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LA VALIDAZIONE DEI METODI INTERNI PER LA RICERCA DI ALLERGENI: approcci per metodiche ELISA e metodiche molecolari

Barbara BERTASI Reparto Controllo Alimenti IZSLER Brescia

I° WORKSHOP ANNUALE CRENARIA 23 Ottobre 2020

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ESPRESSIONE DEL RISULTATO

IDENTIFICAZIONE ALLERGENI

QUALITATIVA QUANTITATIVA

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SISTEMI ELISA

VALIDAZIONE QUALITATIVA

VALIDAZIONE QUANTITATIVA

Come trattiamo un sistema che fornisce un risultato qualitativo sulla base di una misura

quantitativa?

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PARAMETRI DI VALIDAZIONE METODI CHIMICI

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LINEE GUIDA PER LA VALIDAZIONE DEI SISTEMI ELISA

Gruppo di Lavoro Settori Chimici II.ZZ.SS. Linea Guida per la Validazione Intra-laboratorio di Metodi di Prova di Screening in accordo con la Decisione 2002/657/CE – Rev. 1 – 14/02/2008

I metodi di screening, oggetto di validazione secondo questa linea guida, sono utilizzabili solo per definire l’assenza o la sospetta presenza dell’analita/i sotto indagine.

……ma l’approccio utilizzato è quantitativo!

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I parametri che devono essere valutati:

PARAMETRI DI VALIDAZIONE

Specificità

Capacità di rilevazione (CC)

Robustezza Applicabilità

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10 campioni a seduta, 5 bianchi e 5 fortificati. 4 sedute

• test di normalità sui dati • Determinare quindi il segnale (cut-off) relativo al limite di decisione [SCC]

costante numerica (distribuzione t di student a una coda) fissata in funzione dell’errore alfa che si intende accettare (k = 2.33, per errore atteso 1,5% ed n =20

media del segnale dei bianchi (almeno 20)

scarto tipo dei segnali ottenuti dai bianchi (almeno 20)

(falsi positivi) 10%.

errore b (percentuale di falsi negativi) al 5%.

SPECIFICITÀ ED ERRORE

ROBUSTEZZA

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• Anche le prove di robustezza spesso sono già eseguite dai produttori….

Approccio Youden secondo Direttiva 96/23/CE

Identificazione di fattori critici nel metodo Calcolo di:

Recupero medio (n=5)

Deviazione standard (s) Deviazione standard relativa (RSD%)

Effetto del parametro Differenza fra la media dei risultati ottenuti con la modifica e media dei risultati ottenuti nelle condizioni

invariate

Per stabilire se la differenza è significativamente diversa da zero viene applicato il t test

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Quindi…..se abbiamo già….. un LOD dichiarato Prove in matrice Prove di robustezza…..

COSA SI PUO’ VALUTARE IN FASE DI VALIDAZIONE?

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• Approccio «qualitativo» per il LOD (% di repliche positive)

• Verifica del LOD pubblicato

• Valutazione del recupero del materiale di riferimento

• Sensibilità e specificità

• Accordanza e concordanza

PARAMETRI «QUALITATIVI» DA CALCOLARE

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ACCURATEZZA Verifica veri positivi/veri negativi Classificazione corretta dei materiali di riferimento

QUALITATIVI QUANTITATIVI

PROCEDURA VALIDAZIONE METODI SIEROLOGICI

PRECISIONE Accordanza/concordanza QUALITATIVI

PRECISIONE Ripetibilità/riproducibilità QUANTITATIVI

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PROCEDURA VALIDAZIONE METODI PCR OGM

c

c

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CRITERI DI ACCETTABILITA’

QUALITATIVI QUANTITATIVI

ACCORDANZA

PROVE ESEGUITE IN DOPPIO

RIPETIBILITA’

ELISA PCR

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Accred Qual Assur (2010) 15:439-444

Peter-Th. Wilrich. The determination of precision of qualitative measurement methods by interlaboratory experiments

…..eppure è possibile calcolare la ripetibilità anche dei metodi qualitativi…….

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PROCEDURA DI VALIDAZIONE IZSLER

Cosa prevede la procedura interna IZSLER?

VALIDAZIONE/VERIFICA DI PERFORMANCE DEI METODI DI PROVA QUALITATIVI DI BIOLOGIA MOLECOLARE APPLICATI AGLI ALIMENTI, ALLE ACQUE ED AI CAMPIONI AMBIENTALI

Metodi qualitativi

assenza di metodo di riferimento

LOD

% falsi positivi e negativi

Selettività

robustezza

ISO 16140 – ISO 22118

PROCEDURA CONDIVISA DA TRE ISTITUTI IZSLER - IZSVE- IZSTO

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DETERMINAZIONE DEL LOD

Categoria matrice Ceppo 1

L0

L1

L2

L0 = controllo negativo

L1 = concentrazione 1

L2 = concentrazione 2

Replica 1

Replica 2

LOD x 60 ripetizioni x matrice

L ….

L3 = concentrazione ……

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VALUTAZIONE PRELIMINARE DEL LOD

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VALUTAZIONE LOD

DETERMINAZIONE DEI FALSI POSITIVI E FALSI NEGATIVI

Frutta

Mela

Prugna

Mix frutta

10 campioni 5 +

5 -

Contaminazione? Di poco superiore al LOD….

% risultati falsi positivi

numero di campioni falsi negativi

Numero totale risultati negativi (compresi i falsi negativi)

% risultati falsi negativi

numero di campioni falsi positivi

Numero totale risultati positivi (compresi i falsi positivi)

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CATEGORIA 1:

matrice/i

1 matrice 2 matrici 3 matrici campioni atteso Operatore A Operatore A Operatore A Operatore B Operatore B Operatore B falsi positivi A falsi negativi A falsi positivi B falsi negativi B Somma falsi positivi A+B Somma falsi negativi A+B

replica 1 replica 2 risultato replica 1 replica 2 risultato 0 0

1 1 1 1 positivo positivo positivo 0 0

2 2 2 2 positivo positivo positivo 0 0 tot negativi (compresi falsi -) tot positivi (compresi falsi +)

3 3 3 3 positivo positivo positivo 0 0 30 30


5 5 5 5 positivo positivo positivo 0 0 % falsi positivi % falsi negativi

6 6 6 6 positivo positivo positivo 0 0 0 0










16 16 16 16 negativo negativo negativo 0 0















15 15 0 0

15 15

compilazione f oglio in base al n. di matrici

Utilizzare questo schema per inserire i

risultati a seconda del n. di matrici a

disposizione

DETERMINAZIONE FALSI POSITIVI E NEGATIVI

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OGM

ISO 22118:2011 ISO 5725-2 ISO 5725-3

VALIDAZIONE DI METODI QUANTITATIVI PCR

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LAVORO DI COLLABORAZIONE SULLE VALIDAZIONI

STESURA DI PROTOCOLLI COMUNI

CONCLUSIONI

GRAZIE PER

L’ATTENZIONE

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