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Giornata di formazioneBologna 25 novembre 2004

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Validazione dei metodi e incertezza di misura nei laboratori di prova addetti al controllo di alimenti e bevande

La validazione dei metodi microbiologici : aspetti applicativi , controllo del processo analitico evalutazione dell’operatore.

Lido Ballati

ARPATAgenzia regionale per la protezione ambientale della ToscanaDirezione generale- Articolazione funzionale sistema qualità

Via Nicola Porpora n.22 - 50144 FIRENZETel. 055-3206405 – Fax 055-3206410E. mail : l.ballati @arpat.toscana.it



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1- Il processo analitico microbiologico 1.1 La effettuazione di prove microbiologiche , intese come “ricerca” e “quantificazione” di entitàmicrobiche ( batteri e miceti) , rappresenta uno dei pilastri del controllo di qualità e/o della sicurezzaigienico-sanitaria che interessano una ampia gamma di attività, quali ad esempio : la produzione , lacommercializzazione ed il controllo igienico- sanitario di alimenti ( di origine animale e/o vegetale) ebevande; la produzione ; la commercializzazione ed il controllo di farmaci e cosmetici; la produzione ,la commercializzazione ed il controllo di mangimi per animali;il controllo ed il monitoraggio di matriciambientali ( acqua, suolo, aria); il controllo della potabilità dell’acqua e il monitoraggio delle reti didistribuzione ; la ricerca e la diagnosi clinico-medica; la valutazione dell’attività di sostanze utilizzate comebatteriostatiche o battericide nella produzione di disinfettanti o antisettici usati in campo alimentare ,industriale, domestico ecc.

I metodi di prova microbiologici “vitali”, siano essi qualitativi ( presenza /assenza),che quantitativi(enumerazione) rappresentano una componente fondamentale del processo analitico (vedi fig.1). e aalla base utilizzano la “capacità naturale“ dei microrganismi ricercati di riprodursi, in determinatecondizioni ambientali e su idonei supporti (terreni colturali), in modo esponenziale ( scissione binaria)1

allo scopo di renderli “visibili” ai nostri occhi e quindi poterli quantificare come UFC ( unità formanticolonie) o come MPN (must probabile number -numero più probabile NPP) .

Nella figura n.1 è schematizzato un generico processo analitico ed ipotizzato un sistema dicontrollo , regolazione e possibile miglioramento di tale processo.

Figura n.1

1 La scissione binaria è il processo “vitale” che consente ai batteri quindi incrementano il loro numero in progressione geometrica. Laprogressione geometrica è riferita alla popolazione del batterio duplicato , ad un determinato intervallo temporale ( tempo di generazione), comerisultato della divisione binaria. In condizioni ottimali , la maggior parte dei batteri presenti in un substrato ha un tempo di generazione molto

breve, ed è stimato sia compreso tra i 20-60 minuti. La formula 2NN n

0t×= ( Nt= numero batteri al tempo t-iesimo ; No= numero batteri al

tempo zero; n=numero di replicazioni nell’intervallo di tempo considerato), consente di stimare il possibile livello di concentrazione battericaraggiunto in condizioni ideali a partire dal livello ipotizzato al tempo zero.



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La rappresenzazione d’insieme consente di evidenziare almeno n.4 “punti critici “ del processoanalitico ai quali prestare sempre attenzione, ed in particolare se il Laboratorio intende conformare ilproprio sistema di gestione ai requisiti della norma UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2000 “Requisiti generaliper la competenza dei laboratori di prova e di taratura” e conseguire l’accreditamento delle proveeffettuate.

Sintetizzando possiamo dire che :

1) se il processo analitico messo in atto dal Laboratorio non è tenuto adeguatamente sotto controllo ,ovvero non si raccolgono e gestiscono in modo corretto le informazioni ( dati output di processo ) ècome eliminare dal processo i “sensori” , quindi di fatto non sappiamo cosa accade ;

2) se il Laboratorio non organizza e definisce opportuni ed appropriati indicatori di riferimento con i qualiconfrontare le misure effettuate ( es. carte di controllo ecc.) e come eliminare dal processo i“comparatori ”. In pratica le misure fatte non possono essere utilizzate né ai fini del controllo interno delprocesso analitico e né forniscono adeguate garanzia al cliente sulla “qualità del dato” prodotto;

3) se il responsabile/ i responsabili ( leadership) del Laboratorio non svolge/svolgono la loro funzionein modo efficace, ovvero non vengono prese decisioni sulla base di dati oggettivi e dei confrontieffettuati è come eliminare dal processo i “decisori “ e quindi di fatto viene a mancare il “motore” diregolazione del processo analitico;

4) se i problemi reali ( non conformità ) e quelli potenziali ( azioni preventive) che si presentano inLaboratorio non vengono affrontati e risolti ( azioni correttive), ovvero non si traducono in indicazionioperative per il personale che esegue l’attività di prova e , ove necessario, in fornitura di risorseadeguate ,significa togliere dal processo gli “ attuatori “ e quindi di fatto viene vanificata la possibilitàdi riportare il processo analitico sotto controllo o di migliorarlo.

----------------------------1.2 Le attività di prova microbiologiche , al pari di altre prove biologiche , rapportandosi alla “ naturavivente” , sono soggette a varie fonti di influenza :

• interne ovvero attribuibili al sistema “vitale” di sviluppo e crescita del /dei microrganismo/irealizzato in laboratorio , su un substrato artificiale , approssimabile a quello “naturale, e al modellostatistico preso a riferimento per stimare la dispersione “possibile ed accettabile ” delle particellemicrobiche nel campione sottoposto a prova;

• esterne dovute ad esempio all’ ambiente di laboratorio , alle attrezzature e materiali, alla tecnicadi prova , al personale ecc.

che, singolarmente considerate o in modo sinergico o antagonista tra di loro, concorrono allavariabilità complessiva di un risultato sperimentale.

Una variabilità “complessa e dinamica “ che :

• da un lato preclude la possibilità di associare , alle prove microbiologiche, un’incertezza dimisura calcolata sulla base di un approccio statistico rigorosamente metrologico;

• dall’altro impone comunque che le diverse fonti di variabilità siano identificate, sia dimostratoche sono tenute sotto controllo e che sia valutato il loro contributo alla variabilità (incertezza) complessiva .

Per rappresentare la complessità del processo analitico microbiologico e “fotografarne “ le possibilicomponenti ( fattori) di variabilità coinvolti e le loro interazioni è stato predisposto (vedi fig.2) undiagramma causa - effetto , sulla base di quanto proposto da Ishikawa , comunemente noto comediagramma a “lisca di pesce.



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Tutte le componenti , ove possibile , devono essere tenute sotto controllo, con modalità definite dallaboratorio , e deve essere valutato il livello del loro contributo all’incertezza generale del risultato diprova , rispetto al livello di probabilità ritenuto accettabile.

Figura n.2

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1.3 Nell’organizzazione delle attività di prova è opportuno e necessario che il Laboratorio consideri edattui anche un appropriato controllo statistico del processo analitico in modo da corrispondere airequisiti della norma internazionale UNI EN ISO/IEC 17025 (p.to 5.4.6.2 e 5.9 )2. La diffusione di personal computer e la disponibilità di programmi informatici, consentono oggi dipianificare e praticare il controllo statistico alle attività di prova , superando anche quella “diffidenzaculturale ” nei confronti della “statistica” che per molti tempo è stata originata anche dalle difficoltà diapplicazione di formule matematiche spesso complesse.Dello “strumento statistico” occorre conoscere e comprendere le potenzialità e valutarne , in modopuntuale e critico, la applicabilità alla “realtà analitica”, ma per fare questo non occorrenecessariamente essere in possesso delle conoscenze statico-matematiche che sono richieste aduno statistico di professione!

Infatti come affermato da Willian John Youden 3 :

2 Anche la norma UNI CEI EN 45001 :1990 , p.to 5.4.1 si confrontava con il controllo statistico dei dati analitici specificando che : “ illaboratorio deve utilizzare metodi di prova e procedure adatti allo scopo delle prove fornendo , quando opportuno, una stima dell’incertezza dimisura calcolata mediante l’uso di tecniche statistiche appropriate “.3 Dalla prefazione alla pubblicazione “ Statistical Methods for Chemists “ di Willian John Youden (1951).



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“ Molte tecniche statistiche non richiedono dimostrazione per essere accettate dallosperimentatore , perché questi sente istintivamente che le esatte formulazioni dello statisticoconcordano con la sua esperienza : la sua fiducia nella potenzialità della statistica poggia suquesto accordo piuttosto che sulle dimostrazioni matematiche.

Si afferma spesso che le tecniche statistiche vengono usate erroneamente se chi le usa manca diuna solida base teorica.

E , d’altra parte, è anche possibile che il matematico si smarrisca se le sue conoscenzescientifiche sono inadeguate: le applicazioni saranno erronee ”.

Considerazioni analoghe a quelle di Yuden , sono state inserite , 50 anni dopo, nella normaeuropea, UNI CEI ENV 13005 : 2000 “Guida all’espressione dell’incertezza di misura”, p.to 3.4.8, dellaquale le elaborazioni statistico -matematiche costituiscono il fondamento :

“ Benché questa guida fornisca uno schema generale per valutare l’incertezza, essa non puòsostituirsi al pensiero critico, all’onestà intellettuale ed alla capacità professionale. La valutazione dell’incertezza non è né un compito di routine né un esercizio puramentematematico, ma dipende dalla conoscenza approfondita della natura del misurando e dellamisurazione.

La qualità e l’utilità dell’incertezza attribuita al risultato di una misurazione dipendono pertanto ,in definitiva, dall’approfondimento, dall’analisi critica e dall’integrità morale di chi contribuiscead assegnarne il valore ”.

2- Validazione dei metodi di prova microbiologici

2.1 La norma UNI CEI EN ISO / IEC 17025 :2000 , p.to 5.4 Metodi di prova e di taratura validazione deimetodi richiede al laboratorio deve utilizzare metodi di prova inclusi i metodi di campionamento, chesoddisfino le esigenze del cliente e che siano appropriati per le prove da eseguire. Specifica inoltre che si devono utilizzare preferibilmente “metodi normalizzati” , ovvero pubblicati :

• nelle norme internazionali (ISO),• nelle norme europee (EN),• nelle norme nazionali (UNI),• metodi pubblicati da enti riconosciuti.

I metodi interni ( p.to 5.4.2) , “metodi non normalizzati” , sviluppati dal laboratorio possono essereutilizzati se sono appropriati all’uso e se sono validati.

La validazione di metodo è un processo pianificato e eseguito “praticamente” per accertare che unametodologia analitica sia ad esempio sensibile, specifica, riproducibile e robusta in relazione al tipo dideterminazione/i che con un determinato metodo si intendono effettuare .

La validazione di un metodo microbiologico è tale se :

1) fornisce la prova documentata che il metodo è adatto per lo scopo e il campo di applicazione adesempio per : - rivelare la presenza /assenza ( metodo qualitativo) o - quantificare ( metodo quantitativo) il numero delle colonie di uno specifico microrganismo o gruppi di microrganismi in una determinata matrice ;



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2) assicura l’affidabilità durante l'uso normale , ovvero che il metodo “è adatto allo scopo” e assicuraanche che, nell’applicazione “routinaria” di laboratorio , le caratteristiche del metodo sono tenutesotto controllo e mantenute entro limiti specificati.

La validazione di un metodo microbiologico in ragione agli obiettivi a cui intende corrispondere puòessere classificata in :

a) validazione primaria ,b) validazione secondaria.

a) Validazione primariaLa validazione primaria ( definita anche convalida) è un processo sperimentale di tipo esplorativo il cuiscopo è stabilire i limiti operativi e le prestazioni (performance) caratteristiche di:- un nuovo metodo;- un metodo modificato o anche di un metodo insufficientemente caratterizzato.I risultati numerici della sperimentazione , le modifiche apportate alla procedura di prova ( esempiovariazioni di terreni colturali, tempi e modalità di incubazione ...) e quant’altro può influenzare leprestazioni del metodo devono essere descritti e dettagliati in modo non ambiguo in un appositodocumento al termine della validazione.Nel caso di metodi che prevedono la ricerca e conteggio totale di microrganismi la validazioneprimaria è generalmente effettuata per confronto con altri metodi normalizzati in uso o per confronto conuna precisione teorica predefinita in ragione allo scopo e al campo di applicazione previsto per quelmetodo metodo.Un laboratorio che sviluppa internamente un metodo ( metodo interno) o modifica un metodonormalizzato esistente dovrebbe validare il metodo seguendo gli stessi passaggi previsti nellavalidazione primaria. E’ di fondamentale importanza che il personale tecnico coinvolto nella validazione primaria abbia maturatouna adeguata e documentata esperienza con altri metodi microbiologici.

b) Validazione secondaria La validazione secondaria ( definita anche verifica) si realizza quando in un laboratorio si utilizza unmetodo sviluppato e validato ( validazione primaria) da altri. La validazione secondaria consiste nel dare evidenza che il laboratorio applicando un metodo validato ècapace di corrispondere alle specifiche stabilite nella validazione primaria.La validazione secondaria in genere selezione e usa semplificandole le procedure utilizzate nellavalidazione primaria ma valutandone le prestazioni del metodo a lungo termine ( es, predisponendoapposite carte di controllo).Al momento molti metodi normalizzati microbiologici non riportano tutte le specifiche richieste dallavalidazione primaria ( esempio dati di riproducibilità).In questo caso la partecipazione a circuiti esterni di assicurazione della qualità dove esistono , può essereun primo passo per il completamento della validazione secondaria. Campioni naturalmente contaminati , ove disponibili , rappresentano un materiale di prova ottimale pervalutare se il metodo di prova è correttamente applicato e rispetta i limiti definiti nella valutazione primaria.

In microbiologia , allo scopo di ridurre il tempo di risposta analitica dei metodi “ tradizionali”, si sonosviluppati e si stanno sviluppando, in particolari settori , i cosiddetti “metodi rapidi” 4. Anche tali metodi devono essere validati a livello primario e secondario. Nella figura 3 è riportato uno schema di validazione di un metodo microbiologico in ragione dellapossibile casistica di riferimento.

4 Il confronto con un metodo normalizzato è una pratica molto utilizzata per la validazione di metodi rapidi microbiologici applicabili alla ricerca edal conteggio di batteri patogeni in particolare quando la ricerca ed il conteggio è complessa e comporta tempi di risposta molto lunghi.In generei metodi rapidi sono sviluppati dall’organizzazione che intende produrli e commercializzarli e sono sottoposti ad approvazione da parte diorganizzazioni riconosciute e competenti in materia , tipo ad esempio ANFOR – Francia, che ne attesta sperimentalmente e ne certifica larispondenza allo scopo, in confronto al un metodo normato di riferimento.



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Figura n.3

2.2 Parametri caratteristici di un metodo



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100FNP

P×

+=

100FPN

N×

+=

Di seguito è riportato il confronto tra le la definizioni di alcuni parametri di qualità comuni aimetodi di prova microbiologici ed a quelli di prova chimici.

Parametro DefinizioneMetodo microbiologico Metodo chimico

Sensibilità Probabilità , espressa comepercentuale, che un risultato positivo siaeffettivamente positivo. P = Risultato positivo FN = Falso negativo

Capacità di discriminare tra piccoledifferenze nella concentrazione oquantità del misurando.Misurando = Quantità o proprietà sottoposta alprocesso di misurazione

Specificità Probabilità , espressa come percentuale,che un risultato negativo sia effettivamentenegativo. N = Risultato negativo FP = Falso positivo

Capacità di misurare quantitativamente leproprietà chimiche o fisiche o biologiche di unmisurando in presenza di potenziali interferenti.

Robustezza La robustezza di un metodo rappresenta la capacità del metodo di non essere influenzatosignificativamente , per effetto di variazioni deliberate introdotte nelle sue fasi direalizzazione.

Precisione Grado di accordo tra misure indipendenti della stessa variabile analitica. In funzione delle modalità con cui vengono replicate le prove, può essere definita comeripetibilità o come riproducibilità.La riproducibilità è valutata attraverso prove organizzate gestite da circuiti interlaboratorio.

Esattezza(accuratezza della media)

Differenza tra il valore medio ottenuto da un sufficiente numero di prove indipendenti ed ilvalore di riferimento accettato come reale.I materiali di riferimento a valore noto disponibili per le prove microbiologiche non sonoancora molti. Sono disponibili a livello europeo alcuni prodotti e commercializzati dal BCR.

Incertezza c) Parametro associato al risultato di una misurazione o prova, che caratterizza ladispersione dei dati ragionevolmente attribuibili al misurando

( Norma UNI CEI EN V 13005:2000 ).

b) Stima che caratterizza il campo di valori entro cui giace il valore vero del misurando ( Norma ISO 3534-1 :4993).

c) Parametro associato al risultato di una misurazione, che caratterizza la dispersione deivalori ragionevolmente attribuibili al misurando. ( VIM - Vocabolario Internazionale dei termini fondamentali e generali in metrologia , 1993).

Ripetibilità Parametro entro il quale si deve confrontare la differenza tra dati in doppio ottenuti sullostesso campione utilizzando lo stesso metodo di prova adottato dal laboratorio.

Limite di ripetibilità

Due prove replicate Conteggio su piastra ( range 15-300 UFC/ piastra)

2121 CCKCC p +×≤−

kp = 1,96 p =0,95

Due prove replicate Sr = Scarto tipo di ripetibilità definitosperimentalmente dal laboratorio applicando undeterminato metodo, su un campione stabile ad undeterminato livello di concentrazione.

t= t di student tabulato per v= n-1 e p=0,95

Nella figura 4 è invece schematizzato il concetto di precisione ed esattezza di un metodo di prova“rappresentato ” come fosse un tiro al bersaglio.

2r21 ××≤− StXX



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Figura n. 4

PRECISIONE = Differenza (scarto aleatorio) tra un singolo valore e la media degli n valori

ESATTEZZA ( accuratezza della media) = Differenza (scostamento) tra il valore presunto vero ed il valore mediodegli n. valori

ACCURATEZZA = Differenza ( scarto) tra il valore presunto vero ed il valore singolo del misurando

ACCURATEZZA = ESATTEZZA ± PRECISIONE

Scarto = scostamento ± scarto aleatorio

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2.3 L’utilizzo di un metodo microbiologico normalizzato validato da un’organizzazione riconosciuta , nonassicura automaticamente la validità dei risultati. E’ necessario sempre definire e applicare un “controllo di qualità” adeguato al tipo di analisi cheroutinariamente vengono eseguite dal laboratorio , applicando un determinato metodo per poterassicurare la qualità dei risultati.Il controllo qualità del metodo può essere un estensione del processo analitico microbiologico peresempio in prove quantitative operando repliche a livelli differenti di concentrazione microbica osemplicemente effettuando delle valutazioni statistiche (calcoli) utilizzando i dati ottenuti nella normaleattività di laboratorio se ad esempio il metodo utilizzato nella routine prevede l’effettuazione di repliche.

Si possono utilizzare , ove esistenti, materiali di riferimento , campioni di circuiti intercalibrazione, ocampioni artificialmente contaminati con ceppi batterici di riferimento .

Nella figura n.5 è riportato uno schema a blocchi di sviluppo ed utilizzo routinario di un metodo di prova le possibili fasi di validazione e monitoraggio nel tempo delle prestazioni.



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Figura n. 5

Le carte di controllo costruite, ad esempio, utilizzando i limiti indicati dal metodo ( validazione primaria) odefiniti a seguito di considerazioni teorico-statistiche sono uno degli strumenti principali che possonoessere utilizzabili anche in microbiologia

Nella figura 6 è riportato un esempio di Kp–chart relativa a prove analitiche effettuate di routine indoppio predisposta utilizzando un foglio elettronico in Excel.Figura n. 6

3- Incertezza del risultato analitico microbiologico



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Incertezza Parametro associato al risultato di una misurazione , che caratterizza la dispersione dei valoriragionevolmente attribuiti al misurando.( p.to 3.9 VIM – Vocabolario Internazionale dei termini fondamentali e generali in metrologia , 1993)

Incertezza tipo Incertezza del risultato di una misurazione espressa come scarto tipo .

( UNI CEI ENV 13005 :2000, p.to 2.3.1)

Incertezza tipo compostaIncertezza tipo del risultato di una misurazione allorquando il risultato è ottenuto mediante i valori di un certonumero di altre grandezze. Essa è uguale alla radice quadrata positiva di una somma di termini, che sono levarianze o le covarianze di quelle grandezze, pesate secondo la variazione del risultato della misurazione alvariare di esse.

( UNI CEI ENV13005 :2000 , pto 2.3.4).

Incertezza estesa Grandezza che definisce , intorno al risultato di una misurazione, un intervallo che ci si aspettacomprendere una frazione rilevante della distribuzione di valori ragionevolmente attribuibili al misurando .( UNI CEI ENV13005 :2000 , pto 2.3.5).

Per poter associare uno specifico livello di fiducia all’intervallo definito dall’incertezza estesa ènecessario fare ipotesi, esplicite o implicite, sulla distribuzione di probabilità caratterizzata dal risultatodella misurazione e dalla sua incertezza tipo composta. Il livello di fiducia che può essere attribuito a questo intervallo può essere conosciuto solo nei limiti entroi quali quelle ipotesi siano giustificate.

Fattore di copertura kp E’ un fattore numerico utilizzato come moltiplicatore dell’incertezza tipo composta per ottenere unaincertezza estesa.

( UNI CEI ENV13005 :2000 , pto 2.3.6). I valori del fattore di copertura Kp che genera un intervallo avente fiducia p, nel caso di distribuzionenormale è di seguito riportato :

Livello p ( %) Fattore di copertura Kp68,27 1

90 1,64595 1,960

95,45 299 2,576

99,73 399,9936 4

In ambito microbiologico la valutazione statistica dei risultati scaturiti da prove quantitative , perdefinire il parametro di incertezza da associare al risultato , deve inevitabilmente tenere conto delle“peculiarità” tipiche della pratica analitica microbiologica, ovvero dei numerosi fattori di variabilità , chenon rendono agevole definire quella “incertezza ” , da associare alla misura (risultato) , comenormalmente viene intesa ad esempio in ambito metrologico ( prove di taratura strumentale ) o inmisurazioni di tipo fisico o chimico. Nella variabilità di una misurazione microbiologica infatti entrano in gioco diversi fattori che possiamodefinire come “fattori naturali” che conferiscono inevitabilmente una certa non “ ripetibilità di fondo “ ai risultati di prova.

Rappresentano sicuramente una fonte di “ naturale” di variabilità di una analisi microbiologica :

• l ’oggetto della ricerca analitica microbiologia che è rappresentato da cellule viventi ( cellulemicrobiche) naturalmente presenti o contaminanti substrati (matrici) di varia natura.



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• la “dispersione non omogenea” dei microrganismi nel campione prelevato e sottoposto adanalisi ;

• l’impossibilità pratica di avere , pur partendo da uno stesso campione aliquote di provaassolutamente corrispondenti, per quanto riguarda le cariche microbiche presenti, qualunque siala loro “ concentrazione”;

• l ’influenza che fattori naturali , di tipo fisico, chimico, biologico, possono direttamente oindirettamente rivestire , nel far si che i microrganismi non siano presenti nel campione in cui sivanno a ricercare, in un condizione ottimale, ovvero si trovino in una condizione “stressata” odi “ danneggiamento irreversibile”;

• la difficoltà , applicando i normali criteri analitici di evidenziare le cellule microbicheirreversibilmente danneggiate , “ injured cells”;

• I possibili effetti inibenti sulla crescita delle “ cellule stressate” , eventualmente presenti nelcampione di prova ,dei terreni di coltura selettivi. Infatti tali terreni infatti facilitano le operazionianalitiche solo nel caso che i microrganismi ricercati siano presenti in

condizioni ottimali sotto il profilo strutturale e funzionale.

Ai “fattori naturali” possono aggiungersi altri fattori non “ naturali” , in grado di accrescere ulteriormente “l’incertezza” del risultato, fino a mettere in ragionevole dubbio la validità del risultato stesso quali adesempio :

• utilizzo di metodi non appropriati al tipo di ricerca effettuata;non corretta conservazione e manipolazione dei campioni di prova;

• ambienti di laboratorio ( locali di prova ecc. ) inadeguati ;• apparecchiature inadeguate ha fornire le prestazioni richieste;• utilizzo di materiali ( terreni colturali, reagenti , reattivi …) che non offrono una sufficiente garanzia

di qualità ;• inadeguata conservazione di terreni , reagenti e reattivi ;• comportamenti non consoni del personale o utilizzo di personale non adeguatamente formato e

addestrato ecc. ecc. L’effetto di alcuni fonti di variabilità quali ad esempio il volume pipettato (inoculo) oppure la pesata delcampione ,effettuata per preparare la sospensione, possono essere misurate direttamente e il lorocontributo statistico alla variabilità può essere quindi facilmente stimato e valutato.

Altri fonti di variabilità collegate ad esempio alla stabilità del campione, preparazione del campione , eccnon possono essere direttamente misurati ed il loro contributo può non essere valutabile in manieradiretta , ma la loro importanza alla variabilità dei risultati dovrebbe essere comunque considerata (stima conservativa).

In microbiologia l’ incertezza da associare al risultato, nel caso di utilizzo della tecnica di semina supiastra , membrana filtrante o MPN , è generalmente espressa come intervallo di fiducia ad un livello diprobabilità del 95 %(p=0,95).Tale intervallo calcolato, con modalità statistiche definite ed esplicitate nel metodo o, in assenza,conmodalità definite dal laboratorio deve essere opportunamente documentato e dichiarato.

Sicuramente tra le componenti che possono incidere notevolmente , in positivo o in negativo , sullaqualità e garanzia di affidabilità del risultato finale e della relativa incertezza , in ragione al livello diefficienza ed efficacia raggiunto dal laboratorio nella gestione e controllo del suo Sistema Qualità ,sono :

a) le procedure di prova , ovvero disponibilità di metodi di prova validati (vedi paragrafo 2);

b) il personale ovvero disponibilità di personale qualificato e abilitato all’esecuzione delle prove(vedi paragrafo 4).



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Valutazione della competenza tecnica del personale4.1 Nelle prove microbiologiche il “ fattore umano ” è sicuramente uno dei principali fattori “critici “ datenere sotto controllo in quanto “fattore trasversale” e unificante dell’intero processo analitico. L’ operatore tecnico è infatti l’esecutore di diverse ed importanti fasi di prova , quali ad esempio:• campionamento, • preparazione e manipolazione dei terreni colturali ,• conservazione , preparazione , diluizione , semina del campione , incubazione, ma è anche lo “strumento” , maggiormente utilizzato per la ricerca ed il conteggio dei microrganismi.

Di fatto l’operatore tecnico microbiologico riassume in sé due fasi importanti del processo di prova :quella preparativa e quella strumentale. Il Laboratorio , in relazione al personale al quale è affidato il compito di eseguire le prove deve:

• fornire evidenza oggettiva della capacità operativa dell’analista mediante predisposizione diopportuna documentazione che comprovi l’addestramento fornito ;

• sia garantito nel tempo ( monitorato ) il mantenimento della capacità operativa conseguita.

4.2 Il calcolo statistico relativo al conteggio su piastra è fondamentalmente basato sulla distribuzione diprobabilità di Poisson , ovvero viene applicando ai conteggi UFC lo stesso approccio statisticoapplicato al conteggio di dispersioni di particelle attuato in ambito fisico ( es. fibre di amianto, particelleradioattive ecc) .Applicando il modello di Poisson la valutazione della ripetibilità può essere effettuatatenendo presente che la varianza è numericamente uguale alla media dei conteggi effettuati ( nel casodi un solo conteggio al conteggio stesso), e che lo scarto tipo essendo la radice quadrata dellavarianza corrisponde alla radice quadrata della media. Ne consegue anche che lo scarto tipo relativo (coefficiente di variazione), che corrisponde al rapporto tra scarto tipo e media nel caso della distribuzionedi Poisson , è pari all’inverso della radice quadrata della media. Nella figura n.7 sono rappresentate ladistribuzione di probabilità di Poisson e quella di Gauss (o normale), nonché le formule applicabili alladistribuzione di Poisson.

Figura 7

In relazione al diametro delle piastre di Petri il randiametro di circa 100 mm ,è stabilito indicativamente in 3

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( normale)ge possibile di conteggio, max per piastra di00 UFC/piastra. Per piastre di diametro di circa



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50 mm tale limite è proporzionalmente ridotto come rapporto tra le superfici ( vedi fig. 8). Le valutazionisono state effettuate considerando come una “risoluzione ideale “ che corrisponde ad una singolaparticella che occupa una superficie di circa 25 mm2.

Figura 8

Per conteggi ricadenti nel range 15 - 300 UFC/mL è considerato possibile ed accettabile assimilare ladistribuzione di Poisson alla distribuzione di Gauss (normale) perché questo facilita indubbiamente lavalutazione statistica dei conteggi e la definizione del relativo intervallo di fiducia associato.

Sotto al valore di 15 UFC/mL tale semplificazione statistica non è invece consigliato praticarla.

In questo caso si applica esclusivamente la distribuzione di Poisson e quindi , l’intervallo di fiducia inragione delle piastre seminate è ricavato da apposite tabelle che riportano i valori riferibili a taledistribuzione in ragione del livello di probabilità prescelto e del valore (somma) determinato.

Quindi per una valutazione ed accettabilità del dato analitico microbiologico (ripetibilità) a seguito diconteggio delle UFC /piastra dobbiamo considerare la possibilità di conteggi ricadenti in due possibilicampi di misura :1) conteggi fino a circa 15 UFC; 3) conteggi uguali o maggiori di 15 UFC fino a circa 300 UFC ,per piastre di circa 90 -100 mm di diametro.

Per valutare la ripetibilità dell’operatore devono essere fatte effettuare all’operatore almeno dueprove in parallelo sullo stesso campione, applicando lo stesso metodo di prova , in un breve intervallo ditempo . In genere è consigliato non superare i 30-40 minuti come tempo utile per predisporre le piastree porle in incubazione (condizioni di ripetibilità stretta).

4.3 Accettabilità dei conteggi inferiori a 15 UFC /piastra prove in doppio

Se le prove effettuate singolarmente sono inferiori a 15 UFC / piastra , quindi la somma totale dei dueconteggi non supera il numero di 30 UFC si calcola il valore dell’intervallo di fiducia al livello diprobabilità del 95 % ( p=0,95) utilizzando i valori tabellati della distribuzione di Poisson.



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Per effettuare tale verifica può essere utilizzata la tabella A.2 allegata alla norma ISO 7218 :1996 “Microbiology of food and animal feeling stuff. General rules for microbiological examination” 5 che èriporta i dati approssimati all’unità della distribuzione di Poisson.

La tabella è divisa in quattro colonne :• la prima riporta la somma totale delle colonie riscontrate nelle due piastre:• la seconda la media dei microrganismi ovvero la somma divisa per due approssimata al

numero intero.• la terza e la quarta l’intervallo di fiducia al 95 % espresso rispettivamente come valore numerico

e in percentuale , limite minimo e limite massimo dell’intervallo, approssimati al numero intero.

Se i valori riscontrati e sommati singolarmente rientrano nell’intervallo tabulato , ovvero nessuno deidue dati è inferiore al limite minimo o superiore al limite massimo , la ripetibilità dei dati è accettabile inquanto rientra nella dispersione casuale prevista dalla distribuzione di Poisson. Quindi il risultatoanalitico può essere espresso come la media dei due conteggi al quale è associato l’intervallo tabulato.

Esempio :Intervallo di fiducia tabulato

( p= 0,95)UFC

Piastra 1UFC

Piastra 2Somma Media Limite

inferioreLimite

superioreRisultato

6 10 16 8 5 13 Accettabile

4 12 16 8 5 13 Critico ( valutare)

Il valore 4 è inferiore al limite minimo dell’intervallo quindi il criterio di ripetibilità non è rispettato.

4.4 Accettabilità dei conteggi superiore a 15 UFC /piastra prove in doppio

Se su ciascuna delle due capsule di Petri si conteggiano delle UFC superiori a 15. La valutazione delrispetto del limite di ripetibilità viene praticata applicando la seguente formula che tiene conto della approssimazione della distribuzione di Poisson alla distribuzione normale:

Dove : C1 e C2 sono i conteggi effettuati sulle due piastre Kp e il valore sperimentale calcolato del fattore di copertura.

Tale valore deve essere confrontato con quello tabulato riferibile ad una distribuzione normale , chegenera un intervallo di fiducia avente il livello di probabilità p ( prescelto) riferibile ad unadistribuzione normale.Per le prova microbiologiche , se non diversamente indicato, il livello p di accettabilità è stabilito al 95%( p= 0,95) al quale corrisponde in questo caso un valore di Kp = 1,96 ( vedi tabella paragrafo 3). In ragione del livello di probabilità prescelto ( 95 %) il risultato può essere compreso all’interno di dell’intervallo kp<= 1,96 ; compreso nell’intervallo 1,96 < Kp < 2,576 ( p tra il 95 % e il 99 % ) ; oltre Kp>2,576 ( p > 99 %).A questi tre livelli sono associati i criteri di valutazione riportati nella sottostante tabella in relazione alvalore di Kp calcolato sui dati sperimentali di ripetibilità.

5 La norma ISO 7218 :1996 “ Microbiology of food and animal feeling stuff. General rules for microbiological examination”

è stata integrata dalla ISO 7218:2001 - Amendment 1 “ “ Microbiology of food and animal feeling stuff. General rules for microbiologicalexamination”, della quale costituisce parte integrante.

pKCC

CC=

+

−

21

21



L. Ballati16 / 28

piastraUFCn

C m / 112

86 96,1 96,1 IF ±=±=±=

piastraUFCn

C m / 571168 96,1 Cm :inferiore Limite =−=−=

piastraUFCn

C m / 791168 96,1 Cm :superiore Limite =+=+=

Caso Valore calcolato Kp Valutazione del risultato

A Kp < 1,96 I conteggi sono accettabili ed è possibile esprimere il risultatocome media aritmetica delle due prove.

B1,96 < Kp < 2,576 La differenza fra i conteggi è considerata critica e quindi occorre

valutare la situazione prima di esprimere il risultato come mediaaritmetica delle due prove.

CKp > 2,576 La differenza fra i conteggi è considerata anomala e le prove

eseguite non vengono considerate valide. Le prove devono essereripetute.

Nota : I valori 1,96 in genere è approssimato a 2 e il valore 2,576 è approssimato a 2,6.

Esempio :Conteggio

UFC/piastraRisultato UFC/piastra

Caso

C1

UFC

C2

UFC

KpValore

sperimentalecalcolato

Valutazione delrisultato

MediaCm

UFC

Incertezzastimata

( IF) p = 0,95

1 60 75 1,29 Accettabile 68 + 11

2 32 54 2,37 Critico - valutare >1,96 < 2,576

3 48 84 3,13 Anomalo > 2,576

La stima dell’incertezza (IF) da associare al conteggio medio Cm (caso 1 -accettabile) per determinare ilimiti dell’intervallo di confidenza e :

dove : Cm = media aritmetica dei due conteggi ; n = numero di prove replicate.

L’intervallo di confidenza della prova eseguita ( p=0,95) associato al valore Cm per n= 2 è il seguente:

Avendo verificato (caso 1) che i risultati che l’operatore fornisce, a frequenza stabilita, relativi a proveeseguite in doppio rientrano nel limite di ripetibilità ritenuto accettabile, assumiamo che il comportamentodell’operatore sia sotto controllo statistico, e che tale controllo garantisce quindi anche l’affidabilità deirisultati di prova che nella routine sono ottenuti eseguendo una singola replica sul campione, perchécosì è previsto dal metodo o è stato definito dal laboratorio.Nel caso che il conteggio singolo sia inferiore a 15 UFC/piastra i limiti dell’intervallo di confidenza daassociare al risultato di prova si ricavano dalla tabella di Poisson ( p=0,95).



L. Ballati17 / 28

2spχ

21-n ; =νχ p

∑∑∑ −=χ i

i

isp C

C

Cn

2

2

m

n

im

c

cci

sp

2

12)(∑

=

−=χ

21;95,0 −=ν=χ np

Le formule a) e b) sono equivalenti

21-n ; =νχ p

La tabella A.1 allegata alla norma ISO 7218 :1996 riporta i valori dell’intervallo di confidenza per provasingola per conteggi compresi tra 1 e15 UFC /piastra.

Nel caso di conteggio superiore a 15 UFC /piastra la stima dell’incertezza da associare al conteggio

per determinare i limiti di tale intervallo di fiducia è : CIF 96,1±= ; ovvero la formula generaleindicata per le prove in doppio si semplifica in quanto , trattandosi di una sola prova Cm = C e n=1.

4.5 Accettabilità dei conteggi superiore a 15 UFC /piastra per prove replicate da un singolo operatore su uno stesso campione ( minimo 5).

Nel caso che il numero di prove sia superiore a due per verificare che la dispersione dei datisperimentali sia conforme alla distribuzione di Poisson si utilizza una valutazione statistica fondatasul calcolo del chi quadrato sperimentale che viene confrontato con quello

del chi quadrato tabulato ad un determinato livello di probabilità p e per ( n- 1) gradi di libertà.

Nella tabella sono riportati i valori del per 6 gradi di libertà e per i livelli di probabilità p ingenere utilizzati : p=0,95 e p=0,98.

p 1 2 3 4 5 60,95 3,841 5,991 7,815 9,488 11,071 12,5920,99 6,635 9,210 11,345 13,277 15,086 16,812

L’indice di dispersione sperimentale di Poisson è calcolato applicando una delle due formule di seguitoriportate Le formule indicate sono equivalenti ; sono riportate entrambe perché in queste due forme sonogeneralmente indicate nella documentazione scientifica.

χ 2 = Indice di dispersione di Poisson (sperimentale) χ 2 = Indice tabulato sp ( chi - quadrato)

a)

b)

n = numero di piastre inoculate contemporaneamente (repliche) ad un livello di diluizioneCi = valore del conteggio (UFC.) riscontrato nella piastra (iesima)Cm = conteggio medio delle n. piastre (repliche) inoculate.

Effettuando il confronto tra l'indice sperimentale con quello limite tabulato , si possono verificare tre casi :

< =



L. Ballati

Risultato : i conteggi sono accettabili ed è possibile esprimere il risultato come mediadelle n prove replicate.

Risultato : la dispersione tra i conteggi deve essere considerata critica e meritevole diapprofondimento prima di esprimere il risultato come media delle n prove replicate .E’ consigliato verificare l’eventuale presenza di dati anomali con il test di Huber ( mediana).

8 558 96,1 96,1 IF ±≈±=±=

nC m

A) χ 2 sperimentale < χ 2 tabulato sp p=0,95; n-1

B) χ 2 tabulato < χ 2 sperimentale < χ 2 tabulato p=0,95; n-1 sp p=0,99; n-1

C ) χ 2 sperimentale > χ 2 tabulato sp p=0,99; n-1

Esempio :

Numero : 5 conteggi replicati sullo stesso campione (gradi di libertà = 4 )

Caso

Piastran.1

UFC

Piastran.2

UFC

Piastran.3

UFC

Piastran.4

UFC

Piastran.5

UFC

Media

UFC

χ 2

speriment.Calcolatoapplicandola formula b)

χ 2 tabulato p =0,95

v = 4


v = 4Risultato

A 83 78 95 68 100 85 7,863 9,488 13,277 Accettabile 7,863 < 9,488

B1 68 80 86 95 110 88 11,399 9,488 13,277Critico

9,488 < 11,399 <13,277 valutare eventuale

presenza dati anomali testdi Huber

B2 84 98 85 126 91 97 12,302 9,488 13,277

Critico 9,488 < 12,302 <13,277

valutare eventualepresenza dati anomali test

di Huber

C 58 72 93 100 86 83 15,002 9,488 13,277 Anomalo 15,002 >13,277

ripetere la prova

Il caso A è accettabile e quindi possiamo esprimere il risultato come valore medio 85 + 8 ( UFC / piastra) , ovvero associandovi l’incertezza calcolata con la formula già utilizzata nell’esempiorepliche in doppio :

Risultato : la dispersione tra i conteggi deve essere considerata eccessiva e le provereplicate pertanto non sono considerate valide.

18 / 28

UFC/piastra



Il caso C è manifestamente anomalo rispetto ai limiti probabilistici definiti , quindi non è possibileesprimere nessun risultato e occorre ripetere la prova.

Il caso B1 e B2 essendo entrambi critici è consigliato procedere alla verifica di anomalia dei datiu lo.

pca

Cpdm

I

Q“c

N

ep

Ie

C

Il test di Huber è uno dei test più efficienti per eliminare i dati anomali.Per la sua applicazione si procede nel seguente modo :1) Si calcola la mediana( CM ) dei conteggi Ci ordinati in senso crescente.2) Si calcolano le differenze (Di ) tra i singoli conteggi e la mediana (CM).3) Si ordinano le differenze(Di) , in valore assoluto, in senso crescente.4) Si calcola la mediana (DM) delle differenze.5) Si confrontano le differenze Di rispetto a DM applicando la relazione Di <= 4,5 x DM ovvero se ;

valore accettabile valore anomalo

5,4≤

M

i

DD 5,4≥

M

i

DD

tilizzando il test di Huber o della mediana per verificare la presenza di un conteggio anoma

L. Ballati19 / 28

Caso B1 - Applicando il test di Huber alla serie dei dati esemplificati nel caso B1 ( 68-80-86-95 -110 ) èossibile verificare che il criterio di accettabilità è soddisfatto da tutti i conteggi , ovvero nessunonteggio si differenzia in modo netto dagli altri , quindi la prova è da ripetere ponendo maggiorettenzione nella sua esecuzione e non è possibile esprimere nessun risultato.

aso B2 - Applicando il test di Huber alla serie dei dati esemplificati nel caso B2 ( 84-95-80-126-91 ) èossibile verificare che il criterio di accettabilità non è soddisfatto per il conteggio 126 . Infatti laifferenza tra questo conteggio e mediana dei conteggi è Di = 35 e la ediana della differenza conteggi è DM=7.

l rapporto anomalo) dato ( 4,5 essendo 5735

>==M

i

DD

uesto conteggio si differenzia in modo netto dagli altri , può quindi essere considerato anomalo e quindieliminato “ dalla serie dei conteggi. Eliminato il dato si procede ad un ulteriore verifica sui restanti n.4onteggi confrontando Il risultato della nuova elaborazione è di seguito riportato :

umero : 4 conteggi replicati sullo stesso campione caso B2 ( gradi di libertà = 3 )

Caso

Piastran.1

UFC

Piastran.2

UFC

Piastran.3

UFC

Piastran.5

UFC

Media

UFC

χ 2

speriment.Calcolatoapplicandola formula b)


v = 3


v = 3Risultato

B2

Consclusione iastra n. 4

84 98 85 91 90 1,397 7,815 11,345

Accettabile

1,397 <7,815

l risultato della verifica del caso B2 , depurato del dato anomalo, è accettabile e quindi possiamosprimere il risultato come valore medio con associato il proprio intervallo di fiducia m = 90 + 9 ( UFC / piastra).



L. Ballati20 / 28

4.6 Verifica proporzionalità delle diluizioni ( indice di proporzionalità )La verifica della proporzionalità della risposta analitica ( conteggi) effettuati rispetto a due o più piastrePetri seminate in parallelo per ogni livello di diluizione può essere praticata sia per la messa a punto diun metodo di prova , sia per valutare la capacità dell’operatore all’esecuzione corretta di questa fase diprova. La formula statistica applicata ( rif . ISO/TR 13843 :2000 p.to A2 è :

dove C1, C2, C3, ….Cn sono i conteggi totali ottenuti sullo stesso campione ai corrispondenti rapportirelativi di diluizione R1,R2, R3, ….Rn Rn è il livello più basso della serie di diluizioni è posto uguale ad 1.Se ad esempio la serie di diluizioni decimali per tre livelli fosse la seguente : 10-1 ;10-2 ; 10-3 icorrispondenti rapporti di diluizione R corrisponderebbero rispettivamente a : R1=100,R2=10,R3=1.C = Somma totale di tutti i conteggi e R = Somma totale di tutti i rapporti relativi.

Nel caso si volesse , partendo da un campione naturalmente o artificialmente contaminato , ottenerela possibilità di poter effettuare conteggi nel range 15-300 UFC/piastra su oltre 2 livelli è consigliatoutilizzare diluizioni 1:2 ( fattore di diluizione 2) . Per sei diluizioni successive ottenute da un campione (20 ;2 -2; 2-3 ; 2-4 ; 2-8 ; 2-16; 2-32 ) i rispettivi rapporti relativi risultano essere rispettivamente : R1 =32 ; R2=16 R3= 8 R4= 4 R5=2 ; R6 =1.

Il risultato del G 2n-1 sperimentale calcolato ( che viene indicato anche con il simbolo del χ 2

sp) è

confrontato con il valore χ 2n-1 tabulato. Se

221 tabulatonG χ≤− la proporzionalità della diluizione è

rispettata ad un livello di probabilità p=0,95.

Nella normale attività analitica di fatto il tipo di diluizione praticata è quella decimale e pertantoapplicando il fattore di diluizione 10 ( nel range 15-300 ) al massimo può essere indagata laproporzionalità delle diluizioni per 3 livelli successivi, solo se una diluizione (max) consente di effettuareuna lettura al limite di 300 UFC/piastra , la successiva (intermedia) 150 UFC/piastra e quello minimo 15UFC/piastra.

Nper le analisi microbiologiche su i prodotti alimentari la norma ISO 7218 :1996 richiede spe due livellidi diluizione decimale successivi e la semina di due piastre per livello. Utilizzando questo disegnosperimentale nel range 15-300 UFC/piastra è possibile valutare durante l’esecuzione della prova stessala ripetibilità di diluizione dell’operatore e la sua precisione (kp) per ciascun livello.

Esempio :

Livello C1 C2 Kp RisultatoKp <= 1,96 p=0,95

Risultato 22

1 tabulatonG χ≤−

Diluizione 110-2

260 238 0,99 Accettabile

Diluizione 210-3

33 30 0,38 AccettabileAccettabile

Verifica proporzionalità :

910,211561ln561

163ln63

10498ln 49822

12

122

1 =⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡⎟⎠⎞

⎜⎝⎛−⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛+⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛×=== −− GGGn

Dalla tabella del 2χ , per ν= 1 e p=0,95 , si ricava che il valore di 3,841 .



L. Ballati21 / 28

d1

BC1,96

B

1,92 + C

= 1 ⎥⎥

⎦

⎤

⎢⎢

⎣

⎡−δ

∑∑B

d1

BC1,96

B

1,92 + C

= 2⎥⎥

⎦

⎤

⎢⎢

⎣

⎡+δ

∑∑B

Essendo il valore del 21−nG calcolato inferiore a quello tabulato i conteggi sono tra di loro congruenti e

quindi l’operatore ha eseguito correttamente la diluizione indicata dal metodo.

Espressione del risultato :

Per il calcolo del N di microrganismi presenti in un campione analizzato, come media ponderata

( ) ( )dnnvponendodnnv

CN i

2121

1,0B 1,0

+=+

= ∑ BC

N i∑=

Dove : iC∑ somma delle colonie contate su tutte le piastre relative alle due successive diluizioni, almeno una delle quali contiene 15 colonie; V Volume di inoculo su piastra , in mL; n1 n. di piastre inoculate con la prima diluizione;

n2 n. di piastre inoculate con la seconda diluizione; d fattore di diluizione corrispondente alla prima soluzione analizzata

La formula per calcolare l’intervallo di fiducia al 95 % (δ) è la seguente :

Limite inferiore

Limite superiore

Utilizzando i dati dell’esempio ( ) prodotto (mL) /g UFC25.500 0,022561

101

21,0213033238260

2 ==××+

+++= −N

Esprimendo il risultato con due cifre significative si avrà N = 2,6 x 104 UFC/g

Per stimare la validità del risultato e poter darne una interpretazione è necessario determinarel’intervallo di fiducia (δ) al 95 % che caratterizza la distribuzione statistica dei microrganismi nelcampione applicando la formula sopra riportata :

I limiti di fiducia dell’intervallo sono quindi :limite inferiore =δL 2,4 x 104 e limite superiore =δU 2,8 x 104 UFC/g .Nel caso che i limiti dell’intervallo di fiducia venissero espressi in percentuale intorno al valore Ncalcolato sono compresi tra – 7,9 % e + 8,6 % inclusi.

d1

BC1,96

B

1,92 + C

= ⎥⎥

⎦

⎤

⎢⎢

⎣

⎡±δ

∑∑B

ISO 7218 :1996 , p.to 9.3.6.1

( ) 22 1021256

101

2,256196,1

2,292,1

2,2561

×±=×⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡±+=δ −



L. Ballati22 / 28

d1

Ba1,96

B

1,92 + a

= ⎥⎥

⎦

⎤

⎢⎢

⎣

⎡±δ

∑∑B

UFC/mL10)47,923,52(10

1 2,2

1131,96 2,2

1,92 + 2,2

113 = 33- ×±=⎥

⎦

⎤⎢⎣

⎡±δ

Caso conferma dopo identificazione Nel caso che il metodo di prova utilizzato preveda una conferma un determinato numero (A ) di colonie( generalmente non meno di 5) , prelevate da ciascuna piastra è sottoposto ad identificazione.

Dopo identificazione viene calcolato per ogni piastra il numero di microrganismi identificati , (a) usando

la seguente formula : CAba ×= , dove bi è il numero di colonie sicuramente identificate per ciascuna

piastra e Ci è il numero totale di colonie contate precedentemente in ciascuna piastra.

La formula per calcolare il N i microrganismi identificati presenti nel campione di prova come mediaponderata è analoga a quella del conteggio generale sostituendo ∑∑ a conC

( ) ( )B

adnnvponendo

dnnva

N ∑∑ =+=+

= 1,0B 1,0 21

21

Esempio ;

Il conteggio diretto di un prodotto liquido ha dato i seguenti risultati :

Livello C1 C2 Kp RisultatoKp <= 1,96 p=0,95

Diluizione 1 10-3 66 80 1,16 AccettabileDiluizione 2 10-4 4 7

I risultati a seguito di inoculazioni per la prova di conferma , condotte su ciascuna piastra sono diseguito riportati:

Diluizione 1 Diluizione 2Piastra

da 66 UFCPiastra

Da 80UFCPiastra

da 4 UFCPiastra

da 7UFC

Prelevate 8 9 4 5Identificate 6 6 4 4a calcolato 50 53 4 6

( ) mLUdnnv

aN /FC 364.51

102,2113

10 2)0,1(2 1645350

1,0 33-21

=×

=××++++

=+

= −

∑

Il numero di microrganismi trovati nel campione è 5,1 x 104 UFC/mL

La formula per calcolare l’intervallo di fiducia al 95 % (δ) per caratterizzazione la dispersione microbicanel

campione è la stessa riportata sopra sostituendo ∑∑ a conC

I limiti di fiducia dell’intervallo sono quindi :limite inferiore =δL 4,3 x 104 e limite superiore =δU 6,2 x 104 UFC/mL .Nel caso che i limiti dell’intervallo di fiducia venissero espressi in percentuale intorno al valore Ncalcolato sono compresi tra – 16,7 % e + 20,1 % inclusi.



L. Ballati23 / 28

4.7 Valutazione ripetibilità del conteggio di un operatore .

Nella valutazione dell’affidabilità dei un operatore e di quella globale del laboratorio è importanteconoscere quale ripetibilità di conteggio che è in grado di ottenere ogni operatore tecnico.

All’operatore , in ragione del metodo di prova utilizzato, vengono consegnate delle piastre, contenenti ilmicrorganismo da identificare ed enumerare, rese disponibili in laboratorio opportunamente siglate enote al responsabile che ha organizzato la valutazione della ripetibilità del conteggio , ma anonimeper l’operatore.

Ogni prova comporta l’effettuazione di due conteggi da parte dell’operatore , su una stessa piastra intempi diversi e in condizioni di “anonimato” che si rinnovano ad ogni lettura.I risultati sono ricollegati tra loro e gestiti dal responsabile della valutazione che ha operato per renderlianonimi.Per una corretta valutazione statistica dei conteggi dovrebbero essere elaborati i dati ricavati dapiastre opportunamente selezionate , contenenti un numero di colonie (UFC/piastra) tali da coprire ilrange “operativo” del laboratorio.

Dovrebbero essere comunque esclusi dall’elaborazione statistica i dati ottenuti da :• conteggi effettuati su piastre contenenti un numero di colonie eccedenti quantomeno il

limite “fisico” di lettura stabilito considerando la superficie della piastra utilizzata. Ad esempio perpiastre di circa 10 cm di diametro il limite è di 300 UFC.

• conteggi effettuati su piastre con numero di colonie inferiori a 15 UFC .

Per ciascuna prova , è registrato il conteggio effettuato dall’operatore , in doppio ed in momenti diversi,sulla stessa piastra e calcolato lo scarto tipo relativo a ciascuna prova ( iu& ) come rapporto tra lo scartotipo tra i due conteggi ( si) e la loro media (Cmi).

mi

ii C

su =&

La stima della ripetibilità media di conteggio per ogni operatore ( mu& ) è data da :

nu

u im

∑=2&

&

dove : 2iu& = varianza relativa media calcolata per ogni prova

n = numero di prove totali effettuate.

La ripetibilità di conteggio intralaboratorio ovvero lo scarto tipo relativo del laboratorio ( labu& ) , ècalcolata , dopo aver preliminarmente verificato tramite il test F di Fischer , (rapporto tra varianza relativamedia maggiore / varianza relativa minore e confronto tra il fattore F calcolato e quello tabulato ad unlivello di probabilità p = 0,95 e tenuto conto dei gradi di libertà , posti al numeratore e al denominatore,calcolati rispetto alle prove effettuate ), che non esiste una differenza significativa tra operatori , inaccordo con quanto riportato nella ISO/TR 13843 :2000, p.to B.2.2.

Sono indicate due modalità per la stima della ripetibilità di conteggio intralaboratorio definite come :



L. Ballati24 / 28

a) Stima non pesata

calcolata utilizzando la seguente formula :

op

mCmBmAlab n

uuuu .....222 +++=

&&&&

dove : 2mAu& , 2

mBu& , 2mCu& , …. rappresentano la varianza relativa media di ogni operatore e nop =

numero degli operatori valutati

b) Stima pesata

calcolata utilizzando la seguente formula :

nuuu

u iCiBiAlab

.....222 +++= ∑∑∑ &&&

&

dove : ∑ 2iAu& , ∑ 2

iBu& , ∑ 2iCu& …. rappresentano la somma delle varianze relative calcolata per

ogni prova eseguita dagli operatori e in questo caso

n = totale delle prove eseguite dagli operatori valutati.

Qualora la differenza nel numero totale delle prove complessivamente eseguite dai vari operatori valutati siaelevata, questo può riflettersi una differenza nel risultato finale calcolato con le modalità indicate nei p,ti a) e b).

Se il numero dei dati attribuiti a ciascun operatore è di eguale numerosità o comunque la differenza è minima irisultati stimati ,come prima richiamato, si equivalgono .

Occorre peraltro avere presente che anche un limitato numero di prove, pur di numerosità identica, riducel’efficacia discriminante del “test F” di Fischer utilizzato per verificare che le ripetibilità media di conteggiodegli operatori, non siano , significativamente diverse tra loro , essendo i valori di F tabulati, per gradi di libertàbassi, molto elevato.

La ripetibilità di conteggio valutata come scarto tipo relativo nelle condizioni reali ed in particolare se effettuata suterreni colturali non selettivi, può essere anche più alta di quella "ideale" U <=0,02 presa a riferimento.Uno scarto tipo relativo nel conteggio maggiore di 0,1 ( da 5 a10 volte lo scarto tipo relativo alla conteggio di unacoltura pura ) è comunque un segnale che esistono dei problemi o difficoltà nel conteggio da considerare conattenzione.

Esempio : Valutazione capacità di conteggio .Conteggi effettuati in doppio stessa piastra resa anonima ed in tempi diversi da parte dell’ operatore A e dell’ operatore B.Range : 15 -150 UFC /piastraColiformi totali MF - Metodo :APAT IRSA-CNR Met. 7010 /C,Man.29/03:2003 Riepilogo risultati letture::



L. Ballati25 / 28

Esempio valutazione statistica risultati Operatore A

RIPETIBILITA' CONTEGGIO OPERATORE A Rapporto tra varianze RIPETIBILITA' CONTEGGIO OPERATORE B

RIPETIBILITA' CONTEGGIO INTRALABORATORIO

Stima non pesata secondo ISO /TR 13843:2000, p.to B 2.2 Stima pesata secondo ISO /TR 13843:2000, p.to B 2.2 Media quadratica varianze relative medie n.2 operatori Media quadratica varianze n.26 totale letture

4.8 Confronto tra operatori nell’esecuzione stesso metodo . Abilitazione e verifica mantenimento nel tempo dell’abilitazione conseguita.

In un laboratorio microbiologico la necessità di mettere a confronto due serie di dati ( A e B ) può avereorigini e motivazione diverse quali ad esempio :a) Valutare la capacità di un operatore in addestramento all'esecuzione di un metodo di prova , in

confronto ad un operatore esperto preso a riferimento, facendo eseguire contemporaneamente ai dueoperatori A e B , sullo stesso campione, lo stesso metodo di prova e effettuando lo stesso n. repliche.

b) 2) Confrontare la prestazione di un metodo normalizzato di riferimento con un metodo internomesso a punto ed utilizzato dal laboratorio per ricercare ed enumerare un migrorganismo in unadeterminata matrice alimentare o ambientale.

2UU

U2mB

2mA

lab+

=26

UUU

2jB

2jA

lab∑ ∑+

=



L. Ballati26 / 28

p

B

mB

A

mA

mBmA K

nC

nC

CC≤

+

−

nK

CCCC p

mBmA

mBmA ≤+

−

c) Confrontare tra loro due metodi di prova che prevedono modalità di semina diversi per la ricerca edenumerazione di uno stesso microrganismo o di gruppi di microrganismi , esempio semina perinclusione o per strisciamento superficie, in una stessa matrice.

d) Confrontare i risultati ottenuti con due tecniche di prova diverse , esempio semina su piastra efiltrazione su membrana, utilizzate per ricercate ed enumerare lo stesso microrganismo nella stessamatrice;

e) Confrontare gli effetti relativi alle variazioni apportate al metodo normalizzato o internoabitualmente utilizzato quali ad esempio cambiamento nella composizione del terreno colturale,variazione di temperatura di incubazione, cambiamento nel tipo di membrana filtrante, ecc. ecc.

Il criterio statistico utilizzato per valutare se il confronto tra le medie ottenuti da due serie di n. dati diprove microbiologiche ( conteggi) su piastra ricadenti nel range 15-300 UFC / piastra è significativo omeno al 95 % proposto considerando la distribuzione di Poisson , consiste nel verificare che lastima di tale confronto sia <= al Kp ( 1,96) ad un livello di probabilità del 95 % ( p=0,95).

La formula da applicare è la seguente :

dove : CmA e CmB = valori medi delle due serie di contegginA e n B = numero di prove effettuate rispettivamente dall’operatore A e dall’operatore B.

Kp = fattore di copertura tabulato che per un livello di probabilità p= 0,95 è pari a 1,96.

Per semplificare il confronto è opportuno che il numero di prove effettuate per ciascuna serie siano innumero equivalente o comunque non molto diversi ed in numero adeguato.Infatti se la numerosità è equivalente , ovvero nA = nB possibilità di discriminare la differenza tra laformula sopra riportata può essere rappresentata nel seguente modo :

Nella tabella sono riportati i valori calcolati di questo rapporto in funzione del numero di prove

Un numero di prove tra 5 e 10 eseguite in parallelo dovrebbe essere sufficiente a coprire le normaliesigenze di un laboratorio microbiologico.

Un numero di prove replicate inferiore a 5 non consente di valutare efficacemente la significatività delconfronto. E’ opportuno evitare anche di effettuare un numero eccessivo di prove replicate, ricercandoun giusto equilibrio tra i requisiti “statistici” e “ fattore tempo”.E’ opportuno ricordare che tutte le prove replicate , dall' iniziale trattamento del campione fino allasemina in piastra , dovrebbero concludersi in circa 30 – 40 minuti max ; questo allo scopo di preveniree comunque limitare qualsiasi aumento "naturale" del numero dei microrganismi originariamente presentinel campione sottoposto a prova. Per ogni serie di dati deve essere effettuata la verifica di congruità dei dati stimando il χ2 ( chi - quadrato)sperimentale su ciascuna serie , con quello tabulato per p=0,95 con le formula riportata al paragrafo4.5. Nella figura n.9 è riportato l’esito della verifica dell’addestramento di un operatore ( B) all'esecuzione delmetodo di prova (coliformi totali) APAT IRSA -CNR Metodo 7010/C ,Manuale 29/03:2003, utilizzando la



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tecnica MF (membrana filtrante) su un campione di acqua superficiale6 (fiume), in confronto con i risultatiottenuti sullo stesso campione dall’ operatore esperto (A) preso a riferimento e facendo eseguire aciascuno n. 10 repliche.

Figura n.9

Il sistema di valutazione statistico illustrato per abilitare il personale all’esecuzione di una prova altermine del periodo di addestramento è applicabile anche per monitorarne il mantenimento nel tempodell’abilitazione e per sostanziare con prove e dati oggettivi eventuali situazioni che possonopresentarsi in un laboratorio microbiologico come indicato all’inizio di questo paragrafo (vedi p.ti b-c-d-e ).

6 Terreno di isolamento C-EC Agar (Chromogenic E.coli/Coliform Medium). Filtrazione di un volume di 100mL del campione o di una suadiluizione attraverso una membrana di esteri di cellulosa con porosità di 0,45 µm di diametro. La membrana al termine della filtrazione è postasulla superficie del terreno di isolamento ed incubata a 36±1°C per 24+2 ore prima di procedere alla lettura dei risultati. Sono consideratecoliformi totali le colonie di colore rosa cresciute entro le 24±2 ore su tale terreno.



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Riferimenti :• UNI EN ISO IEC 17025 : 2000 “ Requisiti generali per la competenza dei laboratori di prova e di taratura “.

• UNI CEI ENV 13005:2000 “ Guida all’espressione dell’incertezza di misura”.

• UNI ISO 3554-1 :2000 “ Statistica – Vocabolario e simboli. Probabilità e termini statistici generali”.

• UNI ISO 3554-2 :2000 “ Statistica – Vocabolario e simboli. Controllo statistico della qualità”.

• EA 4/10 :2002 “Accreditation for microbiological laboratories”.

• UNI ISO 7667 ; 1987 ” Schema per i metodi di esame microbiologici”.

• FIL /IDF 169:1994 “Controle de la qualità en laboratorie de microbiologie – Evalutation des performances dell’analyste pour le denombrement des colonies “.

• ISO 7218 :1996 “ Microbiology of food and animal feeling stuff. General rules for microbiological examination”• ISO 7218:2001 - Amendment 1 “ “ Microbiology of food and animal feeling stuff. General rules for microbiological examination”.

• UNIEN ISO 6887-1 :2000 Preparazione dei campioni di prova , sospensione iniziale e diluizioni decimali perl’analisi microbiologica . Regole generali per la preparazione della sospensione iniziale e delle diluizioni decimali.

• • ISO/TR 13843:2000 “ Water qualità. Guidance on validation of microbiological methods”.

• UNI 10674 :2002 “Guida generale per le determinazioni microbiologiche”.

• ISO/TR 13843:2000 “ Water qualità. Guidance on validation of microbiological methods”.

• UNI ENV ISO 13843 :2003: “Guida per la validazione di metodi microbiologici “.

• ISO/FDIS 16140 :2002 “ Microbiology of food and animal feeding stuffs- Protocol for validation of alternativemethods “.

• Documentazione corso Unichim Milano :2001 : “Valutazione sull’attendibilità dei risultati e sull’operatività in unlaboratorio di microbiologia”.

• Documentazione corso Unichim Milano :2002 “La qualità nei laboratori di microbiologia secondo la UNI CEI ENISO/IEC 17025 : competenza tecnica degli operatori e qualità dei risultati”.

• ISO/FDIS 16410 :2002 “ Microbiology of food and animal feeling stuff-Protocol for validation of alternative methods.

• Centre metrology and accreditation (Helsinki) Seppo I.Niemela “Uncertainty of quantitative determinations derivedby cultivation of microrganism”.

• • Documentazione corso Unichim Milano :2003 “La qualità nella pratica analitica microbiologica- Criteri di

valutazione della competenza degli operatori e della qualità dei risultati”.

• Manuale e linee guida APAT- IRSA CNR : 2003 in 3 volumi che tratta delle metodologie analitiche per ilcontrollo della qualità delle acque.

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