1 Normative e linee guida per la validazione dei metodi di analisi Giampaolo Tommasi A.C.R.A.F....

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Normative e linee guida per la validazione Normative e linee guida per la validazione dei metodi di analisidei metodi di analisi

Giampaolo TommasiGiampaolo TommasiA.C.R.A.F. S.p.A. Angelini FarmaceuticiA.C.R.A.F. S.p.A. Angelini Farmaceutici

Sviluppo FarmaceuticoSviluppo [email protected]@angelini.it

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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI

IntroduzioneIntroduzione Aspetti normativi:linee guida ICH, FDA, EmeaAspetti normativi:linee guida ICH, FDA, Emea Finalità studi di validazioneFinalità studi di validazione Come sviluppare un metodo analitico HPLC:caso praticoCome sviluppare un metodo analitico HPLC:caso pratico Risultati di una validazioneRisultati di una validazione Convalida analitica e specifiche di prodottoConvalida analitica e specifiche di prodotto Approfondimenti:Approfondimenti:

Stress test - normativeStress test - normative Finalità studi di degradazioneFinalità studi di degradazione Considerazioni generali sulla degradazioneConsiderazioni generali sulla degradazione Fattori che favoriscono la degradazione di un farmacoFattori che favoriscono la degradazione di un farmaco

ConclusioniConclusioni

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Perché validare un metodo di analisiPerché validare un metodo di analisi

Misurare una caratteristica o proprietà di un prodotto

Titolo principio attivo

Contenuto di impurezze

pH di una soluzione (es. collirio)

Stabilire quanto è attendibile la misura ottenuta

VALIDARE = pesare quanto vale VALIDARE = pesare quanto vale

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Normative sulla validazione: FDANormative sulla validazione: FDA

The FDA is responsible for protecting the public health by assuring the safety, efficacy, and security of human and veterinary drugs, biological products, medical devices, our nation’s food supply, cosmetics, and products that emit radiation. The FDA is also responsible for advancing the public health by helping to speed innovations that make medicines and foods more effective, safer, and more affordable; and helping the public get the accurate, science-based information they need to use medicines and foods to improve their health.

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Normative sulla validazione: FDANormative sulla validazione: FDA

Reviewer Guidance - Validation of Chromatographic Methods

Guidance for Industry - Analytical Procedures and Methods Validation - Chemistry, Manufacturing, and Controls Documentation

http://www.fda.gov

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Normative sulla validazione: EmeaNormative sulla validazione: Emea

European Medicines Agency (EMEA) is a decentralised body of the European Union with headquarters in London. Its main responsibility is the protection and promotion of public and animal health, through the evaluation and supervision of medicines for human and veterinary use. The EMEA coordinates the evaluation and supervision of medicinal products throughout the European Union. The Agency brings together the scientific resources of the 25 EU Member States in a network of 42 national competent authorities. It cooperates closely with international partners, reinforcing the EU contribution to global harmonisation.

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CVMP/VICH/590/98-Topic GL1CVMP/VICH/590/98-Topic GL1 >> >> Guidelines on Validation of analytical procedures: Definitions and Terminology

CVMP/VICH/590/98-Topic GL2CVMP/VICH/590/98-Topic GL2 >> >> Guidelines on Validation of analytical procedures: Methodology

Normative sulla validazione: EmeaNormative sulla validazione: Emea

http://www.emea.eu.int

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Normative sulla validazione: ICHNormative sulla validazione: ICH

The International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) is a unique project that brings together the regulatory authorities of Europe, Japan and the United States and experts from the pharmaceutical industry in the three regions to discuss scientific and technical aspects of product registration.

The purpose is to make recommendations on ways to achieve greater harmonisation in the interpretation and application of technical guidelines and requirements for product registration in order to reduce or obviate the need to duplicate the testing carried out during the research and development of new medicines.

The objective of such harmonisation is a more economical use of human, animal and material resources, and the elimination of unnecessary delay in the global development and availability of new medicines whilst maintaining safeguards on quality, safety and efficacy, and regulatory obligations to protect public health

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Normative sulla validazione: ICHNormative sulla validazione: ICH

Q2AQ2A >> >> Text on Validation of Analytical Procedures

Q2BQ2B >> >> Validation of Analytical Procedures: Methodology

http://www.ich.org

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Linea guida ICH Q2ALinea guida ICH Q2A

Identificaz.Identificaz.

-

-

+

-

-

-

-

-

-

Test di validazioneTest di validazione

Precisione

Accuratezza

Specificità

Linearità

Intervallo

Limite di detection (LOD)

Limite di quantificazione

Robustezza

Test di efficienza del sistema

QuantitativaQuantitativa

+

+

+

+

+

-

-

+

+

ImpurezzeImpurezze

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

-

+

-

-

+

-

-

-

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Sviluppo di un metodo di analisi HPLCSviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico: caso pratico

TESTTEST

REPORTREPORT

PIANO DI STUDIOPIANO DI STUDIO

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AttivitàAttività

Produzione di lotti pilotaProduzione di lotti pilota >> >> secondo quanto indicato nel dossier

Transfert methodTransfert method >> >> test statistico

DocumentiDocumenti >> >> emissione di certificato analitico

PRODOTTOPRODOTTO >> >> Gel a base di Diclofenac sodico

SCOPO DELLO STUDIOSCOPO DELLO STUDIO >> >> Trasferimento sito produttivo

DOCUMENTAZIONEDOCUMENTAZIONE >> >> Dossier farmaceutico

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VALUTAZIONE METODO DI ANALISIVALUTAZIONE METODO DI ANALISI

Condizioni analiticheCondizioni analitiche ColonnaColonna: LiChrospher RP Select B

M.Ph.M.Ph. >> 50% MeOH - 50% Tampone fosfato

Conc. DiclofenacConc. Diclofenac >> 0.25 mg/ml >> 0.25 mg/ml

Vol. inj.Vol. inj. >> 20 µl (5µg diclofenac)

Flow rateFlow rate >> 1.7 ml/min

pH pH >> 4.3 circa

>> 282 nm

TemperaturaTemperatura >> 40°C

ttRR = 20,447 min = 20,447 min

= 1.51 (= 1.51 ( = a/b) = a/b)N = 3241N = 3241Width = 0,8467 minWidth = 0,8467 min

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VALUTAZIONE DEI RISULTATI CROMATOGRAFICIVALUTAZIONE DEI RISULTATI CROMATOGRAFICI

Lunghi tempi di ritenzione >> analisi lunghe (tLunghi tempi di ritenzione >> analisi lunghe (tRR = 20,447 min.) = 20,447 min.)

Simmetria picco non ottimale >> problemi integrazione (Simmetria picco non ottimale >> problemi integrazione ( = 1,5) = 1,5)

Bassa efficienza >> rapida usura della colonna (N = 3241)Bassa efficienza >> rapida usura della colonna (N = 3241)

CONCLUSIONICONCLUSIONI

Picchi con la pancia >> analisi problematicaPicchi con la pancia >> analisi problematica

DECISIONEDECISIONE

Rivalidazione metodo di analisiRivalidazione metodo di analisi

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PIANO DI STUDIO PIANO DI STUDIO >> Informazioni>> Informazioni

Cosa misuriamo Cosa misuriamo >> Analisi quantitativa diclofenac >> Analisi quantitativa diclofenac

Come misuriamoCome misuriamo >> Tecnica Cromatografica>> Tecnica Cromatografica

Principi chimico - fisiciPrincipi chimico - fisici >> RP-HPLC / Legge di Lambert - Beer>> RP-HPLC / Legge di Lambert - Beer

Campo di applicazioneCampo di applicazione >> Rilascio lotti (SI)>> Rilascio lotti (SI)>> Studi di stabilità (SI)>> Studi di stabilità (SI)>> Convalida di processo (SI)>> Convalida di processo (SI)>> Cleaning validation (NO)>> Cleaning validation (NO)

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PIANO DI STUDIO PIANO DI STUDIO >> Informazioni>> Informazioni

Chimica sost.esameChimica sost.esame >> Impurezze e prodotti di degradazione>> Impurezze e prodotti di degradazione

Metodi notiMetodi noti >> Diclofenac in collirio>> Diclofenac in collirio

Forma farmaceuticaForma farmaceutica >> Eccipienti / Gel>> Eccipienti / Gel

Preparazione campionePreparazione campione >> Solubilità sostanza in esame>> Solubilità sostanza in esame

Tempo analisi Tempo analisi >> Obiettivo max 10 minuti>> Obiettivo max 10 minuti

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CHIMICA DICLOFENAC SODICOCHIMICA DICLOFENAC SODICO fonte Farmacopea Europeafonte Farmacopea Europea

COONa

NH

ClCl

2-[(2,6-diclorofenil)aminofenil]acetato di sodioDICLOFENAC SODICO

N

O

Cl

Cl

1-(2,6-diclorofenil)-1,3-diidro-2H-indol-2-one

CHO

NH

ClCl

2-[(2,6-diclorofenil)amino]benzaldeide

NH

ClCl

OH

2-[(2,6-diclorofenil)amino]fenilmetanolo

COONa

NH

BrCl

NH

O

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FORMULATO PRODOTTOFORMULATO PRODOTTO fonte Dossier farmaceuticofonte Dossier farmaceutico

FormulatoDiclofenac sodico Diclofenac sodico >> 1 g>> 1 g

Copherol F 1300Copherol F 1300 >> 1 g>> 1 g

Carbopol 980 Carbopol 980 >> 1.50 g>> 1.50 g

Ammoniaca Sol 10%Ammoniaca Sol 10% >> 2.60 g>> 2.60 g

Cetiol VCetiol V >> 0.50 g>> 0.50 g

Phospholipon 80 Phospholipon 80 >> 2.00 g>> 2.00 g

Titriplex III Titriplex III >> 0.04 g>> 0.04 g

Eutanol GEutanol G >> 0.50 g>> 0.50 g

Aroma “Vert de Creme”Aroma “Vert de Creme” >> 0.02 g>> 0.02 g

Alcool Isopropilico g Alcool Isopropilico g >> 20.17g>> 20.17g

Acqua dem.ta Acqua dem.ta >> q.b. a 100 g>> q.b. a 100 g

Analisi

Alto contenuto massa gelificanteAlto contenuto massa gelificante

Alto contenuto massa grassaAlto contenuto massa grassa

Phospholipon 80 >> effetto matricePhospholipon 80 >> effetto matrice

Profumo “Vert de Creme” (mix)Profumo “Vert de Creme” (mix)

Verifiche

Doppia diluizione >> riduzione interf.Doppia diluizione >> riduzione interf.

Intervallo tra 0.2 - 0.6 µg >> no sovracaricoIntervallo tra 0.2 - 0.6 µg >> no sovracarico

Analisi placebo Phospholipon 80 Analisi placebo Phospholipon 80

Analisi spettraleAnalisi spettrale

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Doppia diluizione: Doppia diluizione: verifiche con vari solventiverifiche con vari solventi

IpotesiIpotesi: solvente che aprisse la matrice gelificante (senza solubilizzarla)

ObiettivoObiettivo: estrarre il P.A. senza modificare la sua ionizzazione

SperimentaleSperimentale: Solventi di estrazione >>

MeOHMeOH - ACN - Fase Mobile - Isopropanolo

Prove rispetto al PhospholiponProve rispetto al Phospholipon

IpotesiIpotesi: possibile “effetto matrice”

ObiettivoObiettivo: Verificare possibile interferenza con il Phospholipon

SperimentaleSperimentale:

Campione con Phospholipon >> 102.4%

Campione senza Phospholipon >> 103.7%

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VALUTAZIONE METODI ANALOGHIVALUTAZIONE METODI ANALOGHI

Condizioni analiticheCondizioni analitiche

ColonnaColonna: LiChrosorb RP18

M.Ph.M.Ph. >> 60% MeOH - 40% Tampone fos.to (0.5M) + NaOH 1N

Conc. DiclofenacConc. Diclofenac >> 0.20 mg/ml >> 0.20 mg/ml

Vol. inj.Vol. inj. >> 10 µl (2 µg diclofenac)

Flow rateFlow rate >> 1.0 ml/minpHpH = alcalino (magg. 7,0)(magg. 7,0)

>> 278 nmTemp.Temp. >> 25°C

RIFERIMENTORIFERIMENTO

ttRR = 7,141 min = 7,141 min

= 0.86 (= 0.86 ( = a/b) = a/b)

N = 4480N = 4480Widh = 0,2511 minWidh = 0,2511 min

SAMPLESAMPLEttRR = 8.440 min = 8.440 min

= 1.37 (= 1.37 ( = a/b) = a/b)

N = 1621N = 1621Widh = 0,4933 minWidh = 0,4933 min

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OTTIMIZZAZIONE METODI DI ANALISIOTTIMIZZAZIONE METODI DI ANALISI

Condizioni analiticheCondizioni analitiche

ColonnaColonna: LiChrospher RP Select B

M.Ph.M.Ph. >> 50% ACN - 50% Tampone ac.to + N(Et)3 0.01M

Conc. DiclofenacConc. Diclofenac >> 0.08 mg/ml >> 0.08 mg/ml Vol. inj.Vol. inj. >> 5 µl (0,4 µg diclofenac)Flow rateFlow rate >> 1.0 ml/minpHpH = ( 6,5 circa)( 6,5 circa)

>> 282/(220) nmTemp.Temp. >> 28°C

SAMPLE in MeOHSAMPLE in MeOH

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OTTIMIZZAZIONE METODI DI ANALISI - ValutazioniOTTIMIZZAZIONE METODI DI ANALISI - Valutazioni

Dati cromatograficiDati cromatografici

Tempo ritenzione (tR)

Simmetria ()

Efficienza (N)

Base picco

Metodo originaleMetodo originale

20,447 min.

= 1,51

N = 3241

0,8467 min.

Metodo ottimizzatoMetodo ottimizzato

4,167 min.

= 0,89

N = 9618

0,1 min.

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Validazione di un metodo di analisi HPLCValidazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico: caso pratico

SPECIFICITA’SPECIFICITA’ SCOPO DEL TESTSCOPO DEL TEST: : Misurare la sostanza in esame in presenza di sostanze potenzialmente interferenti

TIPOLOGIE TESTTIPOLOGIE TEST Identificazione Il metodo analitico deve identificare selettivamente l’analitaDosaggio Il metodo analitico deve dosare selettivamente l’analitaPurezza Il metodo analitico deve interagire selettivamente con l’analita

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RANGE E LINEARITA’RANGE E LINEARITA’

100%100%

Risp

osta

Risp

osta

ConcentrazioneConcentrazione100%100%

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Test validazioneTest validazione

Range

Coeff. correlazione

Pendenza

Intercetta

Metodo originaleMetodo originale

4,0 - 6,0 g

0,999

85537

61575

Metodo ottimizzatoMetodo ottimizzato

0,2 - 0,6 g

0,999

22944,37

- 5,13

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Confronto intercetteConfronto intercettetabulato 2.14 >> sperim. 1.10

Confronto pendenzeConfronto pendenzetabulato 2.14 >> sperim. 1.08

Confronto intercetta rettaConfronto intercetta rettastandard con lo zerostandard con lo zerotabulato 2.14 >> sperim. 1.15

Confronto intercetta rettaConfronto intercetta rettaricostituito con lo zeroricostituito con lo zerotabulato 2.14 >> sperim. 1.13

Confronto statistico linearità

-500

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14

Conc mg/ml

Area

Standard

Ricostituitointervallo di validazione

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ACCURATEZZA, PRECISIONE, TEST EFFICIENZAACCURATEZZA, PRECISIONE, TEST EFFICIENZA

ACCURATEZZAACCURATEZZARecupero >> -0.71%Recupero >> -0.71%

PRECISIONEPRECISIONECV% >> 1.01%CV% >> 1.01%

Errore sistematico del metodo di analisi

Errore casuale del metodo di analisi

Test di EfficienzaTest di Efficienza tR >> tra 4.0 e 4.8 min >> tra 0.8 e 1.0 N >> maggiore 8000 Rs >> non indicabile CV% area >> inf. 2.0%

VALIDARE = pesare quanto vale VALIDARE = pesare quanto vale

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CONCLUSIONICONCLUSIONI

pH fase mobilepH fase mobile

Eluizione pH-dipendente % Modificatore organico% Modificatore organico

ACN sostituisce MeOH

TemperaturaTemperaturaDa 40°C a 28°C

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SPECIFICHE: Prodotto vs. ValidazioneSPECIFICHE: Prodotto vs. Validazione

ACCURATEZZAACCURATEZZARecupero >> -0.71%Recupero >> -0.71%

PRECISIONEPRECISIONECV% >> 1.01%CV% >> 1.01%

Specifiche prodottoSpecifiche prodotto

Rilascio lotti >> 95% - 105%

Studi stabilità>> 95% - 105%

95% 100% 105%

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Stress Test >> introduzioneStress Test >> introduzione

Aspetti normativiAspetti normativi Finalità studi di degradazioneFinalità studi di degradazione Considerazioni generali sulla degradazioneConsiderazioni generali sulla degradazione Fattori che favoriscono la degradazione di un farmacoFattori che favoriscono la degradazione di un farmaco

Temperatura / UmiditàTemperatura / Umidità LuceLuce pHpH Agenti ossidantiAgenti ossidanti

ConclusioniConclusioni

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Aspetti normativiAspetti normativi

Stress TestStress Test come voce di glossario [rif. ICH Q1A] come voce di glossario [rif. ICH Q1A]

Stress TestStress Test come parte della linea guida [rif. ICH Q1A_2R] come parte della linea guida [rif. ICH Q1A_2R]

Validazione metodi di analisi “stability indicating” [rif. ICH Q2B]Validazione metodi di analisi “stability indicating” [rif. ICH Q2B]

Qualificazione e quantificazione impurezze [rif. ICH Q3A]Qualificazione e quantificazione impurezze [rif. ICH Q3A]

Studi di stabilità principi attivi noti [rif. EMEA CPMP/QWP/122/02]Studi di stabilità principi attivi noti [rif. EMEA CPMP/QWP/122/02]


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Aspetti normativi alcune considerazioni ….Aspetti normativi alcune considerazioni ….

Numero di lotti da utilizzare nei test di stress >> 1Numero di lotti da utilizzare nei test di stress >> 1

Non è necessario identificare e/o quantificare potenziali impurezzeNon è necessario identificare e/o quantificare potenziali impurezze

Non è necessario effettuare studi cineticiNon è necessario effettuare studi cinetici

I risultati ottenuti possono essere utilizzati come dati di supportoI risultati ottenuti possono essere utilizzati come dati di supporto

Ampia libertà nella conduzione dei testAmpia libertà nella conduzione dei test


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Scopo studi di degradazioneScopo studi di degradazione

Ottenere informazioni dalla degradazione forzata di un P.A.Ottenere informazioni dalla degradazione forzata di un P.A.

Verificare le caratteristiche intrinseche di stabilità di un principio attivo

Mettere in evidenza quali fattori provocano la degradazione del principio attivo

Prevedere accorgimenti necessari nello sviluppo formulativo di un prodotto

Valutare le misure necessarie da adottare al fine di proteggere il prodotto

Sviluppo e convalida della più adatta procedura analitica

Anticipare il comportamento del prodotto finito durante gli studi di stabilità


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Cosa occorre?Cosa occorre?

Piano sperimentale corretto:Piano sperimentale corretto:

Personale qualificatoPersonale qualificato

Conoscenza della chimica organica di degradazione Conoscenze analitiche della sostanza in esame Interpretazione dei risultati

Caratteristiche strutturali della molecola in studio

Durata del piano deve avere carattere predittivo

Tipologia dei test per favorirne la degradazione


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Degradazione: considerazione generaliDegradazione: considerazione generali

MOLECOLAMOLECOLA

DURATADURATA

TESTTEST


36

Degradazione: la molecolaDegradazione: la molecola

Caratteristiche strutturaliCaratteristiche strutturali

Forma farmaceuticaForma farmaceutica

Gruppi funzionali vs principali reazioni di degradazioneGruppi funzionali vs principali reazioni di degradazione

Ampio ventaglio di principi attiviAmpio ventaglio di principi attivi

EccipientiEccipienti

Impurezze presenti in materie primeImpurezze presenti in materie prime


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Degradazione: durata dei testDegradazione: durata dei test

EsempioEsempio: reazione consecutiva di 1° ordine: reazione consecutiva di 1° ordine

P.A.P.A. BB CCk1 k2

Aspetti generaliAspetti generali

Carattere predittivoCarattere predittivoRaggiungere il 10 - 20% di degradazioneRaggiungere il 10 - 20% di degradazione


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P.A.

B

C

0

20

40

60

80

100

120

Tempo

Modello cinetico per reazioni di degradazione consecutive 1°ordine

Degradazione: durata dei testDegradazione: durata dei test


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Tipologia dei testTipologia dei test

Stato SolidoStato Solido::

Esposizione Temperatura-UmiditàEsposizione Temperatura-Umidità

Esposizione LuceEsposizione Luce

Stato LiquidoStato Liquido::

Esposizione LuceEsposizione Luce

Esposizione pHEsposizione pH

Esposizione agenti ossidantiEsposizione agenti ossidanti

Aspetti generaliAspetti generali

Verificare vari fattori ambientaliVerificare vari fattori ambientali

Replicare i processi degradativiReplicare i processi degradativi

Degradazione: caratteristiche testDegradazione: caratteristiche test


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Test >> Temperatura - UmiditàTest >> Temperatura - Umidità


It should include the effect of temperatures (… 50°C - 60°C)… and humidity (75%RH or greater) where appropriate …

Campioni analiticiCampioni analitici

Principi attivi - Miscele (p.a. + eccipienti) - Formulati

Direttamente esposti [rif. Q1A_R2]

Principali processi degradativiPrincipali processi degradativi

Idrolisi - Decarbossilazione - Ossidazione - Pirolisi (?!?)

Polimorfismo


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Durata Durata ?? >> piccola considerazione termodinamica?? >> piccola considerazione termodinamica

Ea Ea 22 kcal 22 kcal mol mol-1-1

Eq. Arrhenius k = A eEq. Arrhenius k = A e-Ea/RT-Ea/RT

T = 60°C T = 60°C T = 25°CT = 25°C

kk(60°C)(60°C)/k/k(25°C) (25°C) 30 30

60 gg; (T= 60°C) 60 gg; (T= 60°C) 4,9 aa; (T=25°C) 4,9 aa; (T=25°C)

P.A.P.A. BB CCk1

k2


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Alcune considerazioni sulla degradazione in fase solidaAlcune considerazioni sulla degradazione in fase solida

Formazione interfaccia solido-liquido (soluzioni sovrasature)

Principio attivo o eccipienti a basso punto di fusione

Eccesso di solventi residui da processi di granulazione

Assorbimento di umidità (sostanze igroscopiche)

Acqua di idratazione


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Esposizione Temperatura - UmiditàEsposizione Temperatura - Umidità

CondizioniCondizioni::

temperatura >>temperatura >> 50° - 60°C50° - 60°Cumidità>>umidità>> 75% - 85% RH75% - 85% RH

DurataDurata:: 60 giorni60 giorni

ControlliControlli:: 0 - 15 - 30 - 45 - 60 giorni0 - 15 - 30 - 45 - 60 giorni

Protocollo di studioProtocollo di studio


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Test >> LuceTest >> Luce Aspetti normativiAspetti normativi

Rif. linea guidaQ1A(R)Rif. linea guidaQ1A(R): It should include the effects … of photolysis on : It should include the effects … of photolysis on the active substance.the active substance.

Rif. linea guida Q1BRif. linea guida Q1B: condizioni sperimentali: condizioni sperimentali

DurataDurata ?? ??

Scopo del testScopo del test >> forzare la degradazione >> forzare la degradazione

Tempo almeno doppio delle condizioni del test di confermaTempo almeno doppio delle condizioni del test di conferma


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Test >> LuceTest >> Luce

P.A.P.A. P.A.*P.A.*h

Fosforescenza/FluorescenzaFosforescenza/Fluorescenza

Emissione caloreEmissione calore

DimerizzazioneDimerizzazione

Prodotti di degradazioneProdotti di degradazionefotoliticifotoliticifotossidazionefotossidazione

FotodegradazioneFotodegradazione

EsempioEsempio >> dimerizzazione >> dimerizzazione

N

N

CH3

O

O

H

H

2h N

N

O

O

H

HCH3

N

N

O

O

H

HCH3


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Test >> LuceTest >> Luce

EsempioEsempio >> prodotti di degradazione - fotolisi >> prodotti di degradazione - fotolisi

EsempioEsempio >> prodotti di degradazione - fotossidazione >> prodotti di degradazione - fotossidazione

Procedono attraverso un intermedio radicalico (INIZIATORE)Procedono attraverso un intermedio radicalico (INIZIATORE)

N

N N

N

NH2

H2N

N

CH3

N

COOH

COOHH

O

N

N N

N

NH2

H2N

CHOhH2N

N

COOH

COOHH

O

hN

N N

N

NH2

H2N

COOH

Metoxarato


47

Esposizione luceEsposizione luce

CondizioniCondizioni - - Stato solidoStato solido Stato liquidoStato liquidoSecondo ICH Q1B (forced degradation)Secondo ICH Q1B (forced degradation)

DurataDurata:: 3 - 10 giorni3 - 10 giorni 3 giorni3 giorni

ControlliControlli:: 0 - 1 - 3 - (7 - 10) giorni0 - 1 - 3 - (7 - 10) giorni 0 - 1 - 3 giorni0 - 1 - 3 giorni



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Test >> pHTest >> pH


……should also evaluate the suscettibility of active substance to should also evaluate the suscettibility of active substance to hydrolysis across a wide range of pH values when in solution or hydrolysis across a wide range of pH values when in solution or suspension suspension …

Campioni analiticiCampioni analitici

Classico schema a tre punti di pH

Principali processi degradativiPrincipali processi degradativi

Idrolisi - degradazioni pH catalizzate


49

Test >> pHTest >> pH Esempio

Processi di degradazione idrolitica che possono essere studiati con Processi di degradazione idrolitica che possono essere studiati con uno schema a tre punti di pHuno schema a tre punti di pH


50


Esempio: Hydrochlorothiazide

NH

NHSO2

Cl

H2NO2S


Andamento degradativo che Andamento degradativo che richiede uno schema di studio a richiede uno schema di studio a più di tre valori di pHpiù di tre valori di pH

51


Esempio: Chlorothiazide

N

NHSO2

Cl

H2NO2S


Interessante caso di processo di Interessante caso di processo di degradazione multiplo strettamente degradazione multiplo strettamente legato ai valori del pHlegato ai valori del pH

52

Esposizione pHEsposizione pH

CondizioniCondizioniAmbiente Acido >> Ambiente Acido >> Soluzione HCl 0,1 MSoluzione HCl 0,1 M

Ambiente Neutro >>Ambiente Neutro >> Sol.Tampone pH ~ 7Sol.Tampone pH ~ 7

Ambiente Alcalino >>Ambiente Alcalino >> Soluzione NaOH 0,1MSoluzione NaOH 0,1M

Temperatura >>Temperatura >> 50°- 60°C50°- 60°C

Conc. P.A. >>Conc. P.A. >> 0,1 – 1,0%0,1 – 1,0%

DurataDurata:: 7 - 14 giorni7 - 14 giorni

ControlliControlli:: 0 - 1 - 3 - (7 - 10 - 14) giorni0 - 1 - 3 - (7 - 10 - 14) giorni

NoteNote ulteriori test in range più definitoulteriori test in range più definito



53

OssidazioniOssidazioni

Aspetti normativi

Rif. linea guidaQ1A(R)Rif. linea guidaQ1A(R): It should include the effects … of oxidation ... on : It should include the effects … of oxidation ... on the active substance.the active substance.

Considerazioni generali

Ossigeno molecolareOssigeno molecolare O O22 >> stato fondamentale tripletto >> stato fondamentale tripletto

Reazioni di ossidazioneReazioni di ossidazione >> procedono via radicalica >> procedono via radicalica

RH + O2 ROO


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Meccanismo di reazione “Autossidazioni”

RH + In R + InH Iniziazione (RIniziazione (Rii))

R• + O2 ROO

ROO + RH ROOH + R Propagazione (KPropagazione (Kpp))

2 ROO Prodotti inerti Terminazione (KTerminazione (Ktt))

d[ROOH]dt

-d[O

dt -

d[RH]dt

= k RH]R2k

2p

i

t

][


55


Uso di iniziatori radicalici

2,2’-azobis( 2-metilpropanonitrile)2,2’-azobis( 2-metilpropanonitrile)[AIBN][AIBN]

N

CH3

CN

H3C N

CH3

CH3

CN


56



CH3

CH3

N N

CH3

CH3

CN CN

CH3

CH3

CN

.2 + N2

CH3

CH3

CN

. + O2 CH3

CH3

CN

O O .

CH3

CH3

CN

O O . RH+ CH3

CH3

CN

O O H + R.

CH3

CH3

CN

O O H CH3

CH3

CN

O . + OH.

R R. .+ R R

R . + R O . R O R

CH3

CH3

CN

O . + R . CH3

CH3

CN

O R

CH3

CH3

CN

O . + CH3

CH3

CN

O O H CH3

CH3

CN

O H + CH3

CH3

CN

O O .

TerminazioniPropagazioni

57


Esempio: Tetrazepam - degradazione

3'

N

NCl

OH3C

N

NCl

O

OOH

H3C

Idroperossido

Epossido

N

NCl

O

O

H3C

Cheton-derivato

N

NCl

O

O

H3C

"Seco"

N

NHCl

O

O

H3C


58


Esempio: Tetrazepam - cromatografia


59


Esempio: Tetrazepam - effetto solvente

SOLVENTESOLVENTE

Acetonitrile

SecoSecoP.A.P.A. ChetoCheto IdropIdrop EpoxEpox

1,9%1,9%65,8%65,8% 11,2%11,2% 8,4%8,4% 2,8%2,8%

Acetonitrile + 20% H2O 1,4%1,4%68,1%68,1% 11,4%11,4% 9,6%9,6% 2,8%2,8%

Metanolo 2,4%2,4%75,2%75,2% 6,6%6,6% 8,3%8,3% 1,8%1,8%

Etanolo 5,2%5,2%84,0%84,0% 1,0%1,0% 6,3%6,3% traccetracce

2-propanolo 4,8%4,8%89,6%89,6% 0,3%0,3% 4,3%4,3% traccetracce


60


Uso di perossido di idrogeno H2O2 >> alcune considerazioni

I risultati devono essere adeguatamente interpretati

Meccanismo di azione ionico

Epossidi e N-ossidi

Esempio: Tetrazepam & Benzidamina HCl

N

NCl

OH3C

N

NCl

OH3C

OH2O2

NN

O

NCH3

CH3

NN

O

NCH3

CH3

OH2O2


61

OssidazioniOssidazioni Uso di ioni di metalli Fe3+ ; Cu2+

Possibili iniziatori

Possono essere presenti in tracce (impurezze di materie prime e confezionamenti)

Prodotti sensibili all’ossidazione

Interpretazione dei risultati

azo-derivati più predittivi

H2O2 predittiva per Epossidi e N-ossidi

Attenzione se il prodotto è sensibile a tutti i test


62


CondizioniCondizioniReagenti >>Reagenti >> Substrato + AIBN (1:1 mol)Substrato + AIBN (1:1 mol)

Substrato + tracce ioni metalli (FeSubstrato + tracce ioni metalli (Fe3+3+ o Cu o Cu2+2+))

Substrato + HSubstrato + H22OO22 (sol. 3%) (sol. 3%)

Solvente >>Solvente >> ACN ( + acqua)ACN ( + acqua)Temperatura >> Temperatura >> 40°C (max)40°C (max)

DurataDurata:: 48 ore48 ore

ControlliControlli:: ogni 24 oreogni 24 ore



63

Conclusioni (1)Conclusioni (1)

Lo stress test è predittivo quando mette in evidenza tutte le impurezze che si possono osservare nella stabilità a lungo termine ed accelerata.

Uno stress test predittivo permette di qualificare un metodo come “stability indicating”.

Un test è predittivo quantitativamente quando permette di anticipare una stabilità critica.


64

Conclusioni (2)Conclusioni (2)

I saggi di degradazione forzata sono semplici, ma devono essere interpretati da esperti.

L’arricchimento delle impurezze nella degradazione forzata ne facilita l’isolamento e la caratterizzazione.

Non è necessario identificare tutte le impurezze osservate nello stress test.


65

Conclusioni (3)Conclusioni (3)La convalida di un metodo analitico comprende i test di

specificità, linearità, accuratezza, precisione, robustezza

A meno di non avere informazioni esaurienti dal produttore, va sempre effettuato un test di stress della materia prima. Inoltre va verificato anche il comportamento del prodotto finito alle comuni condizioni di stress (compatibilità con eccipienti).

Occorre prevedere nel metodo una sezione di calcolo per le impurezze incognite (ICH Q3B(R)).


66

PrecisionePrecisione

La precisione di un metodo analitico esprime la vicinanza (grado di dispersione) tra una serie di misurazioni ottenute da vari campionamenti di un medesimo campione omogeneo secondo le condizioni prescritte.

La precisione può essere considerata a tre livelli: ripetibilità, precisione intermedia, e riproducibilità.

La precisione dovrebbe essere investigata utilizzando un “prodotto finito” omogeneo. Comunque, se non è possibile ottenere un campione omogeneo, può essere investigata usando un campione preparato artificialmente o un campione in soluzione.

La precisione di un metodo analitico è di solito espressa come la varianza, la deviazione standard o il coefficiente di variazione della serie di misurazioni.


Ritorna a linea guida ICH Q2A

67

AccuratezzaAccuratezza

L’accuratezza di un metodo analitico esprime la differenza tra il valore convenzionalmente accettato come vero o come valore di riferimento e quello trovato

Può a volte essere definita “esattezza”



68

SpecificitàSpecificità La specificità è la capacità di valutare inequivocabilmente l’analita in presenza di componenti di cui può

essere prevista la presenza. Tipicamente questi potrebbero includere impurezze, degradati, matrici, etc.

La mancanza di specificità di una singola procedura analitica può essere compensata da altre procedure di sostegno.

Questa definizione ha le seguenti implicazioni:

1. Identificazione: per accertare l’identità di un analita

2. Prove di purezza: per accertarsi che tutte le procedure analitiche effettuate permettano una dichiarazione esatta del contenuto delle impurità di un analita, i.e. prova delle sostanze correlate, metalli pesanti, contenuto dei solventi residui, etc.

3. Analisi (contenuto o efficacia): per fornire un risultato esatto che permette una dichiarazione esatta sul contenuto o sull’efficacia dell’analita in un campione.



69

LinearitàLinearità

La linearità di una procedura analitica è la relativa capacità (all’interno di un certo intervallo) di ottenere dei risultati che sono direttamente proporzionali alla concentrazione dell’analita nel campione.



70

LinearitàLinearità



clA Legge Lambert-Beer

Risp

osta

Risp

osta

ConcentrazioneConcentrazione

cbaA L&B

Generica

Generica

100%100% 100%100%

r

c

cba

cba

''

%

Se a=a’=0 e b=b’:r

c

c

c%

71

Intervallo (range)Intervallo (range)

Il range di un metodo analitico è l’intervallo fra la concentrazione superiore e quella inferiore di analita nel campione (queste concentrazioni comprese) per cui è stato dimostrato che la procedura analitica ha un livello adatto di precisione, di accuratezza e di linearità.



72

Limite di detection (LOD)Limite di detection (LOD)

Il LOD in un metodo analitico è la minima quantità di analita in un campione che può essere rilevata ma non necessariamente essere quantificato come valore esatto.



73

Limite di quantificazione (LOQ)Limite di quantificazione (LOQ)

Il limite di quantificazione di una procedura analitica è la quantità più bassa di analita che può essere determinato quantitativamente in un campione con adatta precisione ed accuratezza.

Il LOQ è un parametro delle analisi quantitative per i bassi livelli di composti in matrici di campioni, ed è usato particolarmente per la determinazione di impurezze e prodotti di degradazione.



74

RobustezzaRobustezza

La robustezza di una procedura analitica è una misura della relativa capacità di rimanere inalterata nonostante piccole intenzionali variazioni dei parametri del metodo e fornisce un’indicazione della relativa affidabilità durante l’uso normale.



75

Test di efficienza del sistemaTest di efficienza del sistema

Il test di efficienza del sistema è parte integrante di molte procedure analitiche. Il test si basa sul concetto che l’apparecchiatura, l’elettronica, le operazioni analitiche ed i campioni da analizzare costituiscono un sistema integrale che può essere valutato come tale. I parametri da stabilire nel test di efficienza del sistema dipendono dal tipo di procedura che si sta convalidando. Per informazioni supplementari vedasi le relative farmacopee.



76

RipetibilitàRipetibilità

La ripetibilità esprime la precisione nelle stesse condizioni di gestione in un breve intervallo di tempo.

La ripetibilità è anche chiamata precisione di intra-analisi


Ritorna a Precisione

77

Precisione intermediaPrecisione intermedia

La precisione intermedia esprime le variazioni di intra-laboratorio : giorni differenti, analisti differenti, attrezzature differenti, etc.



78

RiproducibilitàRiproducibilità

La riproducibilità esprime la precisione fra i laboratori ( studi collaborativi, solitamente applicati alla standardizzazione di metodologie).



1 Normative e linee guida per la validazione dei metodi di analisi Giampaolo Tommasi A.C.R.A.F....

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