LE FASI DELLA RICERCA -...

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LE FASI DELLA RICERCA

4 Estensione della biotecnologia a varie materie prime (De Angelis e Di Cagno, 2010); 24

ore

Prolungamento del processo di fermentazione in condizioni semi-liquide (Di Cagno et al., 2002; Di Cagno et al., 2004);

In collaborazione con il Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta e degli Alimenti Università di Bari, Italia

• Di Cagno et al., 2002. Proteolysis by sourdough lactic acid bacteria: effects on wheat flour protein fractions and gliadin peptides involved in

human cereal intolerance. Applied and Environmental Microbiology, 68:623–633.

• Di Cagno et al., 2004. Sourdough bread made from wheat and nontoxic flours and started with selected lactobacilli is tolerated in celiac

sprue patients. Applied and Environmental Microbiology, 70:1088–1096.

• Di Cagno et al., 2005. Pasta made from durum wheat semolina fermented with selected lactobacilli as a tool for a potential decrease of the

gluten intolerance. Journal of Agricultural and Food Chemistry: 53 (11):4393–4402.

• De Angelis et al., 2006a. VSL#3 probiotic preparation has the capacity to hydrolyze gliadin polypeptides responsible for celiac sprue.

Biochimica et Biophysica Acta, 1762:80–93.

• De Angelis et al., 2006b. Fermentation by selected sourdough lactic acid bacteria to decrease the intolerance to rye and barley flours.

Journal of Cereal Science, 43:301–314.

• Gobbetti et al., 2007. Sourdough lactobacilli and celiac disease. Food Microbiology, 24(2):187-196.

• Rizzello et al., 2007. Highly efficient gluten degradation by lactobacilli and fungal proteases during food processing: new

perspectives for celiac disease. Applied and Environmental Microbiology, 73(14):4499-4507.

• Di Cagno et al., 2009. Different fecal microbiotas and volatile organic compounds in treated and untreated children with celiac disease.

Applied and Environmental Microbiology, 75(12):3963–3971.

• De Angelis et al., 2010. Mechanism of degradation of immunogenic gluten epitopes from Triticum turgidum L. var. durum by sourdough

lactobacilli and fungal proteases. Applied and Environmental Microbiology, 76(2):508–518.

• Di Cagno et al., 2010. Gluten-free sourdough wheat baked goods appear safe for young celiac patients: a pilot study. Journal of Pediatric

Gastroenterology & Nutrition, 51(6):777–783.

• Greco et al., 2011. Safety for patients with celiac disease of baked goods made of wheat flour hydrolyzed during food processing. Clinical

Gastroenterology and Hepatology, 9(1):24-29.

• Di Cagno et al., 2011. Duodenal and faecal microbiota of celiac children: molecular, phenotype and metabolome characterization. BMC

Microbiology, 11,

• Rizzello CG et al., 2014. Use of fungal proteases and selected sourdough lactic acid bacteria for making wheat bread with an intermediate

content of gluten. Food Microbiology, 37;59-68.

• Curiel JA et al., 2014. Manufacture and characterization of pasta made with wheat flour rendered gluten-free using fungal proteases and

selected sourdough lactic acid bacteria. Journal of Cereal Science, 59;79-87.


Lb. brevis 14GLb. alimentarius 15M Lb. hilgardii 51BLb. sanfranciscensis 7A

Lb. sanfranciscensis E14Lb. sanfranciscensis E21 Lb. sanfranciscensis 174 Lb. sanfranciscensis 13Lb. sanfranciscensis A1 Lb. sanfranciscensis 274

+

+Proteasi fungine (200 ppm)

Pool 1

Pool 2

ϖ -gliadins

α, β, ϖ -gliadins

hydrolizedgliadins

St 1 2

St, European gliadin standard;1, chemically acidified dough (CAD);2, fermented dough (20% wheat flour)with pool 1, 2 and proteases (SLP)

(SLP)(CAD)

Water salt soluble

GluteninsGlutenins

Gliadins

Alb.-Glob.

(ca. log 9/ml)

(ca. log 8/ml)

R5-ELISASLP < 10 ppm


pH 11pH 6 pH 11pH 6

(A) (B)

MrkDa

200 200

10 10

St, Standard Europeo della gliadina1, CAD2, Lattobacilli selezionati e proteasi

(St)

(1)

(2)

18000 60000

100 3177035204

3863519307 41796 5480748858

ωα, β, γ

18000 60000

100

ωα β,γ

31454

38979

19741

3517433267

18000 60000ωα β,γ

(2)

100 6098

699472887718

5000

18000 60000

100 3177035204

3863519307 41796 5480748858

ωα, β, γ

Tipico profilo della gliadina

% In

tens

ità

18000 60000

100

ωα β,γ

31454

38979

19741

3517433267

Massa (m/z)18000 60000ωα β,γ

100 6098

699472887718

5000

(2)


Glut

ine

resid

uo (p

pm)

Tempo (anni)

CURVA TEMPORALE DEL PROGETTO DI RICERCA

Brevetto Giuliani RM2008A000690

-Lactobacillus sanfranciscensis DPPMA12 (depositato presso il DSMZ in data 28 Novembre 2008 con N. DSM22063);

-Lactobacillus plantarum DPPMA125 (depositato presso il DSMZ in data 28 Novembre 2008 con N. DSM22064).


Proteolisi durante la lievitazione naturale

Proteolisi primaria

gliadine

LMW glutenine

y-HMW glutenine

x-HMW glutenine

Prodotti di degradazione

peptide

Proteolisi secondaria

-

alkaline

acid

Amminoacidi

H+

+

DtpT

Opp

PepN

PepO

PepP

PepQ

PepX

Ψredox - pH

Enzimi endogeni

Enzimi esogeni


Target Agente terapeutico

Peptidi del glutine Prolyl endopeptidasi (PEP)

Zonulina Antagonista del recettore della zonulina (AT-1001)

Interleuchina 15 Anticorpo anti-interleuchina-15

Transglutamminasi tissutale Inibitore della transglutamminasi tissutale

HLA-DQ2/DQ8 DQ2/DQ8

Cellule dendritiche Vaccino

Interferon-γ Anticorpo anti-Interferon-γ (fontolizumab)

Cellule T Anticorpo Anti CD3 (visilizumab)Anticorpo anti-CD24 (cM-T412)Anticorpo anti-CD25 (daclizumab)

Cellule T (Tr) Interleuchina-10 umana ricombinante (Tenovil)

Molecole di adesione Anticorpo anti-integrina α4 (natalizumab)anti-integrina α4/β7 (MLN-02)Antagonista α4 (T-0047)

APPROCCI TERAPEUTICI FUTURI PER LA PATOLOGIA CELIACA

Peptidi del glutine Lattobacilli del lievito naturale


TEST IN VITRO

GlutineImpasto di farina di frumento acidificato chimicamente (lievito di birra)-CONTROLLO

24 ore

Impasto di farina di frumento fermentato con batteri lattici

Glutine

Digestione enzimatica in

vitro

«PT-DIGEST»

Test in vitro su diversi modelli

cellulari

Prolammine idrolizzate

Prolammine non idrolizzate


TEST IN VITROIn cellule IEC-6 (cellule epiteliali intestinali di ratto) esposte a prolammine non idrolizzate estratte da un impasto acidificato chimicamente (controllo), le prolammine idrolizzate dal pool di batteri lattici e dalle proteasi fungine, inducono una riorganizzazione meno pronunciata dell’ F-actina intracellulare (De Angelis et al.,

2006a).

RIORGANIZZAZIONE F-ACTINA

RILASCIO DI ZONULINA

In cellule epiteliali intestinali Balb/c si assiste aduna riduzione del rilascio di zonulina da parte delle cellule trattate con gliadine pre-digerite nell’impasto fermentato con i batteri lattici selezionati (De Angelis et al., 2006a);

PERMEABILITA’ INTESTINALE

In cellule epiteliali intestinali Balb/c si assiste all’attenuazione della permeabilità intestinale da parte delle cellule trattate con gliadine pre-digerite nell’impasto fermentato con i batteri lattici selezionati (De Angelis et al., 2006a);

VITALITA’ CELLULARE

Aumento della vitalità cellulare in cellule epiteliali intestinali Caco-2 trattate con gliadine idrolizzate nell’impasto fermentato con i batteri lattici selezionati (De Angelis et al., 2006b).

ATTIVITA’ DELLA CASPASI 3

Evidente riduzione dell’attività della Caspasi 3 in cellule epiteliali intestinali Caco-2esposte a prolammine idrolizzate dal pool di batteri lattici e dalle proteasi fungine (LAB PT rye) rispetto alle prolammine non idrolizzate estratte da un impasto acidificato chimicamente (PT rye) (De Angelis et al., 2006b).

ESPRESSIONE PROTEINA FAS

Riduzione dell’espressione della proteina FAS (il cui aumento è responsabile dell’atrofia dei villi) in biopsie di pazienti celiaci esposte a prolammine idrolizzate dal pool di batteri lattici e dalle proteasi fungine (B) rispetto alle prolammine non idrolizzate estratte da un impasto acidificato chimicamente (A) (De Angelis et al.,

2006b).

INFILTRAZIONE LINFOCITI CD3+

Rispetto al trattamento con prolammine non idrolizzate estratte da un impasto acidificato chimicamente (A), biopsie digiunali di pazienti celiaci esposte a prolammine idrolizzate dal pool di batteri lattici e dalle proteasi fungine (B) non hanno indotto un aumento delle infiltrazioni dei linfociti intraepiteliali CD3 + (De Angelis et

al., 2006a).


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