UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DELL’AQUILA

DIPARTIMENTO DI MEDICINA CLINICA, SANITÀ PUBBLICA,

SCIENZE DELLA VITA E DELL’AMBIENTE

in collaborazione con

LaboratoriodiBiologiaMolecolare

IdentificailgenereelaspeciemediantePCReDNA

barcode

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DNABarcoding IlcodiceabarredelDNA(DNABarcoding)e'unasequenzadiDNAcheidentificainmodounivocoogni specie vivente, proprio come il codice a barre di un prodotto identifica ogni oggetto invendita in un negozio. Gli studenti utilizzeranno il codice a barre del DNA per esplorare labiodiversita'incampovegetale(Fig.1).

Fig1.Dalcampionamentodelmaterialebiologico,grazieall’estrazionedelDNAeallaPCR,alsequenziamentodelgenespecie---specifico.

L'idea di proporre questa attività e' nata dalla consapevolezza che affrontare in laboratorioargomentidifficili,qualiilsequeziamentodelDNA,ilbarcodegeneticoetc.,siapiùfacileeintuitivoe inoltre questi temi sono molto adatti per approfondimenti interdisciplinari utilizzando labioinformaticaeletecnologiemultimedialipiu'innovative.

Cornicescientifica La Tassonomia e' la Scienza che individua e organizza le specie in gruppi sulla base dicaratteristichecomuni.Finoapocotempofa,tutteleclassificazionitassonomichesiavvalevanodiespetiticapacidivalutaresoggettivamentelepochee,avoltesottili,differenzetraduespecie.Lasituazione e' radicalmente cambiata con l'avventodel codice a barre delDNA, chepermette dieffettuareunaidentificazioneoggettivadiunaspecie,basandosisullasequenzadiopportunigeni"marcatori" (Fig. 2). I geni marcatori utilizzati per la definizione del codice a barre di animali,piante e funghi hanno sequenze sufficientemente diverse tra specie e specie inmodo che ognisequenzaidentificatapossaessereunivocamenteaAribuitaadunaunicaspeciediorigine. IlcodiceabarredelDNA(DNAbarcoding)e'rapidamentediventatounostrumentoessenzialepergli studi tassonomici, ma trova applicazioni anche in altri campi, come nel monitoraggioambientale,nell'analisidellabiodiversita'diunecosistemaetc. TutticolorocheutilizzanoquestametodologiainvianoirisultatidellorolavoroalConsorzioperilCodice a Barre della Vita (CBOL, Consortium for the Barcoding Of Life), un movimentointernazionale che associa musei di storia naturale, erbari, giardini zoologici, istituti di ricerca,agenzie governativee intergovernative, associazioninongovernative, compagnieprivatee altreorganizzazioni coinvolte nella ricerca tassonomica e nei temi della biodiversita'. Questomovimentocoinvolgepiu'di200organizzazioniinpiu'di50paesinei6continenti.

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IdatiraccoltidalCBOLapartiredal2003,oltreunmilioneemezzodi"record"checopronopiu'di150.000specie(datirelativial31.3.2012),rappresentanosolounapiccolapartedellabiodiversita'totaledellaterra,mailloronumerostacrescendoinmodosignificativodiannoinanno.Labancadati del CBOL e' accessibile dal sito www.barcodinglife.org che fornisce anche strumentiinformaticimoltosofisticatiperidentificarelaspecieacuiappartieneunadatasequenzadiDNA.

Nella banca dati, per ogni specie sono catalogate tutte lesequenzedi codiceabarredisponibili, il luogoe ilmodo in cuisono stati raccolti i campioni, le relative immagini e leconnessioniWebadaltrisitiutili. Perfaresoloalcuniesempi,l'importanzadelcodiceabarredelDNAe'evidentenelrecentelavorocondottodaiRoyalBotanicGardensdiKewincollaborazioneconilMissouriBotanicalGardens,chehaeliminato,inquantogia'presenti,600.000nomidipiantefioritedaunmilionedinomiregistrati.Al contrario, uno studio della biodiversita' del Costa RicautilizzandoilcodiceabarredelDNAhaevidenziatocheuntipodifarfalla(Astraptesfulgerator),studiataeclassificatadal1775,e'inrealta'rappresentatadadiecispeciedistinte.

LatecnicadelDNAbarcoding:statodell'arte Igeni“barcode”sonostatiindividuatiesceltiinquantolalorosequenzae'moltoconservata,masignificativamentediversatralevariespecie;taligenisonodeimarcatoriaffidabiliperidentificarerapidamentelediversespecie,apartiredauncampionediDNA. Requisitidiungenebarcode Lasequenzadiungenebarcodedeveesseresufficientementediversatraspecieespecieinmodoche ogni sequenza identificata possa essere univocamente attribuita ad una unica specie diorigine.Dalmomentoche, inmoltigeni,siosservanovariazionidisequenzaancheall'internodiunaspecie, lavariazionetraspeciediverse(inter---specie)deveesseremaggioredellavariazioneall'internodellastessaspecie(intra---specie). I geni identificati come marcatori (Fig. 2) e attualmente utilizzati per la definizione del DNAbarcodesonoilgeneCOX1(permaterialeanimale)eilgenerbcL(permaterialevegetale). Il gene COX1 (citocromo ossidasi 1) e' un gene mitocondriale che codifica la subunita' 1 di uncomplesso enzimatico coinvolto nella catena di trasporto di elettroni nella membranamitocondriale interna. Il gene rbcL (Rubisco) e' un gene del cloroplasto che codifica l'enzimaprincipaledellacatenadireazionidellasintesiclorofilliana. Avereidentificatoquestigenihaconsentitodicreareuncatalogogeneraledelladiversita',difacileaccesso per chiunque voglia rapidamente, ma accuratamente, identificare un organismo. Unastretta corrispondenza tra la sequenza di basi del campione e una sequenza nel databaseidentificarapidamenteunaspeciechee'gia'presenteneldatabase.Codiciabarredeltuttonuovi,consentonodiimmetterenuovespecienonancoradescritte.

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Fig.2Genomadelcloroplasto(asinistra)coninevidenzailgeneRubisco,rbcL,edelmitocondrio(adestra)inevidenzailgenedellacitocromoossidasi1,COX1.

PossibiliambitidiutilizzodelDNAbarcode IlDNAbarcodingcostituisceunvalidostrumentonel lavorodi conservazionedellabiodiversita',nelladiagnosidipatogeni,nelmonitoraggiodispecieinvasive(quelleingradodicolonizzarenuoviambientiascapitodellespecienative)einmoltialtricampi. Il DNA barcoding e' utile per individuare le frodi alimentari in prodotti conservati e moltoelaborati, altrimenti non identificabili e per monitorare nei prodotti alimentari la presenza dimaterialiprovenientidaspecieprotette. IlDNAbarcodingpuo' anche contribuire alla salutepubblicamonitorando la presenzadi insettivettoridimalattieumaneeanimali;adesempio,e'statorecentementeutilizzatoperdistinguerelezanzarevettoridimalariaealtremalattieinIndia. Nonostante tutti i dati che confermano l'utilità del barcode nella identificazione delle specieanimalievegetali,l'usodelcodiceabarredelDNAnone'ancorastatointrodottoeapprovatopereseguire i test alimentari in nessun paese del mondo. Alcuni test sono attualmente in fase distudioedisviluppo,epasserannoallafasediconvalidaintempibrevi.L'utilizzodelcodiceabarredelDNAper identificare ilpotenzialerischiobiologicotra iprodottidicontrabbandosequestratidalledoganee'ancoraall'inizio. Reagenti TamponediEstrazione(NaCl2M;Tris---HCl200mM,pH8.0;EDTA 70mM,pH8.0;Sodiummeta---bisulfite20mM) SDS(SodioDodecilSolfato)5% TE(TrisHCl10.0mM---EDTA1.0mMpH8.0) TBE(Tris---Borato---EDTA)1x Ammonioacetato Isopropanolo

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Etanolo70% Primers(forwardandreverse,15pmol/μl) RNAsienzima TaqDNAPolymeraseenzima5U/μl Taqbuffer10x dNTPs(10mM) Agarosio EuroSafeDNAStain Loadingdye6x H2Odistillata Normedilavoro •perchihaicapellilunghi:legarsiicapelliconunelastico•primadicominciarealavorare,lavarsilemani •pulireilbancodilavoroconalcoletilicodenaturato •primadicominciarel’esperimento,lostudenteverràfamiliarizzatoconlastrumentazionechedovràutilizzare,inmodoparticolareconlemicropipette •indossareiguantimonouso“disposable” Protocolloperl’estrazionedelDNAgenomicodaspecievegetale 1) Provateariconoscerelaspecievegetaleanalizzandoiltessutomessoadisposizione(uncampionediversoperciascunstudente)2) Porreunpezzoditessutovegetale,tagliatoconleforbici(circa1---2cm),inunaeppendorfda1.5mlsullaqualeverràriportatoilcodiceidentificativodelcampione(e/odelragazzo/a)

3) Addizionare 300 μl di Tampone diEstrazionee100μldiSDS5%4) Macinarebeneiltessutoconunpestello5) Incubareintermostatoallatemperaturadi60°Cpercirca30minuti6) Prepararedeinuovitubieppendorfriportandoicodiciidentificativi

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7) Centrifugare per 15minuti a 13000 giri(rpm,roundperminute)8) Trasferire150μldisurnatanteinunanuovaeppendorf(faremoltaaAenzioneanonaspirareilpellet)eaddizionare150μldiammonioacetato5Me300μldiisopropanolo9) Miscelareperinversione(5volte)eincubareatemperaturaambienteper15minuti10) Centrifugareper5minutia13000rpmebuAareilsurnatantestandoattenticheilpelletrimangaaAaccatoall’eppendorf11) Lavare il pellet addizionando 500μldietanolo70%12) Centrifugare5minuti13) Buttareilsurnatante,scolarebenelaprovettafacendoattenzioneanonperdereilpelletelasciareasciugareintermostatoper30minuti14) Risospendereilpelletin50μldiTE+RNAsi

ProtocolloPCRperDNAvegetale

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Buffer10x 2 ,5 MixPCRper1campionediDNAestraAoda PrimerF(15pmol/μl) 0 ,4 vegetali PrimerR1 0 ,2

PrimerR2 0 ,2 dNTPs(10mM) 0 ,5 H2O 1 8.7 DNAestraAo 2 Taq5U/μl 0 ,5

Totale 2 5μl PrimerperrbcL F)5’---TGTAAAACGACGGCCAGTATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC---3’(forwardprimer–rbcLafM13)R1)5’---CAGGAAACAGCTATGACGTAAAATCAAGTCCACCACG---3’(reverseprimer–rbcLa---revM13) R2)5’---CAGGAAACAGCTATGACGTAAAATCAAGTCCACCGCG---3’(reverseprimer–rbcLa---revM13)

94°C 2min

94°C 30sec per35

CondizionePCR 54°C 45sec

cicli

72°C 45sec

72°C 3min

4°C end

AnalisideiprodottidiPCRmedianteelettroforesisugeldiagarosio Preparazionedelgeldiagarosio La concentrazione di agarosio del gel viene scelta dal ricercatore in base alle dimensioni deiframmenti di DNA da separare. Nel nostro caso, dovendo separare frammenti lineari di DNAcompresitra550e600bp(basepairs,coppiedibasi),siutilizzaungeldiagarosioal2%.

prepararelavaschettaperelettroforesiconbordidi“nastroadesivodicarta”verificarecheilpianosucuisiappoggialavaschettaperelettroforesisia“inbolla” misurare30mlditamponeTBE1xinuncilindroeversarlinellabeutadivetropirexchecontienegià0,6grdiagarosio. pesarelabeutacontenentelasoluzionediagarosioesegnareilpeso scioglierel’agarosionelfornoamicroonde.Ognitantospegnereeagitaredelicatamentelasoluzione. pesarelasoluzionediagarosioeriportarlaalpesooriginale,utilizzandounaspruzzettaconH2Odistillata. quandolasoluzionesièunpo’raffreddata(riusciteatenerlainmano)aggiungere1µldiEurosafe. versarelasoluzionediagarosio,evitandodiformarebolle,nellavaschettaperelettroforesidoveègiàstatoinseritoilpettine. lasciaresolidificareatemperaturaambientepercirca15min.Quandoèsolidificato,ilgeldiventaopaco togliereilnastrodicartadallavaschettaemetterlanellacellaelettroforeticacontenente250mldiTBE1x toglierelentamenteilpettine,tenendosiperpendicolarerispettoalgel

Corsaelettroforetica

aggiungere2µldiloadingdye6xa10µldiciascuncampionediDNAcentrifugarebrevemente(6sec) caricarelentamenteciascuncampioneneisingolipozzeG inunpozzettolaterale,caricareilmarkerdiDNAapesomolecolarenotochiudereilcoperchiodellacellaelettroforetica collegareimorsettialgeneratoredicorrente,fissareilvoltaggioalvalorecostantedi80Velasciareprocederelacorsaelettroforeticapercirca30min osservare lamigrazionedel loadingdyeper valutare lamigrazionedelDNA, che, essendoincolore,nonsipuòvedere.IlbludibromofenolomigraallastessavelocitàdiunframmentodiDNAadoppiaelicadicirca300bp,mentreloxilencianolomigraallastessavelocitàdiunframmentodicirca4.000bp allafinedellacorsaelettroforetica,osservareilgelsultransilluminatore

Analisideirisulta' Interpretazionedeirisulta'dellacorsaelettrofore'ca

1000bp

500bp

300bp

200bp

100 bp

M: marcatoredipesomolecolare(100bp). corsia1,2,3,4:bandadelgenerbcLestrattodacampionevegetaleeamplificato(circa550bp)

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AttivitàdiBioinformatica:analisidellesequenzediDNAottenutedaframmentivegetali Durantei30minutidicorsaelettroforetica,sarannodistribuitiaglistudentialcunielettroferogrammi(Fig.3)perimparareadanalizzareidatiottenutidalsequenziamentodelDNA.

Fig.3EleAroferogrammaoAenutodaldasequenziamentodelDNA

Lesequenzechesarannoanalizzatedaglistudentiporterannoall’identificazionediciascunaspecievegetaledacuièstatoestratto ilDNA.A talescopoverra'utilizzata l'interfacciasemplificataedintuitiva (Fig.4 e 5), appositamente sviluppata dal DNA Learning Center di New York che e'collegataatuttelebanchedatidisponibilipertaleanalisi.

Fig.4DNASubway,piaAaformautilizzataperleanalisidellesequenzediDNA

Fig.5SchermatadellabancadatiincuisiIndividuailnomedellaspecievegetale 9

Cosa c’è nel polpettone? Identificazione della specie carnea

SCOPO DELL’ATTIVITÀ L’analisi di un gene mitocondriale, il citocromo b, consente di identificare la specie carnea di campioni aventi una dubbia origine. Il gene è molto variabile tra specie e specie, ma estremamente conservato a livello intraspecifico: amplificando tramite PCR una determinata sequenza interna al gene, si ottengono frammenti specie--�specifici di diversa lunghezza che, analizzati mediante elettroforesi, individuano il tipo di carne (equina, bovina, ovina...). PREREQUISITI

• Struttura del DNA • La PCR • L'elettroforesi del DNA

INTRODUZIONE Quando si acquista carne al supermercato o in macelleria di solito non si hanno problemi a capire se la merce è fresca e ben conservata, anche solo osservando attentamente l’aspetto e il colore di ciò che si vuole comperare. Se invece si acquista un macinato, un insaccato o un polpettone la difficoltà nel riconoscere la freschezza e la qualità è maggiore, per non parlare della provenienza delle carni che vengono tritate e amalgamate insieme. In questi casi per identificare la specie a cui appartiene la carne macinata si deve ricorrere al test del DNA. Con la PCR viene amplificata una parte del citocromo b, un gene mitocondriale: si utilizza un primer forward (5'--CCT CCC AGC TCC ATC AAA CAT CTC ATC TTG ATG AAA--3') comune a tutte le specie carnee mentre come reverse primer viene utilizzato un oligonucleotide specie-specifico (vedi tabella). I prodotti della PCR sono quindi di lunghezza tipica della specie a cui appartiene il campione analizzato.

Specie carnea Primer reverse capra 5'--CTC GAC AAA TGT GAG TTA CAG AGG GA--3' pollo 5'---AAG ATA CAG ATG AAG AAG AAT GAG GCG--3' bovino 5'--CTA GAA AAG TGT AAG ACC CGT AAT, ATAAG--3' maiale 5'--GCT GAT AGT AGA TTT GTG ATG ACC GTA--3' cavallo 5'--CTC AGA TTC ACT CGA CGA GGG TAG TA--3'

I prodotti della PCR vengono poi visualizzati su gel di agarosio e si evidenziano le seguenti bande :

-- 157 bp (base pairs, coppie di basi) per la carne di capra -- 227 bp per la carne di pollo -- 274 bp per la carne bovina -- 398 bp per la carne di maiale -- 439 bp per la carne di cavallo

SCHEMA DELL’ESPERIMENTO Agli studenti vengono fornite provette eppendorf numerate da 1 a 5 contenenti campioni di DNA provenienti da diverse specie carnee: 1 = capra 2= pollo 3= bovino 4= maiale 5 = cavallo La provetta n° 6 contiene il DNA estratto da un composto di carne macinata di dubbia composizione PROTOCOLLO SPERIMENTALE Preparazione del gel di agarosio Nota di laboratorio: la concentrazione di agarosio del gel viene scelta dal ricercatore in base alle dimensioni dei frammenti di DNA da separare. Nel nostro caso, dovendo separare frammenti lineari di DNA compresi tra 100 e 2.000 bp, si utilizza un gel di agarosio al 2%. Preparazione del gel q preparare la vaschetta per elettroforesi con bordi di nastro adesivo di carta q verificare che il piano su cui si appoggia la vaschetta per elettroforesi sia a bolla q misurare 30 ml di tampone TBE 1x in un cilindro e versarli nella beuta di vetro pirex che contiene già 0,6 gr di agarosio. Attenzione a non rovesciare la beuta. q pesare la beuta contenente la soluzione di agarosio e segnare il peso sul protocollo: _______ q sciogliere l’agarosio nel forno a microonde impostato sulla potenza indicata da una figura con tre fiammelle ( circa 500V) per 1 minuto. Aprire poi il forno a microonde, agitare delicatamente la soluzione con una presina, facendo attenzione a non scottarsi. Richiudere il forno a microonde e sciogliere la soluzione per un ulteriore minuto alla stessa potenza q pesare la soluzione di agarosio (l’acqua del tampone, bollendo, è evaporata!) e riportare la soluzione di agarosio al peso originale, utilizzando una spruzzetta con H2O distillata. Attenzione: far cadere l’acqua delicatamente, facendola scivolare lungo i bordi della beuta, altrimenti si formano delle bolle q aspettare 3--�5 minuti, coprendo la beuta contenente la soluzione di agarosio con un pezzetto di stagnola, per evitare l’evaporazione. L’agarosio deve raggiungere una temperatura intorno ai 60°C, altrimenti rovina il supporto di plastica della vaschetta dell’elettroforesi. Quindi versare la soluzione di agarosio, evitando di formare bolle, nella vaschetta per elettroforesi dove è già stato inserito il pettine. I pozzetti si formano quando, una volta solidificato il gel, viene tolto il pettine

Lasciare solidificare a temperatura ambiente per circa 15 min. Quando è solidificato, il gel diventa opaco q mentre si aspetta che il gel solidifica, fare delle prove di caricamento dei pozzetti del gel (12∝l di loading dye 1x) su altri gel già pronti q togliere il nastro di carta dalla vaschetta e metterla nella cella q togliere lentamente il pettine, tenendosi perpendicolare rispetto al gel Corsa elettroforetica q aggiungere 2 µl di loading dye 6x ai 10 µl di ciascun campione di DNA e risospendere con la micropipetta, evitando di formare bolle. Il glicerolo presente nel loading dye serve per rendere più densa la soluzione di DNA da caricare nel pozzetto e quindi a facilitarne l’entrata nel pozzetto q se si formano bolle, centrifugare brevemente (1 sec) in una microcentrifuga eppendorf (in gergo di laboratorio, si dice “spinnare” da spin, centrifugare) q caricare lentamente ciascun campione (12 µl) nei singoli pozzetti (ogni pozzetto ha un volume di circa 15 µl), ponendosi con la punta della micropipetta in un angolo del pozzetto e perpendicolare rispetto al gel, facendo attenzione a non bucare il fondo del pozzetto stesso e a non far uscire il campione fuori dal pozzetto q in un pozzetto laterale, caricare il marker di DNA a peso molecolare noto q chiudere il coperchio della cella elettroforetica q collegare i morsetti alla camera di corsa e ai poli del generatore di corrente, detto anche power supply; il DNA è carico negativamente e migra verso il polo positivo q fissare il voltaggio al valore costante di 100 V e lasciare procedere la corsa elettroforetica per circa 30 min q fare attenzione che la banda del blu di bromofenolo non esca dal gel (altrimenti alcune bande di DNA possono uscire dal gel) q osservare la migrazione del loading dye per valutare la migrazione del DNA, che, essendo incolore, non si può vedere. Il blu di bromofenolo migra alla stessa velocità di un frammento di DNA a doppia elica di circa 300 bp, mentre lo xilen cianolo migra alla stessa velocità di un frammento di circa 4.000 bp. Attenzione: fermare la corsa elettroforetica quando il blu di bromofenolo si trova a circa 1--�2 cm dalla fine del gel, in modo da evitare che il DNA esca dal gel stesso. Se dovesse succedere, si perdono i campioni di DNA! Operazioni da svolgere alla fine della corsa elettroforetica. Questa operazione viene svolta dal tutor: q al termine della corsa, indossare i guanti monouso, togliere delicatamente il gel dalla cella q osservare il gel al transilluminatore q pulire le apparecchiature ed il banco di lavoro con acqua ed etanolo denaturato q dopo aver finito di lavorare, lavarsi le mani