Le titolazioni complessometriche sono basate sulla formazione di un complesso

tra il titolante e il titolato.

Una reazione di complessazione può essere usata a fini analitici se:

•complessi stabili: la ki deve essere abbastanza piccola in modo che vicino al punto

equivalente si registri una notevole variazione dello ione cercato

•reazione di stechiometria certa

•raggiungere l’equilibrio rapidamente

TITOLAZIONI COMPLESSOMETRICHE

Titolazioni complessometriche

Solitamente reazioni che coinvolgono leganti monofunzionali non hanno questi

requisiti. Per tale motivo si usano i leganti polifunzionali (CHELANTI) che contengono

più gruppi complessanti in una stessa molecola (formazione di CHELATI)

Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)(LEGANTE ESADENTATO)

Ka1= 1.02x10-2

Ka2= 2.14x10-3

Ka3= 6.92x10-7

Ka4= 5.5x10-11

CHELOMETRIA: ASPETTI TEORICI: i chelanti saturano la sfera di coordinazione degli ioni metallici a cui si legano in uno stadio singolo e con

un rapporto stechiometrico ben definito, di solito 1:1

Chelante multidentato (legante esadentato) acido etilendiamino-tetra-acetico (EDTA)

N

N

HOOC

HOOCCOOH

COOH

N

O O

COO-

N

OO

-OOC

Ca

H4Y CaY2-

M2+ + Y4- MY2- K = [MY2-] / ( [M2+][Y4-] )

Metallo logKstab Metallo logKstab Metallo logKstab

Na+

Li+

Ba2+

Mg2+

Ca2+

Mn2+

1.82.97.88.710.713.8

Fe2+

Ce3+

Co2+

Al3+

Cd2+

Zn2+

14.315.916.316.416.516.6

Pb2+

Ni2+

Cu2+

Hg2+

Cr3+

Fe3+

18.118.718.821.824.025.1

Struttura delle forme protonate dell’EDTA

pH

ACIDO

BASE

Ka1= 1.02x10-2

Ka2= 2.14x10-3

Ka3= 6.92x10-7

Ka4= 5.5x10-11

HH66YY2+2+ = H = H55YY++ + H + H++ pKpK11 = 0,0 = 0,0

HH55YY++ = H = H44Y + HY + H+ + pK pK22 = 1,5 = 1,5

HH44Y = HY = H33YY-- + H + H++ pKpK33 = 2,01 = 2,01

HH33YY-- = H = H22YY2-2- + H + H++ pK = 2,75pK = 2,75

HH22YY2-2- = HY = HY3-3- + H + H++ pKpK55 = 6,24 = 6,24

HYHY3-3- = Y = Y4-4- + H + H++ pKpK66 = 10,3 = 10,3

L’ac. libero, HL’ac. libero, H44Y, ed il sale sodico diidrato, Y, ed il sale sodico diidrato,

NaNa22HH22YY..2H2H22O, possono essere usati come standard O, possono essere usati come standard

primari dopo essiccamento (a temperature primari dopo essiccamento (a temperature dell’ordine di 130-145°C e di 80°C, rispettivamentedell’ordine di 130-145°C e di 80°C, rispettivamente).).

5

Struttura complesso chelato metallo/EDTA

Complesso EDTA con ioni metallici

L’EDTA è il chelante di scelta nelle titolazioni complessometriche per i seguenti motivi:- forma chelati con tutti i cationi (eccetto metalli alcalini)- la maggior parte dei chelati è stabile (struttura a gabbia del chelato)

Mn+ + Y4- MY (n-4)+

Ag+ + Y4- AgY 3-

Al3+ + Y4- AlY -

NB: la K si riferisce all’equilibrio che coinvolge la specie Y4-

Costante stabilità EDTA-metallo (logKstab)

Mn+ + Y4- MY (n-4)+

La Kequilibrio effettiva dipende non solo dalla Kstabilità ma anche dalla temperatura e dal mezzo in cui si opera la titolazione ed in particolare dal pH () e dalla presenza di altri complessanti ()

Kstabilità

[MY (n-4)+]

[Mn+] [Y4-]=

Kstabilità

Kequilibrio =

Calcoli di equilibrio relativi all’EDTA

Influenza del pH:

Considerando le diverse specie cariche di EDTA, si definisce per ciascuna specie la frazione di EDTA presente in quella forma

Y4- =[Y4-]

[EDTA]

[EDTA]= la somma di tutte le specie di EDTA in forma libera

[Y4-] [EDTA] = Y4-

Kformazione

[MY (n-4)+]

[Mn+]=Mn+ + Y4- MY (n-4)+

[EDTA] Y4-

K’formazione

[MY (n-4)+]

[Mn+]=

[EDTA] Y4-

costante formazione Condizionale è la costante

solo al pH per il qualee’ applicabile

= Kformazione

Y4-

H4Y H3Y- + H+

H3Y- H2Y2- + H+

H2Y2- HY3- + H+

HY3- Y4- + H+

Ka1

[H+]

[H4Y]=

[H3Y-]

Ka2

[H+]

[H3Y-]=

[H2Y2-]

Ka3

[H+]

[H2Y2-]=

[HY3-]

Ka4

[H+]

[HY3-]=

[Y4-]

F = [H4Y]+ [H3Y-] + [H2Y2-] + [HY3-] + [Y4-]

F= +[H]+

Ka1 [H4Y][H4Y] +[H]+

Ka2 [H3Y-]+

[H]+

Ka3 [H2Y2-]

[H]+

Ka4 [HY3-]+

[1]

[2]

H2Y2- HY3- + H+

HY3- Y4- + H+

Ka3 =[H+]

[H2Y2-]

[HY3-]

Ka4 =[H+]

[HY3-]

[Y4-][HY3-]

[H+]

Ka4

[Y4-]=

[H2Y2-][H+]

Ka3

[HY3-]

= =[H+]2

Ka4

[Y4-]Ka3

Esprimendo in funzione di [Y4-] e [H+]

F= +[H]+

Ka1 [H4Y][H4Y] +[H]+

Ka2 [H3Y-]+

[H]+

Ka3 [H2Y2-]

[H]+

Ka4 [HY3-]+

H3Y- H2Y2- + H+ Ka2 =[H+]

[H3Y -]

[H2Y2-][H3Y-]

[H+]

Ka2

[H2Y2-]= =

[H+]3

Ka4

[Y4-]

Ka3Ka2

H4Y H3Y- + H+ Ka1 =[H+]

[H4Y]

[H3Y-][H4Y] =

[H+]

Ka1

[H3Y-]=

Ka4

[H+]4 [Y4-]

Ka3Ka1 Ka2

F= Ka4

[H+]4 [Y4-]

Ka3Ka1 Ka2

[H+]3

Ka4

[Y4-]

Ka3Ka2

[H+]2

Ka4

[Y4-]

Ka3

[H+]

Ka4

[Y4-][Y4-]+ + + +

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

F= Ka4

[H+]4 [Y4-]

Ka3Ka1 Ka2

[H+]3

Ka4

[Y4-]

Ka3Ka2

[H+]2

Ka4

[Y4-]Ka3

[H+]

Ka4

[Y4-][Y4-]+ + + +

Y4-

Y4-

F=

F= Ka4

1

Ka3Ka1 Ka2

[H+]4 [Y4-] [H+]3 [Y4-]Ka1

[H+] [Y4-] Ka1 Ka2 Ka3Ka4[Y4-]

+ +

+ +

[H+]2 [Y4-]Ka1 Ka2

Ka1 Ka2 Ka3

Ka4Ka3Ka1 Ka2

[H+]4 [H+]3Ka1 [H+] Ka1 Ka2 Ka3Ka4+ + +[H+]2Ka1 Ka2 Ka1 Ka2 Ka3

=

( )

[7]

[8]

[9]

Impiego della costante di formazione condizionale

Calcolare la concentrazione di Ca2+ libero in una soluzione di CaY2- 0.1 M a pH 10 e a pH 6

Ca2+ + EDTA CaY2- Kf= 4.9x1010

Y4-

Determinando come descritto si calcolano le costanti di formazione condizionale

A pH = 10 K’f= (0.36)(4.9 x 1010) = 1.8 x1010

A pH = 6 K’f= (2.3X10-5)(4.9 x 1010) = 1.1 x106

Ca2+ + EDTA CaY2-

Concentrazioni all’equilibrio x x 0.1 - x

[CaY2-]

[Ca2+] [EDTA]=

0.1 - x

x2

a pH = 10 K’f= 1.8 x1010

a pH = 6 K’f= 1.1 x106

Calcolando il valore di x (=[Ca2+]), si trova [Ca2+]= 2.4x10-6 M (pH=10) e 3.0x10-4 M a pH 6

La reazione di formazione del complesso è la seguente:

Il complesso metallo-EDTA diventa meno stabile al diminuire del valore del pH

Al diminuire del pH la K di equilibrio si riduce e la reazione di fatto giunge meno a

“completamento”

L'effettiva disponibilità dei doppietti elettronici necessari per i legami di coordinazione dipende dal grado di dissociazione dei gruppi acidi e quindi dal pH.

La frazione 4 tende a 1 per valori alti di pH.

Purtroppo non è possibile effettuare le titolazioni con EDTA a pH molto basici, in quanto si deve evitare la precipitazione degli ioni metallici come idrossidi.

In una soluzione 0,1 M di Mg2+ la precipitazione dell'idrossido inizia a pH circa uguale a 9 (valore ottenuto considerando il relativo prodotto di solubilità), ma in una soluzione 0,1 M di Fe3+ la precipitazione avviene già a pH = 1,3.

Il fatto che spesso non si possa operare a pH sufficientemente basici fa prevedere che la reazione di complessazione sia meno completa del previsto (anche se comunque molto spostata verso destra!).

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Equilibri durante la reazione di complessazione M2+ + Y4- MY2- K = [MY2-] / ( [M2+][Y4-] )

minimo valore per titolare

effetto del pH Y4- + nH+ HnYn-4

formazione di altri complessi

M2+ + mZ MZm2+

formazione di altri chelati

MY2- HMY- , MYOH-, MYNH32-

Es: per titolare il Mg2+ si puo’ operare a pH 10 ma non a pH 5

Spesso le titolazioni Me-EDTA vengono effettuate in presenza di agenti complessanti ausiliari che agendo come tamponi ad un determinato pH, impediscono la precipitazione dell’idrossi o dell’ossido del metallo. Questi reagenti mantengono gli ioni metallici in soluzione senza interferire con l’equilibrio Me-EDTA

Agenti complessanti ausiliari

Un agente complessante ausiliario permette la titolazione di molti metalli con EDTA

anche in soluzioni alcaline

Un agente complessante ausiliario lega il metallo in modo sufficientemente forte da

prevenire la precipitazione dell’idrossido, ma anche in modo sufficientemente debole da

rilasciare il metallo quando viene aggiunto EDTA (es. titolazione di Zn2+ in tampone

ammoniacale).

Determinazione del punto finale in chelometria

La determinazione del punto finale viene di solito rivelata con indicatori metallo-cromici

(formano chelati colorati già alla conc. pari a 10-7M) o mediante metodi strumentali sensibili

alla conc. del metallo libero.

L’indicatore deve soddisfare i seguenti requisiti:

- deve dare una reazione cromatica netta e sensibile

- deve dare un complesso abbastanza stabile con il metallo ma meno stabile di

quello EDTA-metallo

- deve dare una reazione rapida con il metallo

M-In + EDTA EDTA-M + In

M + In M-In

Colore A Colore B

L’indicatore ottimale soddisfa i seguenti requisiti:

Kstabilità M-In= [M-In]

[M][In] 105

e

Kstab EDTA-M

Kstab M-Ind= 104

CURVA DI TITOLAZIONE

PRIMA DEL PE: si osserva il colore del complesso metallo-indicatoreDOPO IL PE: l’EDTA sposta l’indicatore provocando un cambiamento di coloreSono indicatori acido-base e cambiano colore con la perdita di H+. Ognuno ha un proprio pH di lavoro

Curve di titolazione di 30 mL di una soluzione 0,005 M di ioni calcio e di 50 mL di una soluzione 0,005 M di ioni magnesio con EDTA 0,01 M in presenza di NET a pH 10.

Il salto di pM al p.e. è tanto maggiore quanto maggiore è la costante condizionale.

Ovviamente esistono molti altri indicatori metallocromici.

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YMY4

'MY C]M[

]MY[KK

Indicatori metallocromici:coloranti organici

•reazione cromatica deve essere sensibile e rapida e selettiva

•Kindicatore-catione KEDTA-catione = il complesso tra analita e indicatore deve essere meno stabile di quello

formato tra analita e titolante

•Il contrasto di colore tra indicatore libero ed quello complessato con il metallo deve essere facilmente rilevabile

•Il complesso indicatore-metallo si deve formare in prossimità del punto equivalente cioè quando la concentrazione di ioni metallici è molto piccola

•La reazione tra metallo ed indicatore deve essere rapida e reversibile e deve verificarsi al pH in cui si opera la titolazione

Nelle titolazioni complessometriche l'individuazione del punto di arresto può essere effettuata mediante uso dei cosiddetti indicatori metallocromici. Questi, come l'EDTA, sono acidi poliprotici in grado di formare chelati con l'analita in esame, e sono caratterizzati dal fatto che, in opportune condizioni di pH, l'indicatore libero e quello legato al metallo hanno diversa colorazione.

L'indicatore metallocromico più noto, il nero eriocromo T (NET o EBT, dall'inglese Erio-Black T) e' un acido triprotico, H3In (pK1 = 3,9, pK2 = 6,4 e pK3 = 11,5).

Nell'intervallo di pH utile ai fini delle titolazioni con EDTA (5 < pH < 13) esistono le specie H2In-, HIn2- e In3-, di colore rosso, blu e arancione, rispettivamente.

Es: complesso Mg2+-NET è rosso a pH<10 la formazione del complesso non è completa

A pH tamponato 10 ho viraggio da rosso a blu

Si evita di superare pH 11 altrimenti il viraggio è da rosso ad arancione e si vede poco.

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NERO ERIOCROMO T = NETNERO ERIOCROMO T = NET

Rosso < pH 6 - Blu - pH 12 > Arancio

N

HO

O2N

-O3S N

OH

Nero mordente C20H12N3NaO7S. (Mr 461,4).1056800. [1787-61-7].

Schultz No. 241. Colour Index No. 14645.

Sodio 2-idrossi-1-[(1-idrossi-2-naftil)azo]-6-nitronaftalen-4-solfonato.

Nero eriocromo T.

Polvere nero-brunastra, solubile in acqua e in alcool.

Viraggio : libero BLU complesso VIOLETTO

pH ottimale di lavoro è 10, si operaIn tampone ammoniacale

Indicatori per titolazioni con EDTA

Nero Eriocromo T(nero mordente)

Acido solfonico

S

N+

N

N

O-

O

O

O-

O

OH

OHNa

+

H2O + H2In- HIn2- + H3O+

rosso blu

H2O + HIn2- In3- + H3O+

blu arancione

K1= 5x10-7

K2= 2.8x10-12

S

N+

N

N

O-

O

O

O-

O

O

ONa

+

M

Il Nero ET è anche un indicatore acido-base. I complessi metallici del Nero ET sono rossi e per tale motivo si tampone il pH a 7 (o maggiore) per avere la forma HIn2- (blu). L’aggiunta del metallo comporta la formazione del complesso MIn2- (rosso).Al primo eccesso di EDTA la soluzione diventa blu in conseguenza della reazione (M= metallo bivalente):

HIn2- (blu)

M

(rosso)

MIn- + HY3- HIn2- + MY2-

Il nero ET si usa per il magnesio, zinco, cadmio e piombo e non per il calcio in quanto la Kstabilità Ca2+-Ind è troppo bassa

Il nero mordente viene usato in dispersione aq. o in soluzione etanolica (0.4% m/v)

H

CALCONECALCONE

OH

NN-O3S

OH

Acido calconcarbossilico. C21H14N2O7S.3H2O. (Mr 492,5).1015300. [3737-95-9]. Acido 2-idrossi-1-(2-idrossi-4-solfo-1-naftilazo)naftalen-3-carbossilico.

Polvere nero-brunastra, poco solubile in acqua, moltopoco solubile in acetone e in alcool, moderatamentesolubile nelle soluzioni di sodio idrossido.

Viraggio : libero BLU complesso VIOLETTO

Ditizone. C13H12N4S. (Mr 256,3). 1033900. [60-10-6].1,5-Difeniltiocarbazone.Polvere nero bluastra, nero brunastra o nera, praticamente insolubile in acqua, solubile in alcool.Viraggio : libero BLU VERDASTRO complesso VIOLETTO ROSSASTRO

DITIZONEDITIZONE

N

N

N

N

N

OH

OH

O

OH

OH OH

Muresside

Ca2+

pH= 12N

N

N

N

N

OH

OH

O

OH

OH OH

Ca2+

violetto rosso

N N

OH

OH

-O3S

CalconDeterminazione del Ca2+ in EP

Titolazioni chelometriche: classificazione

A) Titolazione direttaIl metodo consiste nell’aggiunta di un indicatore metallico ad una soluzione tampone. A tale soluzione si aggiunge la soluzione di chelante fino al viraggio (si possono aggiungere agenti ausiliari). Il metodo non può essere utilizzato nei seguenti casi:- non si abbia a disposizione l’indicatore adatto- si abbia difficoltà a mantenere lo ione in soluzione a causa del pH- la velocità di formazione del precipitato è troppo lenta

B) Metodo inversoSi aggiunge un eccesso di EDTA che viene retrotitolato con ZnCl2 o ZnSO4. Il metodo viene utilizzato quando la reazione è lenta. Unica condizione da osservare è che la stabilità EDTA-metallo > EDTA-Zn. L’errore di una titolazione inversa è > della diretta

C) Metodo per spostamentoSi usa quando la titolazione non può essere effettuata perché non c’è un indicatore adatto. Si aggiunge alla soluzione un sale di EDTA che contiene un metallo che forma un complesso meno stabile di quello del metallo da determinare, solitamente sali di Mg2+ o Zn2+. L’eccesso di Mg2+ o Zn2+ equivalente allo ione da determinare viene titolato con EDTA

Ba2+ + MgY2- BaY2- + Mg2+

TITOLAZIONI CHELOMETRICHE Titolazione Diretta

Titolo con EDTA standard a pH tamponato

soluz.Me2+ (fino a viraggio)

Retro-titolazione: se analita forma complesso con indicatore più stabile rispetto a quello con EDTA

EDTA (eccesso) titolo eccesso di EDTA con

soluz. Zn2+ standard

Me2+ + EDTA (fino a viraggio)

Titolazione per spostamentoSe analita precipita nelle condizioni di reazione EDTA

Mg-EDTA(in eccesso) + soluz.Me2+ soluz. Mg2+ (fino viraggio)

Liberato quantitativ.

Mg-EDTA deve avere una costante di stabilità inferiore

MascheramentoLe reazioni chelometriche non sono specifiche. Il “mascheramento” elimina eventuali

sostanze interferenti per azione di un complessante che forma con lo ione interferente un

complesso stabile e insolubile in acqua. Ad esempio Ni2+, Co2+, Cu2+, Zn2+, Cd2+ possono

venire mascherati per aggiunta di ioni CN-, Al3+ e Fe3+. Altri esempi sono lo ione OH- come

mascherante di Al3+ (ad esempio per miscela di Al3+ e Ca2+)

Preparazione e standardizzazione di EDTA 0.1 MIl sale bisodico dell’EDTA biidrato non può essere impiegato come sostanza madre, in

quanto può contenere impurezze e umidità. Si prepara la soluzione approssimata e si

standardizza usando una opportuna soluzione madre (CaCO3, ZnO, HgO). Il CaCO3 è la

sostanza madre più utilizzata anche se contiene tracce di umidità facilmente eliminabili per

riscaldamento in stufa.

2.5.11. COMPLEXOMETRIC TITRATIONSALUMINIUMIntroduce 20.0 ml of the prescribed solution into a 500 ml conical flask, add 25.0 ml of 0.1 M sodium edetate and 10 ml of a mixture of equal volumes of a 155 g/l solution of ammonium acetate R and dilute acetic acid R. Boil for 2 min, then cool. Add 50 ml of ethanol R and 3 ml of a freshly prepared 0.25 g/l solution of dithizone R in ethanol R. Titrate the excess of sodium edetate with 0.1 M zinc sulphate until the colour changes from greenish-blue to reddish-violet.1 ml of 0.1 M sodium edetate is equivalent to 2.698 mg of Al.

Per l’alluminio si preferisce utilizzare un metodo inverso perché anche se il complesso Al-EDTA è abbastanza stabile (logKstab= 16.4) si forma lentamente e bisogna scaldare per completarne la formazione

BISMUTHIntroduce the prescribed solution into a 500 ml conical flask. Dilute to 250 ml with water R and then, unless otherwise prescribed, add dropwise, with shaking, concentrated ammonia R until the mixture becomes cloudy. Add 0.5 ml of nitric acid R. Heat to about 70 °C until the cloudiness disappears completely. Add about 50 mg of xylenol orange triturate R and titrate with 0.1 M sodium edetate until the colour changes from pinkish-violet to yellow.1 ml of 0.1 M sodium edetate is equivalent to 20.90 mg of Bi.

Da EP 5.07

CALCIUMIntroduce the prescribed solution into a 500 ml conical flask, and dilute to 300 ml with water R. Add 6.0 ml of strong sodium hydroxide solution R and about 15 mg of calconecarboxylic acid triturate R. Titrate with 0.1 M sodium edetate until the colour changes from violet to full blue.1 ml of 0.1 M sodium edetate is equivalent to 4.008 mg of Ca.MAGNESIUMMagnesiumIntroduce the prescribed solution into a 500 ml conical flask and dilute to 300 ml with water R. Add 10 ml of ammonium chloride buffer solution pH 10.0 R and about 50 mg of mordant black 11 triturate R. Heat to about 40 °C then titrate at this temperature with 0.1 M sodium edetate until the colour changes from violet to full blue.1 ml of 0.1 M sodium edetate is equivalent to 2.431 mg of Mg.

LEADIntroduce the prescribed solution into a 500 ml conical flask and dilute to 200 ml with water R. Add about 50 mg of xylenol orange triturate R and hexamethylenetetramine R until the solution becomes violet-pink. Titrate with 0.1 M sodium edetate until the violet-pink colour changes to yellow.1 ml of 0.1 M sodium edetate is equivalent to 20.72 mg of Pb.

ZINCIntroduce the prescribed solution into a 500 ml conical flask and dilute to 200 ml with water R. Add about 50 mg of xylenol orange triturate R and hexamethylenetetramine R until the solution becomes violet-pink. Add 2 g of hexamethylenetetramine R in excess. Titrate with 0.1 M sodium edetate until the violet-pink colour changes to yellow.1 ml of 0.1 M sodium edetate is equivalent to 6.54 mg of Zn.

MAGNESIUM CHLORIDE 4.5-HYDRATEMagnesii chloridum 4.5-hydricum

MgCl2,xH2O with x 4. 5≃Mr 95.21 (anhydrous substance)

DEFINITIONMagnesium chloride 4.5 - hydrate contains not less than 98.5 per cent and not more

than the equivalent of 101.0 per cent of MgCl2, calculated with reference to the anhydrous substance.

ASSAYDissolve 0.250 g in 50 ml of water R. Carry out the complexometric titration of

magnesium (2.5.11).1 ml of 0.1 M sodium edetate is equivalent to 9.521 mg of MgCl2.

…………….

McDonald's USA Ingredient List Hot Mustard Sauce:

Water, high fructose corn syrup, distilled vinegar, soybean oil, mustard seed, sugar, mustard flour, salt, egg yolks, spices, modified corn starch, xanthan gum, turmeric, sodium benzoate or potassium sorbate (preservatives), annatto extract, caramel color, extractive of capsicum, paprika, calcium disodium EDTA to protect flavor.

Mayonnaise:Soybean oil, whole eggs, egg yolks, vinegar, water, salt, sugar, mustard flour, lemon juice concentrate, calcium disodium EDTA to protect flavor.

Big Mac Sauce:

Soybean oil, pickles, distilled vinegar, water, sugar, egg yolks, high fructose corn syrup, corn syrup, mustard flour, salt, xanthan gum, potassium sorbate as a preservative, natural flavor (vegetable source), spice and spice extractives, garlic*, hydrolyzed soy, corn and wheat protein, extractive of onion and paprika, calcium disodium EDTA to protect flavor.

*dehydrated

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Analisi dei Farmaci I (Prof. S. Villa) - Esercitazione n. 6DETERMINAZIONE COMPLESSOMETRICA DEL Mg++ CON EDTA(Esprimere il risultato in mg di Mg2+ contenuto in 100 ml)

La soluzione in esame contenente Mg++ viene portata a 100 ml esatti. Si prelevano con una pipetta campioni da 20 ml. A ciascun campione si aggiungono 30 ml di H2O, 10 ml di soluzione tampone a pH 10 ed una punta di spatola di nero eriocromo T (NET).Si titola con una soluzione 0,01 M di EDTA fino a viraggio da rosso a blu.mg Mg++ = ml EDTA 0,01 24,32 5