteallapropriadensità:ilgradientesiformadurantelacentrifugazionestessa.Sitratta,quindi,diunatecnicacheseparaleparticellediunamiscelaesclusivamenteinbasealladensità,enoninbaseallaforma ed alle dimensioni. Una volta raggiunto l'equilibrio, questo non viene alterato dal tempo dicentrifugazione.

Una volta terminata la centrifugazione, si possono raccogliere le particelle contenute nelle bande cosìseparatefacendounbucosulfondodellaprovettaeraccogliendoilgradientegocciaagoccia.

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Le ultracentrifughe preparative possono raggiungere veocità massime fino a 70 000 rpm e campicentrifughi oltre i 200 000 g. in questo modo, riescono a separare particelle piccole quali microsomi,ribosomi, batteri, virus, acidi nucleici e proteine. Le ultracentrifughe analitiche, che invece possonooperare a velocità che arrivano fino a 100 000 rpm (oltre 600 000 g), possiedonoun sistemaottico chepermettediosservareilmaterialebiologicomentresedimenta.Manmanochelasedimentazioneprocede,l'insiemediparticelle,equindiilpicco,sispostano,percuilamisuradellavelocitàdispostamentodelpiccocostituisce la velocità di sedimentazione della particella. Dalla velocità di sedimentazione si possonoricavare il coefficiente di sedimentazione, quello di diffusione, il peso molecolare, la densità, laconcentrazioneel'omogeneitàdiunasoluzione.

Le centrifughe da banco sono le più semplici e le meno costose, spesso usate per raccogliere piccolequantitàdimaterialechesedimentarapidamente.Generalmentepresentanovelocitàmassimecompresetra4000e6000rpmconRCFmassimidicompresitra3000e7000g.Moltediesseoperanoatemperaturaambiente,tuttaviaalcunimodellisonoprovvistidiunsistemadirefrigerazione.

Lecentrifugherefrigerateadaltavelocitàsonosistemichepossonoraggiungereunavelocitàmassimadi8000 - 20000 rpm e un RCF massimo di 10000 - 50000 g. Tutte posseggono camere refrigerate e ledifferenzetraunacentrifugael'altraconsistonoessenzialmentenellacapacitàmassimadeglialloggiamentideirotori.Conquestecentrifughesipossonousaresiarotoriadangolofissosiaabraccioscillanti.

Esistonodiversitipidirotori:

• Adangolofisso:incuileprovettesonoposteaduncertoangolorispettoall'angolodirotazione,dai 15 ai 45°; questi hanno piccole differenze fra rmax e rmin, presentano un tempo per lasedimentazioneminore, sono più pesanti e necessitano di unamaggiore energia per operare;infinesiutilizzanopersedimentaremacromolecoleeparticellefini.

• Verticali:incuileprovettesonoposteparallelamenteall'assedirotazione;• Abraccioscillanti: incuileprovetteinpartenzasonoposteparallelamenteall'assedirotazione,

maiportaprovettepossonoruotareequindileprovettevengonoatrovarsia90°rispettoall'assedi rotazione durante la centrifugazione; analogalmente a ciò che avviene in certe giostre aiseggiolinideipasseggeri.Questisonodapreferirepercentrifugareparticellecelluleeparticelleeperlacentrifugazionesugradiente.

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Lez.4-MetodicromatograficiLacromatografia (dalleparolegrechechromos,colore,egraphein, scrivere)èunatecnicadiseparazionebasata sulla differente ripartizione tra due fasi immiscibili dellemolecole che si vogliono separare.Nelleseparazionicromatografiche,unadelleduefasi(fasemobile,chepuòessereliquidaogassosa)vienefattascorrereattraversol'altrafase(fasestazionaria,chepuòesseresolidaoliquida),cheèimmobilizzatasuunsupporto generalmente costituito da una colonna o una lastrina. Il fondamento di tutte le tecnichecromatograficheè ilcoefficientedi ripartizioneodidistribuzione (Kr), chedefinisce leproporzioni incuiuna sostanza si distribuisce tra le due fasi immiscibili. Ad una determinata temperatura, una sostanza sidistribuiscetraleduefasiconuncoefficientediripartizionedefinitocome:

Kr=!"#$%#&'()*"#% !"##$ !"#$ !"#$%&

!"#$%#&'()*"#% !"##$ !"#$ !"#$%&'#(%#

Ogni sostanza ha un suo caratteristico valore di Kr, che la identifica in modo univoco. Le molecole dasepararedevono,infatti,averecoefficientididistribuzionediversitraleduefasi.

Inbaseallaformadeldellettocromatograficosucuièrealizzatoilprocessoseparativo,possiamoavereleseguentivarianti:

• Cromatografiasucolonna:lafasestazionariaècontenutaall'internodiunacolonnacilindrica,chepuòessereriempitacompletamente(colonnaimpaccata)oppurerivestitasullasuperficieinterna(colonnatubulare);

• Cromatografiaplanare:lafasestazionariaèdistribuitasuunasuperficiepiana,chepuòessereunsupporto cartaceo (cromatografia su carta, PC) o una lastrina in vetro o altri materiali(cromatografiasustratosottile,TLC).

Ponendo all'uscita della colonnaun rivelatore chemisuri la concentrazionedel soluto nell'eluito (cioè lafase mobile che esce dalla colonna) e riportando il segnale in funzione del tempo, si può ottenere uncromatogramma.

Dalpuntodivistateorico,iprincipaliparametricromatograficisonoiseguenti:

• Tempo di ritenzione (tR): il tempo che intercorre dall'introduzione del campione in colonnaall'uscitadallacolonnadell'apicedelpiccodieluizionecorrispondente;

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• Tempomorto (tM): il tempo che unamolecola non trattenuta (o la fasemobile) impiegano perusciredallacolonna;

• Temponettodiritenzione:èdatodalladifferenzafratempodiritenzioneetempomorto;• Volumediritenzione(VR):ilvolumedifasemobilerichiestopereluireunamolecola;• Volumemorto (VM): ilvolumedi ritenzionediuncompostochenonè trattenuto (corrispondeal

volumedifasemobilecheoccupaunacolonna).

Lalarghezzadellabase(w)assumesolitamentelaformadiunagaussiana.Lemolecolediunanalita,però,non simuovono lungo la colonna con la stessa velocità: la loro dispersione ha generalmente un profilogaussiano,eilcentrodelprofilo(bandadieluizione)rappresentalavelocitàmedia.Ifattoricheprovocanodeviazionidalvaloremediosono:

• diffusione longitudinale: diffusione delle molecole dalla zona a maggiore concentrazione versoquellaaminoreconcentrazione,indirezioneparallelaall’assedellacolonna;

• Trasferimentodimassatrafasemobileefasestazionaria;• Percorsimultipli.

Oltreal tempodi ritenzione tR,èposibilequantificare l'interazionediunsolutocon la fasestazionaria induemodi:

1. Volumediritenzione:a. VR=tRxF;doveFèlavelocitàdiflussomedianteilvolumedifasemobileVRnecessarioper

eluire il flusso. La velocità di flusso dipende dalle dimensioni della colonna, dallecaratteristichedelleparticelleedallaviscositàdellafasemobile.

b. VR = VM + KdVs ; dove VS è il volume della fase stazionaria e Kd è il coefficiente didistribuzionetraleduefasi.

2. Rapportodiritenzione(odicapacità)K':èunamisuradeltempoeffettivocheunanalitaimpiegaadeluiredallacolonnaconfrontatoconquellodiunanalitaeslusoononritenuto(nonsiripartiscenellafasestazionaria,perciòk'=0).K'ètantopiùelevatoquantopiùalungoètrattenutoilsoluto.

Nelsuocomplesso,labontàdiunsistemacromatograficodipendedaiseguentiparametri:

A. Selettività: è la capacità di un sistema cromatografico (fase stazionaria + fase mobile) didiscriminare tradue composti strutturalmente correlati e simisura come rapporto tra i tempidiritenzione;

B. Risoluzione(R):èunamisuraquantitativadellacapacitàdisepararedueanaliti.

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C. Efficienza: lacapacitàdiunsistemacromatograficodieluiretutte leparticelledellastessaspecieallastessavelocità,inmododaformarebandestretteincolonnadacuipicchistretti(interminidiampiezza).È,inpratica,lamisuradeglieffettididiffusione,cheprovocanol'allargamentodeipicchielalorosovrapposizione.

L'efficienza di un sistema cromatografico, e in particolare di una colonna, si quantifica con il cosiddettonumerodipiattiteorici,cioèlaseriedistratisottiliincuisiconsideracompostounsistemacromatografico.Inognunodiquestimicroelementidellacolonnasirealizzal'equilibriodidistribuzionedelsolutotralafasestazionaria e la fase mobile. Lo spostamento lungo la colonna è dovuto all'azione dinamica della fasemobile.Dalla formadiunpiccosipuòricavare ilnumerodipiatti teoriciNperquellacromatografia,checonsiderailvolumedieluizione(VR)el'ampiezzadiunpicco:

N=16(VR/W)2

Noto N, si può risalire all'altezza equivalente del piatto teorico (H.E.T.P) H, detta L la lunghezza dellacolonna:

H=!!

Levariabilicheinfluenzanol'efficienza(lalarghezzadeipicchi)diunacolonnasono:

• Lavelocitàdiflussolineare(cm/s)dellafasemobile;• L'altezzaequivalentedelpiatto teorico (H), chedipendepropriodallavelocitàdi flussodella fase

mobile;• L'impaccamentodellacolonna.

Levariabilicheinfluenzanolarisoluzione(separazionedeipicchi)diunacolonnasono:

• Lasceltadellafasestazionaria;• Lasceltadellafasemobile;• Lalunghezzadellacolonna;• Latemperatura.

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4.1CromatografiaascambioionicoIlprincipiosucuisibasaquestotipodicromatografiaèl'attrazionechesiverificatramolecoledicarichedisegnoopposto.Lacaricanettachequesticompostipresentanodipendedal loropunto isoelettrico (pI)edalpHdellasoluzionetamponeincuisonodisciolti.Adesempio,proteineposteinunasoluzionetamponeaventeunpHinferiorealloropuntoisoelettricoavrannocaricanettapositiva,mentreseiltamponehaunvaloredipHsuperiorealloropuntoisoelettricoesseavrannocaricanettanegativa.

Talemetodopermettequindidisepararelemolecolesullabasedellacaricanettasuperficiale.Lemolecolemodificheranno il grado di interazione con il mezzo cromatografico in base alla loro carica totale, alladensità di carica e alla distribuzione della loro carica. I gruppi che contribuiscono alla formazione dellacaricanettadiunamolecolahannodiversivaloridipKadipendentidallalorostrutturaedalmicroambientein cui si trovanoe la loro caricaè strettamentedipendentedalpH. La cromatografiaa scambio ionico siavvantaggiaperilfattocheilrapportoesistentetralacaricanettaeilpHperunaspecificaproteinaèunico.

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Leseparazioniperscambioionicosonocondotteincolonneimpaccateconunaresinascambiatricediioni.Esistonoduetipidiresine:

• Scambiatori cationici: possiedono gruppi carichi negativamente e attraggono molecole carichepositivamente (i cationi); sono anche chiamati materiali acidi a scambio ionico, perché le lorocarichenegativerisultanodallaionizzazionedigruppiacidi.

• Scambiatori anionici: possiedono gruppi carichi positivamente e attraggono pertanto molecolecarichenegativamente(glianioni).Sonoanchechiamatimaterialibasiciascambioionico,perchélelorocarichepositiverisultanogeneralmentedall'associazionediprotonicongruppibasici.

Esistono scambiatori forti, chemantengono la loro carica anche per valori di pH estremi, e scambiatorideboli,icuigruppiionizzabilititolanoinveceatalivaloridipH.Gliscambiatorisonolefaticovalentementeamatricisolideinerti.Questeresinescambiatricidiionisonoformatedapolimeriinsolubiliunititralorodalegamiintrecciati,cheformanounamatricepiùomenointricata.Leparticelledacuisonoformatequesteresine possono essere di diverse dimensioni, dette mesh. Il mesh indica le dimensioni del setacciomolecolare:maggioreèilnumerodimesh,piùpiccolesonoleparticellechecompongonolamatrice.

Leresinepossonoessereporoseononporose,madevono:

• Esserefisicamentestabili;• Esserechimicamenteresistentiancheacondizionistringentidilavaggio;• Averebassilivellidiinterazionenonspecifica;• Esseremodificabiliperdiventarespecifiche;

Tamponicationicidovrebberoessereutilizzaticonresineascambioanionico,etamponianioniciconresineascambiocationico.Inquestomodononsiinfluiscesullacapacitàdellaresina.

UnaproteinachenonhacaricanettaadunpHequivalentealpropriopInoninteragiràconunmezzocaricomaadunpHsuperiorealpI, laproteina legheràunmezzocaricopositivamenteoadunoscambiatoredianioni;mentreadunpHinferiorealpropriopI, laproteinalegheràunmezzocariconegamenteoadunoscambiatoredicationi.

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Larisoluzioneèdefinitacomeladistanzamassimatraipicchiinrapportoallamediadellalarghezzadellabasedeipicchi(puòesseredeterminatadalcromatogramma)edipende:

• Dalleproprietàdellamatrice;• Dallecondizionidieluizione;• Dallecondizionidiimpaccamentodellacolonna;• Dalflussodellafasemobile.

L'efficienzadipende:

• Dalla diffusione longitudinale, che a sua volta dipende dall'impaccamento della colonna, e dallapresenzadibolle;

• Dal tipo di resina utilizzata: più piccole sono le dimensioni delle particelle, migliore sarà ladimensionedelpicco.

Laselettivitàdipende:

• Dallanaturaedalnumerodigruppifunzionalipresentisullamatrice;• DallecondizionisperimentalicomeilpHedallaforzaionica;• Dallecondizionidieluizione.

Laselettività, infunzionedelpH,siraggiungeutilizzandolacromatografiaascambio ionicoavaloridipHperiqualisipossanorenderemassimeledifferenzeinterminidicaricanettadeicomponentidiinteresse.L'optimumdi selettività siottienenormalmenteavaloridipHper iquali siamassima ladifferenza tra lecurve di titolazione (maggiore differenza in carica netta) e utilizzando uno scambiatore di ioni con unacaricaoppostaallacaricadellaproteinaaquelparticolarepH.

Talvolta la curva di titolazione di una proteina non è totalmente predittiva sul comportamento dellaproteina:ilpIèdatodallacaricanettatotale,mentrelacromatografiaascambioionicoèbasatasolosullapresenzadellacaricanettasuperficiale.

4.2CromatografiadiaffinitàLa purificazione tramite cromatografia di affinità, a differenza degli altri tipi di cromatografia,dell'elettroforesi edella centrifugazione,non si basa sulledifferenzenelleproprietà chimico-fisichedellemolecole da separare, ma sfrutta le interazioni altamente specifche che si possono instaurare tra lemacromolecole biologiche. Tale tecnica permette, infatti, di separare proteine sulla base di un legamereversibile (interazionidinaturaelettrostaticao idrofobica, forzediVanderWaalsoponti idrogeno) trauna proteina e uno specifico ligando agganciato alla matrice cromatografica. Pertanto, la tecnica ècaratterizzata da alta selettività, alta risoluzione e alta capacità, permettendo di raggiungere unapurificazionecompletainunasingolatappa,anchepartendodamiscelecomplesse.

Se, in condizioni sperimentali corrette, si introduce inunacolonnadi affinitàunamiscela contenente lamacromolecoladapurificare,soloquestasilegheràallafasestazionaria,mentreglialtrielementiverrannorimossi con un semplice lavaggio. La macromolecola di interesse sarà poi recuperata eluendo lacromatografiaconuntamponeopportuno,utilizzandounligandocompetitivoomodificandoilpH,laforzaionica (la cui variazione provoca una diminuizione della forza del legame tra proteina e ligando) o lapolarità.

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Questo metodo è ovviamente basato sulla conoscenza approfondita della struttura e delle proprietà dilegame della macromolecola che si vuole isolare, utile per scegliere il giusto ligando e scegliere (osintetizzare)unabuonaresinadiaffinità.Illigandoutilizzato,chedisolitoèlegatoadunbracciospaziatoreperrenderlopiùaccessibileallamacromolecola,deveavereleseguenticaratteristiche:

• Il gruppo chimico da legare alla matrice o al braccio spaziatore non deve essere coinvolto nellegameconlamacromolecoladapurificare;

• Deve essere attaccato alla matrice in modo da non interferire con la capacità di legare lamacromolecola;

• Ilbracciospaziatoretraligandoematricedeveavereunalunghezzadi6-10atomidicarbonio.

Lamatriceidealedautilizzarenellacromatografiadiaffinitàdevepossedereleseguenticaratteristiche:

• Devecontenerenumerosigruppireattiviadattialegarecovalentementeilligandoedeverisultarestabilenellecondizioniincuiavvienetaleattacco;

• Deveesserestabilenellecondizionidiinterazionedellamacromolecolaenellasuccessivaeluizione;• Nondeve interagire, senondebolmente, conaltremacromolecole,perevitareunadsorbimento

aspecifico;• Devepossederebuonecapacitàdiflusso.

4.3CromatografiadiadsorbimentoQuesto tipo di cromatografia si basa sulla capacità di alcunimateriali solidi di adsorbire (legare tramiteinterazionideboli,quali forzediVanderWaalse legami idrogeno) lemolecolesulla lorosuperficie.Sullasuperficiedeigranulisitrovanositiattivichepossonostabilirelegamideboli(reversibili!)conlemolecoledellamisceladaseparare.Utilizzandotaletecnica,lemolecolechesivoglionosepararesi leganoallafasestazionaria solida e devono essere eluite utilizzando una fase mobile diversa da quella usata perl'equilibraturadellacolonna.

Sitrattaquindidicromatografiadiadsorbimento,chepuòesseregas-solidooliquido-solidoasecondadellanaturadellafasemobileedèindicatapersepararemolecoleconpolaritàdiversa.

Isitidiadsorbimentopossonoessereoccupatidall'eluenteodall'analità.Untipicoadsorbenteè lasilice,che è leggermente acida e può interagire con gruppi polari dell'analita o dell'eluente. Le proprietà diseparazione dipendono dalla disposizione dei gruppi di silanolo. Altre resine utilizzate sono l'allumina(Al2O3)eilcarbone.

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Esistonodue tipi principali di cromatografiadi adsorbimento, che si differenzianoper la relativapolaritàdellafasestazionariaedellafasemobile:

• In fase normale: la fase stazionaria è polare (acqua o un'alchimmina legata alla silice) e la fasemobileèrelativamentenonpolare(unamisceladiacquaesolventiorganici);vieneeluitoperprimol'analitamenopolareeperultimoquellopiùpolare.Lafasenormaleèadattaperseparareanaliticonscarsasolubilitàinsolventiacquosi.

• Infaseinversa:lafasestazionariaèapolare,mentrequellamobileèrelativamentepolare.Lafasestazionariaècostituitanellamaggiorpartedeicasidagruppialchilicilegatiallasiliceeipiùutilizzatisono il butile (C4), l'ottile (C8) e l'ottadecile (C18). L'eluizioneviene condottautilizzando solventiacquosi,metanolo,acetonitrile,tetraidrofuranoomiscelediquesti.Glianalitipolarieluisconoperprimi, inquanto la fasestazionariaè inertee instaurasolo interazioniapolari idrofobiche conglianaliti. L'eluizione può richiedere un gradiente con proporzioni crescenti di solvente a bassapolarità.

Basilare è la scelta del solvente di eluizione (fase mobile), che solitamente si sceglie con un grado dipolaritàparagonabileaquellodell'analitàpiùpolarepresentenellamisceladaseparare:

Alcoli:selamiscelacontieneanaliticongruppiossidrilici; Acetoneoesteri:seglianalitipresentanogruppicarbonilici; Idrocarburicomeesano,eptanoetolueneperanalitinonpolari.

L'eluizionepuòessereisocratica,cioèaconcentrazionecostante,oppureessereingradiente.

4.4CromatografiaadesclusionemolecolareogelfiltrazioneLacromatografiaadesclusionemolecolareogel-filtrazionevieneutilizzatapersepararelemacromolecoleinbaseallelorodimensioni.Inquestotipodicromatografialefasistazionariesonocostituitedamaterialiporosichehannoproprietàdisetaccioeriesconoafiltrare lemolecoleasecondadelle lorodimensioni. Imaterialipiùcomunementeusatiaquestoscoposonodeigranuli costituitidapolisaccaridi insolubili che

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formano un reticolo tridimensionale e, una volta immersi nella fase mobile acquosa, le assorbonoaumentando il loro volume e assumendo la consistenza e le proprietà di un gel: la quantità di solventeassorbita per ogni grammo di gel secco dipende dalla dimensione dei pori. La fase stazionaria è quindicostituitadasferettegelatinosechesiimpaccanolasciandotralorounospaziointerstiziale.Lemolecoledaseparare,discioltenellafasemobile,sonocaricatesullacolonnae lasciatepenetrarenelgel.Lemolecolechesonotroppograndiperpenetrarenelreticologelatinosovengonocompletamenteesclusedalvolumedellesferetteequindisimuovonosoloattraversoglispaziinterstiziali(chenelloroinsiemecostituisconoilcosiddetto volume escluso o vuoto). Le molecole più piccole invece riescono a penetrare nel reticologelatinosoesi ripartisconoall'equilibriotra l'internoe l'esternodellesferette. Inquestomodoessesonorallentaterispettoallemolecolechepassanonelvolumeescluso.Lemolecolechepenetranonellesferettesono a loro volta rallentate in modo diverso a seconda delle loro dimensioni, che determinano ilcoefficientedidistribuzione(trasolventeesternoedinternoallesferettedigel).Lafasemobilepuòessereunsolventeorganico(GelPermeationCromatography,GPC)oppureacquaounasoluzionetampone(GelFiltrationCromatography,GFC).

Ognifasestazionariaècaratterizzatadaunlimitesuperiorediesclusione,espressocomeilvaloredipesomolecolarealdisopradelqualeleproteinesonoesclusedalvolumeinternodellesferette(ossiapassanosolonelvolumevuoto),eunlimiteinferiorediesclusione.Aldisottodiuncertopesomolecolare,infatti,non c'è separazione tra leproteine, poichéquestepassano coneguale facilitànel volumevuotoe tra lemaglie del gel. Soltanto le proteine con peso molecolare compreso nell'intervallo tra i due limiti sonoseparabilitramitecromatografiasuquelladeterminataresina.Laqualitàdellaseparazioneètantomigliorequantopiù ristretto è l'intervallo in cui si distribuiscono le dimensioni delle particelle. Le proprietà delleresinedipartenzahannoleseguentiproprietà:

• Limitediesclusione;• Intervallodifrazionamento;• Acquaguadagnataevolumediletto(bedvolume);• Formaedimensionedelleparticellediresina.

Le fasi stazionarie più comunemente utilizzate comprendono destrani a legami incrociati (come laSephadex), agarosio (Sepharosio, Bio-Gel A), poliacrilammide (Bio-Gel P), poliesteri, gel di silice,poliacrilomorfinaepolistireni.

Anche nel caso della cromatografia ad esclusionemolecolare abbiamo dei parametri fissi che dobbiamotenereinconsiderazione:

ü Ilvolumemorto(V0);ü Ilvolumeinterno(VI);ü IlVolumetotale(VT)dellafasemobile incolonna:ètuttoilvolumeadisposizionedelleparticelle

dellamiscela,cioè:

VT=V0+VI+Vmatrice

ü Il volume di ritenzione o di eluizione (VR o VE): il volume di fase mobile eluita dal momentodell'ingressofinoall'uscitadallacolonnadiunadeterminatasostanza.Talevolumevienemisuratoincorrispondenzadelmassimodelrelativopiccocromatografico. Ilvolumediritenzionecorretto(V'e)vienedefinitoinmododeltuttoanalogoaquelloperlealtretecnichecromatografiche:

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V'e=VR-V0

L'eluizionediuncompostoinunacolonnaèmegliocaratterizzatodalcoefficientedidistribuzione(Kd),cheesprimelafrazionedifasestazionariadisponibileperunadatamolecola(Vi).Kddipendedallatipologiaedèdefinitocome:

Allostessomodo, puòesseredefinitouncoefficientediavanzamento(Kav)come:

Kavpuòesserericavatodaltracciatocromatograficoedèinrelazioneconledimensionidellemolecole:esso,infatti,correlalinearmenteconlogMW.

Per quanto riguarda il volume del campione, questo deve essere: il 10-25% di Vt se lo scopo finale è laseparazioneingruppi(desalting);l'1-5%diVtseloscopoèlaseparazionefrazionatadidiversicomposti.

Perquantoriguardalafasemobile,sipossonoutiizzaresoluzioniacquosesalineoppuresolventiorganici.Nella preparazione delle soluzioni saline occorre tenere sotto controllo alcuni fattori. Alcune separazionidevonoessereeseguiteapHbendeterminatieognigelhaunbenprecisocampodiapplicazione,aldifuoridelqualepossonoverificarsiidrolisiomodificazionidellastrutturadelpolimero.Gliagentiossidantidevonoessereevitati,perchécausanomodificazioninellastrutturadeipolimeri.Infine,perevitarelaformazionedibollenellacolonna,igasdiscioltinell'eleuente(soprattuttoCO2)devonoessereeliminati.

Lecaratteristichedicuibisognatenerecontoperlasceltadellacolonnasono:

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ü Iltipodiseparazionechesiintendeeffettuare(suddivisioneindueopiùfrazioniogruppi);ü L'intervallodifrazionamentodelgel;ü L'intervallodidistribuzionedellemassemolarideicomponentidelcampione;

Le colonne per SEC sono di vetro borosilicato oppure di plastica (trasparente e inerte) con elevataresistenza meccanica. I volumi morti, prima e dopo la colonna, devono essere minimi (max 0,1 % delvolumedelgel),perevitarecheilcampioneolabandainuscitasidiffondanoosidiluiscano.

Gliimpieghisperimentalidellacromatografiaadesclusionemolecolaresono:

A. Purificazione: le molecole di interesse devono cadere entro l'intervallo di separazione dellospecifico gel usato, quindi per scegliere una certa matrice per la purificazione dobbiamo avereun'ideapreliminaredelledimensioniodelpesomolecolaredellaparticella.

B. Determinazionedelpesomolecolarediproteine: iltempodiritenzioneper leproteineglobularidipende dalle dimensioni e quindi dalla massa molecolare. Per una data colonna, i tempi diritenzionedidiverseproteineglobularidipendonolinearmentedallamassadelleproteinestesse.

C. Dissalazione: si possono separare soluti ad alto pesomolecolare dei sali o dai solventi organiciusandocolonne impaccateconunaresinapergel-filtrazioneaporipiccoli (comunque il limitediesclusionedelgeldeveessereinferiorialledimensionidellamacromolecolad'interesse).

4.5Cromatografialiquidaadalteprestazioni(HPLC)La strategia messa in atto nella cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) è proprio quella diaumentare la superficie di scambio, in primo luogo riducendo le dimensioni delle particelle (di diametrovariabiledai3ai10μm)checostituisconolaresinacromatografica.Inquestomodo,siottieneunmaggiornumerodipiatti teorici il chevuoldireunamaggior risoluzione.Riducendo ledimensionidelleparticelleche costituiscono la resina cromatografica, è necessaria una pressione maggiore (diverse centinaia diatmosfere), che deve essere generata da pompemeccaniche, per far passare attraverso di essa la fasemobile. L'HPLC non è quindi unmetodo di separazione nuovo rispetto a quelli già illustrati,ma solo unsistemapiùsofisticatopersfruttareglistessiprincipialfinediottenereprestazionimoltopiùelevate.

UncromatografoHPLCècostituitodalleseguentiparti:

• Riservadisolventi:unoopiùsolventichepossonoessereutilizzatisingolarmenteoinmiscela;• Poma:conpressionefinoa400atmeflussostabiletra0.1e10ml/min;• Sistemadiiniezione:costituitodaunavalvolaapiùvieedauncircuitoavolumefisso(oloop)nel

qualemettereilcampione;• Colonnacromatografica(edeventualeprecolonna);• Rivelatorepermonitorareglieluati;• PCpergestireilsistemaeidati.

LalunghezzadellecolonnenellacromatografiaHPLCvariada10a30cm,mentreil lorodiametrointernodai4ai10mm.Leparticelledellafasestazionariahannoundiametrodai5ai10μm,dellaqualelaresinapiùutilizzataèlasilice.Colonnediquestotipoarrivanogeneralmenteaconteneredai40000ai60000piattipermetrodilunghezza.

Dalmomentochevengonoutilizzatideivolumimoltopiccoli,imetodidirivelamentodevonoesseremoltosensibiliesonosceltiinbaseallesingoleesigenze:

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A. RilevatorespettrofotometricoUV/visibile;B. Rilevatoreaindicedirifrazione(RI);C. Rilevatoreafluorescenza;D. Spettrofotometrodimassa.

Lez.5-ElettroforesiIl termine elettroforesi indica il movimento di particelle cariche all'interno di unmezzo percorso da uncampoelettrico.Quandosiapplicaunadifferenzadipotenziale(ΔV)tradueelettrodi,sigenerauncampoelettrico (E), che dipende dalla distanza tra gli elettrodi (d) verso l'elettrodo di carica opposta e cheinduce la mobilità di una molecola di carica q verso l'elettrodo di carica opposta, imprimendole unavelocitàdimigrazione(v).Lemolecolesispostanoversoilcatodosehannocaricapositivaeversol'anodose hanno carica negativa. Amminoacidi, peptidi, proteine, nucleotidi ed acidi nucleici possiedono gruppiionizzabiliequindi,adognivaloredipH,sonopresenti insoluzionecomespecieelettricamentecaricheepossonoesseresottopostiadelettroforesi.

La velocità con cui lamolecolamigradipende,oltre chedalleproprietàdi caricadellamolecola stessaedall'intensitàdelcampoelettricoapplicato,dadiversialtrifattori.Inparticolare,ilsupportoelettroforeticoutilizzato esercita una frizione in opposizione al movimento delle molecole, che dipende dallecaratteristichedelsupportostessoedallaformadellamolecola,echeèespressadalcoefficientefrizionale(f).Lavelocitàdimigrazionevieneespressacome:

v=!"!

L'apparecchiatura necessaria è costituita da un alimentatore di corrente e da una camera o cellaelettroforetica. Il supporto elettroforetico agisce da setacciomolecolare1, contribuendo alla separazionedellamiscelanellesuecomponentidurantelamigrazione.Isupportichesiutilizzanopiùfrequentementesonogelottenutisciogliendoagarosio(otalvoltaamido)opolimerizzandoacrilammideinpoliacrilammideinunopportunotamponeperlacorsaelettroforetica.Questatecnicasichiamaquindigelelettroforesi.Inpassatosiutilizzavaanchecartadafiltrooacetatodicellulosa,maquestotipodielettroforesisucartaèormaiutilizzatodiradoesoloperpiccolemolecole(amminoacidiadesempio).Qualunquesiailmaterialeutilizzatoperilsupportoporoso,questodeveessereimbevutoinunasoluzionetampone,chehailduplicescopo di condurre la corrente e di consentire lo spostamento delle molecole durante la corsaelettroforetica.

1Ungel in cui la resistenzaalmovimentodi unaparticella aumentaall'aumentaredelledimensionidellaparticellastessa. Inungel con capacitàdi setacciomolecolareaumenta ladifferenzadimobilità traproteinedidiversopesomolecolare.Questaèlabaseperlaseparazione.

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Ilgeldiagarosiovieneottenutosciogliendoacaldoneltamponequantitàvariabilidiagarosio(dallo0,6al3%peso/volume).L'agarosioèunpolisaccaride linearediunitàdiagarobiosiocostituitedaD-galattosioe3,6-anidro-L-galattosio.Unavoltascioltoedopocheharaggiuntounatemperaturamoderata(circa40°C),acuil'agarosioèancoraliquido,questovieneversatoinunacameraelettroforeticaelasciatosolidificare.

Il gel di poliacrilammide viene invece ottenuto mediante polimerizzazione di unità di acrilammide inpresenza di piccole quantità (una parte su 20-30) di N,N'-metilen-bis-acrilammide, che formando legamicrociatitraipolimeridiacrilammidegeneraunreticologelatinoso.Lapolimerizzazionedell'acrilammideèuna reazione radicalica a catena, innescata dal persolfato di ammoni che tende a scindersispontaneamenteproducendoradicaliliberi.Peraccelerarelaformazionediquestiradicaliliberi,siincludenella miscela di polimerizzazione la base TEMED (N,N,N',N'-tetrametilendiammina), che catalizza ladecomposizionedelloionepersolfato:

S2O82-+1e--->SO4

2-+SO4-

Il radicale SO4- rappresenta la specie efficace (R·) nella catalisi della polimerizzazione con persolfato.

L'attaccoradicalicodiR·adunamolecoladiacrilammide(M)innescalapolimerizzazione,inquantogeneraunradicaleliberodellastessamolecoladiacrilammide,cheattaccaunasecondamolecoladiacrilammideecosìvia,formanounacatenacrescente.

La percentuale relativa di acrilammide determina la porosità e la consistenza del gel: un gel a 4-6% diacrilammideèestremamentemorbidoehaporigrandi,mentreungela10-15%èrelativamentecompattoehaporipiccoli.Anche inquestocaso l'acrilammidevieneversatanellacameraelettroforeticaquandoèancoraliquidaesilasciaquindiavvenirelapolimerizzazione.

Lacamera incuivieneallestito ilgelpereffettuare lamigrazioneelettroforeticapuòessereorizzontaleoverticale. Nelle celle orizzontali, normalmente utilizzate per l'agarosio, il gel viene fatto formare in unavaschettachedurantelacorsaelettroforeticavieneimmersaneltamponeincuisonodispostiglielettrodi.

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Camereelettroforeticheverticali,formatedaduevetriodaunvetroeunalastradialluminioseparatedaduespaziatori,vengonoinvecenormalmenteutilizzateperl'elettroforesisugeldipoliacrilammide(PAGE).LaPAGEvienetalvoltaeffettuatasugelpolimerizzatoall'internodiuntubicinodivetro.AnchenellaPAGE,unavoltasolidificato, ilgelvieneimmersoneltamponetra idueelettrodi.Inentrambi icasi,glielettrodisono costituiti da due fili di platino paralleli e connessi all'alimentatore di corrente. Inoltre è semprenecessario formare all'interno del gel delle cavità (ipozzetti) in cui inserire i campioni da sottoporre adelettroforesi.Ipozzettivengonoottenutiposizionandounabarrettadiplasticaoteflonaformadipettinenelgelnonancorasolidificato.Quandoilgelèsolidificato,ilpettinevienerimossolasciandoliberiipozzettichesisonoformati incorrispondenzadeidenti. Ipozzettipossonoavereunvolumechevariadai5ai50μL,asecondadeltipodigelelettroforetico.

5.1ElettroforesidiproteineNelcasopiùsemplicediseparazionediunamisceladiproteine,questaavvienesuPAGE(acrilammideal6-15%)inuntamponeapHvicinoallaneutralità(spessocostituitodaTris-HCleglicina)checonsentedinondenaturare leproteine.Questemigrano inbasealla caricaapparente,maanche inbasealledimensioni,chenecondizionanol'interazionefrizionaleconilsupportoporoso.

Un'importante e diffusa variante dell'elettroforesi di proteine su gel di acrilammide (PAGE) è quellacondottainpresenzadisodiododecil-solfato (SDS)sudiungeldiscontinuo,unatecnicanotacomeSDS-PAGE.L'SDS-PAGEutilizzaunsupportoformatodadueparti:

• Uno stacking gel: ha una concentrazione di acrilammide minore (4-5%), e quindi maggioreporosità,edèpreparato inuntamponeapH leggermenteacido (pH6,8), incui lamobilitàdellaglicinaèminoredellamobilitàdelleproteine;quandovieneapplicatalacorrente,quindi,gliioniCl-migrano velocemente, lasciando indietro la glicina e creando una zona a bassa conduzione chepermettealleproteinediconcentrarsi.

• Un resolvinggel:hamaggioreconcentrazionediacrilammide (10-20%)eunpHmoderatamentebasico(pH8,8).Nelresolvinggel,lamobilitàdellaglicinaaumentadimoltoequindicessal'effettostacking (accumulodelleproteine inun'unicabandamolto sottile) eprevale l'effettodi setacciodovutoallaporositàdelgel.

Diversamente dagli altri PAGE, in cui le proteine sono sottoposte a elettroforesi in condizioni native2,nell'SDS-PAGE la presenza del detergente ionico SDS causa la denaturazione delle proteine. Questevengonodenaturateperchél'SDSimpedisceleinterazionichimicheintracatena,chesonoresponsabilidellastruttura tridimensionale e dell'associazione di più subunità polipeptidiche in proteine multimeriche.Inoltreildetergenteconferiscecaricanegativaatutteleproteinedellamiscela,inmanieraessenzialmenteproporzionale alla loro massa, perché l'SDS si lega con un rapporto stechiometrico fisso di circa unamolecoladiSDSognidueamminoacidiproteina.L'SDSèpresentesianelgelsianeltamponeutilizzatopercaricarelamisceladiproteine.Iltamponedicaricamento,dettosamplebuffer,solitamentecontieneancheunforteagenteriducente,comeilDTT(ditiotreitolo)oil2-mercaptoetanolo,cherimuoveeventualipontidisolfurointra-ointer-catenaeneimpediscelariformazione.

NelSDS-PAGE, leproteine si comportanoessenzialmentecome filamenti carichinegativamente: la caricaintrinseca della singola proteina diviene trascurabile rispetto alla carica conferita dall'SDS e quindi la

2Cioèincondizionichepreservanolalorostrutturatridimensionaleelalorocarica.

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migrazione avviene in base alla lunghezza della proteina (oppure essenzialmente in base alla massamolecolare).Quindinell'SDS-PAGE,perleproprietàdisetacciomolecolaredelgel,leproteineaminorpesomolecolare si muovono più velocemente, mentre quelle a maggior peso molecolare migrano più

lentamente.

La mobilità relativa, cioè il rapporto tra la distanzapercorsa da una determinata banda proteica e quellapercorsadalfrontedelgel,diunaproteinadenaturatain un'elettroforesi SDS-PAGE è inversamenteproporzionale al logaritmo della massa molecolareespressa in kDa. Ciò consente di usare questa tecnicaperdeterminare,siapureinmanieraapprossimativa,lamassa molecolare apparente di una proteina. Infatti,sesiconfrontalamobilitàrelativadiunaproteinaXconuna retta costruita facendo correre in un'altra corsiadellostessogelunamisceladiproteinedimassanota,dettemarcatoridipesomolecolare,èpossibilerisalirealla massa apparente della proteina X con una

precisionedicirca0,5-10kDa.

L'SDS-PAGEvienequindiutilizzataper:

A. Seguireilcorsodellapurificazionediproteine.Permettedievidenziareicontaminantieilgradodipurezza;

B. Determinazionedellamassamolecolaredicatenepolipeptidiche;C. Determinarelaconcentrazionediunaproteinanellecellulegrazieadunacolorazionequantitativa

oalsuccessivoWesternBlot(valutazionecomparativa);

Il campione di proteine che viene caricato nel pozzetto, oltre alle proteine e ad un tampone che nepreserva le caratteristiche, contieneancheglicerolo, che serveper appesantire il campionee facilitare ilcaricamentoneipozzetti,eunapiccolaquantitàdiuncoloranteinerte(bludibromofenolo)conunacaricanegativa, che migra velocemente nel campo elettrico e consente di seguire l'andamento della corsaelettroforetica.Unavoltaavvenutalamigrazione, leproteinecontenutenellamiscelaeseparatesugelsisarannodisposteinbandedispostelungocorsie(olanes),ciascunacorrispondentealcampionecaricatoinunpozzetto.

Ilproblemanellamaggiorpartedeitipidielettroforesièchelapotenzageneratanelmezzoincuipassalacorrentevienedissipatasottoformadicalore,chepuòavereiseguentieffettinegativi:

• Aumento della velocità di diffusione dei campioni e degli ioni del tampone, che determina laformazionedibandemenodefinite;

• Comparsadicorrenticonvettive,cheportanoalmescolamentodeicampioniseparati;• Denaturazionediqueicampionichesonopocostabiliallealtetemperature.

Le bande di proteine sono invisibili all'osservatore, a meno che non vengano evidenziate mediantecolorazioneconreagentiingradodilegarsiallaproteina.Imetodidivisualizzazionepiùutilizzatisono:

A. Legameacolorantiorganici;

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B. Riduzionediionimetallici(colorazioneconnitratod'argento;Silverstaining);C. Fluorescenza(gelimpregnatodiunasoluzionecontenenteunamolecolafluorescente);D. Metodiradioattivi(proteinemarcateinvivocon35S,14C,3He,sefosfoproteine,con32P).

LecolorazionipiùutilizzatesonoquelleinbludiCoomassie,chelegagliamminoacidiaromatici,l'istidinael'arginina,equellaconsalid'argento (solitamentenitrato)chelegaigruppisulfidrilici (-SH),carbossilici (-COOH)ecarbonilicidellecatenelateralideiresiduiamminoacidici.

Il blu di comassie si lega in maniera aspecifica alle proteine per interazioni idrofobiche e ioniche con igruppi idrofobici e cariche delle proteine, formando dei complessi colorati di blu. La colorazione èquantitativa, inquanto il colorantesi legaalleproteine inrapportostechiometrico: l'intensitàdelcoloreche si sviluppa è quindi direttamente proporzionale alla quantità di proteina presente nella bandaelettroforetica3. La sensibilità di questo colorante è di circa 0,2-15 μg di proteina e, dal punto di vistaoperativo,siprocedenelmodoseguente:

1. Fissazione: si rendono insolubili le proteine e si rimuovono i composti che interferiscono con ilcoloranteattraversodeglialcoli(metanolooetanolo);

2. Colorazione:attraversounasoluzionedicolorante;3. Destaining: per diffusione (attraverso una soluzione di etanolo o acido acetico in acqua) o per

elettroforesi (il bludiCoomassieèanionico,per cui vieneeliminatopermigrazione inun campoelettrico).

La colorazione con l'argento è circa 50 volte più sensibile di quella con il blu di Comassie, ed è quindiutilizzatadipreferenzaperevidenziarequantitàmoltopiccolediproteine.Tuttavia, a causadiuna certalaboriositàdella tecnicacon l'argentoedellamaggiore specificitàdi riconoscimentoperalcuneproteine,spesso si preferisce usare il blu di Comassie per la semplicità, economicità, riproducibilità e relativaaspecificitàdiquestacolorazione.Dalpuntodivistaoperativo,siprocedenelmodoseguente:

1. Fissazione: si rendono insolubili le proteine e si rimuovono i composti che interferiscono con ilcolorante;

2. Sensitizzazione: aumenta la sensibilità attraverso una reazione di ossidazione con il cromato dipotassio(K2CrO4);

3. Impregnazione con argento: viene ottenuta mediante nitrato di argento o con argentoammoniacale;

3 E' possibile dare una stima quantitativa della proteina totale contenuta in una singola banda attraverso unaquantificazionedensitometrica.

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4. Sviluppo dell'immagine: per riduzione dell'Ag+ ad argento metallico ad opera di un agenteriducentequalelaformaldeide,formandobandenero-brunastre.

Lez.6-WesternblotetecnicheimmunochimicheIlblottingèstatoeseguitoper laprimavoltadaSouthernnel1975coniltrasferimentodiDNAdalgeldiagarosioallamembranadinitrocellulosa. Successivamente il blottingè statoapplicatoall'RNA (NorthernBlot)ealleproteine(WesternBlot).

Ilwestern blot è una tecnica che permette di rivelare e quantificare proteine, che reagiscono con unanticorpo specifico. In questa tecnica, le proteine -dopo essere state frazionate in SDS-PAGE- vengonotrasferite su membrana grazie ad un campo elettrico trasversale che le forza a migrare dal gel sullamembranaa cui aderiscono; sudi essa si ottieneuna replicaesattadellebandedel gel e labandadellaproteinadiinteressevieneidentificatasfruttandoilsuoriconoscimentospecificodapartediunanticorpo.Schematicamente,laproceduradaimpiegareèlaseguente:

1. La miscela proteica viene sottoposta a elettroforesi su gel di poliacrilammide. Solitamente siutilizza un classico SDS-PAGE su gel discontinuo. Finita l'elettroforesi, si taglia il gel ametà e sicoloraunadelleduemetàinbludiCoomassie.Dopoaverfattociò,siprendonolemisuredell'altrametàesitaglialamembranadiPVDFdellemedesimedimensioni.

2. Dopo lacorsa, si trasferiscono lebandeproteichedalgeladunamembranadinitrocellulosa,dinylon o di PVDF (polivinildenfloruro). Per fare questo, il gel viene messo a contatto con lamembranainunsandwichfraduestratidispugnaecartadafiltro.Ilsandwichvienepoipostoinunpiccoloapparatocheconsentelamigrazionedelleproteineperelettroforesi,maconilcampoelettricoindirizzatoortogonalmentealsandwich(elettroblotting).

Lemembranepossonoesserecostituitedaiseguentimateriali:

a. Nitrocellulosa:presentaunacapacitàdibindingdi100mg/cm2elegadebolmenteproteineconMWinferiorea14kDaattraversointerazioniidrofobichenoncovalenti;

b. Nylon:presentaunacapacitàdibindingdi450mg/cm2;sonomebranecationiche(+)chelegano poco efficientemente proteine basiche e possiedono un elevato background nelrilevamento;

c. PVDF:sonoidrofobicheepresentanounacapacitàdibindingdi120mg/cm2.

Il colorante rosso Ponceau (Ponceau S) è usato per colorarerapidamente e reversibilmente le bande proteiche sumembranedinitrocellulosaoPVDFneiWesternBlot.IlPonceauS è un colorante carico negativamente che si lega ai gruppiamminici (positivi) delle proteine. Inoltre, si lega noncovalentemente a regioni nonpolari delle proteine. La tecnicanonèsensibilecomelacolorazioneconBlueCoomassie,peròèutileper verificare se il trasferimentodal gel allamembranaè

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stato efficiente: se il gel risulta privo di bande proteiche, allora tutto ilmateriale è stato trasferito sullamembrana.

3. Atrasferimentoottenuto,lamembranavieneprelevatadalsandwicheincubataconunasoluzionediblocco(solitamenteBSA,cioèalbuminadisierobovino,olatte)persaturarelamembrana4.

4. Dopoil"blocco"dellamembrana,si incubailtuttoconunanticorpodirettocontrolaproteinadiinteresse(anticorpoprimario),acuisilegaspecificamente,inunopportunotamponedibinding.L'anticorpoprimariopuòessereindifferentementemonoclonaleopoliclonaleelasceltadipendedalladisponibilità,maanchedallaspecificitàrichiesta.

5. Mentre l'anticorponon legato viene rimosso conuna seriedi lavaggi con il tamponedibinding,l'anticorpopresentesulfiltroelegatoall'antigenevienerivelatousandounanticorposecondario,diretto contro l'anticorpo primario. L'anticorpo secondario viene scelto a seconda della specieanimalechehafornitol'anticorpoprimario5.

6. L'anticorpo secondario viene coniugato ad un opportunomarcatore (tag),cosìdaeffettuareilrilevamentodellabandaelettroforetica. infatti gli anticorpi secondari sono forniti informamodificata,coniugatecovalentementeallabiotinaoadun enzima come la fosfatasi alcalina o la perossidasi dirafano, poiché una singola molecola di enzima reagisce conpiù molecole di substrato e produce molte molecole diprodotto colorato: l'enzima amplifica il segnale. Imarcatorisonoenzimi capacidi convertireun substrato inunprodottocolorato che precipita in corrispondenza della bandaelettroforetica(reazionecolorimetrica)oppureinunprodottochemioluminescente, cioè che emette radiazione luminosarilevabilesulastraautoradiografica.

6.1TecnicheimmunochimicheUnnutritogruppodimetodibiochimicisibasasull'usodianticorpiesfruttaleproprietàdiquestemolecolediriconoscereunoopiùepitopi(specificiraggruppamentidiatomi)presentinellamolecolaantigene(Ag;

molecolachesuscitaunarispostaanticorpale).Ilgrandepregiodiquestemetodiche è che la specificità del riconoscimento molecolare fraantigene e anticorpo consente di rivelare e dosare una determinatamolecola in una miscela complessa senza purificarla dalle altricomponenti, in qualche caso anche con notevole accuratezza esensibilità.

Glianticorpi (Abo immunoglobuline) sono una classe di glicoproteinedelsiero,prodottedailinfocitiB,ilcuiruolofisiologicoèquellodilegarsiin maniera specifica agli antigeni (microrganismi infettivi, tossine oqualunque macromolecola estranea all'organismo, ossia non-self)durante la risposta immunitaria. Le immunoglobuline presentano una

4L'affinitàdellamembranaperleproteinepotrebbebloccareglianticorpi,impedendonel'azione.5Adesempio,sel'Abprimarioerastatopreparatointopo,l'AbsecondariodevericonosceregliAbditopoequindideveesserestatopreparatoinunaltroospite(adesempio,inpecora).

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strutturagenerale formatadaduecatenepesantieduecatene leggereunitedapontidisolfuro, incui sidistinguono le regioni costanti in ogni classe di Ab e quelle variabili, che mediano la specificità delriconoscimento molecolare. Le immunoglobuline sono suddivise in classi, che differiscono per il tipo dicatenepesanti.Lalorostrutturamolecolare,checonsentelalacombinazionedipiùmodulipresentinellecatene leggere e nelle catene pesanti, garantisce la possibilità di generare un altissimo numero diconfigurazioni diverse, capaci di coprire l'intero spettro antigenico virtualmente incontrabile dal sistemaimmunitario.

La produzione di anticorpi per l'impiego farmacologico o di laboratorio sfrutta il fatto che l'organismoreagisce all'incontro con un antigene estraneo stimolando un clone di linfociti B a proliferare, adifferenziarsi inplasmacellulee aprodurree secernereanticorpi specifici controquell'antigene (rispostaprimaria). Una successiva introduzione dello stesso antigene agisce su un sistema immunitario checonservalamemoriaimmunologicaequindilarispostaanticorpalesecondariaèpiùprontaepiùenergica.

L'epitopo (o determinante antigenico) è quella piccola parte di antigene che lega l'anticorpo specifico.Inoltre,lasingolamolecoladiantigenepuòcontenerediversiepitopiriconosciutidaanticorpidifferenti.Sidistinguono,inlineadimassima,dueepitopidifferenti:

• Epitopisequenziali:caratterizzatidaunaspecificasequenzalineareamminoacidica;• Epitopiconformazionali:riconosciutidalsistemaimmunitariocomecomplessitridimensionali.Gli

epitopi conformazionali possono essere costituiti da elementi anche molto distanti tra loro intermini di sequenza primaria (lineare), ma estremamente vicini a livello della struttura terziaria(tridimensionale)acausadelripiegamentochecaratterizzalemacromolecolebiologiche.+

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Perquantoriguardaglianticorpi,inlaboratorioseneposonoutilizzarediduetipologie:

• Anticorpipoliclonali:sonounamisceladianticorpi,ciascunodeiqualiprodottodaundiversoclonedi linfocitiB,chericonosconoepitopidellostessoantigene.Leprincipali immuglobulineottenibilisonoIgMedIgGevengonoprodotte,dopoaverpurificatounacertaquantitàdiantigene,tramite:

o Iniezioni endovenose multiple con dosi crescenti di antigene (con tempi brevi traun'iniezione e l'altra per evitare la distruzione dell'antigene da parte del sistemaimmunitario);

o Iniezioni sottocutanee o intramuscolari: garantisce un lento rilascio dell'antigene nelsangueassicurando,conunminornumerodi iniezionidirichiamo,unapresenzacontinuaperdiversesettimane.

Inentrambiicasi,siprelevapoiilsierodell'animaleimmunizzato,checontienel'anticorpo.

• Anticorpimonoclonali:leganoununicoepitopo,sonoprodottidaununicoclonedilinfocitiBelaloroproduzioneèunpo'piùcomplessaecostosadiquelladeipoliclonali:

1. L'antigene purificato viene iniettato in un topo e si provoca la produzione di anticorpi,comeperglianticorpipoliclonali;

2. Nonsiprelevailsiero,bensìlamilza(organolinfoide).3. Lecelluledellamilzavengonofuseconcelluledimieloma,cheessendocelluletumoraliin

condizioniopportunesipropaganovirtualmenteinmanieraindefinita.4. Lerisultanticelluleibride(detteibridomi)vengonofattecresceepoidiluitetantodapoter

isolare un certo numero di cloni cellulari, derivati da singole cellule, che vengonoselezionati per la capacità di produrre anticorpi in grado di riconoscere l'antigene. Ogniclone produce un solo tipo di anticorpo, diretto contro in singolo epitopo presentesull'antigene.

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Gli anticorpipoliclonali presentano i vantaggi: di esseremolto sensibili, riuscendoa riconoscerequantitàpiccole della sostanza ricercata; di essere poco costosi e di rilevare la presenza degli antigeni anche sealcuni determinanti antigenici hanno subito modifiche o sono stati danneggiati. Viceversa, gli anticorpipoliclonalipresentanolosvantaggiodipoterdareunriconoscimentoaspecifico.

Gli anticorpi monoclonali, invece, presentano il vantaggio dell'alta specificità, non dando risposteaspecifiche,elosvantaggiodiunapreparazionemoltolungaemoltocostosa.

Lez.7-BiopolimeriNegli ultimi decenni sono stati realizzati progressi molto importanti nella chimica dei carboidrati,soprattutto in termini di una migliore comprensione dell'attività biologica di molte di queste sostanzenaturali. Tale attività biologica può andare ben oltre il relativamente semplice ruolo svolto da numerosipolisaccaridinell'accumuloenellasuccessivamobilizzazionedienergia(adesempio,l'amidoneivegetalieilglicogenoneglianimali)oppurenelcontribuireallastabilitàedintegritàdicelluleetessutisianeivegetalisianell'uomo. Infatti,èoranotochealcunicarboidrati svolgonoun ruolo importantenel riconoscimentointercellulare. L'utilizzo delle biotecnologie convenzionali a livello industriale porta alla valorizzazione dimacromolecolepolisaccaridicheancheadaltissimovaloreaggiunto(adesempio,l'acidoialuronico)oppureamaterialipolimerici chenon trovanocontroparte in terminidi rapportoprestazioni/prezzoneipolimerisintetici.

Èutilesegnalarealtridue importantistimolicheagiscono insinergia,apromuovereunsemplicemaggiorutilizzodeicarboidrati(speciedeipolisaccaridi):

1. È necessario incrementare lo sfruttamento di fonti alternative rinnovabili (ad esempio, lebiomasse vegetali) per ottenere materiali base (monomerici o polimerici) indispensabili per lachimicamoderna;

2. È sempre più sentita l'esigenza di utilizzaremateriali biocompatibili e biodegradabili in svariatisettoriapplicativi,dall'alimetarealbiomedico.

Numerosipolisaccaridisonoingradodiformaregelacquosiconbuonecaratteristichemeccanicheancheaconcentrazioni basse, dell'ordine dell'1% in peso. Le catene polisaccaridiche interagiscono tra loro aformare un reticolo tridimensionale caratterizzato da zone di giunzione rigide, risultanti da interazionispecifichetracatene.Questigelvengonoimpiegaticomebiomaterialiperlaterapiacellulareel'ingegneriatissutale(incapsulazionedicellule,scaffold),comeriempitiviiniettabilieperapplicazionitopiche.

L'alginato appartiene ad una famiglia di copolimeri lineari di acido α-L-guluronico (G) e di acido β-D-mannuronico(M)concatenatiattraversolegamiglicosidici1-->4.Iresiduipossonoformareall'internodellacatena strutture a blocchi con regioni di soli residui G (blocchi-G) e di soli residui M (blocchi-M),interspaziatedaregioniconstrutturaalternata(blocchi-MG).

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L'alginatoècaratterizzatodaunelevatogradodibiocompatibilitàedallapossibilitàdiformaredeinetworktridimensionali(gel)attraversoillegamedicationibivalenti(Ca2+)conleunitàG.

Per queste sue caratteristiche l'alginato viene ampiamente utilizzato come materiale per lamicroincapsulazione, che consiste nell'immobilizzazione e nella protezione di cellule e biomolecoleall'internodimicro-sferedigel.

Le capsule di alginato vengono prodotte facendogocciolareunasoluzionedialginatoinunasoluzionecontenente cationi bivalenti. Si utilizza in genereCa2+ nei processi di gelificazione in ambitobiomedico,perchénontossico.Talvoltapuòesserenecessaria la riduzione delle dimensioni dellecapsule di alginato (per esempio, per la nano-incapsulazione di farmaci). Questa si ottienemicronizzando le gocce di soluzione polimerica,portandole poi a gelificazione. Una metodologiamolto utilizzata per ottenere tale effetto èl'emulsioneacqua-olio.

L'alginato, nell'industria alimentare, viene utilizzato come addensante in numerose preparazioni, qualibudiniegelati.L'alginato,inpiù,permettelaformazionedimatriciidoneeallaprotezionediprincipiattivifarmaceuticieal lororilasciocontrollato. Ipolimeridialginatosonoestremamente importantinelcampodell’ingegneriatissutale,dovevièl’esigenzadistrutture3Dporosecheconsentanolacrescitadellecelluleevenganopoi riassorbite lasciandospazioal solo tessutobiologico.PolimeribiodegradabilicomePLGAePLLA,idrogeliepolimeridioriginenaturalesonoutilizzaticomescaffoldperlagenerazionedinuovitessuti

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Lez.8-TecnichespettroscopicheLetecnichespettroscopichesonobasatesullostudiodell'interazionedienergiaemateria.Alcontrariodialtre tecniche, permettono delle indagini sulla costituzione della materia e non risultano distruttive neiconfronti del campione in esame, che può essere successivamente riutilizzato. Inoltre, spesso possonoessereimpiegateanchesucampioninonpurificati.

Quandouna radiazione elettromagnetica attraversa lamateria vi è sempre un'interazione. Lamateria è,infatti,costituitadacaricheinmovimento,cherisentonodelleperturbazionidiuncampoelettromagneticovicino.

Leonde elettromagnetichepossono propagarsi nellamateria,ma anche nel vuoto, e sono generate daqualsiasicaricachesubiscaun'accelerazione.Ogniondaècaratterizzatadaiseguentiparametri:

• Lunghezzad'onda(λ):ladistanzafraduepuntisuccessiviinfasetraloronelprofilospaziale,cioèlalunghezzadell'oscillazionedell'onda;

• Frequenza(ν):ilnumerodioscillazionialsecondo;• Periodo (T): ladistanza fraduepunti consecutivi in fase tra loronelprofilo temporaledell'onda,

cheèparialreciprocodellafrequenza(T=1/ν);• Ampiezza(A):ilmassimospostamentodiunpuntorispettoallaposizionediequilibrio;• Intensità(I):l'energiachel'ondatrasportainunsecondoattraversounasuperficiediareaunitaria

perpendicolarealladirezionedipropagazione;

La lunghezza d'onda e la frequenza sono due grandezze inversamente proporzionali: λ = c/ν, dove c =velocitàdellalucenelvuoto.

L'insiemeditutteleradiazionielettromagnetichecostituiscelospettroelettromagnetico,checopretuttol'intervallocompresofraleonderadio(λ>1m)eiraggicosmici(λ<10-13m).Aogniradiazioneèassociataunaenergiache,inbaseallaleggediPlanck,èdirettamenteproporzionaleallasuafrequenza:

E=hυ=h !ν

Interminidimeccanicaondulatoria,ognifotone (inpratica,unpacchettodienergia)possiedeun'energiachedipendedallafrequenzadell'ondaadessaassociata.

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Lo spettro elettromagnetico viene classificato sulla base delle lunghezze d'onda e delle frequenze dellevarie radiazioni elettromagnetiche che lo compongono.Queste, nonostanteabbiano tutte caratteristichemoltosimili, sviluppanodelle interazionicon lamateriamoltodiversetradi loro. Lospettrodelvisibileèuna finestra molto ristretta dello spettro elettromagnetico, la sola parte che il nostro occhio riesce apercepirecomecolore.

Letransizionielettronichechecoinvolgonoglielettronidivalenzaavvengonoinunrangediλcompresetra200e800nm(spettrofotometriaUV/visibile).Nontuttigliatomielemolecoleassorbonoquestaenergia,in quanto l'assorbimento avviene soltanto quando ΔE = hυ. Gli orbitali di valenza sono quantizzati e sitrovano normalmente allo stato fondamentale. Nel momento in cui arriva un raggio luminoso conun'energia che corrisponde alla ΔE tra lo stato fondamentale e lo stato eccitato, l'elettrone assorve la

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radiazioneepassaperqualchefrazionedisecondoallostatoeccitatoperpoiriemetterenell'ambientelaradiazionesottoformadicalore.

Unasostanzacheassorbenellafinestradelvisibileunaparticolarelunghezzad'ondariemetteunadiversalunghezzad'onda,checorrispondealcolorecomplementareconilqualenoilavediamo.

Lamisuradell'assorbimentoavvienefacendopassareattraversouncampioneunafrazionedellaradiazioneincidentediunadeterminataλ,trasmettendolapoiadunrilevatore.Sidefinisce:

Trasmittanza(T):T=𝐈𝐈0,doveI0èl'intensitàdiluceincidenteeIèl'intensitàdilucetrasmessa.

La trasmittanza ci dice quanto della radiazione luminosa viene assorbita e otteniamo la T % se lamoltiplichiamoper100.SeT=1,allorailcampioneètrasparenteenonassorbealcunaradiazione;seT=0,allorailcampioneassorbetuttalaluceincidente.

Dalmomentochelatrasmittanzanonècorrelatalinearmentealcamminoottico(spessoredellasoluzioneattraversatadalraggio),sidefinisceun'altragrandezza:

Assorbanza(A)=log!" !!

= − log!" T

L’assorbanzaèlinearmentecorrelataconilcamminootticodellaradiazione.

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La leggediLambert-Beerpermettedimettere inrelazione ivaloridiassorbanzacon leconcentrazionidiunaspeciechimica:

LeggediLambert-Beer:A=εxlxC

L'assorbanzaèproporzionalesiaallaconcentrazionedellasostanzaassorbentesiaallospessoredellostratoattraversato.Ilcoefficientediassorbimentomolare(ε)èilvalorediassorbanzadelcompostoquandol=1cm e C = 1M e dipende dalle proprietà intinseche della molecola e dalla lunghezza d'onda della luceincidente.SediunasostanzaconosciamoεemisuriamoA,allorariusciamoacalcolare laconcentrazionedelcomposto.

L'accuratezzadellamisuranonèuniformepertuttol'intervalloditrasmissioneT,inquantol'errorerelativodapartedellostrumentodimisurazionedell'assorbimentodiventaparticolarmenteelevatoquandoT%<20v>T%>100.

Moltesostanzedannounarisposta linearesolo inuncerto intervallodiconcentrazione.Se ilcampioneètorbidosihaun'assorbanzafittizia,dovutaadautoassorbimentooaduninsufficientepassaggiodellaluceattraversolasoluzione.

Tutti igruppiindicatiassorbononellaregionedell'UVeciappaionoincolori,tranneilnitratocheperòhaun ε molto basso. Le basi azotate, invece, assorbono tutte ad una λass=260 nm ed hanno una ε moltoelevata.Pertanto,sono facilmente individuabili conunostrumentocapacedi irradiaree rilevareunaλdi260nm.

NAD+eNADH(inbassoasx)presentanounsegnalediassorbimentonelvisibilesufficientementediversouno dall'altro per poter essere distinti: nel NAD+ scompare completamente il picco a 340 nm. Pertanto,dallamisuradell'assorbanza, saròcapacedicomprenderequantoNAD+eNADHsi formano inseguitoadunareazionecatalizzatadaunadeidrogenasiNAD+dipendente.

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Ilparanitrofenolo(inbassoadx)ècapacedicambiareilpropriospettroinbaseallesueproprietàchimico-fisiche: nella sua forma indissociata è trasparente, mentre nella sua forma ionizzata assume unacolorazionegialla.Ciòcipermettedi saperese insoluzione ilparanitrofenoloassume la formadissociataoppure quella indissociata, e di utilizzare il paranitrofenolo come indicatore del pH della soluzione sullabasedellacolorazionechequestaassume.

Lospettrofotometroconsistedi4elementi:

• Unasorgente,cioèunalampadacheemetteradiazioninell'intervallospettraledimisura;• Unmonocromatore,cheselezionalelunghezzed'ondapiùopportuneperlamisura;• Uncompartimentocelle(ocuvette)incuièpostoilcampione;• Unrilevatorechemisural'intensitàdellaradiazione.

Lelampadepossonoemetterenelcampospettraledell'UVoppuredelvisibile.Perlaregionedelvisibilesiutilizzano lampade a filamento di tungsteno. Per la regione dell'UV, lampade a scarica di gas (quali lelampadeadeuterio,chesonoimportantifontidiraggiUV).

Le lampadeemettono radiazioni in tutte ledirezionidello spazioequindi,perottenereun fasciodi lucesottile e ben focalizzato, è necessario un sistema ottico costituito da lenti, specchi e fenditure. Questoraggio viene poi inviato sul monocromatore, che scompone la radiazione policromatica in bandemonocromatiche.Imonocromatorisonosostanzialmentediduetipi:

• Filtri:assorbonounapartedellecomponentispettralidellaradiazioneincidenteenetrasmettonounagammapiùomenoampia;

• Elementidisperdenti (qualiprismiereticoli):diffrangono la lucepolicromaticaseparandolanellediversecomponentimonocromatiche.

Lacella (ocuvette)è lacomponentechecontiene il campionedaesaminare,generalmente insoluzione.Devono essere trasparenti alla radiazione impiegata e avere un ben preciso cammino ottico. Permisurenellospettrodell'UV,siutilizzanocelleinquarzo(SiO2),chesonoperòmoltofragiliecostose,oinplastica.Permisure nel campo del visibile, si utilizzano celle in vetro (che, invece, assorbe nell'UV) o in plastica.Recentemente, le cuvette in vetro sono state quasi completamente rimpiazzate da celle costituite damaterialipolimericitrasparenti.

Il rivelatore trasforma l'intensitàdella radiazioneelettromagneticagiuntaadesso inun segnaleelettricochepuòesseremisurato.Ilsegnalevienepoiamplificatoeconvertitoinunvalorenumerico,proporzionaleall'intensitàdelsegnale,compresotra0e100(ilvaloredelsegnaleinassenzadelcampione),dalqualesi

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ottiene la trasmittanzaedaquesto l'assorbanza.Dal rivelatoredipende sia la sensibilità sia l'accuratezzadellostrumento.

Glispettrofotometrimonoraggiosonousatiprevalentementenelleanalisiquantitative.Perogniλ,sideveripeterel'azzeramentocontroilbianco6(solvente),oppuresideveregistrareprimalospettrodelsolventeotampone(lineadibase),poilospettrodelcampioneedinfinesottrarrealsecondoilprimo.Laregistrazionedella linea di base serve a togliere le disomogeneità fra le due cuvette e a fornire il valore di zerodell'assorbanzadelsolvente(tampone).

Gli spettrofotometri a doppio raggio hanno un sistema che invia due raggi identici per frequenza eintensità,unoattraverso ilcampionee l'altroattraverso ilbianco,percuisihaunconfrontocontinuofral'assorbanzadelcampioneequelladelbianco.Inquestomodo,èpossibileeffettuaremisuredirettamenteaqualsiasiλsenzaripetereazzeramenti,esoprattuttoregistrarecontinuamentelospettrodiassorbimento.Perquestomotivoildoppioraggioèpreferitoperleapplicazioniqualitative.

Lez.9-DosaggiodiproteineDeterminarequantitativamentelaconcentrazionedelleproteinepuòessereutileperconoscernel'attivitàbiologica, i livelli di espressione e l'interazione con altre proteine. La scelta del metodo per ladeterminazionequantitativa delle proteine dipendedalla natura della proteina, dai componenti presentinelcampione,dallavelocità,dall'accuratezzaedallasensibilitàdelmetodorichiesto.Comunque,imetodichesipossonoutilizzaresonoiseguenti:

• Metodo gravimetrico: attraverso la pesata del campione solido; è un metodo poco sensibile,necessario per disporre di elevate quantità di campione allo stato solido e di elevato grado dipurezza;

• Metodi diretti: attraverso la misura dell'assorbanza; è una determinazione assoluta, ma ilcontributo di ciascun amminoacido all'assorbanza totale risulta variabile e dipende dallaconcentrazione;

• Metodiindiretti(reazionicromogene):attraversoillegamedelleproteineadopportunicromofori,inmododamisurarlemediantespettrofotometria.Sonometodi sensibili chevengono influenzatidallacomposizioneamminoacidica.Infine,lamisuraèrelativaaproteinediriferimento.

Sidefinisconocromoforiigruppicheassorbonolaluce;essisonocaratterizzati da specifiche transizioni elettroniche e quindidifferenti lunghezze d'onda di assorbimento. I principalicromofori delle proteine sono il legame peptidico e gliamminoacidiaromatici.Neilegamipeptidicisipossonoosservaredue diversi picchi di assorbimento nella regione 210-220 nm (εcirca 100M-1·cm-1) e nella regione 190-210 nm dello spettro (εcirca7000M-1·cm-1).Nellecatenelateralidegliamminoacidi,oltreatransizionicomuniaquelledellegamepeptidico,sonopresenti

6L'azzeramentovieneeffettuatoversandoilbiancoinunacuvettaeselezionandolalunghezzad'ondadimisura.Poisiversailcampionenellastessacuvettaesiprocedeallaletturadiassorbanza.L'operazionedeveessereripetutaognivoltachesicambialalunghezzad'onda.

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le transizioni elettroniche caratteristiche dei residui aromatici (triptofano, tirosina e fenilalanina) chericadononellaregionedellospettrotra260e280nm.

L'amminoacido che contribuisceprincipalmente all'assorbimentodelle proteine a 280nmè il triptofano,mentre la tirosinae la fenilalaninahannocoefficientidiestinzionenotevolmentepiùbassi. Tuttaviaessesono in generemolto più frequenti del triptofanonelle proteine e quindi il loro contributo è comunqueimportanteediventamoltoevidenteinproteinechepossiedonopochionessunresiduoditriptofano.

Ilmetododiretto,cioèlamisuradell'assorbanza,èapplicabileaproteinepurificateegarantisceilrecuperodelcampione.Questometododipendedallacomposizioneamminoacidicaedallastrutturadellaproteina,ma risentedella presenzadi contaminanti: solventi assorbononella regione spettrale attorno a 200nm,interferendoconl'assorbimentodeicromoforiproteici.Aparitàdiconcentrazione,lospettroel'intensitàdiassorbimentocambianoasecondadellacomposizioneamminoacidica.

L'assorbimentodelgruppopeptidico (190-210nm)èsensibileallastrutturasecondariadelleproteine.Lospettrodellapoli-Llisina,adesempio,puòmodificarsiper:

• L'effettodiunaumentodelpH,cheinducelaformazionedell'α-elicadaunastrutturadisordinata;

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• L'effettodiunaumentoditemperatura,checonverteilpolipeptideinβ-foglietto;

Nel caso di una soluzione di proteina pura, la concentrazione della proteina è proporzionale al suocoefficientediestinzione(c=A/εl)chedeveessereovviamentenoto.E'comunquepossibiledeterminareilcoefficiente di estizione molare ε a 280 nm di una proteina sulla base della sua composizioneamminoacidica.Unaformulasempliceè:

ε280=N°Trp·5500+N°Tyr·1490+N°Cys·125

Nelcaso laproteinavengacompletamentedenaturata(inguanidiniocloruro) laformuladautilizzareè laseguente:

ε280=N°Trp·5690+N°Tyr·1280+N°Cys·120

Allasommadelnumerodiresiduiditriptofanoetirosinavaaggiuntoancheilnumerodiresiduidicisteina,che contribuiscono debolmente all'assorbanza a 280 nm se presenti come ponti disolfuro. Se invece lasoluzioneproteicaèeterogenea,cioèsi trattadiunamisceladiproteinediverse,èpossibileutilizzareuncoefficientegenericoa280nm,espressoinunitàdiassorbanzapermg/mL,enormalmentecompresotra0,6e1asecondadell'abbondanzainresiduiaromatici.

Imetodi indiretti sfruttanopeculiariproprietà spettroscopichedimolecole (cromofori) chesi leganoalleproteine.Icromoforidevonopresentareleseguentiproprietà:

• Possederedelleproprietàspettroscopichediversequandoilcromoforoeliberorispettoaquantoècomplessatoconunaproteina;

• Tutta la proteina deve essere complessata con il cromoforo, che pertanto deve essere in largoeccessorispettoallaproteina;

• Ilcromoforonondeveavereunaselettivitàdiversaperlediverseproteine;• Bisognacostruireunacurvadicalibrazioneutilizzandounaproteinaaconcentrazionenota.

Unesempioclassicodiquestovastogruppodi tecnicheèquellodeldosaggiodelleproteine totali con ilmetododiLowry.InquestosaggiosicombinanolareazionedelbiuretoelareazionedelreagentediFolin-Ciocalteau.Leproteinevengonocolorate:

1. Facendo reagire ioni rame (Cu2+) con i legami peptidici in condizioni alcaline, provocando lariduzionedel rameaCu+e ilviraggiodabluavioletto. Insoluzionebasica,gli ioni rameformanocomplessi tetradentati congli azoti ammidicidi coppieopposte impegnate in legamipeptidici; lareazionedipendeinparteanchedalleproprietàdellecatenelateraliTrpeTyr.

2. Ossidando i residui amminoacidi aromatici (principalmente triptofano e tirosina) in presenza delreagentediFolin-Ciocalteu,chereagisceconilCu+,siriduceeformailbludimolibdeno.

Inseguitoaquestereazioni,icampioniproteiciappaionocoloratiinbluedèpossibilemisurarel'intensitàdel colore (l'assorbanza a 750 nm), che è proporzionale alla concentrazione delle proteine presenti nelcampione.Peravereunastimaquantitativa,però,ènecessariocostruireunacurvaditaratura,utilizzandocampioni di proteine a concentrazioni note. La proteina ideale da usare come standard è la formaassolutamente pura della proteina da dosare. In assenza di questa, si può usare un’altra proteina comestandard relativoquali laBSA (sieroalbuminabovina)e legamma-globuline.Sieseguequindi il saggiodiLowrysusoluzionidiBSAaconcentrazionenota,senemisural'asorbanzaa750nmelasimetteingraficoin funzione delle corrispondenti concentrazioni. Si esegue, poi, il test per i campioni a concentrazione

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ignota.Unavoltadeterminati i lorovaloridiassorbanza,dal confrontocon la rettadi taratura (ottenutatramite interpolazione grafica) si ricavano le concentrazioni delle proteine a concentrazione ignota.Tamponi quali tris e tamponi zwitterionici e altre sostanze sono incompatibili con il saggio, perchéinterferiscononellamisura.IlmetododiLowryèutilizzatoprincipalmentepermiscelediproteineedhaunrangedisensibilitàdicirca10-1000μg/mL.

Un'alternativa è quella di usare il saggio dell'acido bicinconinico (BCA). La reazione del BCA è simile aquelladelreattivodiLowry:loioneCu2+èridottoaCu+dallemolecoleproteicheinsoluzionealcalina,duemolecolediBCAchelanounoionerameosoequestoeventodeterminalaformazionediuncomplessoconun intenso colore violetto con un massimo di assorbimento a 562 nm. Il metodo BCA è praticamenteinsensibile ad interferenze da detergenti o tamponi ed è molto utilizzato, anche perché consente divalutarecorrettamentequantitàtra1e10μgdiproteinaepuòquindiessereutilizzatocomemicro-metodosupiccolequantitàdicampione.Ilrangedisensibilitàdiquestometodoèdi0,5-2000μg/mL.

UndosaggiodelleproteinedeltuttoanalogoèquellochesieffettuaconilmetodoBradford,chesibasasulla reazione delle proteine con il Coomassie Brilliant Blue G-250, un composto disulfonato deltrifenilmetano, di colore bruno-rosso. Questo colorante si lega ai residui di arginina (moltoefficientemente), triptofano, tirosina ed istidina. Questa interazione destabilizza il folding proteico,esponendo regioni idrofobiche a cui le regioni non polari del blu di Coomassie si legano medianteinterazionidiVanderWaals.Unavolta legato, il colorantenellasua formaanionicadiventabluesepuòmisurare l'assorbanzaa595nm,cheèproporzionaleallaquantitàdiproteine.Anche inquestocaso,perottenere una misura quantitativa dei campioni, è necessario costruire una curva di taratura con unaproteinastandard.Ilmetodoèmoltorapido(10minuti),dipendedallacomposizioneamminoacidicaedhaunrangedisensibilitàdi1-2000μg/mL.

L'analisi amminoacidica è un metodo utilizzato per determinare la composizione amminoacidica diproteineepeptidi.Inoltre,l'utilizzodiquestometodo,permettedideterminarel'identitàdellaproteinainbaseallacomposizioneamminoacidica,diquantificarelaproteinaediidentificareamminoacidimodificatinellaproteina.operativamenteparlando,siprocedenelseguentemodo:

1. Idrolisiinfaseliquida:laproteinavieneripresainHCl6Nall'internodiunafialaincuivienefattoilvuoto in atmosferadi azoto. La fiala vienequindimessa in stufa a110°Cperun tempovariabilecompresotra24-72ore.

2. Derivatizzazione(attraversoPITC)eseparazione(attraversoHPLC);

Laseparazionecromatografiapermettedideterminare l'identitàe la quantità relativa di ogni amminoacido presente nellaproteina. E' necessario, però, avere standard di confrontocostituitidamiscelediamminoacidiaconcentrazionenota.Talemetodoèprecisomamoltolaborioso.

Le conclusioni dei metodi di dosaggio delle proteine sono iseguenti:

• Imetodidirettieindirettisonotuttibasatisulleproprietàspettroscopiche;• Lestrategiesonodiverseasecondacheicampionisianopurioinmiscela;• Nessunmetodosoddisfapienamentelenecessitàdideterminareconprecisionelaconcentrazione

proteica;

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• Puòessereutileutilizzarepiùmetodiche.

Lez.10-TecnichespettroscopicheLa luminescenzaèunfenomenodovutoall'emissionediradiazioneelettromagnetica(visibileo invisibile).La fluoresecenza e la fosforescenza sono determinate dall'emissione di parte delle radiazioni assorbite.L'energiadellaluceassorbitadauncompostoqualsiasivienegeneralmentedissipatasottoformadicalore,mentre certe sostanze liberano parte di questa energia sotto forma di emissione di radiazione. Lachemiluminescenza, invece, viene determinata dall'energia che si libera da una reazione chimica. Neisistemibiologici,questereazionisonocatalizzatedaenzimi(bioluminescenza).

La fluorescenza è un processo fotofisico secondo il quale una molecola eccitata con radiazioni di unadeterminata frequenza emette radiazioni nel corso di una transizione ad un livello energetico minore.L'assorbimento di luce avviene a lunghezze d'onda minori (cioè a maggiore energia) rispetto a quelleemesse (aminoreenergia) e ladifferenza fraquestedue lunghezzed'ondaènota come shiftdi Stokes.L'origine di questa differenza dipende dal fatto che lamolecola eccitata elettronicamente ritorna al piùbassostatoeccitato (rilassamento)attraversounaseriedirilassamentivibrazionalie rotazionali (10-12 s)chedissipanoenergiasenzaemissionediluce(conversioneinterna).Latransizionedienergiadaunostatopiù alto ad uno più basso (10-8 s) è accompagnata da una emissione di radiazione di energia inferiore aquelladipartenza.

Nellafosforescenza ilrilassamentodellamolecolaavvienetramiteilpassaggiodell'elettroneadunostatointermedio (T) dal quale la probabilità di ricadere sull'orbitale di partenza è estremamente bassa(transizioneproibita).Glielettroninondecadonotuttinellostessoistante,mainmodocasualeduranteuntempo ben più lungo.Nella fosforescenza l'emissione ha un tempo di decadimento più lungo e persisteanche quando l'eccitazione è terminata (sec-min). Sia per i fenomeni di fluorescenza che per quelli difosforescenzavalelaleggediStokes.

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Una volta eccitata, la molecola può perdere energia sotto forma di calore, conversione interna, percollisione con altre molecole oppure attraverso transizioni intermedie che non producono fotoni conenergia sufficiente. Si definisce quindi come resa quantica (oquantumyield,φF) il rapporto tra i fotoniemessiequelliassorbiti,chepuòvariaretra0e1:

L'intensitàdifluorescenza(F)èproporzionaleallaconcentrazionedelfluoroforo,all'assorbimentodiradiazione(ε)eallaresaquantica:

Lafluorescenzaèulteriormenteinfluenzatadallapresenzadialtresostanzeinsoluzioneingradodiridurrelaluceemessadalfluoroforo,detteinibitoriosmorzatori(quencher).Mentrelemisurediassorbanzasonocorretteper intervalli di concentrazionemolto ampi, la fluorescenzaèproporzionale alla concentrazionesolo a basse concentrazioni di fluoroforo. Infatti elevate concentrazioni portano ad un eccessivoassorbimentodellaluce,dovutoallacollisioneconaltremolecole,ediconseguenzaadun'attenuazionedelsegnale di emissioni (fenomeni diauto-quenchinge di effetto filtro). Pertanto, la F è proporzionale allaconcentrazionedellamolecolasoloabasseconcentrazioni.

Glispettrofluorimetri sonodotatidimonocromatoriaprismaoreticoloesono ingradodi fornireanalisiqualitativequali lospettrodieccitazioneequellodifluorescenza.Leradiazioniprovenientidallasorgenteluminosapassanoattraversoilsistemamonocromatore(dieccitazione)earrivanoalcampione.Loschemaottico più comunemente utilizzato è quello a L o a 90°. Le radiazioni della luce di fluorescenza vengonoprelevate adunangolodi 90° ed inviate adun secondo sistemamonocromatore (di emissione) equindiquantificate da un tubo fotomoltiplicatore. Questa disposizione permette di escludere le radiazionitrasmesseononassorbitedallasoluzioneeottenereunamisuradellasolaradiazionedifluorescenza.

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Ifluorimetrisonodeglistrumenti incui laradiazione luminosavieneresamonocromaticaattraversofiltrichesonoutilizzatiesclusivamenteascopoquantitativo.

L'intensitàdella lucedifluorescenzaèunamisurarelativachedipendedavarifattori,traiqualilageometriadellostrumentoelabandapassante,eviene pertanto espressa in unità arbitrarie (u.a.). Lo spettro di emissioneviene ottenuto eccitando il campione ad una lunghezza d'onda precisa efissa(λecc)evariandolaλemda400a600nm.L'intensitàdifluorescenzaFrisultaproporzionaleallaλem.

Lafluorescenzapuòessereutilizzatainbiologianelleseguentitecnicheeperleseguentifinalità:

A. Fluorimetria/Spettrofluorimetria:a. Determinazionedellaconcentrazionedimolecoleconfluorofori(mM);b. Interazioni proteina-proteina: distanza tra due fluorofori (FRET) e polarizzazione di

fluorescenza;c. Informazionisullastruttura:accessibilitàalsolvente.

B. Microscopiaafluorescenza:a. Permettedidistinguerecelluleecomponentisubcellulari;b. Permettedilocalizzaresingoleproteine;

C. Citofluorimetria:permetteun'analisiveloceedautomaticadipopolazionicellulari insospensione,misurandonelecaratteristichefisichee/obiochimiche(volume,granulositàefluorescenza).

Lamicroscopia a fluorescenza usa la luce ultravioletta ad una lunghezza d'onda di 200-400 nm e lestrutturesonoanalizzatesullabasedellafluorescenzacheemettononellospettrovisibile.Lafluorescenzaindottadaunacolorazioneconsostanzefluorescenti,dettefluorocromi;vengonoutilizzatideglianticorpimarcatiodelleproteineinfusioneconpolipeptidifluorescenti(GFP).

Nellamicroscopia confocale la luce viene generata da un laser che viene focalizzato dall'obiettivo sulcampione,chequindiarrivainunsolopuntodelcampione.Dalmomentochesiottengonosoltantolalucedelpianofocale,siottengonodelleimmaginimoltonitideepulite.

La Green Fluorescent Protein (GFP) viene frequentemente utilizzata come reporter fluorescente perrilevarel'espressionedigenidiinteresseinorganismisiaprocarioticisiaeucariotici,inquantoèingradodiriemetterelucedicoloreverdeaccesosecolpitaedeccitatadaunaradiazioneadunaspecificalunghezza

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d'onda. Questa proteina ha una struttura tridimensionale pressochécilindrica che racchiude al centro un cromoforo formato da treamminoacidi consecutivi (serina 65, tirosina 66 e glicina 67), i qualireagisconochimicamentefraloroinpresenzadiossigenoperformareilcromoforo.Questitreamminoacidisonoessenzialiperl'emissioneelaqualitàdellafluorescenzadellaproteina,vistochesostituzionideitreresiduiamminoacidiciodiresiduiviciniadessimodificanoleproprietàdella fluorescenzadellaGFP.Vennero identificatediversevarianti, tralequaliunaincuilamutazionedellaserinainposizione65intreoninagenerava una GFP più brillante (EGFP) e un'altra in cui lamutazione

dellatirosinainposizione66inistidinageneravalaBlueFluorescentProtein(BFP).Ilfattochelamutazionedellatirosinamodificasselalunghezzad'ondadiemissionedellafluorescenzaspinseiricercatoriaprovareasostituirelatirosinaconaltriamminoacidipervederesesiottenevanoaltrevariantiutili.

Lachemiluminescenzaèunfenomenodiemissionediradiazioneluminosadovutaadunareazionechimica.Ifotonivengonoprodottidirettamentedaelettronieccitatichimicamentedimolecolechepartecipanoadunareazioneesoergonicacheriguardareazionidiossidoriduzione.

La bioluminescenza è un processo di emissione di luce visibile negli organismi viventi dovuto ad unareazionechimica(enzimatica).Lereazionidibioluminescenzaavvengonotipicamentenegliorganismidegliabissimarini.

Laluminescenzavienemisurataattraversolaluminometria.Primadiessereregistrato,ilsegnaleluminosoviene raccolto da un fotomoltiplicatore collegato ad un amplificatore di corrente. Pertanto, non c'è

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necessitàdiunfotomoltiplicatore.Tratuttequellecheutilizzanolafluorescenza,letecnichemaggiormenteselettivesono:

• IldosaggiodisubstratiediattivitàenzimatichechecoinvolgonoATPoNAD/NADH;• LetecnichediImaginginbio-echemiluminescenza;• Lamarcaturadianticorpioantigeniconmolecolechemiluminescenti;• Ibiosensoricellulariluminescenti.

Ilnumerodimolecolenaturalmente luminescentiè relativamente ristretto. Inmolti casièperòpossibilerendere luminescentimolecole non emittentimediante derivatizzazione, ovvero attraverso una reazionechimicaindicatrichechecomportaillegamedellamolecolaadunaspecieluminescente.

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Lez.10-CineticaenzimaticaGlienzimi sonomacromolecolebiologichedinaturaproteica,congruppi funzionalisuiqualihanno luogoscambio trasformazionidi sostanze,chesvolgonouna funzionedi catalizzatori (biologici),accelerando lereazionichimicheofacendoavveniredellereazionichealtrimentinonavrebberoluogo.

L'energia libera (G) è una funzione termodinamica che rappresenta una misura dell'energia utile, cioèdell'energiaingradodicompiereunlavoro.Adunareazionechimicaèsempreassociataunavariazionedienergialibera(ΔG),chepuòessere:

• ΔG < 0 : reazione esoergonica, in cui la trasformazione dei reagenti nei prodotti avvienespontaneamente;

• ΔG > 0 : reazione endoergonica, in cui la trasformazione dei reagenti nei prodotti NON avvienespontaneamente;

• ΔG=0:reazioneall'equilibrio.

Pertanto, la variazionedienergia liberamisura laspontaneitàdiuna reazione. LaΔGnon fornisceperòinformazioni sulla velocità di reazione e non significa nemmeno che la reazione avverrà ad una velocitàapprezzabile.Glienzimi,alcontrario,aumentanolavelocitàdellareazionemanonmodificanolaposizionedell'equilibrio.

La conversione Y --> X è termodinamicamente favorevole, ma la reazione non può avvenire se Y nonacquisiscesufficienteenergiapersuperarelabarrieradell'energiadiattivazione.

Glienzimisicombinanotransientementeconilsubstrato,abbassandonel'energiadiattivazione.Glienziminonspostanol'equilibriodellareazione,masoltantolavelocitàconilqualequestovieneraggiunto.Inoltre,gli enzimi non subiscono modificazioni permanenti durante la reazione e sono subito disponibili percatalizzareunnuovociclodireazioni.

L'attività di un enzima viene misurata come velocità della reazione da esso catalizzata. La velocità direazione viene misurata in termini di quantità di substrato trasformato, o di prodotto che si forma,

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nell'unitàdi tempo.Lavelocitàdelle reazionichimicheèsoggettaa leggichimico-fisichebendefinitecheconsentono di ricavare delle equazioni della velocità diverse a seconda del tipo di reazione. Questeequazionimettonoinrelazionelavelocitàdireazioneconlaconcentrazionedeireagenti. Inunareazionechimica non catalizzata, la velocità di reazione è direttamente proporzionale a [S] e il grafico velocità-concentrazioneèproporzionaleadunalinearetta.

In una reazione enzimatica, la dipendenza della velocità di reazionedalla [S] non è costantema varia alvariaredellaconcentrazionedelsubstratostesso.Ilgraficovelocità-[S]èuniperbolerettangolaredescrittadall'equazionediMichaelisMenten, incui lavelocitàve la[S]sono leduevariabili,mentreVeKmsonoduecostanti.

ESèunintermediodireazioneilcuibassovaloredienergiadi attivazione permette di fare avvenire una specificareazione catalizzata. La formazionedel complessoenzima-substrato (ES) è la prima tappa nella catalisi enzimatica(step veloce), mentre la seconda reazione è più lenta elimita quindi la velocità globale. In qualsiasi istante,l'enzima è presente nella forma libera e in quellacombinata.Quando la [S]èbassa, l'enzimasaràper lopiù

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nellaformalibera;manmanochela[S]tendeadaumentarevienefavoritalaformazionediES.

Lavelocità iniziale (V0)diunareazioneaumentaquasi linearmenteall'aumentaredellaconcentrazionedisubstrato.Lavelocitàquièdirettamenteproporzionaleallaconcentrazionedelsubstratoelareazioneèdiprimo ordine: V = k · [S]. La proporzionalità fra V e [S] diminuisce progressivamente: la velocità inizialediventa indipendente dalla [S] e la reazione è di ordine zero rispetto al substrato. La velocità inizialemassimadella reazione (Vmax) si osserva quando tutto l'enzimaè presente sotto formadi complesso ES.Questacondizioneesistesoltantoquandola[S]èelevata.L'effettosaturantedelsubstratoèresponsabiledell'appiattimentodellacurva.L'equazionechedescrivelarelazionevelocità-[S]inunareazioneenzimaticaèl'equazionediMichaelis-Menten:

Adalteconcentrazionidisubstrato,l'enzimaèsaturatoeperciò[ES]=[E],dacuiVmax=K2·[E].L'equazionepuòancheessere scritta in una formadiversa cheevidenzia la dipendenzadella velocità, oltre chedallaconcentrazionedisubstrato,dallaconcentrazionedienzima:

SeKM=[S],alloraV0=1/2Vmax.QuindiKMèequivalenteallaconcentrazionedelsubstratoincuiV0èlametadellaVmax.LaVmaxèdirettamenteproporzionalealla[E],mentreKMèindipendentedalla[E]edalla[S].

K2èlacostantechelimitalavelocità(stadiolento),percuièmoltominorerispettoaK-1(cheèlacostantedidissociazionedelcomplessoES).QuindilaKMèla[S]allaqualelametàdeisitisonosaturati.QuindiKMfornisceunamisuradella[S]richiestaaffinchélacatalisiabbialuogo.LaVmax,invece,esprimeilnumeroditurnover degli enzimi, cioè il numero di molecole di substrato convertite in prodotto da una molecolaenzimaticanell'unitàditempo,quandol'enzimaètotalmentesaturatodalsubstrato.IlnumeroditurnoverdipendedipendedaK2,cheèanchedettaKcat.Seènotalaconcentrazionetotaledisitiattivi[ET],alloraVmax=K2·[ET]equindi:k2=Vmax/[E]T.

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IlrapportoKcat/KMèunamisuradell'efficienzacatalitica.Quandola[S]èmoltopiùelevatadiKMlavelocitàdellareazionecatalizzataèugualeaVmax.

Riassumendo:

1. Ad una bassa [S] la velocità V aumenta quasi linearmente all'aumentare della [S]. All'ulterioreaumentare della [S], gli aumenti di V diventano progressivamente più piccoli. L'asintotorappresenta la velocità massima della reazione (Vmax) che non può essere superataindipendentementedall'aumentodi[S],perchéadun'alta[S]l'enzimavienesaturato.

2. Adunaelevata[S],lostadiolimitantedellareazioneèlaconversionedelcomplessoESaP+E.Diconseguenza,Vmaxrappresentaunamisuradirettadell'abilitàdell'enzimadiconvertireilsubstratoinprodotto,cioèlasuaattivitàenzimatica.

3. Laposizionedell'equilibriodipendeanchedallaforzadilegametrailsubstratoel'enzima.Piùessisono deboli, più alta è la concentrazione di substrato necessaria per avere il 50%di saturazionedell'enzima,quindipiùaltosarà il valorediKM.KMèun'espressionedell'affinitàdell'enzimaper ilsubstrato: se il suovaloreèbasso, l'affinitàdell'enzimasaràalto; se il suovaloreèalto, l'affinitàdell'enzimaperilsubstratosaràbasso.

DalgraficodiMichaelis-Mentennonèagevolecalcolarelavelocitàmassimadellareazione,perchéadalte[S] lacurvahaunandamentoasintotico.Perquestomotivosiusa l'elaborazionediLineweaver-Burk,chepermettedilinearizzarel'equazionetramiteilcalcolodeidoppireciproci.Nelgraficodeidoppireciproci(odiLineweaver-Burk),siriportagraficamentel'andamentodi1/Vinfunzionedi1/[S].Intalmodo,siottieneunarettaconintercettasull'assedelleascissenelpunto-1/KMesull'assedelleordinatenelpunto1/[Vmax],econpendenzaparialrapportoKM/Vmax.

Unenzimapuòesseremisuratointerminidiconcentrazionecomequalunquealtraproteina.Daunpuntodivistaanalitico,però, interessa lamisuradell'attivitàcatalitica (oattivitàenzimatica),chesiesprime inUnitàInternazionali(U.I.).1U.I.èlaquantitàdienzimachecatalizzalaformazionediunamacromolecoladiprodottoinunminuto.

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Ifattoricheinfluenzanolavelocitàdiunareazionesonoiseguenti:

A. Laconcentrazionedell'enzima;B. Laconcentrazionedelsubstrato;C. Nelcasodienzimiallosterici(conpiùsubunità),lapresenzadimodulatoripositivienegativi;D. Latemperatura;E. IlpH.

La velocità delle reazioni chimiche e la stabilità di unaproteina dipendono dalla temperatura. Lemolecole nonpossiedono,anchesecatalizzate,l'energiasufficientepersuperare la barriera dell'energia di attivazione. Uneccessivo aumento della temperatura, però, provoca ladenaturazione degli enzimi, con la modificazioneirreversibile del sito attivo e la drastica riduzionedell'attivitàcatalitica.

La stabilità di una proteina dipende dal pH e, perché avvengano, alcuni processi necessitano di valoriestremi di pH. Il cambiamento di pH altera il grado di ionizzazione dei gruppi ionizzabili eventualmentepresenti nella molecola di substrato e/o nell'enzima: sia la natura ionica del substrato che quelladell'enzimamodificanoilmododicombinarsidell'unoconl'altro.

Le funzioni di un enzima sono quelle di accelerare le reazioni e di controllare e regolare i processimetabolici,ancheattraversol'inibizioneenzimatica.Uninibitoreenzimaticoèunamolecolacheimpedisceall'enzimadifunzionarecorrettamente,epuòessere:

• Reversibile: agisce conmodalità che consentono all'enzima di recuperare la propria funzionalitàbiologica;

• Irreversibile: si lega covalentemente ad un residuo amminoacidico presente nel sito attivo,modificandoloinmodoirreversibile;pertantoannullal'attivitàdell'enzima.

Gli inibitori competitivi sonomolecole simili al substrato che occupano reversibilmente lo stesso sito dilegame.Lacompetizioneperconquistare il sitoattivodipendedallaconcentrazionedeiduecontendenti.Un inibitore competitivo riduce l'affinità dell'enzima per il substrato, aumentando il valore della sua KM.

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L'inibitorecompetitivosipuòrimuovereaumentandola[S].Adalteconcentrazionidisubstrato, infatti, lareazionenonvienerallentataeVmaxèsemprelastessa.

Gliinibitorinoncompetitivisonomolecolediversedalsubstratoesileganoadunsitoproprio.Gliinibitorinon competitivi agiscono diminuendo il numero di Turnover, ma non agiscono sulla proporzione dimolecole che legano il substrato. Il substrato può ancora legarsi al complesso EI oltre che all'enzima dasolo.InognicasoilcomplessoESInonprocedeversolaformazionedeiprodotti.

Nell'inibizione incompetitiva, l'inibitore si lega solo ad ES, e il complesso ESI non procede verso laformazionedelprodotto.Ilsubstratoquindinonvienepiùconvertitoinprodotto.

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Lapossibilitàdivedereunareazioneenzimaticaèlegataalfattocheisubstratieiprodottihannodiverseproprietàchimico-fisiche.Taliproprietàdevonopoteresseremisurabilieimetodidirivelazionepiùcomuniinenzimiologiasonospettrofotometricieluminometrici.

Le fosfatasi, ad esempio, catalizzano la rimozione di gruppi fosfato da diversi tipi di molecole, e ledistinguiamo fra acide e basiche a seconda del pH a cui si esplica la loro massima attività. La fosfatasialcalinaèpresenteintuttiitessutiumanieanimali,edèpurediffusatraimicroorganismi.Comeindicailnome, la massima efficienza di questo enzima si ottiene a pH basici. Si trova nei reni, nel fegato,nell'intestinoenelleossa. Ilmigliore substratoper ildosaggio sperimentaledella fosfatasialcalinaè il4-nitrofenilfosfato. Tale composto non è certamente un substrato fisiologico dell'enzima. Tuttavia, vienerapidamente idrolizzato in vitro dalla fosfatasi, dando come prodotto di idrolisi il 4-nitrofenolato, che inambiente alcalino sviluppa una colorazione nettamente gialla (che può essere così misurata medianteletturaspettrofotometricaa405nm).

UtilizzandolacurvaditaraturafattaconilPNP,cheèilprodottodellareazioneenzimatica,siestrapolanola[P]ottenutaapartiredallediverse[S]utilizzate.Conoscendo il tempodireazione,sicalcola lavelocitàdiformazionedelprodottoperogni[S]utilizzataesiriportainungraficolavelocitàinfunzionedi[S].Infine,si calcolano i reciproci di v e di [S], riportandoli su un grafico di Lineweaver-Burk. In questo modo, siricavanoivaloridiKMediVmax.