LA RICERCA SULLA SCLEROSI MULTIPLA · Riprogrammazione epigenetica nella sclerosi multipla...

LA RICERCA SULLASCLEROSI MULTIPLA

Finanziata dallaFondazione Italiana Sclerosi Multipla

2014

A cura diRoberta GuglielminoArea Ricerca scientifica AISM-FISM

Coordinamento editorialeSilvia ZinoArea Comunicazione e Ufficio Stampa AISM

Progetto graficoFrancesca Massa

Copyright 2014Fondazione Italiana Sclerosi Multipla

Fondazione Italiana Sclerosi Multipla - OnlusVia Operai 40 - 16149 GenovaTel. 010 27 13 226Fax 010 27 13 [email protected]

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Pubblicato e distribuito daAssociazione Italiana Sclerosi Multipla - OnlusVia Operai, 40 - 16149 Genova

ISBN 9788871480886

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INDICE / INDEX

INTRODUZIONE / INTRODUCTIONMario A. Battaglia 7

Dalla parte della persona con sclerosi multipla /Stand on the side of the person with MSPaola Zaratin 9

PATOGENESI E FATTORI DI RISCHIO /PATHOGENESIS AND RISK FACTORS

Disanto Giulio 14Caratterizzazione funzionale delle varianti dei geni KIFcoinvolti nella patogenesi della sclerosi multiplaFunctional characterization of KIF genetic variants invol-ved in multiple sclerosis pathogenesis

Marongiu Mara 17Studio del meccanismo funzionale alla base dell’asso-ciazione di CBLB con la sclerosi multiplaStudy of the functional mechanisms underlying the as-sociation of CBLB with multiple sclerosis

Perga Simona 20Analisi delle variazioni di singoli nucleotidi polimorfi inTNFAIP3 associati alla sclerosi multiplaAnalysis of single-nucleotide polimorphisms in TNFAIP3associated with multiple sclerosis

Caiafa Paola 23Riprogrammazione epigenetica nella sclerosi multiplaEpigenetic reprogramming in multiple sclerosis patients

Baldari Cosima 26La proteina adattatrice Rai in differenziamento, attività echemiotassi dei linfociti Th17 e nella patogenesi dellasclerosi multiplaThe Rai adaptor protein in Th17 cell differentiation, effec-tor function and chemotaxis and in the pathogenesis ofmultiple sclerosis

Gran Bruno 30Modulazione dell’equilibrio tra cellule T regolatrici e T hel-per 17 da parte di recettori Toll-like: implicazioni per lasclerosi multiplaToll-like receptors modulate the balance between regu-latory (Treg) and T helper 17 (Th17) cells: implications formultiple sclerosis

Novelli Francesco 33Regolazione interferone-dipendente dei linfocit Th17 eTh22 nella sclerosi multiplaInterferon-dependent regulation of Th17 and Th22 lym-phocytes in multiple sclerosis

Bononi Angela 36Ruolo di proteine mitocondriali nella patogenesi dellasclerosi multiplaInvolvement of mitochondrial proteins in the pathogene-sis of multiple sclerosis

Morara Stefano 39Ruolo protettivo di Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP)nella patogenesi dell’EAEProtective role of Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP)in EAE pathogenesis

Piccio Laura 42Ruolo di TREM-2 nella sclerosi multipla e nel suo modelloanimaleRole of TREM2 in multiple sclerosis and its animal model

Ria Francesco 46Meccanismi molecolari del trasferimento delle informa-zioni ambientali alle cellule T nella patogenesi della EAE:ruolo del TLR2Molecular mechanism transmitting information from en-vironment to encephalitogenic T cells in the pathogenesisof EAE: role of TLR2

Aloisi Francesca 49Analisi dell’infezione con virus di Esptein-Barr e della ri-sposta immunitaria nel fluido cerebrospinale e nel sanguedi pazienti con sclerosi multipla mediante tecniche alta-mente sensibili di PCRAnalysis of Epstein-Barr virus infection and immune re-sponse in the cerebrospinal fluid and blood of patients withmultiple sclerosis using highly sensitive PCR techniques

Chiappetta Giuseppe 52Ricerca di interazioni patogeneticamente rilevanti tra EBVe il retrovirus endogeno della famiglia W MSRV nel cer-vello con sclerosi multiplaSearching for pathogenically relevant interactions betwe-en EBV and MSRV/human endogenous retrovirus-W inthe multiple sclerosis brain

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CLASSIFICAZIONE E DIAGNOSI DELLAMALATTIA / DISEASE CLASSIFICATIONAND DIAGNOSIS

Dolei Antonina 56Studio del retrovirus associato alla sclerosi multipla(MSRV)/HERV-W come marcatore prognostico di pro-gressione e del suo contributo alla patogenesiStudy of multiple sclerosis-associated retrovirus(MSRV)/HERV-W as disease progression marker, and ofits contribution to pathogenesis

Barnaba Vincenzo 60Immuno-attivazione cronica nella sclerosi multiplaChronic immune activation in multiple sclerosis

Cossarizza Andrea 62Polifunzionalità delle cellule iNKT periferiche come markerimmunologico delle diverse forme della sclerosi multiplaPolyfunctionality of peripheral blood iNKT cells as an im-munological marker of different forms of multiple sclerosis

De Stefano Nicola 65Modifiche nell’arco di 10 anni della sostanza bianca e gri-gia cerebrale in pazienti con sclerosi multipla in rapportoalla loro disabilità fisicaTen-year changes in the cerebral white and grey matterof patients with multiple sclerosis and their relevance tophysical disability

Deriu Franca 68Studio neurofisiologico, neuroradiologico e clinico deltronco encefalico in pazienti con sclerosi multiplaNeurophysiologic, neuroimaging and clinical study ofbrainstem in patients with multiple sclerosis

VERSO NUOVI TRATTAMENTI /TOWARDS NEW TREATMENTS

Battistini Luca 72Ruolo delle cellule MAIT nella sclerosi multipla: come laflora intestinale influenza le risposte autoimmuniRole of MAIT cells in multiple sclerosis: how can the gutflora influence autoimmune responses

Riccio Paolo 75Le basi molecolari per un intervento nutrizionale nellasclerosi multiplaThe molecular basis of nutritional intervention in multiplesclerosis

Casazza Simona 79Le cellule mesenchimali staminali influenzano l’ambientemicrogliale? Implicazioni per il trattamento della sclerosimultiplaDo mesenchymal stem cells impact microglia behavior?Implications for the treatment of multiple sclerosis

Saccardi Riccardo 82Valutazione immunologica del midollo osseo in pazientiaffetti da sclerosi multipla severa sottoposti ad autotra-pianto di cellule staminali ematopoieticheImmunological evaluation of bone marrow in severe mul-tiple sclerosis patients undergoing autologous haemato-poietic stem cell transplantation

Abbracchio Maria Pia 85Strategie rimielinizzanti innovative per la sclerosi multipla:focus su GPR17, nuovo recettore coinvolto nel differen-ziamento oligodendrocitarioInnovative re-myelinating strategies for multiple sclerosisvia the exploitment of the new oligodendrocyte receptorGPR17

Palmisano Marilena 89Ruolo delle MAP chinasi p38 nella mielinizzazioneRole of p38 MAP kinases in myelination

Annunziata Pasquale 92Studio degli effetti immunomodulatori di un nuovo can-nabinoide agonista selettivo per il recettore CB2 su cel-lule immunocompetenti nella sclerosi multiplaStudy of immunomodulatory effects of a new cannabi-noid CB2-selective agonist on immunocompetent cellsfrom multiple sclerosis patients

Maccarrone Mauro 94Ruolo del sistema endocannabinoide nel processo neu-rodegenerativo della sclerosi multipla sperimentaleRole of the endocannabinoid system in the neurodege-nerative process of experimental multiple sclerosis

Pedotti Rosetta 98Il sistema delle prokineticine nelle malattie demielinizzantiautoimmuni del sistema nervoso centrale: meccanismipatogenetici e possibili nuovi bersagli di terapia per lasclerosi multiplaThe prokineticin system in autoimmune demyelinating di-sease of the central nervous system: pathogenetic me-chanisms and possible novel target of therapy for humanmultiple sclerosis

COMPENDIO 2014

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Avolio Carlo 102Recettore purinergico P2X7 su monociti di pazienti consclerosi multipla ed effetti degli attuali trattamenti immu-nomodulanti per la malattiaP2X7 purinergic receptor on monocytes of patients withmultiple sclerosis and effects of current immune treat-ments of the disease

Tirassa Paola 105Il nerve growth factor somministrato in forma di collirioin un modello animale di sclerosi multipla: uno studioprospettico sul trattamento durante le fasi precoci dellamalattiaNerve growth factor given as eye drops in the animal mo-del of multiple sclerosis: a prospective study of treatmentin early stage of disease

NEURORIABILITAZIONE E NEUROPLASTICITÀ /NEUROREHABILITATION ANDNEUROPLASTICITY

Marzola Pasquina 109Imaging funzionale nello studio della plasticità neuronalein un modello sperimentale di sclerosi multipla su rattoFunctional MRI to study brain plasticity in an experimen-tal model of MS in rats

Calabresi Paolo 111Uno studio elettrofisiologico dei meccanismi di alterataplasticità sinaptica in modelli sperimentali di sclerosimultiplaAn electrophysiological study of the mechanisms of sy-naptic plasticity impairment in experimental multiple scle-rosis

Tecchio Franca 116Alleviare la fatica nella sclerosi multipla: un intervento constimolazione transcranica in corrente continua (studi Fa-MuSNe e FaReMuS DiCDiT)Fatigue relief in multiple sclerosis by neuromodulation: atranscranial direct current stimulation intervention [FaMu-SNe & FaReMuS DiCDiT]

Tomassini Valentina 120Valutazione dell’immaginazione motoria e degli effetti del-la pratica mentale di un compito motorio in pazienti consclerosi multiplaAssessing motor imagery and the effects of mental prac-tice of a motor task in patients with multiple sclerosis

Basaglia Nino 123Gli effetti della rieducazione robot-assistita sulla funzio-nalità deambulatoria e sull’attivazione delle unità motoriein persone con sclerosi multipla. Uno studio randomiz-zato controllatoThe effects of robot-assisted gait training on locomotorfunction and motor unit firing in multiple sclerosis sub-jects. A randomized control trial

QUALITÀ DELLA VITA / QUALITY OF LIFE

Bassi Marta 127Il sistema della cura: promozione del benessere tra per-sone con sclerosi multipla, caregiver ed operatori sanitari.Uno studio pilotaThe care system: well-being promotion among peoplewith multiple sclerosis, caregivers and health professio-nals. A pilot study

Filippini Graziella 131Integrare le esperienze e le preferenze dei pazienti consclerosi multipla con i risultati della ricerca scientifica persviluppare informazioni sulla salute utili per decisioni in-formate e condiviseIN-DEEP-integrating and deriving evidence, experiences,preferences: developing research-based health informa-tion applicable to decision making and self-managementby people with multiple sclerosis

Solari Alessandra 135Preferenze di ruolo, conoscenza del rischio e decision-making nelle persone con sclerosi multipla (AutoMS)Autonomy preferences, risk knowledge and decision-ma-king performance in multiple sclerosis patients (AutoMS)

PROGETTI DI RICERCA E BORSE DI STUDIOFINANZIATI DALLA FISM /FISM FUNDED RESEARCH PROJECTS AND FELLOWSHIPS

2013, 2012, 2011 140

COMITATO SCIENTIFICO FISM /FISM SCIENTIFIC COMMITTEE

2013, 2012, 2011 151

LISTA DEGLI AUTORI /LIST OF THE AUTHORS 158

INDICE / INDEX

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Questo è stato un lungo anno per la ricerca scientifica, che si è trovata a lungo sotto le luci della pubblicaattenzione. A volte, come ha ricordato Umberto Veronesi, è sembrato che «da una parte ci fosse una

comunità scientifica chiusa nei suoi dogmi e sorda al dolore dei pazienti, dall’altra uno Stato che si occupadei problemi dei malati solo quando appaiono sui media». La ricerca scientifica che AISM indirizza, sostiene e promuove attraverso la propria Fondazione FISM, e chequesto Compendio documenta con esattezza, è la testimonianza che esiste una ricerca rigorosa che noncerca scorciatoie ma trova la via, passo dopo passo, progetto dopo progetto. Senza propinare illusioni,costruisce risposte. Non è distante ma vicina alle domande e ai desideri di vita autentica di tante persone.Perché è una ricerca fatta da persone per altre persone.Lo testimonia, del resto, il fatto che da oltre 25 anni l’Associazione stia formando una vera e propria «scuola»di ricercatori che, iniziando da giovani e restando fedeli negli anni all’appassionante sfida di individuare fi-nalmente le cause e le cure di questa malattia, partono rigorosamente dai bisogni delle persone con SM. AISM, infatti, è da sempre convinta che il primo bisogno, il primo diritto delle persone con SM sia quello disapere che c’è un vasto mondo di ricercatori eccellenti che continuano ad essere coinvolti nella lotta allaSM. Anche per questo, prima in Italia, FISM adotta dal 1986 la peer review come bussola nella scelta deglistudi da sostenere.L’abbondanza dei progetti qui presentati e, soprattutto, la loro alta qualità di risultati è testimoniata dal fattoche nel 2013 ben 140 studi dei ricercatori finanziati dall’Associazione hanno pubblicato i propri studi su au-torevoli riviste scientifiche (+39% rispetto al 2012), con un Impact Factor complessivo del 5,9 %. Tutto ciò rende l’Associazione orgogliosa dei «propri» ricercatori, pur nella consapevolezza che tutti insiemesi possa e si debba sempre fare meglio, da ogni punto di vista. Non è un caso se il Bando FISM 2013 ha raccolto progetti per un totale finanziabile di oltre 10 milioni dieuro, mentre a disposizione ve n’erano solo 3.I 27 progetti di ricerca e le 8 borse di studio selezionate e finanziate con il Bando 2013 coinvolgono 39 lab-oratori in 11 Regioni italiane e 3 all’estero, a testimonianza di un diffuso radicamento nazionale e inter-nazionale della comunità dei ricercatori che si impegnano nel campo della sclerosi multipla. Significativo iltrend dei finanziamenti erogati. Il 28,6% dei progetti finanziati è collocabile nella ricerca di base su fattori di rischio, cause e progressionedella malattia, in coerenza con la storia e la missione della Fondazione di AISM, che a quest’area avevadedicato il 61% dei finanziamenti ancora nel 2011. Ma è in crescita decisa anche il finanziamento per lo sviluppo e validazione di trattamenti neuro-riabilitativie, in generale, ai progetti di ricerca traslazionale (22,9%) e clinica (28,6%, rispetto all’11,7% del 2012) cheindirizzano con vigore all’individuazione di nuovi trattamenti in grado di incidere sull’andamento di malattiae sulla qualità di vita.Come ha scritto la Senatrice Elena Cattaneo «la scienza è un catalizzatore di cambiamenti, un modo di com-portarsi nel mondo».Perché questo accada, l’impegno della ricerca non finisce quando produce risultati importanti e attendibili:a quel punto è necessario che i decisori politici prendano le proprie decisioni sulle politiche socio-sanitarieda perseguire proprio a partire da questi risultati ottenuti con rigore e metodo. Precisamente questo è lo scopo della ricerca che FISM indirizza, promuove e finanzia: cambiare l’oggi e ildomani, raccogliere e vincere con rigore e tenacia le sfide non ancora affrontate; diventare uno strumentodel diritto all’informazione, alla salute, alla vita delle persone con SM; essere protagonista di un’autenticastrategia di «advocacy» e, in ultima analisi, contribuire con decisione alla costruzione di un mondo finalmentelibero dalla sclerosi multipla.

Mario A. BattagliaPresidente FISM

Introduzione

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This has been a long year for scientific research, which has been subjected to public scrutiny for long. At times,as Umberto Veronesi reminds us, it seemed that «on the one hand there was the scientific community hide-

bound within its dogmas and deaf towards the pain of the patients, while on the other hand the State would lookinto the problems of the sick only when the same were taken up by the media».The scientific research that Italian Multiple Sclerosis Society, AISM, directs, supports and promotes through itsFoundation FISM, and is documented precisely by this Compendium, is proof that there exists rigorous researchthat doesn’t look for short-cuts but finds the way, one step after another, one project after another. Without creatingillusions, provides answers. It is not removed from, but is close to the questions and the authentic desire of life ofmany people, because it is research done by people for other people.This is also proven by the fact that since more than 25 years the Society has been forming a «school» of re-searchers, who commence at a young age and stay faithful over the years to the passionate challenge of finallyidentifying the causes and the cures for this disease while they start out strictly based on the needs of peoplewith MS.In fact, AISM, has always been of the firm conviction that the primary need, the primary right of the people withMS is to know that there is a vast number of excellent researchers who remain engaged in the struggle againstMS. Also for this reason, FISM is the first in Italy to have adopted since 1986 peer review as a guide for the se-lection of research studies to support.The large number of projects presented here, and especially the high quality of their results is proven by the factthat in 2013, 140 researchers funded by the Society have published their papers in peer scientific journals (39%more than in 2012), with an overall Impact Factor of 5.9 %.All this is a source of pride for the Society in its «very own» researchers, while at the same time acknowledgingthat all together can and must always do better under every aspect.As a matter of fact, in response to the FISM Call for Applications 2013 the total of the requested funding wasmore than 10 million Euros, while only 3 million Euros were available.The 27 research projects and the 8 fellowships selected and funded with the Call for Applications 2013 involve39 laboratories in 11 Italian Regions and 3 laboratories abroad, providing proof of a large scale national and in-ternational presence of the research community that is committed in the field of multiple sclerosis. The trend ofthe released funding is significant.28.6% of the funded projects can be collocated in basic research on risk factors, causes and the disease pro-gression, in keeping with the history and the mission of the Foundation, which dedicated to this area 61% of thefunding even in 2011.However, the funding for the development and validation of neurorehabilitation treatments is in sustained growthand, generally, to the translational (22.9%) and clinical (28.6%, compared to 11.7% in 2012) research projects,which vigorously directs towards identifying new treatments that are capable of having an impact on the diseaseprogression and on the quality of life.As the Senator Elena Cattaneo has written «science is a catalyst of change, a way to conduct oneself in theworld».For this to happen, the commitment of research does not end when important and reliable results are obtained:at that point it is necessary that the political decision-makers make their decisions regarding the social and healthpolicies to be followed by taking as a starting point these results that were obtained with rigour and method.This is precisely the scope of the research that the FISM directs, promotes and funds: change today and tomorrow,take up and win with rigour and tenacity the challenges that have not been confronted as yet; become the meansof the right to information, health and life for people with MS; be the protagonist of a real «advocacy» strategyand, in the final count, contribute decisively to creating a world that is finally free of multiple sclerosis.

Mario A. BattagliaChairman of Italian MS Foundation

COMPENDIO 2014

Introduction

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La definizione che il vocabolario inglese dà della parola «advocacy» potrebbe essere anche un’efficacedefinizione della «ricerca» che AISM promuove e finanzia attraverso la sua Fondazione: una ricerca rigo-

rosa, eccellente nel suo individuare evidenze che incidono sulla vita e, per questo «schierata» dalla partedelle persone nella loro lotta alla sclerosi multipla.

Quello che AISM promuove è una scienza che sia reale supporto, risposta efficace alle urgenze di chi ha di-ritto di accesso a una ricerca che dia, finalmente, risposte «personalizzate».

Una ricerca, insomma, che diventa il primo strumento di advocacy, il più efficace supporto attivo ad unacausa, alla vittoria delle persone sulla malattia, al trionfo della vita sulla sclerosi multipla.

Poiché la ricerca che cambia la vita inizia proprio dall’ascolto delle persone per cui tenacemente lavora, inquesto 2013, non a caso, l’Associazione ha interpellato nuovamente le persone con SM sui bisogni cui chie-dono risposte per oggi e per domani.

Le stesse persone con sclerosi multipla sono state coinvolte attivamente, per citare un esempio emblema-tico, in un’importante ricerca socio-sanitaria sui costi sociali finanziata dal Ministero per la Salute e presentataall’ultimo Congresso della Società Italiana di Neurologia (“Approccio integrato tra i servizi nella rete di rife-rimento e condivisione di azione interdisciplinare tra operatori di eccellenza in linea con raccomandazionieuropee e linee guida nazionali per la sclerosi multipla come modello di disabilità fisica”).

Così come sono state le stesse persone con SM e i loro familiari il «motore» del Progetto IN-DEEP (Integratingand Deriving Evidence, Experiences and Preferences) che, integrando le esperienze e le preferenze dei pa-zienti con i risultati della ricerca scientifica, ha messo a punto un modello informativo via internet per garantirel’accesso a informazioni chiare, sicure, basate sull’evidenza, utili per decisioni informate e condivise.

Di cosa hanno dunque bisogno le persone con sclerosi multipla? Cosa domandano alla ricerca?

Chiedono sicuramente che vengano identificate con precisione quali sono le varianti genetiche e i fattori dirischio che agiscono nella patogenesi della malattia. Sono ben 13 i progetti conclusi che, in questo Com-pendio, documentano l’impegno continuativo di FISM nel promuovere questo ambito della ricerca di base.Anche il 60% dei nuovi progetti finanziati con il Bando FISM 2013 è legato alla conoscenza dei fattori di ri-schio, delle cause della malattia e della sua progressione.

Le persone con SM, con urgenza maggiore, chiedono alla ricerca una classificazione sempre più precisadella malattia e una diagnosi puntuale, efficace, precoce. Vogliono avere una «fotografia» della singola si-tuazione individuale, dell’evoluzione delle lesioni mieliniche, dello stato della struttura e della funzionalitàdel sistema nervoso, della possibilità di intervenire per prevenire o ritardare la neuro degenerazione e la pro-gressione della disabilità fisica.

La sfida cui le persone con SM chiamano la ricerca, in altri termini, è quella di arrivare a un vero trattamentopersonalizzato, che li accompagni fin dai primi momenti lungo tutto il «viaggio» che dovranno compiere in-sieme alla malattia. In questo ambito si collocano 5 Progetti del Compendio FISM 2014.

Ma alle persone non basta neppure questo, né basta alla ricerca che FISM vuole sostenere: occorre che ogniconoscenza in più sia fortemente indirizzata alla messa a punto di nuovi trattamenti per combattere la malattia.

È proprio nella ricerca di nuovi trattamenti che si collocano diversi dei progetti di punta finanziati da FISM.

Sono qui presentati 11 progetti; anzitutto quelli sulle cellule staminali e quelli di valutazione su pazienti sot-toposti ad autotrapianto di staminali ematopoietiche, campi nei quali i ricercatori italiani sostenuti dall’As-sociazione sono pionieri da oltre dieci anni.

Altrettanto decisivi potranno risultare i progetti che stanno sviluppando strategie volte a riparare la mielina:sarebbe un salto di qualità nel trattamento della malattia e nella prevenzione della neuro degenerazione.

Ugualmente importanti, per migliorare i trattamenti e la qualità della vita con cui si affronta quotidianamentela malattia e le sue conseguenze, potranno rivelarsi gli studi indirizzati all’individuazione di nuovi trattamenti

Dalla parte della persona con sclerosi multipla

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sintomatici o sulla conoscenza delle basi molecolari della nutrizione e sul ruolo della flora intestinale nel pro-cesso infiammatorio alla base della malattia. Sulla malattia incidono anche le ricerche su neuroplasticità eneuroriabilitazione che stanno diventando una delle nuove frontiere, delle caratteristiche distintive della ri-cerca sulla sclerosi multipla, in particolare di quelle finanziate e promosse in tutto il mondo dalle AssociazioniSM. Un campo nel quale AISM attraverso la sua Fondazione è impegnata in prima persona insieme ai ricer-catori di eccellenza italiani. I 5 studi qui presentati sui meccanismi di plasticità sinaptica e quelli che potreb-bero essere presto applicabili sull’immaginazione motoria, sulla rieducazione robot-assistita della funzionalitàdeambulatoria, come anche quelli di stimolazione transcranica per alleviare la fatica sono esemplificativi manon esaustivi dell’importanza che deve assumere questo ambito di ricerca.

Tre progetti qui presentati sono dedicati alla qualità di vita, indirizzati alla valutazione della capacità del «si-stema di cura» di promuovere benessere, al ruolo che i pazienti vogliono assumere nella «presa di decisione»su come curarsi, agli strumenti informativi che devono avere per essere in grado di decidere liberamentecome curarsi nel migliore dei modi.

Oltre ai Progetti finanziati con Bando, qui presentati, FISM ha dedicato altri 3 milioni circa a «Progetti spe-ciali» che promettono di incidere molto sul futuro della conoscenza e del trattamento della SM.

Può essere importante una breve ricognizione tra i temi e i titoli dei «Progetti Speciali».

Dal 2009 la Fondazione finanzia il progetto Immunochip che studia i fattori genetici e di suscettibilità dellasclerosi multipla e che nel 2013 ha portato alla scoperta di 48 nuove varianti genetiche che influenzano il ri-schio di sviluppare la SM.

Dal 2011 FISM sta finanziando due progetti di ricerca triennali: un progetto speciale di «laboratorio delle in-terazioni Axo-gliali» e un progetto in neuroriabilitazione per la messa a punto di «trattamenti attraverso laneurostimolazione centrale e periferica».

Dal 2007 continua il nostro impegno per trasformare la ricerca sulle cellule staminali in terapia e nel 2012FISM ha deciso di sostenere il Progetto MESEMS per una «terapia con cellule staminali mesenchimali».Inoltre, sempre nel 2012, ha promosso due importanti progetti riabilitativi sulla «messa a punto di outcomeper misurare l’efficacia della riabilitazione» e sui «disturbi dell’equilibrio», il Progetto PenSAMI per lo sviluppodi un nuovo modello di cure palliative nella SM, e un progetto di «analisi stakeholder» su come «famiglie epersone con SM affrontano la disabilità».

Anche nel 2013 FISM ha aperto ulteriori frontiere: un primo «Progetto speciale» mira alla costituzione di un«Network Italiano di Neuroimaging (INNI) per l’ottimizzazione dell’utilizzo di tecniche avanzate di RisonanzaMagnetica in pazienti con SM»; un secondo studio intende sviluppare « nuovi modulatori di GPR17, recettorechiave nei processi di rimielinizzazione». Una terza ricerca, infine, si propone di migliorare gli strumenti diclassificazione della SM attraverso l’individuazione di «biomarcatori di diagnosi e prognosi.

Emerge un panorama vasto, complesso, sfidante, di ricerche concluse e ancora in corso d’opera.

Senza dimenticare il Bando sulle forme progressive di SM, citato nelle pagine precedenti, per il quale l’As-sociazione ha giocato un ruolo determinante. La piattaforma di eccellenza della Progressive MS Alliancevuole essere il catalizzatore di questa eccellenza per vincere la sfida di sviluppare una terapia per le formeprogressive. Il valore chiave per un «salto di qualità» nella cura della SM, infatti, è quello dell’«alleanza» trai diversi attori in gioco, perché come intitolava un editoriale di Todd Sherer pubblicato su Nature Medicinenel 2013 «money without collaboration won’t bring cure».

È questo il momento opportuno per accelerare insieme, Associazioni SM, comunità dei ricercatori, pazienti,ma anche organizzazioni finanziatrici, industria, agenzie regolatorie, responsabili politici ai diversi livelli. Ognu-no può, e probabilmente deve, mettere a disposizione la propria eccellenza per trovare finalmente la via versol'accesso ad un trattamento personalizzato per raggiungere un mondo libero dalla sclerosi multipla.

Paola ZaratinDirettore Ricerca Scientifica

COMPENDIO 2014

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The definition that the English dictionary gives for the word «advocacy» may be an effective definition ofthe «research» that Italian Multiple Sclerosis Society promotes and funds through its Foundation: a rig-

orous research, excellent in identifying evidence that makes an impact on life and stand on the side of thepeople struggle against multiple sclerosis.

The science that AISM promotes is a science that it is true support and effective response to the imperativesof those that have the right of access to a research that provides, finally, «personalized» answers.

On the whole, research that becomes the ‘advocacy tool’, the most effective active support to a cause, tothe people victory over the disease, to the triumph of life over multiple sclerosis.

The research, that changes life, starts by listening to the need of people for whom one works diligently. In2013, the Society has once again called upon people with MS to express the needs for which they seekanswers for today and for tomorrow.

To cite a significant example, people with multiple sclerosis have been involved actively in an important re-search on social costs funded by the Ministry of Health and presented at the last Congress of the ItalianSociety of Neurology in 2013.

Just like it was the people with MS and their family members who were the «engine» of the project IN-DEEP (Integrating and Deriving Evidence, Experiences and Preferences) that, by integrating the experiencesand the preferences of the patients with the results of scientific research, has fine-tuned an informationmodel via internet in order to guarantee access to clear, safe, evidence-based, shared information usefulfor making informed decisions.

Thus, what people with multiple sclerosis need? What do they demand to research?

Surely they ask that genetic variations and risk-factors, that have an impact on the pathogenesis of thedisease, are identified with precision. There are 13 completed projects that are presented in this Com-pendium, that document the continuous commitment of FISM in promoting this field of basic research.Also 60% of new projects funded via FISM 2013 Call for Applications is linked to the knowledge of therisk-factors, the causes of the disease and its progression.

The people with MS, with great urgency, ask to research for a classification of the disease that is moreprecise and will allow a punctual, effective and early diagnosis. They want to have a «picture» of their in-dividual situation, of the development of the lesions, of the state of the structure and the functionality ofthe nervous system, of the possibility to intervene in order to avoid or delay the neurodegeneration andthe progression of physical disability.

In other words, people with MS call research for action, to arrive at truly personalized treatments, that standon their side from the beginning along the whole «journey» that they will have to make with the disease. Inthis field 5 Projects of FISM 2014 Compendium are collocated.

But this is not enough for the research that FISM wants to promote: it is needed that every additional knowl-edge be strongly directed towards the fine-tuning of new treatments in order to fight against the disease.

It is precisely in the research for new treatments that various frontline projects funded by FISM are collo-cated.

11 projects are presented here; first of all those on stem cells and those that evaluate patients who haveundergone autologous transplants of hematopoietic cells, fields in which Italian researchers supported bythe Society are pioneers since more than ten years.

The projects that are developing remyelinating strategies might also result to be decisive in the same meas-ure: it would be the next level in quality in treating the disease and in the prevention of neurodegeneration.

The studies, that are aimed at identifying new symptomatic treatments or on the knowledge of the molecularbasis of nutrition and on the role of the intestinal flora in the inflammatory process might also result to beequally important in order to improve treatments and quality of life.

Stand on the side of the person with MS

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Disease life is also impacted by research on neuroplasticity and neurorehabilitation that are becomingone of the newer frontiers, of the distinctive characteristics of research on multiple sclerosis, particularlythose that are funded and promoted in the whole world by MS Societies. A field in which AISM is directlycommitted through its Foundation together with high-quality Italian researchers. The 5 studies on the mech-anism of synaptic plasticity presented here and those that may soon be applicable on motor imagery, onrobot-assisted rehabilitation of the ambulatory function, as also those of transcranial stimulation for relievingfatigue are non-exhaustive examples of the importance that this field of research must achieve.

Three projects presented here are dedicated to the quality of life. These projects aimed at evaluating thecapacity of the «caring systems» to promote wellbeing, the role that patients want to assume in «taking adecision» about how to get treated and the information that they need to have in order to freely decideabout how to get treated in the best manner.

In addition to the Projects funded by the Call for applications and presented here, in 2013 FISM provides3 million to «Special Projects» that promise to greatly affect the future of knowledge and treatment of MS.

A brief overview of the themes and titles of the «Special Projects» it is also important.

Since 2009, the Foundation has been funding the Immunochip project that is studying the genetic and sus-ceptibility factors of multiple sclerosis. In 2013 this project led to the discovery of 48 new genetic variantsthat influence the risk of developing MS.

Since 2011 FISM has been funding two three-year long research projects: a special project of «laboratoryof Axo-glial interactions» and a project in neurorehabilitation for the fine tuning of «symptomatic treatmentthrough central and peripheral neurostimulation».

Since 2007 we have been committed to transform research on stem cells into therapy. In 2012 FISM hasdecided to promote Project MESEMS for a «therapy with mesenchymal stem cells». Other than that, alwaysin 2012 it promoted two important rehabilitation projects on «fine-tuning the outcome for measuring theeffectiveness of rehabilitation» and on «balance disorders», the Project PenSAMI for the development of anew model of palliative care in MS and the project of «stakeholder analysis» on how «families and peoplewith MS confront the disability».

In 2013 FISM has opened other frontiers: a first «Special Project» aims at the establishment of an «ItalianNetwork of Neuroimaging (INNI) for optimizing the use of advanced techniques of magnetic resonance im-aging in patients with MS»; a second study intends to develop «new modulators of GPR17, a key receptorin the process of remyelination». In the end, a third research, proposes to improve the instruments for clas-sification of MS through the identification of «biomarkers of diagnosis and prognosis». A vast, complexscenario of research finding emerges, some concluded and some still in progress.

Without forgetting the Call for Applications on the progressive forms of MS, mentioned in the previouspages, for which the Society played a decisive role. The Progressive MS Alliance excellence platform aimsto be the catalyst of this high quality in order to win the challenge of developing a therapy for progressiveforms. The key to achieving the «next level in quality» in curing MS, is in fact an «alliance» between thevarious parties involved, because as in the title of an editorial of Todd Sherer published in Nature Medicinein 2013 «money without collaboration won’t bring cure».

This is the right moment to speed up together, MS Societies, the research community, patients, but alsofunding organisations, industry, regulatory agencies, and political decision makers, each for their part, atdifferent levels. Everyone can, and probably must, make available their own excellence to have finally ac-cess to a personalized treatment to achieve freedom from MS.

Paola Zaratin

Director of Scientific Research

COMPENDIO 2014

PATOGENESI EFATTORI DI RISCHIO

PREMESSE E OBIETTIVIIl decorso clinico della sclerosi multipla (SM) puòvariare da una condizione quasi impercettibile (SMbenigna) a casi in cui la malattia progredisce moltovelocemente (SM maligna). C’è ragione di ritenereche la genetica svolga un ruolo non solo nel deter-minare il rischio di SM ma anche il suo decorso cli-nico. L’obiettivo originale di questo studio è statoquello di identificare il potenziale ruolo svolto dauna famiglia di geni chiamati KIF (importanti per iltrasporto di mitocondri e vescicole sinaptiche neineuroni) nell’influenzare il decorso clinico della SM.È ormai stabilito che sia i geni che l’ambiente de-terminano l’insorgenza della SM. Per esempio, èstato visto che più di 100 varianti genetiche, comeanche la deficienza di vitamina D (VD) e l’infezioneda virus di Epstein-Barr (EBV) aumentano il rischiodi SM. Per questo, abbiamo anche deciso di stu-diare il ruolo svolto da fattori genetici e ambientalinel causare la SM.

RISULTATIAbbiamo sequenziato 4 geni KIF (KIF1B, KIF5A,KIF21B e KIFAP3) in un elevato numero di pazienticon SM benigna, SM maligna e controlli senza SM.Abbiamo trovato la presenza di varianti genetichecon potenziali effetti negativi sulle proteine KIF neipazienti con SM maligna ma non in quelli con SMbenigna e controlli. Abbiamo tentato di replicarequesti risultati in un gruppo separato di pazienti conSM, ma purtroppo non è stato possibile raccoglierenuovi campioni e abbiamo dovuto momentanea-mente interrompere questo progetto.Ci siamo quindi concentrati sul ruolo di geni e am-biente nel determinare l’insorgenza della SM. Ab-biamo raccolto tutti gli studi sulla frequenzad’infezione da EBV in pazienti SM e controlli sani eabbiamo visto che la frequenza di quest’infezioneaumenta con la latitudine. Questo è importante per-

ché più si vive lontano dall’equatore e più è elevatala probabilità di avere bassi livelli di VD. Studi re-centi hanno suggerito che la VD può influenzare ilcontrollo di infezioni virali. Abbiamo quindi decisodi studiare il rapporto tra VD e EBV e osservato cheil trattamento con elevate dosi di VD diminuisce si-gnificativamente i livelli di anticorpi contro EBV neipazienti con SM.Abbiamo poi studiato la relazione tra varianti gene-tiche che influenzano il rischio di SM (varianti SM) elo stato della cromatina in più di 100 tipi di cellule.La cromatina può essere definita come la combina-zione di DNA e proteine nel nucleo cellulare e la suaconformazione determina quali regioni di DNA sonoattive e quali inattive in ciascun tipo di cellula. Ab-biamo integrato i dati sulle varianti SM e lo statodella cromatina e abbiamo visto che le varianti SMsono localizzate in regioni di DNA attive nelle celluledel sistema immunitario ed in particolare linfociti TCD4+, T CD8+ e B.La deficienza di VD rappresenta un fattore di rischioper la SM, ma i meccanismi responsabili per questaassociazione non sono chiari. Abbiamo studiato larelazione tra il recettore della VD (VDR) e gli statidella cromatina in cellule del sistema immunitario eosservato che il VDR si lega in regioni attive di DNAe che questo accade anche in prossimità delle va-rianti SM.

CONCLUSIONIVarianti genetiche nei geni KIF sembrano avere unruolo nel determinare il decorso clinico della SM.Questo suggerisce che la suscettibilità dei neuronialla perdita di mielina che caratterizza la SM potreb-be influenzare la severità della malattia. Questi risul-tati sono però ancora preliminari e devono essereconfermati in un gruppo separato di pazienti con SM.Abbiamo visto come la frequenza dell’infezione daEBV aumenti con l’aumentare della latitudine e co-

Caratterizzazione funzionale delle varianti dei geni KIFcoinvolti nella patogenesi della sclerosi multipla

COMPENDIO 2014

Giulio, DisantoDepartment of Neurology, Wellcome Trust Centre for Human Genetics, University of Oxford, UK

MENTORE: George Ebers and Sreeram Ramagopalan

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me il trattamento con VD sia in grado di influenzarela risposta immunitaria contro questo virus. Questirisultati suggeriscono la possibile presenza di un le-game causale tra VD e EBV nella insorgenza dellaSM. Abbiamo poi usato dati di cromatina presi dapiù di 100 tipi di cellule per scoprire quali di questisono alla base della SM. I risultati ottenuti dimostra-no la natura immunitaria della SM e l’importanza diparticolari popolazioni cellulari come linfociti TCD4+, T CD8+ e B. Infine, abbiamo visto come ilVDR si lega in regioni di DNA attive in cellule del si-stema immunitario e vicino alle varianti SM. Questo

suggerisce che i ruoli svolti dalla VD e dalle variantiSM convergono nell’influenzare l’attività dei genicoinvolti nell’anomala risposta immunitaria che ca-ratterizza la SM.Non è chiaro come questi risultati influenzeranno lavita delle persone con SM. Ma l’identificazione deitipi cellulari alla base dell’insorgenza della SM è im-portante per lo sviluppo di terapie sempre più mi-rate ed efficaci. Inoltre, lo studio dei meccanismiattraverso cui i fattori ambientali agiscono sul siste-ma immunitario è necessario per organizzare stra-tegie di prevenzione della malattia.

INTRODUCTION AND AIMSThe clinical outcome of multiple sclerosis (MS)varies from a barely perceptible lifelong disease tomortality within a year of disease onset. These twophenotypic extremes are thought to be benign andmalignant forms of MS. There is reason to believethat genes may not only play a role in MS suscep-tibility, but also in clinical outcome. The original aimof this project was to characterize the potential roleof KIF genes (a family of genes involved in axonaltransport of mitochondria and synaptic vesicles) ininfluencing the clinical outcome of MS.It is now established that both genes and environ-ment underlie MS aetiology. For example, studieshave shown that more than 100 genetic variants aswell as vitamin D (VD) deficiency and past Epstein-Barr virus (EBV) infection increase the risk of devel-oping MS. Therefore, in addition to the role playedby KIF genes in clinical outcome, we aimed to elu-cidate the role of genetic and environmental factorsinfluencing susceptibility to MS.

RESULTSWe sequenced kinesin family genes (KIF1B, KIF5A,KIF21B and KIFAP3) in a large number of benignMS, malignant MS and healthy individuals. At leastone genetic variant with a likely functional effectwas observed in the malignant samples but not inbenign patients or controls. We aimed to replicatethese results in a new separate cohort of MS pa-tients and controls. Unfortunately, it has not been

possible to obtain new DNA samples and we hadto temporarily suspend this part of the project.We therefore focused on the role played by geneticsand environment in determining the onset of MS.We performed a meta-analysis of studies investi-gating the frequency of EBV infection in MS patientsand controls and found that the frequency of EBVinfection increases with increasing latitude. This isimportant because living at northern latitudes is amajor determinant of vitamin D (VD) deficiency,which also increases MS risk later in life. Recent da-ta suggests that VD may influence the control ofpersistent infections. Therefore, we investigatedwhether high dose VD supplementation had any ef-fect on the humoral response against EBV in MSpatients. VD supplementation considerably de-creased antibody levels against EBV.We then studied the relation between genetic vari-ants influencing the risk of MS (MS variants) andchromatin states across more than 100 different celltypes. Chromatin can be defined as the combina-tion of protein and DNA within the nucleus of a celland its conformation determines whether a specificregion of DNA is active or inactive in a particular celltype. By integrating MS variants and cell specificchromatin profiles, we found that MS variants werelocated within regions of the genome specificallyactive in immune cell types and in particular CD4+

T, CD8+ T and B cells.As mentioned above, VD deficiency represents arisk factor for MS, but the molecular mechanisms

Functional characterization of KIF genetic variants involvedin multiple sclerosis pathogenesis

PATOGENESI E FATTORI DI RISCHIO

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behind this association remain elusive. We investi-gated the relationship between vitamin D receptor(VDR) binding and chromatin states in immune celltypes. We found that the VDR binds to active chro-matin states in immune cell types and that this hap-pens near MS variants more than expected bychance.

CONCLUSIONSGenetic variation within KIF genes appears to influ-ence the clinical outcome of MS. This suggests thatneuronal susceptibility to demyelination may be animportant factor determining how severe the dis-ease will be. However, these results are still prelim-inary and require confirmation in a separate groupof MS patients.We observed that the frequency of EBV infection ispositively associated with latitude and we demon-strated that vitamin D supplementation results in adecreased production of antibodies against thisvirus. These results support the presence of a cas-

cade linking these two environmental agents in thecausal model of MS. We used chromatin data acrossmore than 100 cell types to define which ones drivethe onset of MS. We found a prominent role playedby immune cell types and in particular CD4+ T, CD8+

T and B cells. Finally, we observed that a very largeproportion of VDR binding in immune cells localizesto active DNA and that this is particularly evidentnear genetic variants influencing MS risk. These find-ings indicate how the roles played by VD and by MSassociated genetic variants converge into the regu-lation of the same genes that likely drive the abnor-mal immune response in MS.It is still unclear how these results will influence thelife of MS patients. However, the identification of thecell types driving MS aetiology will be relevant forthe development of strategies of targeted treat-ment. Furthermore, elucidating how environmentalagents such as VD and EBV infection act in MS willprovide the rationale behind the development ofstrategies of disease prevention.

PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI

Disanto G, Sandve GK, Ricigliano VA, Pakpoor J, Berlanga-Taylor AJ, et al. DNase hypersensitive sites and association with multiple sclerosis. Hum MolGenet. 2014 Feb 15;23(4):942-8. doi: 10.1093/hmg/ddt489.

Disanto G, Pakpoor J, Morahan JM, Hall C, Meier UC, et al. Epstein-Barr virus, latitude and multiple sclerosis.Mult Scler 2013;19: 362-365.

Disanto G, Handel AE, Damoiseaux J, Hupperts R, Giovannoni G, et al. Vitamin D supplementation and antibodies against the Epstein-Barr virus inmultiple sclerosis patients. Mult Scler. 2013 Oct;19(12):1679-80. doi: 10.1177/1352458513494494.

Disanto G, Watson CT, Meier UC, Ebers GC, Giovannoni G, Ramagopalan SV Month of birth and thymic output.JAMA Neurology 2013; 70: 527-528

Disanto G, Hall C, Lucas R, et al. Assessing interactions between HLA-DRB1*15 and infectious mononucleosis on the risk of multiple sclerosis.Mult Scler. 2013 Sep;19(10):1355-8. doi: 10.1177/1352458513477231

Disanto G, Ramagopalan SV (2013) On the sex ratio of multiple sclerosis.Mult Scler. 2013 Jan;19(1):3-4. doi: 10.1177/1352458512447594.

Disanto G, Morahan JM, Barnett MH, Giovannoni G, Ramagopalan SV The evidence for a role of B cells in multiple sclerosis.Neurology 2012; 78: 823-832.

Disanto G, Sandve GK, Berlanga-Taylor AJ, Morahan JM, Dobson R, et al. Genomic regions associated with multiple sclerosis are active in B cells.PLoS One 2012; 7: e32281.

Disanto G, Sandve GK, Berlanga-Taylor AJ, Ragnedda G, Morahan JM, et al. Vitamin D receptor binding, chromatin states and association with multiplesclerosis. Hum Mol Genet 2012; 21: 3575-3586.

Ragnedda G, Disanto G, Giovannoni G, Ebers GC, Sotgiu S, et al. Protein-protein interaction analysis highlights additional loci of interest for multiplesclerosis. PLoS One 2012; 7: e46730.

Disanto G, Ramagopalan SV Multiple sclerosis and co-morbid autoimmune disease: the final nail in the coffin?Mult Scler 2012; 18: 1370-1371

Disanto G, Morahan JM, Ramagopalan SV (2012) Multiple sclerosis: risk factors and their interactions.CNS & Neurological Disorders Drug Targets 2012;11: 545-555

Borsa di studio finanziata con il Bando 2010 per il periodo di 2 anni e l’ammontare di 20.700 €

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COMPENDIO 2014

PREMESSE E OBIETTIVILa sclerosi multipla (SM) è una grave patologia mul-tifattoriale che interessa il sistema nervoso centrale(SNC). È caratterizzata da perdita di mielina, infiam-mazione cronica e disfunzione neurologica progres-siva. Nelle popolazioni Europee, la SM è una causacomune di disabilità neurologica nei giovani adulti.Recentemente il nostro gruppo di ricerca ha effet-tuato uno studio di associazione genetica su tuttoil genoma (GWAS) nella popolazione sarda (studiocaso/controllo) e ha identificato un’associazione trala SM e diversi SNPs (polimorfismi a singolo nu-cleotide) posizionati nel gene CBLB. L’associazionepiù forte identificata è quella con lo SNP rs9657904(p=1.60x10-10), posizionato nel primo introne delgene. Un secondo SNP, ovvero rs7649466, ha mo-strato un grado di associazione simile a quello delrs9657904, e si trova nella regione non tradotta al5’ del gene, (Sanna et al., 2010).CBLB, che codifica per una proteina della famigliaRING delle ubiquitin ligasi E3, agisce come regola-tore negativo di molti recettori tirosin chinasici e piùin generale dell’attivazione delle cellule T. Il funzio-namento alterato del CBLB è implicato nell’ autoim-munità.Il razionale della ricerca è quello di analizzare il ruolodegli SNPs rs9657904 e rs7649466 trovati associaticon SM, attraverso la caratterizzazione funzionaledella regione genomica che li comprende entrambi,valutando, inoltre, gli aplotipi protettivo (Hap1) epredisponente (Hap2).

RISULTATIQuesto progetto è stato finanziato come studio pi-lota. Abbiamo analizzato in vitro una regione geno-mica di 1.9kb, contenente gli SNPs rs9657904 ers7649466, considerando gli aplotipi protettivo

(Hap1) e predisponente (Hap2). Per caratterizzare ilruolo funzionale di questi SNPs, la regione di 1.9kbe diversi frammenti di delezione derivati da essa so-no stati inseriti in plasmidi necessari per eseguiresaggi reporter basati sulla luciferasi, effettuati in cel-lule Saos-2 e Jurkat che esprimono endogenamen-te il CBLB. Questi saggi hanno rivelato cha laregione di 1.9 kb ha diverse attività regolatorie di-pendenti dall’aplotipo. In particolare i risultati sup-portano l’ipotesi che le regioni che comprendonors7649466 e rs9657904 abbiano rispettivamente at-tività promotrice e silenziatrice.La nostra ipotesi di partenza era che l’aplotipo dipredisposizione Hap2 fosse associato con una di-minuzione dell’espressione di CBLB, quindi conuna riduzione del controllo negativo sull’infiamma-zione. Malgrado studi di espressione in cellule T pri-marie selezionate in base ai diversi aplotipi Hap1 eHap2 (effettuati dal nostro gruppo nell’ambito di unaltro progetto assegnato dalla FISM al prof. Fran-cesco Cucca) supportino questa ipotesi, i nostri ri-sultati in vitro sono discordanti, con Hap2 associatoad un aumento dell’espressione del gene reporter,che corrisponderebbe all’aumento dell’espressionedel gene CBLB in cellule primarie con medesimoaplotipo.Questa discordanza rimane ancora da chiarire. Lepossibili spiegazioni che proponiamo riguardano ilimiti degli studi in vitro, della grandezza della regio-ne genomica considerata e/o il tipo di linee cellulariutilizzate. Per superare questi limiti ripeteremo gliesperimenti di luciferasi in cellule T primarie, e rifi-niremo l’associazione genetica alla ricerca di even-tuali nuove varianti associate.Attraverso studi in silico abbiamo individuato poten-ziali siti di legame per la vitamina D nella regionepromotrice. Abbiamo quindi eseguito esperimenti di

Studio del meccanismo funzionale alla base dell’associazionedi CBLB con la sclerosi multipla

Mara MarongiuIstituto di Ricerca Genetica e Biomedica (IRGB), CNR, Monserrato (CA)

COLLABORATORI:Angela Loi, Loredana Porcu, Francesca Crobu, Isadora Asunis, Laura Crisponi,Francesco Cucca

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induzione con la vitamina D in vitro, su cellule tra-sfettate con vettori contenenti la regione interessata,posizionata a monte del gene reporter per la lucife-rasi. Questi studi suggeriscono che l’espressione delCBLB possa essere indotta con la vitamina D, masono necessari ulteriori studi per identificare esatta-mente i siti di legame.Gli obiettivi principali dello studio pilota sono statiraggiunti malgrado l’analisi per chiarire la funzionedelle regioni regolatrici identificate, e il loro ruolonella SM rimanga da completare. I nostri risultatisupportano il proseguimento della ricerca, che po-trà portare ad una migliore comprensione del ruolodi CBLB nella SM.

CONCLUSIONIIl CBLB è un regolatore negativo dell’infiammazione,

e il suo ruolo è considerato importante sia nelle pa-tologie autoimmuni che nella protezione dai tumori.L’associazione genetica del CBLB con la SM, èsupportata dal suo ruolo ben noto nel controllo del-le risposte immuni. Malgrado le varianti associatecon la SM siano localizzate nelle regioni di controlloputative del CBLB, il meccanismo esatto che sot-tende la loro funzione non è stato ancora chiarito.Dimostrare le associazioni causative con la malattianon è semplice, perché le associazioni derivanti dastudi GWAS solitamente sono caratterizzate da ef-fetti funzionali deboli. Sono tuttavia necessarie evi-denze funzionali che chiariscano i meccanismimolecolari alla base dell’associazione genetica edella patofisiologia della SM, al fine di rendere pos-sibile lo sviluppo dei trattamenti farmacologici, cherappresentano il nostro obiettivo finale.

INTRODUCTION AND AIMSMultiple sclerosis (MS) is a common and severemultifactorial disorder affecting central nervous sys-tem (CNS) and it is characterized by myelin loss,chronic inflammation and progressive neurologicaldysfunction. In Europeans MS is a common causeof neurological disability in young adults.Recently our research group carried out a GenomeWide Association Study (GWAS) in the Sardinianpopulation (case/control study) and found geneticassociations between MS and several SNPs (singlenucleotide polymorphisms) located within the CBLBgene. The strongest association was withrs9657904 (p=1.60x10-10), located within the intron1 of the CBLB gene. A second SNP rs7649466, lo-cated in the 5’UTR region, showed a degree of as-sociation similar to that of rs9657904 (Sanna et al.,2010).CBLB encodes a protein that belongs to the RING-family E3 ubiquitin ligases acting as negative regu-lator of many receptor tyrosine kinases. CBLB hasbeen recently highlighted as a negative regulator ofT-cell activation and its dysfunction usually resultsin autoimmunity.The rationale of this study is to analyze the func-tional role of the SNPs rs9657904 and rs7649466

found associated to MS, by the characterization ofthe putative regulatory role of the genomic regionharboring both SNPs, and of their relationship withMS considering the protecting (Hap 1) and predis-posing (Hap 2) haplotypes.

RESULTSThis project was supported as a pilot study. We an-alyzed in vitro a 1.9 kb genomic region containingSNPs rs9657904 and rs7649466, taking into ac-count the protecting (Hap 1) and the predisposing(Hap 2) haplotypes. To characterize the functionalrole of these SNPs, the 1.9 kb region as well as sev-eral derived deletion fragments were inserted intoplasmids necessary to perform luciferase reporterassays in Saos-2 and Jurkat cell lines, that expressendogenously CBLB. These assays revealed thatthe 1.9 kb region shows differential transcriptionalregulatory activity, haplotype-dependent. In partic-ular the results suggest that the regions encompass-ing rs7649466 and rs9657904 have respectivelypromoter and silencer activity.Our starting hypothesis was that the predisposinghaplotype (Hap 2) would have been associated toa decrease in CBLB expression, thus to a reductionof its negative control of inflammation. Although

Study of the functional mechanisms underlyingthe association of CBLB with multiple sclerosis

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COMPENDIO 2014

CBLB expression studies on Hap1 and Hap2 pri-mary T cells (performed by our group in the contextof another project assigned by FISM to prof.Francesco Cucca), support this hypothesis, our invitro results are apparently discordant, with Hap 2associated with an increased expression of the re-porter gene, so suggesting an increased expressionof CBLB.This discordance has to be addressed. At the mo-ment, possible explanations proposed could be re-lated to the limit of in vitro analysis, to the size ofthe genomic region considered, and/or to the cellline used. To overcome these limits we are planningto repeat luciferase experiments by transfection ofprimary T cells and to refine the genetic associationto eventually find new variant(s) associated.In silico prediction analysis for transcription factorbinding sites revealed a potential binding motif forvitamin D in the promoter region. In vitro luciferaseassays with or without vitamin D induction suggest-ed that CBLB expression would actually be underits control, although more studies are requested toidentify the exact binding site(s).Main aims of the pilot study have been achieved al-though further work is needed to clarify the function

of the regulatory regions identified, and their role inMS. Our results support the continuation of the re-search, which would result in a better comprehen-sion of the role of CBLB in MS.

CONCLUSIONSCBLB is a negative regulator of inflammation, andits role is considered important both in autoimmunediseases and in tumor protection. The genetic as-sociation of CBLB found with MS, is clearly sup-ported by its already well known role in the controlof the immune responses. Although the MS asso-ciated variants are located in putative regulatory re-gions for CBLB, the exact mechanism underlyingtheir function have not yet been clarified. Further-more our group is still working on the refinement ofthe genetic association.Testing causative associations with the disease isnot straightforward, because genetic association de-rived from GWAS usually are characterized by weakfunctional effects. However functional evidences arenecessary to understand the molecular mechanismsunderlying pathophysiology of MS, required for thesubsequent development of pharmacological treat-ments, which represent our very final aim.

Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2011 per il periodo di 1 anno e l’ammontare di 30.000 €

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Simona PergaLaboratorio di Neurobiologia Clinica, Centro di Riferimento Regionale per la Sclerosi Multipla(CReSM) AOU San Luigi Gonzaga, Orbassano TO

COLLABORATORI:Antonio Bertolotto, Francesca Montarolo, Serena Martire, Michela Spadaro,Nicole Navone, Marco Capobianco, Francesca Sperli, Simona Malucchi

COLLABORAZIONI CON ALTRI GRUPPI:Paola Berchialla, Dipartimento di Scienze Cliniche e Biologiche, Università degli Studidi Torino, TorinoSandra D’Alfonso, Dipartimento di Scienze Mediche Facoltà di Medicina e Chirurgia,Università del Piemonte Orientale, Novara

COMPENDIO 2014

Analisi delle variazioni di singoli nucleotidi polimorfiin TNFAIP3 associati alla sclerosi multipla

PREMESSE E OBIETTIVIL’enzima A20 (codificato dal gene TNFAIP3) svolgeun ruolo chiave nella regolazione negativa dell’in-fiammazione e dell’immunità, limitando numerosisegnali pro-infiammatori, tra cui quelli mediati daNFkB. Ridotti livelli di espressione di A20 predi-spongono a patologie croniche infiammatorie tracui la sclerosi multipla (SM). Recentemente abbia-mo dimostrato una significativa diminuzione dei li-velli trascrizionali di A20 nel sangue di pazienti conSM, con un ritorno a livelli normali durante la gravi-danza.Dal momento che A20 potrebbe rappresentare unbersaglio farmacologico interessante, abbiamo cer-cato di capire il ruolo dell’enzima nella patologiadella SM e le cause della sua deregolazione nei pa-zienti, considerando possibili meccanismi geneticie fattori ormonali collegati alla gravidanza.A tale scopo abbiamo valutato se specifiche variantialleliche di A20 potessero causare nei pazienti conSM un ridotto livello di espressione dell’enzima, conconseguente riduzione dell’attività anti-infiammato-ria, e se vi fosse un aumento del rischio di svilup-pare la malattia nei soggetti che presentino talivarianti. In particolare, ci siamo focalizzati sulla cor-relazione tra l’espressione genica di A20 e la geno-tipizzazione di specifici polimorfismi a singolonucleotide (SNP) nella regione regolatoria e codifi-cante del gene TNFAIP3.In parallelo abbiamo ipotizzato che alcuni ormoni

importanti durante la gravidanza potessero influen-zare i livelli di espressione di A20: abbiamo quindivalutato l’effetto di beta-estradiolo, progesterone,idrocortisone e prolattina sui livelli di A20 nel san-gue intero ottenuto da pazienti con SM e controllisani (CS) in presenza o meno di lipopolisaccaride(LPS) e fitoemoagglutinina (PHA), aggiunti per simu-lare un ambiente infiammatorio.

RISULTATISfruttando l’approccio “haplotype tagging SNPs”(tagSNPs) abbiamo genotipizzato un pannello diSNP selezionati nella regione regolatoria e codifi-cante del gene TNFAIP3 in un gruppo di pazienticon SM e CS per valutare se specifici polimorfismio uno o più assetti aplotipici fossero in grado di in-fluenzare i livelli di espressione di A20.Con questastrategia abbiamo identificato un pannello di 17tagSNPs nel promotore (considerando 100 kb amonte del gene), 9 tagSNPs nella regione codificatee altri 3 SNP non sinonimi, in grado di cambiarel’aminoacido codificato.Per effettuare una correlazione genotipo-espressio-ne di A20 abbiamo selezionato una popolazione di58 pazienti con SM a recidive e remissioni, naïve altrattamento farmacologico specifico, e 54 controllisani associati per sesso ed età. Dall’analisi di questigruppi abbiamo nuovamente confermato chel’espressione di A20 è significativamente ridotta neipazienti con SM (p=0,010). L’analisi di correlazione

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tra il genotipo e l’espressione del RNA messaggero(mRNA) ha rivelato l’associazione tra bassi livelli delmRNA di A20 e gli SNP rs719149 nella regione co-dificante e rs694764 nel promotore (p=0,055), oltreagli SNP rs2230926 non-sinonimo nel gene ers670369 nella regione regolatoria, i quali mostranouna tendenza alla significatività statistica (p=0,059e p=0,099 rispettivamente). Inoltre, abbiamo dimo-strato che due specifici assetti aplotipici nel promo-tore (comprendenti gli SNP rs657597, rs694764,rs799419, rs670369, rs2027276, rs11970361,rs11970411, rs730503, rs600144, rs12527457) in-fluenzano significativamente l’espressione di A20nella popolazione studiata.Per testare l’ipotesi che gli ormoni che rivestono unruolo chiave durante la gravidanza siano in grado diinfluenzare l’espressione di A20, abbiamo valutatol’effetto di beta-estradiolo, progesterone, idrocorti-sone e prolattina sui livelli di A20 nel sangue interoottenuto da dieci pazienti con SM naïve al trattamen-to e 20 controlli sani (CS), associati per sesso ed età,in presenza o meno di LPS e PHA. Abbiamo osser-vato che tutti gli ormoni sono in grado di influenzare

l’espressione di A20, ma in modo diverso nei pazientirispetto ai CS. Mentre nei CS il livello di A20 sembraaumentare in seguito al trattamento con estradiolo eprogesterone, nei pazienti diminuisce. La modulazio-ne è neutralizzata dall’aggiunta di LPS/PHA, sebbe-ne in maniera minore rispetto ai CS. L’idrocortisone,invece, mostra effetti simili in CS e pazienti, ma inquesti ultimi con entità minore. Infine, la prolattina èin grado di aumentare l’espressione di A20 in condi-zioni basali, mentre in combinazione con la stimoloinfiammatorio è incapace di incrementarla ulterior-mente nei pazienti come accade invece per i CS.

CONCLUSIONII dati suggeriscono che gli SNP nel gene TNFAIP3ed in particolare nel suo promotore hanno un ruolonella regolazione dell’espressione di A20, sebbenesia probabile il coinvolgimento di ulteriori meccani-smi. Infatti, i livelli di A20 sembrano influenzati dafattori solubili come gli ormoni sessuali, sia nei CSche nei pazienti, anche se in modi differenti. Questirisultati spiegano in parte la bassa espressione diA20 osservata nei pazienti con SM.

Analysis of single-nucleotide polimorphisms in TNFAIP3associated with multiple sclerosis

INTRODUCTION AND AIMSThe ubiquitin-ending enzyme A20 (codified by TN-FAIP3 gene) is a key player in the negative regula-tion of inflammation and immunity, by restrictingand terminating a number of pro-inflammatory sig-nals, including NFkB pathway. A reduced level ofA20 expression predisposes to chronic inflamma-tion-sensitive pathologies, including multiple scle-rosis (MS). Recently, we demonstrated a significantdecrease of A20 transcriptional level in peripheralblood obtained by MS patients, with a reversion toa normal level during pregnancy.Since A20 enzyme could be potentially amenable topharmacological intervention, we aimed at deepen theknowledge of the role of A20 in the immunopathologyof MS. In particular, we wanted to investigate thecauses underlying A20 gene expression deregulationin MS patients, evaluating possible genetic mecha-nisms and pregnancy-related hormonal factors. At thispurpose, we tested whether specific A20 allelic vari-

ants may cause a reduced level in MS patients withdecreased anti-inflammatory activity, influencing thedevelopment of the disease in individual bearing thesevariants. Particularly, we focused on the correlationbetween A20 gene expression and the presence ofspecific single nucleotide polymorphisms (SNPs) inthe regulatory and in the coding genomic regions.In parallel, we hypothesized that pregnancy-relatedhormones could influence A20 gene expression.Therefore, we evaluated the effects of beta-estra-diol, progesterone, hydrocortisone and prolactin onA20 level on whole blood obtained by MS patientsand matched healthy controls (HC), followed by theaddition or not of the lipopolysaccharide (LPS) andthe phytohaemagglutinin (PHA) to simulate an in-flammatory environment.

RESULTSWe genotyped selected “haplotype tagging SNPs”(tagSNPs) in TNFAIP3 gene and regulatory regions in

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Perga S, Martire S, Montarolo F, Spadaro M, Navone ND, Berchialla P, Bertolotto A. Role of single nucleotide polimorhisms and haplotype variants inTNFAIP3 expression modulation in multiple sclerosis patients. Manuscript in preparation.

Perga S, Martire S, Montarolo F, Spadaro M, Navone ND, Berchialla P, Bertolotto A. Investigating the causes of A20 down-regulation in multiple sclerosis:genetic mechanisms and hormonal modulations.15th International Congress of Immunology – ICI 2013, Milan, August 22-27, 2013

Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2010 per un periodo di 2 anni per l’ammontare di 40.000 €

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MS patients and HC group to asses weather specificpolymorphisms or one or more haplotype settingswere able to influence A20 gene expression. The“tagging SNPs” approach allows to capture the infor-mation of the haplotype blocks present in each geneby genotyping a minimum number of SNPs, payingparticular attention to those already associated withother autoimmune inflammatory diseases. With thisstrategy we identified a panel of 17 tagSNPs in theregulatory region which includes 100 kb upstream theTNFAIP3 gene, 9 tagSNPs in the coding region andother 3 interesting non-synonymous SNPs.To perform a correlation between A20 genotype andgene expression level, we selected a populationcomprehending 58 treatment-naïve relapsing-remit-ting MS patients and 54 sex- and age-matched HC.In particular MS patients blood samples were ob-tained at the diagnosis before starting any pharma-cological treatment, to avoid any influence on geneexpression. In this new groups we confirmed thatA20 expression was significantly lower in MS pa-tients compared to healthy controls (p=0.010).Moreover, genotype-messenger RNA (mRNA) ex-pression correlation analysis revealed that SNPrs719149 in the coding region and SNP rs694764in the promoter were associated with decreasedA20 mRNA levels in the whole population (p=0,055),while the non-synonymous rs2230926 in the geneand the rs670369 in the regulatory region showeda trend (p=0,059 and p=0,099 respectively). In ad-dition, two specific haplotype combinations ofSNPs located in the TNFAIP3 promoter (includingSNPs rs657597, rs694764, rs799419, rs670369,rs2027276, rs11970361, rs11970411, rs730503,

rs600144, rs12527457) resulted significantly asso-ciated to gene expression.At the same time, we hypothesized that pregnan-cy-related hormones could influence A20 gene ex-pression. Therefore, we evaluated the effects ofbeta-estradiol, progesterone, hydrocortisone andprolactin on A20 level on whole blood obtained byten treatment-naïve MS patients and 20 matchedHC followed by the addition or not of LPS and PHA.We demonstrated that all the hormones were ableto modulated A20 expression both in MS patientsand HC. However, while in HC they increased A20level, in MS patients estradiol and progesterone de-creased it. This was rescued by the addition ofLPS/PHA but at lower levels compared to HC. Fur-thermore, hydrocortisone showed similar effects onboth MS patients and HC, although the magnitudeof the phenomenon was lower in patients than inHC. Finally, prolactin was able to increase A20 geneexpression in basal condition but in combinationwith the inflammatory LPS/PHA stimulation in MSpatients was unable to further increase its level, asoccurred in HC, as a cell protective mechanism.

CONCLUSIONSThese data suggest that SNPs in TNFAIP3 genomicregion and particularly in the promoter seem tohave a role in the A20 gene expression regulation,even if others mechanism are probably involved. Infact, A20 transcripts appear influenced by solublefactors such as sex-hormones both in MS patientsand HC, although in a different way. These resultscould partially explain the decreased level of A20observed in MS patients.

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PREMESSE E OBIETTIVII cambiamenti epigenetici che avvengono nel siste-ma immunitario e nel cervello sono alla base delmeccanismi patogenetici della sclerosi multipla(SM). La deregolazione del quadro di metilazionedel DNA può portare ad instabilità genomica ed adalterazione dell’espressione genica. I pazienti affettida SM presentano una diminuzione di 2/3 dei livellidi 5metilcitosina (5mC) rispetto ai controlli. L’eventodi demetilazione può determinare instabilità geno-mica, ma soprattutto l’attivazione di geni che devo-no essere silenti nel cervello. Quest’ultimo evento èstato descritto per l’enzima peptidil-arginina deimi-nasi 2 (PAD2), che è significativamente più espressonel cervello e nelle cellule mononucleate del sangueperiferico (PBMCs) di pazienti affetti da SM a causadella demetilazione del suo promotore. L’induzionedi PAD2 sembra essere coinvolta nella destabiliz-zazione della mielina e nell’esacerbare la rispostaautoimmune nel cervello. Il nostro obiettivo è statoquello di fornire una serie di informazioni sui cam-biamenti epigenetici in PBMCs di pazienti con SMrispetto a donatori sani (H) e di individuare un me-todo diagnostico non invasivo per questa patologia.Abbiamo ipotizzato che è possibile trovare una cor-rispondenza tra sangue e cervello nell’espressionedi geni coinvolti nella regolazione epigenetica. Datidi letteratura mostrano, infatti, che le PBMC rappre-sentano un surrogato del cervello nell’identificazio-ne di biomarcatori delle malattie neurologiche,supportando l’uso di tali cellule nei nostri esperi-menti. Per caratterizzare ulteriormente il quadro epi-genetico nella SM, abbiamo concentrato la nostraattenzione su geni che codificano proteine coinvoltein eventi epigenetici come: metilazione/demetilazio-

ne del DNA; poli-ADP-ribosilazione e degradazionedel polimero di ADP-ribosio e di altri geni potenzial-mente coinvolti nell’eziopatogenesi della SM.

RISULTATIIl nostro studio è stato incentrato sull’espressionee l’attività enzimatica della famiglia delle DNA me-tiltransferasi (DNMTs) e delle proteine TET coinvolterispettivamente nell’aggiunta di 5mC sul genoma enella formazione dell’intermedio di demetilazionedel DNA 5–idrossimetilcitosina (5hmC). I nostri ri-sultati hanno dimostrato che l’espressione di TET2e DNMT1 è diminuita nei PBMC di pazienti con SM,sia a livello di mRNA che di proteina. Questa dimi-nuzione si accompagna con differenze nella meti-lazione del loro promotore. I diminuiti livelli di TET2corrispondono a una bassa quantità di 5hmC sulgenoma di pazienti SM mentre il livello di 5mC èleggermente aumentato.Per quanto riguarda la poli-ADP-ribosilazione la nostraanalisi è stata estesa agli enzimi della poli-ADP-ribo-silazione, coinvolti nella regolazione della metilazionedel DNA attraverso la modulazione dell’attività dellaDNMT1. Abbiamo riscontrato una ridotta espressio-ne di PARG, enzima che degrada i polimeri di ADP-ribosio. In parallelo abbiamo condotto esperimential fine di studiare il livello basale ed inducibile del-l’attività PARP. I risultati hanno mostrato che, seb-bene i livelli basali di attività PARP erano simili tra icampioni H e SM, era presente una inferiore attiva-zione di PARP in campioni SM in presenza di DNAtagliato.Abbiamo concentrato la nostra attenzione anche suCTCF poiché questo fattore di trascrizione è coinvol-to nel cross-talk tra poli ADP-ribosilazione e metila-

Riprogrammazione epigenetica nella sclerosi multipla

Paola CaiafaDipartimento di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia, Sapienza Università di Roma, Roma

COLLABORATORI:Michele Zampieri, Fabio Ciccarone, Roberta Calabrese, Elisabetta Valentini,Tiziana Guastafierro, Maria Giulia Bacalini, Vito G.A. Ricigliano

COLLABORAZIONI CON ALTRI GRUPPI:Marco Salvetti, Dipartimento di Neuroscienze, Salute Mentale e Organi di Senso, SapienzaUniversità di Roma, Roma

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zione del DNA. CTCF controlla sia l’espressione digeni coinvolti nella sclerosi multipla sia il passaggiodalla fase latente a litica del virus Epstein-Barr, cheè noto essere coinvolto nella patogenesi della SM. Inostri dati evidenziano che CTCF è espresso sia inMS che in donatori H e che il suo livello di espres-sione non cambia nella patologia. La nostra ricercasi è focalizzata anche sul rapporto tra le due isoformedi CTCF, la proteina di 130 kDa e la forma poli ADP-ribosilata di 180 kDa. E quest’ultima rappresenta laforma predominante nei PBMC dei pazienti SM.Abbiamo analizzato anche geni potenzialmentecoinvolti nella patogenesi della SM, come la fami-glia NOTCH. Dati di letteratura indicano che il se-gnale di NOTCH può rappresentare un nuovointeressante bersaglio terapeutico nella SM. I nostririsultati mostrano che i livelli di NOTCH1 sono si-gnificativamente aumentati nei pazienti con SM,mentre NOTCH3 non è espresso nei PBMCs. Per

quanto riguarda gli studi sui gemelli monozigotiavevamo disponibilità solo del DNA. Abbiamo ana-lizzato i cambiamenti dello stato di metilazione delDNA dei geni deregolati nei PBMC di pazienti SM.Tra le 5 coppie di gemelli esaminati, di cui uno af-fetto dalla patologia, abbiamo scoperto che solo inuna coppia, l’individuo affetto mostrava ipermetila-zione del promotore di tutti i geni ad eccezione diPAD2.

CONCLUSIONII nostri dati forniscono nuove informazioni sui cam-biamenti epigenetici che avvengono nelle cellulemononucleate del sangue di pazienti affetti da SMe rafforzano l’idea che l’epigenetica possa avereruoli rilevanti nella patogenesi della SM. Questa ri-cerca è anche di grande interesse al fine di indivi-duare un metodo non invasivo da utilizzare nelladiagnosi e/o nel trattamento della SM.

INTRODUCTION AND AIMSEpigenetic changes occurring in the immune systemand in the brain may support multiple sclerosis (MS)pathogenesis. Aberrant DNA methylation can lead togenome destabilization and to deregulated gene ex-pression. Multiple sclerosis (MS) patients show a de-crease in 5-methylcytosine (5mC) level by 2/3 inwhite matter. This demethylation is dangerous: it isresponsible for genomic instability but even more forreactivation of genes that must be silenced in brain.The latter was demonstrated for peptidyl argininadeiminase 2 (PAD2), which is significantly up-regula-ted in brain and PBMCs of MS patients because itspromoter is demethylated. PAD2 over-expression se-ems to be responsible for myelin deregulation andfor reinforcing autoimmune response in MS brain.Aim of this study has been to provide a range of in-formation on epigenetic changes in PBMCs from MSpatients and to identify a non-invasive diagnosticmethod for this pathology. We hypothesized that itwas possible to find a correspondence between blo-od and brain in expression of genes involved in epi-genetic regulation. In fact, data showing that PBMCsrepresent a good substitute for brain to identify bio-markers for neurological diseases support the use ofPBMCs in our experiments. To further characterize

the epigenetic landscape in MS, we focused our at-tention on genes encoding proteins involved in epi-genetic events as: DNA methylation/demethylationmachinery; poly(ADP-ribosyl)ation/(ADP-ribose)po-lymer degradation; other potential genes involved inthe etiopathogenesis of MS.

RESULTSOur study has been focused on the expression ofthe enzymes involved in DNA methylation/demethy-lation machinery. Attention was focused on the ex-pression and enzymatic activity of DNAmethyltransferases (DNMTs) and Ten-eleven-tran-slocation (TET) family proteins involved in the addi-tion of 5mC on the genome and in the formation ofthe intermediate of DNA demethylation 5-hydroxy-methylcytosine (5hmC), respectively. Our resultsshowed that the expression of TET2 and DNMT1,is down-regulated both at mRNA and protein levelsin PBMCs of MS patients vs healthy donors. Thisdown-regulation could be associated with slight butreproducible differences in the methylation of spe-cific CpGs present in their promoters. The decreaseof TET2 level corresponds to low amount of 5hmCon the genome of MS patients while the level of5mC is slightly increased.

Epigenetic reprogramming in multiple sclerosis patients

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Concerning poly(ADP-ribosyl)ation machinery ouranalysis was extended to enzymes responsible forADP-ribose polymer synthesis and degradation asthey are involved in the regulation of DNA methyla-tion patterns through the modulation of DNMT1 ac-tivity. We found reduced expression of PARGenzyme. Parallel experiments were carried out tostudy the basal and inducible level of PARP activity.Results showed that although basal levels of PARPactivity were similar in H and MS samples, intere-stingly, lower PARP activation was evidenced in MSsamples in the presence of nicked DNA.We focused our attention also on CTCF since thistranscriptional factor is involved in the cross-talkbetween poly(ADP-ribosyl)ation and DNA methyla-tion. CTCF controls both the expression of genesinvolved in multiple sclerosis and the passage fromthe latent to lytic phase of Epstein-Barr virus, whichis known to be involved in MS pathogenesis. Ourdata evidenced that CTCF is expressed in both MSand H donors and the expression level does notchange in the pathology. This research was also fo-cused on the ratio between the two forms of CTCFwhich were previously identified: a 130-kDa protein(CTCF-130) and the poly(ADP-ribosyl)ation-modi-fied 180-kDa isoform (CTCF-180). Interestingly, We-stern-blot analysis showed that the 180 kDa form

of CTCF, corresponding to the PARylated protein re-presents the predominant form present in PBMCsof MS patients. We focused our attention also ongenes potentially involved in MS pathogenesis asNOTCH family; several findings indicate thatNOTCH signaling may represent a novel interestingtherapeutic target in MS. Our results show thatNOTCH1 levels are significantly up-regulated in MSpatients while no expression was observed forNOTCH3. As concerns the study on monozygotictwins, we have only had the availability of DNAs. Weanalyzed changes in DNA methylation profiling ofthe genes that we found to be up/down regulatedin PBMCs of MS patients. Out of the five sets oftwins examined, we found that in only one set, werepromoters hypermethylated in MS subject apartfrom PAD2.

CONCLUSIONSOur data provide new information on epigeneticchanges in peripheral blood mononuclear cells ofMS patients showing new pathogenic mechanismsand reinforce the idea that epigenetics may haverelevant roles in MS pathogenesis. This research isalso of interest to provide new information to gen-erate a set of data useful for non-invasive diagnosisand/or treatment of MS.


Calabrese R., Valentini E., Ciccarone F., Guastafierro T., Bacalini M.G., Ricigliano V.A.G., Zampieri M., Annibali V., Mechelli R., Franceschi C., Salvetti M andCaiafa P. TET2 gene expression and 5-hydroxymethylcytosine level in multiple sclerosis peripheral blood cells. BBA Molecular Basis of Disease, in press

Calabrese, R. , Valentini E., Ciccarone, F., Guastafierro, T., Bacalini, M.G., Zampieri, M., Ricigliano, V.A.G., Annibali, V., Mechelli, R., Salvetti, M., CaiafaP., Epigenetic reprogramming in peripheral mononuclear cells from multiple sclerosis patients. XXV Italian Meeting “ADP-RIBOSYLATION REACTIONS”IGM -CNR Pavia, 31 May-01 June 2013.

Calabrese, R. , Valentini E., Ciccarone, F., Guastafierro, T., Bacalini, M.G., Zampieri, M., Ricigliano, V.A.G., Annibali, V., Mechelli, R., Salvetti, M., CaiafaP., Epigenetic reprogramming in peripheral mononuclear cells from multiple sclerosis patients. Congresso Scientifico Annuale FISM - 29-30 May 2013.



La proteina adattatrice Rai in differenziamento,attività e chemiotassi dei linfociti Th17 e nella patogenesidella sclerosi multipla

Cosima BaldariDipartimento di Scienze della Vita, Università degli Studi di Siena, Siena

COLLABORATORI: Cristina Ulivieri, Maria Teresa Savino, Emanuela Fanigliulo,Giulia Masi, Patrussi Laura

COLLABORAZIONI CON ALTRI GRUPPI:Mario Milco D’Elios, Dipartimento di Medicina Sperimentale e Clinica, Università degli Studidi Firenze, FirenzeClara Ballerini, Dipartimento di Neuroscienze, Psicologia, Area del Farmaco e Salute del Bambino(NEUROFARBA), Università degli Studi di Firenze, FirenzeGiuliana Pelicci, Dipartimento di Oncologia Sperimentale, Istituto Europeo di Oncologia, Milano

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PREMESSE E OBIETTIVILa sclerosi multipla (SM) è una malattia cronica de-mielinizzante del sistema nervoso centrale (SNC) ca-ratterizzata da infiammazione e neurodegenerazione,la cui eziologia non è ancora ben conosciuta. Tutta-via dati ottenuti su lesioni SM, suscettibilità geneticae studi su modelli animali, così come l’efficacia delleimmunoterapie, forniscono forti elementi a favore delfatto che la SM sia una malattia mediata dal sistemaimmunitario in cui l’infiammazione locale nel SNC eil risultante danno tissutale sono principalmente me-diati da linfociti T CD4+ autoreattivi per la mielina. Èstato proposto che i linfociti T autoreattivi attivati inperiferia passano nel SNC dove vengono riattivati damacrofagi e cellule della microglia che presentanoantigeni della mielina. Tra le cellule CD4+ i linfocitiTh17 sono stati identificati come il principale tipo cel-lulare implicato nella patogenesi della SM, come in-dicato dalla aumentata frequenza di linfociti Th17 edalle elevate concentrazioni di IL-17 documentatenelle lesioni del SNC, nel liquido cerebro-spinale enel sangue di pazienti SM. L’inibizione delle rispostemediate da IL-17/Th17 appare pertanto al momentol’opzione terapeutica più promettente nella SM. Iden-tificare regolatori negativi del differenziamento dellafunzione delle cellule Th17 potrebbe quindi promuo-vere lo sviluppo di terapie mirate sicure ed efficaci.Il principale obiettivo di questo progetto è statoquello di capire se Rai, un membro della famigliadegli adattatori Shc che abbiamo recentemente di-mostrato controllare negativamente lo sviluppo di

una malattia autoimmune simile al lupus sistemicoeritematoso (LSE) attenuando le risposte T e B, fos-se in grado di modulare non solo l’attivazione deilinfociti CD4+ ma anche il loro differenziamento a lin-fociti effettori noti essere associati con l’autoimmu-nità, traslando i risultati alla patogenesi della SM.

RISULTATINella fase iniziale del progetto abbiamo studiato ilruolo di Rai nello sviluppo di linfociti Th1 e Th17,che sono implicati nella patogenesi di diverse pa-tologie autoimmuni tra cui il LSE e la SM. Il ruolo diRai nel differenziamento di linfociti Th1, Th2 e Th17è stato studiato utilizzando linfociti T isolati da topiRai-/- e di controllo e valutando l’espressione di ci-tochine e fattori di trascrizione caratteristici per ognisottopopolazione. I risultati ottenuti hanno mostratoche l’assenza di Rai promuove il differenziamentospontaneo dei linfociti verso linfociti Th1 e Th17mentre reprime il differenziamento dei Th2, a sup-porto di un ruolo di Rai non solo quale regolatorenegativo dell’attivazione dei linfociti T ma anchedello sviluppo di linfociti Th1 e Th17 in vivo. Questirisultati sono stati confermati in vitro in esperimentisu linfociti T CD4+ sia naïve che effettori/memoria,che hanno dimostrato che l’assenza di Rai favorisceselettivamente sia il differenziamento che l’espan-sione dei linfociti Th17.Al fine di esplorare il legame tra lo sbilanciamento ver-so Th1/Th17 osservato in topi Rai-/- e la loro suscet-tibilità a sviluppare spontaneamente una patologia di

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tipo LSE, abbiamo caratterizzato l’infiltrato T nel rene,il principale organo bersaglio della risposta autoim-mune in questa malattia. Infiltrati Th1 e Th17 sonostati identificati nei reni di topi Rai-/-, a dimostrazioneche l’assenza di Rai contribuisce allo sviluppo dellanefrite autoimmune non solo aumentando l’attivazio-ne linfocitaria ma anche favorendo lo sviluppo el’espansione dei linfociti T effettori proinfiammatori. Èda notare che abbiamo riscontrato un difetto nel-l’espressione di Rai nei linfociti isolati da pazienti af-fetti da LSE, a conferma che Rai svolge un ruoloimportante nella patogenesi di questa malattia.Questi risultati suggeriscono che, alterando l’equili-brio tra le sottopopolazioni di linfociti T helper versoTh1/Th17, la deficienza di Rai potrebbe contribuireallo sviluppo di altre patologie autoimmuni oltre ilLSE, inclusa la SM. Per valutare questa ipotesi ab-biamo studiato l’impatto dell’assenza di Rai sullosviluppo dell’ESA, il modello murino della SM uma-na. Topi wild-type e Rai-/- sono stati immunizzati conil peptide della mielina MOG35-55 e monitorati per se-gni clinici. Sorprendentemente, in contrasto con lanostra ipotesi, abbiamo osservato che i topi Rai-/-

sviluppavano una malattia meno grave se parago-nata ai topi di controllo. In accordo con i dati clinici,analisi istologiche su sezioni seriali di midollo spi-nale hanno evidenziato una ridotta demielinizzazio-ne in topi Rai-/- rispetto ai controlli accompagnatada minore attivazione sia della microglia che degliastrociti.Una possibile spiegazione della ridotta severità dellamalattia in topi Rai-/- può essere che l’assenza di Raicompromette la risposta immunitaria indotta dall’an-tigene MOG35-55 e/o l’infiltrazione dei linfociti T nelSNC. Per valutare questa possibilità abbiamo ana-lizzato in vitro la proliferazione in risposta a MOG35-55

di splenociti da topi wild-type o Rai-/- ESA 10 giornipost-immunizzazione. Abbiamo inoltre caratterizza-to gli infiltrati cellulari nel midollo spinale di topi wild-type o Rai-/- ESA al picco della malattia. I risultatihanno mostrato che la ridotta gravità della malattiae la ridotta demielinizzazione nei topi Rai-/- non ècausata né da risposte immunitarie anomale al pep-tide MOG, che induce il caratteristico sbilanciamen-to Th1/Th17 precedentemente osservato in questitopi, né da una ridotta infiltrazione dei linfociti T nelmidollo spinale. Inoltre esperimenti di trasferimentodi malattia in topi immunodeficienti che esprimonoRai hanno dimostrato che i linfociti T Rai-/- MOGspecifici inducono una malattia più grave se para-gonati a linfociti T MOG specifici di controllo, in ac-

cordo con l’elevata proporzione di linfociti Th1/Th17,suggerendo che l’assenza di Rai nel SNC potrebbeproteggere i topi dall’ESA.Gli astrociti sono il tipo cellulare più abbondante delSNC e sono importanti regolatori del processo infiam-matorio e neurodegenerativo tipico dell’ESA. È statodimostrato che gli astrociti alterano la permeabilitàdella barriera ematoencefalica, attraggono cellule delsistema immunitario nel SNC e contribuiscono al dan-no neuronale mediante la produzione di citochine edossido nitrico. Abbiamo quindi deciso di studiarel’espressione e la funzione di Rai in astrociti primaridi topo. Abbiamo dimostrato per la prima volta cheRai è espresso in queste cellule. Inoltre, per studiarela funzione di Rai negli astrociti nel contesto del-l’ESA abbiamo sviluppato un modello in vitro in cuigli astrociti Rai-/- o di controllo sono stati esposti aterreno di coltura condizionato da linfociti T wild-ty-pe o Rai-/- specifici per MOG e misurato la produzio-ne della citochina proinfiammtoria IL-6. I risultatiottenuti mostrano che gli astrociti Rai-/- produconolivelli più bassi di IL-6 rispetto ai controlli indicandoche Rai regola positivamente la produzione di IL-6da parte degli astrociti.

CONCLUSIONILe cellule Th17 svolgono un ruolo cruciale nella pa-togenesi della SM, e l’identificazione di molecole ca-paci di modulare il differenziamento e le funzionieffettrici di questa popolazione potrebbe quindi rap-presentare un importante punto di partenza per lo svi-luppo di terapie innovative. In questo studio abbiamoidentificato la proteina Rai come nuovo regolatore ne-gativo del differenziamento e dell’espansione dellecellule Th17 in vitro e in vivo e fornito evidenze delsuo ruolo nella patogenesi di malattie autoimmunimediate dai linfociti Th17. Il risultato inatteso che, adispetto di questa funzione, l’insorgenza e la progres-sione dell’ESA sono ritardati e il decorso della malat-tia è meno grave nei topi Rai-/-, si può spiegare allaluce della nuova funzione di Rai emersa da questostudio quale regolatore positivo della produzione dicitochine proinfiammatorie da parte degli astrociti.Complessivamente questi dati suggeriscono quindiche l’inibizione di Rai nel SNC potrebbe creare unambiente protettivo mediante la soppressione dellareazione infiammatoria mediata dagli astrociti, anchein presenza di cellule Th17 iperattive. Pertanto, stra-tegie volte a bloccare la funzione di Rai negli astrocitipotrebbero contribuire allo sviluppo di una nuova te-rapia neuroprotettiva per la SM.

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INTRODUCTION AND AIMSMultiple sclerosis (MS) is a chronic demyelinatingdisease of the central nervous system characterizedby inflammation and axonal degeneration, the aeti-ology of which is as yet not fully understood. How-ever, data from MS lesions, genetic susceptibility andstudies on animal models, taken together with theefficacy of immunotherapies, strongly support thenotion that MS is an immune-mediated diseasewhere local inflammation in the central nervous sys-tem (CNS) and the resulting tissue damage are pri-marily mediated by self-reactive myelin-specificCD4+ T cells. It has been proposed that the autore-active T cells activated in periphery gain access tothe CNS where they are reactivated by macrophagesand microglial cells presenting myelin antigens.Among CD4+ T cells, IL-17- producing Th17 cellshave been identified as the main immune cell typeimplicated in the pathogenesis of MS, as indicatedby the increased frequency of Th17 cells and elevat-ed concentrations of IL-17 found in CNS lesions,cerebrospinal fluid and blood-derived mononuclearcells from MS patients. Based on these findings,strategies to inhibit IL-17/Th17 responses appear atpresent as the most promising therapeutic option forMS. Identifying novel negative regulators of Th17 dif-ferentiation and function are expected bring us closerto develop safe and effective targeted therapies.The principal aim of this proposal was to understandwhether Rai, a Shc family adaptor protein which wehave recently demonstrated to be implicated in thenegative control of lupus-like autoimmunity by actingas an attenuator of T and B cell responses, couldregulate not only the activation of CD4+ T cells, butalso their differentiation to Th effectors associatedwith autoimmunity, translating the results to thepathogenesis of MS.

RESULTSIn the initial phase of the project we evaluated thepotential role of Rai in the development of the Th1and Th17 subsets, which are centrally implicated inthe pathogenesis of several autoimmune disorders,including SLE and MS. The role of Rai in the devel-opment of the Th1, Th2 and Th17 subsets was as-sessed on T cells isolated from wild-type and Rai-/-

mice which were analyzed for the expression of cy-tokines and transcription factors diagnostic for eachsubset. Rai was found to promote the spontaneouspolarization of Th1 and Th17 cells while repressingTh2 polarization, indicating a role of Rai as negativeregulator not only of T cell activation, as previouslyreported, but also of Th1 and Th17 cell developmentin vivo. These results were confirmed in in vitro ex-periments on purified naïve and effector/memoryCD4+ T cells, which demonstrated that Rai deficiencyselectively favours the differentiation of Th17 cells aswell as their expansion.To further explore the link between the Th1/Th17 biasobserved in Rai-/- mice and their susceptibility tospontaneously develop lupus-like autoimmunity, wecharacterized the T cell infiltrate in the kidney, themain target organ of autoimmune response in SLE.Th1 and Th17 cell infiltrates were found in the kidneysof Rai-/- mice, providing evidence that Rai deficiencycontributes to the development of lupus nephritis notonly by enhancing lymphocyte activation but also bypromoting the development and expansion of proin-flammatory effector T cells. Interestingly, T cells fromSLE patients were found to have a defect in Rai ex-pression, supporting a role for Rai in the pathogenesisof this autoimmune disease.These findings suggest that, by altering the balanceamong helper T cell subsets towards Th1/Th17, Raideficiency may contribute to the development ofother autoimmune diseases beside SLE, includingMS. To address this hypothesis, the impact of Raideficiency on the development of EAE, a mousemodel of human MS, was assessed. Wild type andRai-/- mice were immunized with the myelin peptideMOG35-55 and monitored for clinical signs. Surpris-ingly, in contrast with our hypothesis, we found thatRai-/- mice developed a milder disease when com-pared to control mice. In agreement with this find-ing, histological analysis on consecutive spinal cordsections showed a reduced demyelination in Rai-/-

mice compared with controls paralleled by a reduc-tion in both microglia and astrocyte activation.One possible explanation for the milder diseaseseverity in Rai-/- mice may be that Rai deficiency im-pairs the primary immune response to MOG35-55 pep-tide and/or T lymphocyte infiltration into the CNS. To

The Rai adaptor protein in Th17 cell differentiation,effector function and chemotaxis and in the pathogenesisof multiple sclerosis

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address these possibilities we analyzed the in vitroproliferation rates in response to MOG35-55 peptide ofsplenocytes from wild-type and Rai-/- EAE mice 10days post-immunization. Moreover we characterizedthe cell infiltrates in the spinal cord of wild-type orRai-/- EAE mice at the peak of disease. The resultsshowed that the reduced disease severity and spinalcord demyelination in Rai-/- EAE mice did not resulteither from abnormal primary immune responses toMOG peptide, which elicits the characteristicTh1/Th17 bias previously observed in these mice, orfrom a reduced T cell infiltration in the spinal cord.Moreover, adoptive transfer experiments into immun-odeficient mice expressing Rai showed that MOGspecific Rai-/- T cells induce a more severe diseasethan their wild-type counterparts, consistent with thehigher proportion of Th1/Th17 cells, and suggestedthat Rai deficiency in the CNS might protects micefrom EAE.Astrocytes are the most abundant cell populationwithin the CNS and are important regulators of neu-roinflammation and neurodegeneration. It has beenshown that astrocytes alter blood-brain barrier per-meability, attract immune cells into the CNS andcontribute to neuronal damage via nitric oxide pro-duction through the cytokines they produce. Hence,the expression and function of Rai in primary mouseastrocytes were analyzed. We provided the firstdemonstration that Rai is expressed in astrocytes.Moreover, to study the function of Rai in astrocytesin the context of EAE we set up an in vitro model in

which wild-type or Rai-/- astrocytes were exposed toconditioned media from wild-type or Rai-/- MOGspecific T cells and the production of the proinflam-matory cytokine IL-6 was measured. Interestingly,Rai-/- astrocytes produced lower levels of IL-6 mRNAcompared to controls, indicating that Rai plays apositive role in IL-6 production by astrocytes.

CONCLUSIONSTh17 cells play a crucial role in the pathogenesis ofMS and the identification of molecules capable tomodulate differentiation and effector functions of thissubset are expected to provide important progressin the development of novel MS therapies. Here weidentified Rai as a negative regulator of Th17 cell dif-ferentiation and expansion in vitro and in vivo andprovided evidence of its role in the pathogenesis ofTh17-mediated disease. The unexpected findingthat, notwithstanding this function, the onset andprogression of EAE are delayed and the diseasecourse milder in Rai-/- mice can be accounted for bythe novel function of Rai emerged from this study asa positive regulator of proinflammatory cytokine pro-duction by astrocytes. Taken together, the data sug-gest that Rai inhibition in the CNS might establish aprotective environment by impairing the astrocyte-mediated inflammatory reaction even in the presenceof hyperactive MOG-specific Th17 cells. Thus it maybe speculated that blockade of Rai in astrocytescould lead to the development of a novel neuropro-tective therapy for MS.


Savino MT, Ulivieri C, Emmi G, Prisco D, De Falco G, Ortensi B, Beccastrini E, Emmi L, Pelicci G, D’Elios MM, Baldari CT. The Shc family protein adaptor,Rai, acts as a negative regulator of Th17 and Th1 cell development J Leukoc Biol 2013; 93: 549-559.

Ulivieri C, Baldari CT. T-cell-based immunotherapy of autoimmune diseases. Expert Rev Vaccines 2013;12: 297-310.

Ulivieri C, Baldari CT. Statins: from cholesterol-lowering drugs to immunomodulators. Pharmacol Res 2014. March 20. [Epub ahead of print]

Ulivieri C, Savino MT, Aldinucci A, Fanigliulo E, Bonechi E, Della Bella C, Pelicci G, Ballerini C, D’Elios MM, Baldari CT. Astrocyte Rai drives IL-6 and NOproduction during experimental autoimmune encephalomyelitis. Manuscript in preparation.

Ulivieri C, Savino MT, Fanigliulo E, Aldinucci A, Bonechi E, Della Bella C, Pelicci G, Ballerini C, D’Elios MM, Baldari CT. The Rai adaptor protein in Th17cell differentiation, effector function and chemotaxis and in the pathogenesis of multiple sclerosis. Congresso Scientifico Annuale FISM, Roma, 29-30Maggio 2013

Ulivieri C, Savino MT, Ortensi B, Pelicci G, Emmi L, D’ Elios MM, Baldari CT. The Shc family protein adaptor Rai, acts as a negative regulator of Th17cell development. European Congress of Immunology, Glasgow, Scotland, 5-8 September 2012

Ulivieri C, Savino MT, Aldinucci A, Luccarini I, Della Bella C, Pelicci G, Ballerini C, D’Elios MM, Baldari CT. The Rai adaptor protein in Th17 cell differen-tiation, effector function and chemotaxis and in the pathogenesis of multiple sclerosis. Congresso Scientifico Annuale FISM, Roma, 30-31 Maggio 2012

Savino MT, Ulivieri C, Aldinucci A, De Falco G, Pelicci G, Ballerini C, D’Elios MM Baldari CT. The Rai adaptor protein in Th17 cell differentiation, effectorfunction and chemotaxis and in the pathogenesis of multiple sclerosis. Congresso Scientifico Annuale FISM, Roma, 25-26 Maggio 2011

Savino MT, Ulivieri C, Aldinucci A, De Falco G, Ballerini C, D’Elios MM, Pelicci G, Baldari CT. Altered balance of helper T cells in Rai-/- mice. XXI AINICongress, Pollenzo Bra (CN), 22-25 September 2011.

Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2010 per il periodo di 2 anni (prorogato di 12 mesi)per l’ammontare di 100.000 €


PREMESSE E OBIETTIVILe cellule T regolatrici (Treg) sono importanti per ilmantenimento della tolleranza alle proprie proteine(‘antigeni’), comprese quelle espresse dalla mielinache vengono colpite da reazioni autoimmuni nellasclerosi multipla (SM). Le Treg inibiscono le funzioniinfiammatorie di cellule ‘effettrici’ del danno tissutale,come le cellule T-helper 17 (Th17). Un aspetto impor-tante dei meccanismi immunologici della SM è chela funzione delle Treg è ridotta nei pazienti, ma nonconosciamo i meccanismi di questa riduzione. In stu-di precedenti condotti in soggetti non affetti da SM,avevamo dimostrato che i recettori ‘toll-like receptor’(TLR), che sono coinvolti nelle funzioni del sistemaimmunitario ‘innato’ (rapido, poco specifico, e senza‘memoria immunologica’), sono espressi anche sucellule del sistema immunitario ‘adattativo’ (più lento,molto specifico, e caratterizzato da memoria immu-nologica), in particolare sulle cellule Treg. Come ri-portato da altri ricercatori nei modelli sperimentali,avevamo dimostrato che nelle Treg umane, la stimo-lazione di TLR2 (uno dei TLR espressi sulla membra-na cellulare) portava alla riduzione della funzionesoppressiva di queste cellule, ‘liberando’ le celluleTh17 proinfiammatorie dai normali meccanismi dicontrollo. Inoltre le Tregs venivano stimolate a tra-sformarsi in cellule Th17, aumentando ulteriormentela tendenza all’infiammazione. In questo progetto pi-lota, l’obiettivo è stato di studiare gli effetti della sti-molazione di TLR2 nelle persone con SM econfrontarli con soggetti di controllo. Riteniamo que-sti studi molto importanti per caratterizzare i mecca-nismi con i quali le infezioni urinarie e respiratorie,

che sono frequenti nella SM, possono indurre rica-dute cliniche.

RISULTATII nostri risultati dimostrano che le persone con SMsono più suscettibili agli effetti della stimolazione diTLR2 rispetto ai soggetti di controllo. Tali differenzecomprendono un più alto livello di espressione delrecettore TLR2 sulle cellule Treg ed una loro più fortesuscettibilità alla perdita di funzione regolatrice e al-l’acquisizione di un fenotipo infiammatorio (Th17)quando stimolate tramite TLR2. Inoltre, gli effetti mo-lecolari dell’attivazione di TLR2 erano più potenti nel-le persone con SM, in particolare nella produzionedell’interleuchina-6 (IL-6) e l’attivazione dei mecca-nismi infiammatori che essa controlla.

CONCLUSIONIIn questo studio pilota, abbiamo dimostrato che imeccanismi immunitari indotti dall’attivazione diTLR2 nelle cellule Treg, che avevamo precedente-mente caratterizzato in soggetti di controllo, sonopresenti ed ancora più potenti nelle persone con SM.Questo potrebbe rappresentare un nuovo meccani-smo di ‘patogenesi’ attraverso il quale infezioni si-stemiche (come quelle degli apparati urinario erespiratorio) possono indurre ricadute di malattia ri-ducendo la funzione soppressiva delle cellule Treged inducendole a diventare proinfiammatorie (Th17).Inoltre, pensiamo che i nostri dati possano contribui-re a spiegare perché i pazienti con SM hanno una ri-dotta funzione Treg. Sarà importante stabilire se oltrealla nota capacità di facilitare le ricadute di SM, le in-

Modulazione dell’equilibrio tra cellule T regolatricie T helper 17 da parte di recettori Toll-like: implicazioni perla sclerosi multipla

Bruno GranDivision of Clinical Neuroscience (Clinical Neurology Research Group),University of Nottingham School of Medicine, United Kingdom

COLLABORATORI:Mukanthu Nyirenda, Cris Constantinescu, Uwe Vinkemeier, Tim Constantin-Teodosiu

COLLABORAZIONI CON ALTRI GRUPPI:Guang-Xian Zhang, Abdolmohamad Rostami, Thomas Jefferson University, Philadelphia, USAAmit Bar-Or, McGill University, Montreal, Canada

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Toll-like receptors modulate the balance betweenregulatory (Treg) and T helper 17 (Th17) cells: implicationsfor multiple sclerosis

INTRODUCTION AND AIMSRegulatory T cells (Tregs) are important to maintainimmune tolerance to self-antigens as they inhibitproinflammatory T cells (such as T-helper 17, Th17cells). Their function is thought to be defective inmultiple sclerosis (MS), possibly contributing to di-sease pathogenesis. However, the mechanisms ofsuch reduced function are not known. We demon-strated that Toll-like receptors (TLR), which are in-volved in the function of the innate immune system,are also expressed on human Tregs. Since studiesin the mouse showed that the activation of TLR2 re-duces the regulatory (anti-inflammatory) function ofTregs, we studied these mechanisms in humancells. We found that activation of human TLR2 onTregs made these cells less suppressive of inflam-matory cells, and even transformed such Tregs intopro-inflammatory Th17 cells. Therefore, there aretwo mechanisms by which stimulation of these re-ceptors could activate inflammation in MS (reducedsuppression of inflammatory T cells and transfor-mation of anti-inflammatory into inflammatory Tcells). In this pilot project, we wanted to comparesuch effects of TLR2 activation in people with andwithout MS. This is important as many types of in-fections can activate TLR2, and we know that uri-nary and respiratory infections are frequent in MSand they can induce disease relapses.

RESULTSWe found that people with MS were more suscep-tible to the effects of TLR2 activation that we had

previously described in people without MS. Suchdifferences included a higher expression of TLR2 byTregs in MS and a stronger tendency of Tregs to be-come less suppressive and more inflammatory(Th17) when stimulated through TLR2. In addition,the effects of TLR2 activation, including the produc-tion of the proinflammatory cytokine, interleukin-6(IL-6) and the activation of its signalling pathways,were more potent in people with MS.

CONCLUSIONSIn this pilot study, we established that immunemechanisms induced by the activation of TLR2 onTregs, which we had previously identified in controlsubjects, are even more potent in people with MS.This may be a novel pathogenic mechanism bywhich systemic infections (such as those affectingthe urinary or respiratory tract, quite common inMS) could induce disease exacerbations by reduc-ing the suppressive activity of Tregs and inducingthem to become pro-inflammatory. This could alsobe a new mechanism to explain why people withMS have a weaker Treg function, an observationthat has been reported by many groups in the last10 years, but for which we didn’t yet have an expla-nation. It will be important to determine whether inaddition to the known effect of facilitating diseaserelapses, infections that activate TLRs may also ac-celerate disease progression.In terms of proximity to cure, we believe that ourdata identify TLR2 and IL-6 as new therapeutic tar-gets in MS.

fezioni che attivano i TLR possono anche accelerarela progressione di malattia.Per quanto riguarda le implicazioni per la cura della

SM, riteniamo che i nostri dati identifichino TLR2 edIL-6 come potenziali bersagli terapeutici.

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Podda G, Nyirenda M, Crooks J, Gran B. Innate immune responses in the CNS: Role of Toll-like receptors, mechanisms, and therapeutic opportunitiesin multiple sclerosis. J Neuroimmune Pharmacol 2013; 8:791-806.

Nyirenda M, Crooks J, Gran B. The Role of Toll-Like Receptors in multiple sclerosis and Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. In: Multiplesclerosis immunology – a foundation for current and future treatments. T. Yamamura and B. Gran, Eds. Springer, New York, 2013(www.springer.com/biomed/immunology/book/978-1-4614-7952-9); Chapter 8, pp. 149-176.

Nyirenda M, Vinkemeier U, Constantin-Teodosiu D, Drinkwater S, King L, Morandi E, Podda, G, Zhang GX, Ghaemmaghami A, Bar-Or A, ConstantinescuCS, and Gran B. TLR2 stimulation regulates the balance between Treg and Th17 function in multiple sclerosis: a new novel mechanism of reduced Tregfunction in autoimmune disease. Manuscript in preparation

Nyirenda M, Constantinescu C, Bar-Or A, Zhang GX, Gran B. Toll-like receptor 2 (TLR2) regulates the balance between Th17 and Treg function in multiplesclerosis: a key role for IL-6/STAT3 signalling. 6th World Immune Regulation Meeting (WIRM), Davos, Switzerland, March 2012 (Late-Breaking Abstract- Winner of WIRM Travel Grant)

Nyirenda M, Constantin-Teodosiu T, Crooks J, Podda G, Bar-Or A, Zhang GX, Constantinescu CS, Gran B. Innate immune sensing by human regulatoryT cells - Role of TLR2 and relevance to autoimmunity in multiple sclerosis. 3rd European Congress of Immunology (ECI), Glasgow, UK, September 2012.

Nyirenda M, Constantinescu C, Bar-Or A, Zhang GX, Gran B. Toll-like receptor 2 (TLR2) regulates the balance between Th17 and Treg function in multiplesclerosis: a key role for IL-6/STAT3 signalling. 11th International Society of Neuroimmunology (ISNI) Congress, Boston, USA, November 2012.


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PREMESSE E OBIETTIVILa sclerosi multipla (SM) è una malattia autoimmu-ne in cui i linfociti T autoreattivi giocano un ruolo cri-tico nel danneggiare il sistema nervoso centrale.Studi condotti nel nostro laboratorio, avvalorati dadati ottenuti in modelli murini, hanno evidenziatoche nel sangue periferico (SP) dei pazienti con SMin fase attiva vi è un aumento dei linfociti CD4 T hel-per (Th) producenti la citochina IL17 (Th17) rispettoai soggetti sani, e che l’interferone (IFN)ß, che è cor-rentemente utilizzato nella terapia della SM, induceproprio la selettiva apoptosi dei linfociti Th17. Re-centemente abbiamo però dimostrato il coinvolgi-mento di una nuova popolazione di linfociti CD4 Thin grado di produrre selettivamente la citochina IL22e per questo definiti Th22. Inoltre, abbiamo osser-vato che l’espressione di una delle catene del re-cettore per l’IFNγ (IFNγR2), potrebbe essere unindicatore di malattia e di suscettibilità alla terapiacon IFNβ. L’IFNγ, una citochina in grado di inibire iTh17, non può essere somministrato ai pazienti peri suoi effetti tossici, ma i suoi effetti inibitori possonoessere regolati tramite, ad esempio, il ferro.Lo scopo del progetto è stato quello di: caratteriz-zare in dettaglio i linfociti Th22 che si espandono du-rante la fase attiva della SM; studiare gli effetti degliinterferoni sui linfociti Th17 e Th22; analizzare se lamodulazione del ferro potesse influire sui segnaliche determinano la sopravvivenza dei linfociti Th17e di conseguenza sull’insorgenza della SM studian-do un modello murino basato sul deficit genetico dihemopexina (Hx), una molecola in grado di regolarela disponibilità cellulare del ferro nei linfociti T.

RISULTATIIl primo obbiettivo del nostro programma di ricercaera quello di definire il ruolo dei linfociti Th22 nella SM.Per questo abbiamo analizzato le cellule del sangueperiferico di 62 pazienti con SM recidivante-remitten-te (SMRR) e 30 soggetti sani dello stesso range di età.Abbiamo osservato che il numero di linfociti Th22 eraaumentato nel SP dei pazienti con SMRR special-mente durante le fasi attive della malattia, aumentavaanche nel liquido cefalorachidiano e che queste cel-lule erano specifiche per l’antigene self della proteinabasica della mielina (MBP). Seguendo alcuni pazientiper un anno, abbiamo visto che, mentre i linfocitiTh17 aumentavano solo durante le fasi attive dellaSM, i linfociti Th22 aumentavano significativamentegià alcuni mesi prima delle recidive.Per caratterizzare meglio queste cellule, abbiamovalutato l’espressione di diversi recettori per che-mochine (CCR) e citochine (IL-R) e fattori trascrizio-nali. I linfociti Th22 auto-reattivi esprimono ad altilivelli di CCR6, ma non di CCR4 e CCR10, recettorein grado di promuovere l’attraversamento della bar-riera ematoencefalica e quindi il raggiungimento delsistema nervoso centrale. I linfociti Th22 sono unsottopopolazione cellulare CD4+ distinta che con-divide solo alcune caratteristiche con i Th17:l’espressione di CD161 e di RoRγT caratterizzano ilinfociti Th17 ma non i Th22; entrambi esprimono ifattori importanti per la differenziazione e la stabi-lizzazione IL- 23R, IL-7R, AhR. Nei pazienti con SM,ma non nei soggetti sani, Th17 e Th22 esprimonoelevati livelli di Tβet, un fattore trascrizionale rico-nosciuto come indice di elevata patogenicità.

Regolazione interferone-dipendente dei linfociti Th17 e Th22nella sclerosi multipla

Francesco NovelliUniversità di Torino, Centro Ricerche Medicina Sperimentale (CeRMS),Azienda Ospedaliera Città della Salute e della Scienza di Torino, Torino

COLLABORATORI:Simona Rolla, Valentina Bardina

COLLABORAZIONI CON ALTRI GRUPPI:Luca Durelli, Marinella Clerico, Divisione di Neurologia, Università di Torino,Facoltà San Luigi Gonzaga, Ospedale S. Luigi Gonzaga, Orbassano (TO)

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INTRODUCTION AND AIMSAn uncontrolled self-reactive effector T-cell re-sponse plays an important role in the pathogenesisof multiple sclerosis (MS). Previously studies per-formed in our lab, in agreement with data in murinemodels, showed that CD4 T helper lymphocytesproducing IL17 cytokine (Th17) increased in thepheripheral blood (PB) of MS patients in the activephase of the disease compared to Healthy Subject(HS); of interest, we showed that Interferon (IFN) β,a common therapy for MS disease, affected and re-duced Th17 cells. Recently, we observed an in-crease of a new Th cells able to selectively produceIL22 and termed Th22 and that the expression of aIFNγ receptor chain (IFNγR2) could be considereda disease marker and predict resistance or sensi-tivity of SM patients for IFNβ administration. IFNγ,a cytokine that regulates Th17 cells, cannot be ad-ministered to MS patients due to its toxic effects,but its inhibitory properties can be regulated by oth-er molecules such iron. Our research programaimed to: clarify and characterize the involvementof Th22 cells in the pathogenesis of MS; the mod-ulation of Th17 and Th22 in response to IFNs; ana-lyze the role of iron in modulating Th17 cells and itsimpact on the pathogenesis of MS by studying a

mouse model deficient for the Hemopexin (Hx), amolecules able to regulate iron availability in T cells.

RESULTSThe first aim of this research program was to ascer-tain the role of Th22 cell in MS. We collected andanalyzed peripheral blood mononuclear cells(PBMC) from 62 patients with relapsing-remittingmultiple sclerosis (RRMS) and 30 age- and gender-matched healthy volunteer (HS) subjects. We founda significant increased number of Th22 cells in thePBMC of RRMS patients with respect to healthysubject. Th22 cells expanded mostly during the re-lapses, were specific for the auto-antigen myelinbasic protein (MBP) and enlarged in the cere-brospinal fluid. Longitudinal analysis showed thatwhereas Th17 cell increased always greater duringthe relapses and were lower or undetectable in theinactive phases, Th22 cells significantly enlarged al-ready in the month prior the relapses.To further characterize this subset in RRMS, the ex-pression of several chemokine (CCR) and cytokine(IL-R) receptors and transcriptional factors were ana-lyzed on Th22 cells in comparison with Th17 cells.Higher expression of CCR6, but not CCR4 andCCR10, delineated self-reactive Th22 cells in active

Interferon-dependent regulation of Th17 and Th22lymphocytes in multiple sclerosis

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Nella seconda parte della nostra ricerca, abbiamocondotto studi per definire gli effetti dell’IFNβ sul-l’espansione dei linfociti Th17 e Th22 nella SM. Men-tre avevamo già descritto che i linfociti Th17 fosseroun bersaglio selettivo della terapia con IFNβ, qui ab-biamo osservato che i Th22 esprimevano livelli piùbassi del recettore IFNAR1 ed erano meno sensibilial trattamento in vitro con l’IFNβ rispetto ai Th17.Infine, per valutare il ruolo dell’Hx nella SM, abbiamoindotto l’encefalomielite sperimentale autoimmune(ESA), il modello murino di SM, in topi wild type (WT)e deficienti per il gene dell’Hx (Hx-/-). I risultati otte-nuti indicano che durante l’ESA aumentano i livelli diHx nel siero; i topi Hx-/- sviluppano una precoce epiù severa patologia, hanno più elevati livelli di linfo-citi Th17 che circolano in periferia e infiltrano il siste-ma nervoso centrale rispetto ai topi WT.

CONCLUSIONII nostri dati indicano che i linfociti Th22 costituisco-no un nuovo sottotipo cellulare patogenetico nellaSM e il loro aumento potrebbe essere un marcatorenel SP che potrebbe predire una recidiva. Inoltre, idati riguardanti la differente risposta all’IFNβ da par-te dei linfociti Th17 e Th22 suggeriscono che livellipiù alti o bassi di linfociti Th22 resistenti all’IFNβpossano contribuire alla refrattarietà alla terapia.Infine, i nostri studi che indicano come l’Hx sia ingrado di influenzare la generazione dei linfociti Th17durante la ESA, suggeriscono un ruolo anti-infiam-matorio di questa molecola, per cui la somministra-zione di Hx potrebbe essere un nuovo approccioterapeutico nelle malattie autoimmuni indotte dailinfociti T come la SM.

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RRMS patients and could promote Th22 invasion ofthe central nervous system by binding the specific re-ceptors expressed on brain blood barrier epithelialcells. Th22 cells in MS represent a distinct pathogenicsubset of CD4+ Th cells that share only some featureswith Th17 cells: CD161, together with RoRγT, are mo-lecular signatures of Th17 cells but not of Th22; bothsubsets express similar high expression of IL-23R, IL-7R and the transcription factor AhR that are importantfor their differentiation and stabilization. Of interest,both subsets express high level of Tβet in patientswith MS compared to HS indicating a more patho-genic phenotype of these subsets in the disease.In the second task of our research, we performed ex-periments planned to study the effect of IFNß in theregulation of Th17 and Th22 expansion in MS.Whereas Th17 cells were already described by ourgroup to be a selective target of the conventionaltherapy with IFN-β, we observed that Th22 cells ex-pressed lower level of IFNAR1 and were less sensitiveto in vitro IFN-β treatment compared to Th17 cells.Finally, to evaluate the role of Hx in MS, Experimen-tal Autoimmune Encephalomyelitis (EAE), the animalmodel of MS, was induced in Wild Type (WT) and Hx

knock-out (Hx-/-) mice. We observed that sera Hxlevel increased during EAE; Hx-/- mice developed aclinically earlier and more severe and pathologicallyexacerbated expression of EAE and higher amountof Th17 cells infiltrating the CNS and circulating inthe periphery compared to WT controls.

CONCLUSIONSOur data suggest that Th22 cells may constitute anew relevant pathogenic subset in multiple sclerosisand could be a PB marker that could predict theclinical or MRI signs of MS disease activity. More-over, the data that account for a differential re-sponse to IFNβ of Th22 cells compared to Th17cells suggest that the high or low proportion of IFNβresistant Th22 cell might contribute to refractorinessto the therapy.Finally, our observations that indicate that Hx couldinfluence the generation of Th17 response duringEAE, suggest an anti-inflammatory role of Hx in au-toimmune disease. Thus, Hx administration may bebeneficial in clinical settings in autoimmune dis-eases such MS, characterized by dysregulation ofT cell differentiation.


Rolla S, Bardina V, De Mercanti S, Quaglino P, De Palma R, Gned D, Durelli L, Novelli F and Clerico M. Th22 cells are expanded in multiple sclerosis andare resistant to IFNβ. J LeuK Biol. (Under revision)

Rolla S, Ingoglia G, Bardina V, Silengo L, Altruda F, Novelli F and Tolosano E. Acute-phase protein hemopexin is a negative regulator of Th17 responseand experimental autoimmune encephalomyelitis development. J Immunol. 2013, 191(11):5451-9

Rolla S, Clerico M, Bardina V, Quaglino P, Durelli L and Novelli F. Phenotypical and functional characterization of t helper 22 cells in multiple sclerosispatients. Keystone Symposia: Th17 Cells in Health and Disease, Keystone, Colorado, February 5 - 10, 2012

Rolla S, Ingoglia G, Bardina V, Silengo L, Altruda F Novelli F and Tolosano E. The acute-phase protein hemopexin regulates th17 cells and experimentalallergic encephalomyelitis development. European congress of Immunology 2012, Glasow, UK, September 5-8, 2012

Rolla S, Bardina V, Clerico M, Durelli L and Novelli F. Multiparametric analysis of Th17 and Th22 cells discloses their pathogenicity in human multiplesclerosis. 11th International Society of NeuroImmunology Congress, Boston, MA, November 4-8, 2012.

Ingoglia G, Rolla S, Bardina V, Silengo L, Altruda F Novelli F and Tolosano E. Hemopexin deficiency in mice resulted in enhanced th17 differentiation andexacerbated experimental autoimmune encephalomyelitis. fifth meeting of the international bioiron society, London UK, April 14 – 18, 2013

Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2011 per il periodo di 1 anno (prorogato di 3 mesi)e l’ammontare di 40.000 €


Angela BononiDipartimento di Morfologia, Chirurgia e Medicina Sperimentale, Sezione di Patologia GeneraleUniversità di Ferrara, Ferrara

MENTORE: Paolo Pinton

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Ruolo di proteine mitocondriali nella patogenesidella sclerosi multipla

PREMESSE E OBIETTIVILa sclerosi multipla (SM) è una malattia neurologicache colpisce il sistema nervoso centrale (SNC), ca-ratterizzata da demielinizzazione e neurodegenera-zione. Nonostante eziologia e patogenesi della SMnon siano ancora state comprese completamente,diversi studi suggeriscono che il danno infiamma-torio alla mielina e agli oligodendrociti (le cellule chegenerano la mielina nel SNC) siano alla base di svi-luppo e progressione della patologia. Inoltre, in di-verse patologie demielinizzanti si sono riscontrateanomalie nella funzionalità dei mitocondri, e recentievidenze hanno messo in luce come i mitocondrisiano coinvolti nella SM. Il corretto espletamentodelle funzioni mitocondriali è necessario per il cor-retto differenziamento degli oligodendrociti e la mie-linizzazione.I mitocondri sono organelli cellulari spesso descritticome le “centrali energetiche” della cellula. A livellomitocondriale avviene l’integrazione sia di segnalidi sopravvivenza che di morte, e ciò è controllatoprincipalmente sulla base della quantità di ioni Ca2+

che i mitocondri accumulano.Questo progetto di ricerca si è avvalso di differentiapprocci sperimentali volti ad una migliore com-prensione della complessa relazione tra omeostasidel Ca2+ mitocondriale e il differenziamento di oli-godendrociti precursori (OPCs), rivolgendo l’atten-zione in particolare alle alterazioni causate dallecondizioni infiammatorie che si osservano in pa-zienti con SM. Capire come tali eventi partecipanoalla patogenesi della SM potrà aprire la strada anuovi approcci terapeutici.

RISULTATIInizialmente è stato ottimizzato un protocollo perisolare e mantenere in vitro colture cellulari di pre-cursori oligodendrocitari, e il loro differenziamentoin oligodendrociti adulti. In seguito abbiamo indaga-

to se il differenziamento degli oligodendrociti è infi-ciato durante gli eventi infiammatori che caratteriz-zano la SM. Il Fattore di Necrosi Tumorale-alpha(TNF-α) è una delle principali citochine coinvolte nel-la patogenesi della SM. Abbiamo dimostrato che ilTNF-α compromette il differenziamento degli oligo-dendrociti.L’evento finale nel differenziamento degli oligoden-drociti è la produzione di mielina e l’avvolgimentodell’assone. Abbiamo misurato l’entità della mieli-nizzazione degli assoni in colture miste di cellulegliali e OPCs, dimostrando in tal modo che gli OPCsesposti al TNF-α hanno una ridotta capacità di for-mare mielina.Per determinare il meccanismo alla base della se-lettiva riduzione di differenziamento e mielinizzazio-ne negli OPCs, abbiamo analizzato la fisiologiamitocondriale in OPCs esposti al TNF-α. L’analisidell’omeostasi intracellulare del Ca2+ ci ha permes-so di dimostrare che il TNF-α altera in modo speci-fico l’accumulo mitocondriale di Ca2+ negli OPCs.Questa osservazione è stata ulteriormente confer-mata in colture miste di cellule gliali e OPCs.Al fine di capire meglio come il TNF-α danneggia imitocondri, abbiamo analizzato anche altri parame-tri mitocondriali. È stato interessante osservare co-me tale trattamento non altera la morfologia o ilnumero dei mitocondri, ma bensì causa una mar-cata riduzione del potenziale di membrana mitocon-driale (MMP), a suggerire una ridotta attività dellacatena respiratoria.È stato dimostrato che una compromissione dellacatena respiratoria può alterare la produzione dispecie reattive dell’ossigeno (ROS), ed è stato pro-vato che il TNF-α ha il medesimo effetto. Nei nostriesperimenti abbiamo osservato un aumento dei li-velli di ROS in OPCs trattati con TNF-α, insieme aduna forte riduzione dell’attività del complesso I dellacatena respiratoria. Abbiamo usato FCCP (carbo-

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Involvement of mitochondrial proteins in the pathogenesisof multiple sclerosis

INTRODUCTION AND AIMSMultiple sclerosis (MS) is a neurological disorder ofthe central nervous system (CNS) characterized bydemyelination and neurodegeneration. Although thepathogenesis of MS is not completely understood,various studies suggest that inflammatory damageto myelin and oligodendrocytes (the myelin-formingcells of the CNS) is associated with the develop-ment and progression of MS. Also mitochondrialdysfunction is frequently associated with demyeli-nating disease, and recent evidences pointed outthe involvement of mitochondria in MS. Mitochon-drial functions are required for proper oligodendro-cytes differentiation and myelination.Mitochondria are cellular organelles often describedas the “powerhouses” of the cell. Integration of sur-vival and death stimuli occurs on mitochondria, andit is mainly controlled by the accumulation of calci-um ions (Ca2+) inside these organelles.The project utilized a variety of experimental ap-proaches to shed light on the complex relationshipbetween mitochondrial Ca2+ homeostasis and theprocess of differentiation in oligodendrocyte precur-sors (OPCs), with special focus on alterationscaused by the inflammatory processes occurring in

MS. Further understanding of how these eventsparticipate in the pathogenesis of MS and can pro-vide rationale for novel therapeutic approaches.

RESULTSWe first established a protocol for isolation and invitro culture of oligodendrocytes progenitors as wellas their differentiation into mature oligodendrocyte.Than we investigated if oligodendrocyte differenti-ation may be affected during the inflammatoryevents that characterize MS. Tumour Necrosis Fac-tor alpha (TNF-α) is one of the most relevant cy-tokines involved in the pathogenesis of MS. Wefound that TNF-α impairs oligodendrocyte differen-tiation. The final event in oligodendrocyte differen-tiation is the production of myelin and theensheathment of axons. We measured the extent ofaxonal myelination in mixed glia and OPCs co-cul-ture, and found that OPCs exposed to TNF-α haveimpaired myelin formation activity.To determine the mechanism for the selective im-pairment of OPCs differentiation and myelinatingcapacity, we examined mitochondrial physiology inOPCs exposed to TNF-α. We analysed intracellularCa2+ homeostasis and found that TNF-α selectively

nylcyanide-p trifluoromethoxyphenylhydrazone), undisaccoppiante mitocondriale, per riprodurre il calodi MMP generato dal TNF-α. FCCP è stato in gradodi riprodurre la diminuzione di MMP osservata incellule trattate con TNF-α, ed è stato inoltre in gra-do di ridurre il differenziamento degli OPCs in modoanalogo al TNF-α.Questi risultati suggeriscono che il TNF-α riduce ildifferenziamento degli oligodendrociti attraverso lacompromissione dell’attività del complesso I dellacatena respiratoria negli OPCs, che si riflette inun’aumentata produzione di superossido, con con-seguenti riduzioni del MMP e dell’accumulo mito-condriale di Ca2+.Sulla base di questi risultati, abbiamo ipotizzato unacompromissione del metabolismo nelle celluleesposte al TNF-α. Un alterato metabolismo mito-condriale causa elevati livelli di AMP e l’attivazione

del sensore metabolico AMPK (AMP-activated pro-tein kinase). Abbiamo dimostrato che i livelli diAMPK aumentano durante l’esposizione al TNF-α,ed, inoltre, l’attivazione farmacologica di AMPK conmetformina ha un effetto sinergico con il TNF-αnell’inibire il differenziamento degli OPCs.

CONCLUSIONII dati da noi raccolti indicano che il TNF-α causa al-terazioni metaboliche inducendo un danno ai mito-condri e attivando AMPK, con conseguente bloccodel differenziamento degli OPCs.Questi risultati ci permettono di comprendere inmodo più approfondito i meccanismi che portanoalla formazione delle lesioni e alla loro mancata ri-mielinizzazione nella SM, e suggeriscono possibilistrategie terapeutiche basate su farmaci in grado dimodulare le funzioni mitocondriali.

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Bonora M, De Marchi E, Patergnani S, Suski JM, Celsi F, Bononi A, Giorgi C, Marchi S, Rimessi A, Duszynski J, Pozzan T, Wieckowski MR, Pinton P(2014) Tumor necrosis factor-α impairs oligodendroglial differentiation through a mitochondria-dependent process. Cell Death Differ In press

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Borsa di ricerca finanziata con il Bando 2010 per il periodo di 2 anni e l’ammontare di 50.000 €

COMPENDIO 2014

impairs mitochondrial Ca2+ uptake in OPCs. We fur-ther confirmed this observation in the mixed glialco-culture system.To better understand how TNF-α promotes mito-chondrial impairment, we analyzed other mitochon-drial parameters. Interestingly, while mitochondriain treated cells did not significantly change in nei-ther size nor number, they displayed a strong reduc-tion of mitochondrial membrane potential (MMP),suggesting a decrease in their respiratory chain ac-tivity. It has been reported that an impairment of therespiratory chain can alter reactive oxygen species(ROS) production, and TNF-α has been shown tohave the same effect. We found increased ROS lev-els in TNF-α-treated OPCs and a strong reductionin respiratory complex I activity. We used carbonyl-cyanide-p trifluoromethoxyphenylhydrazone (FC-CP), a mitochondrial uncoupler, to mimic the MMPimpairment generated by TNF-α. FCCP was able toreproduce the lowered MMP observed in cells treat-ed with TNF-α, and was also able to reduce OPCsdifferentiation in a similar way to TNF-α. These re-sults suggest that TNF-α damages oligodendrocyte

differentiation by impairing respiratory complex I inOPCs, with subsequent increased superoxide lev-els, lowered MMP and consequently reduced mito-chondrial Ca2+ uptake.Based on these results, the cells exposed to TNF-αwere expected to display metabolic impairment. Theimpairment of mitochondrial metabolism might in-crease the levels of AMP and the activation of the me-tabolism sensor AMP-activated protein kinase(AMPK). We demonstrated that AMPK levels are in-creased during TNF-α exposure, and AMPK pharma-cological activation with metformin exerts a synergisticeffect with TNF-α to inhibit OPCs differentiation.

CONCLUSIONSOverall our data indicates that TNF-α is able to in-duce a metabolic alteration driven by mitochondrialimpairment and AMPK activation, resulting in a dif-ferentiation blockade of OPCs. These results pro-vide new insights the understanding of lesionformation and remyelination failure in MS and sug-gest possible therapeutic strategies based on drugsthat modulate mitochondrial functions.

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PREMESSE E OBIETTIVIIl ruolo dei neuropeptidi nella sclerosi multipla staassumendo una rilevanza crescente. Nostri risultatipreliminari hanno mostrato che il ‘Calcitonin Gene-Related Peptide’ (CGRP) inibisce il rilascio di cito-chine infiammatorie e ossido nitrico dalla microgliaattivata in vitro. Questa azione e la diffusa espressio-ne del peptide e del suo recettore nel sistema nervo-so centrale (CNS) ci hanno fatto ipotizzare un suoruolo nei processi neuroinfiammatori che caratteriz-zano la SM. Questo studio analizza il coinvolgimentodel CGRP e di un componente citoplasmatico del re-cettore, ‘CGRP-Receptor Component Protein (RCP)’,nella encefalite autoimmune sperimentale (EAE) me-diante l’analisi di i) effetti dell’induzione di EAE in topiknockout per il gene alfa-CGRP (ceppo 129S6), ii) ef-fetti della somministrazione lombare cronica nel liquordurante l’EAE, iii) effetti dell’induzione di EAE nel-l’espressione di RCP.

RISULTATIL’immunizzazione con MOG35-55 in topi 129S6 wildtype ha prodotto la forma leggera di EAE cronica de-scritta in questo ceppo, mentre in topi knockout haprodotto una forma più severa. Il punteggio clinicoseguiva la scala topi knockout > eterozigoti > wildtype. Il progetto verteva sull’uso di questi topi, ma ilprogramma è stato bloccato da una contaminazione

della colonia che l’ha resa inservibile. Per otteneredati funzionali, abbiamo adottato una nuova tecnica,la somministrazione cronica di CGRP nel liquor lom-bare di topi mediante minipompe osmotiche.La somministrazione di CGRP durante le prime duesettimane post-immunizzazione ha ridotto il punteg-gio clinico. Un’analisi morfologica quantitativa dellamicroglia ha mostrato che il CGRP inibisce parzial-mente l’attivazione della microglia stessa, mentrenon ha effetti sull’espressione di GFAP negli astro-citi, la densità cellulare e l’infiltrazione linfocitaria. Inperiferia, i linfociti non hanno mostrato alterazioni diproduzione di interferon-gamma, TNF-alpha, IL-17,IL-2 e IL-4, suggerendo che l’azione del CGRP fosseconfinata al CNS.Il coinvolgimento del recettore è stato analizzato inun terzo modello sperimentale, l’EAE riacutizzante-remittente, indotta da PLP139-151, in topi SJL. Nel-la sostanza bianca, in condizioni fisiologiche RCPè espresso in microglia, astrociti, oligodendrociti ecellule endoteliali, mentre durante l’EAE è espressoanche nei linfociti infiltranti. Nei topi EAE l’espres-sione di RCP era aumentata in fase di riacutizzazio-ne (nei siti di lesione), sebbene senza correlazionecon la densità cellulare. Nessuna differenza durantela remissione. La localizzazione nucleare di RCPnella microglia era aumentata sia dall'EAE che dallasomministrazione intraliquorale di CGRP. L’EAE in-

Stefano MoraraIstituto di Neuroscienze, CNR, Milano

COLLABORATORI:Claudia Sardi, Marco Righi, Laura Zambusi, Alessia De Simone

COLLABORAZIONI CON ALTRI GRUPPI:Luciano Provini, Istituto di Fisiologia Generale e Chimica Biologica, Università di Milano, MilanoRoberto Furlan, Annamaria Finardi, Francesca Ruffini, Divisione di Neuroscienze,Unità INSPE, Istituto Scientifico San Raffaele, MilanoFabio Grohovaz, Daniele Zacchetti, Divisione di Neuroscienze, Neurofisiologia Cellulare,Istituto Scientifico San Raffaele, MilanoIan M Dickerson, Department of Neurobiology and Anatomy, University of Rochester, NY, USAAdviye A Tolun, Department of Biochemistry & Molecular Biology, University of Miami, USA

Ruolo protettivo di Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP)nella patogenesi dell’EAE

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INTRODUCTION AND AIMSThe role of neuropeptides in multiple sclerosis patho-genesis is emerging. Previous results of ours showedthat Calcitonin gene-related peptide (CGRP) potentlyinhibits the release of inflammatory cytokines and ni-tric oxide from activated microglia in vitro. This anti-inflammatory action and the widespread distributionof both the peptide and its receptor in several areasof the central nervous system (CNS) led us to hy-pothesize a role in neuroinflammatory processes. Inthe current study we addressed the involvement ofCGRP and a cytoplasmic component of its receptor,CGRP-Receptor Component Protein (RCP), in ex-perimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) byanalyzing i) the effects of EAE induction in alpha-CGRP null mutant mice (strain 129S6), ii) the effectsof lumbar CSF chronic delivery of CGRP during EAE,iii) the effects of EAE induction in RCP expression.

RESULTSImmunization with MOG35-55 in wild type 129S6mice induced the mild form of chronic EAE de-

scribed for this strain whereas in alpha-CGRP nullmice induced a more severe form of EAE. Thescores followed the scale alpha-CGRP null > het-erozygote > wild type.The experimental backbone of the project was builton the usage of alpha-CGRP null mice, but the sub-sequent unavailability of the colony (due to a majorhealth outbreak) blocked this plan. Thus, we intro-duced a novel experimental approach capable toprovide functional data: CGRP administration intospinal CSF by osmotic minipumps. CGRP deliveryinto lumbar cerebrospinal fluid (CSF) reducedchronic EAE clinical score when administered dur-ing the first two weeks after immunization. A quan-titative morphological analysis of microglia shaperevealed that CGRP partially inhibited microglia ac-tivation. GFAP expression in astrocytes, cell densityand lymphocyte infiltration were not affected. In ad-dition, peripheral lymphocytes did not alter the pro-duction of interferon-gamma, TNF-alpha, IL-17, IL-2and IL-4, suggesting that the action of CGRP wasexerted from within the CNS.

Protective role of Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP)in EAE pathogenesis

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duceva, invece, una sua diminuzione negli astrociti,e non induceva cambiamenti nella localizzazionenucleare di CLR (componente di membrana del re-cettore) nella microglia. Infine, l’espressione diCGRP era aumentata nei motoneuroni.In studi in vitro, è stata confermata l’azione anti-in-fiammatoria di CGRP sulla microglia attivata sia conLPS, sia con altri stimoli pro-infiammatori, quali, ades., beta-amiloide fibrillare: CGRP inibiva il rilasciodi IL-6, l’induzione di iNOS e la produzione di NO(Consonni et al., in preparazione). Una analisi tra-scrittomica di colture gliali in condizioni di controlloe stimolazione ha confermato che il peptide inibisceil processo di attivazione indotto dagli stimoli pro-infiammatori, rivertendo lo stato gliale ad uno statodi base, invece di dirigerlo verso uno stato di atti-vazione alternativa (ad es., tipo M2).Un’analisi bioinformatica ha mostrato che il CGRPinibisce l’attivazione indotta da LPS con un mecca-nismo che coinvolge, ma non è limitato a, l’attiva-zione mediante cAMP. Gli inibitori della via della

MAPK (PD98059 per MEK e SB203580 per p38)non sono stati in grado di inibire l’effetto del peptidesulla microglia.

CONCLUSIONIIn conclusione, il CGRP inibisce l’attivazione micro-gliale in vivo, ed il peptide ed il suo recettore pos-sono rappresentare nuovi fattori endogeni coinvoltinella patogenesi dell’EAE, almeno durante la sua fa-se di sviluppo. Il ruolo protettivo del CGRP potreb-be essere mediato dalla traslocazione intracellularedifferenziale (che viene modulata dall’EAE) in spe-cifici tipi cellulari del CNS, contribuendo all’aumen-to della segnalazione attraverso il recettore.L’utilizzo della somministrazione lombare intraliquo-rale del peptide, potrebbe permettere di verificare ilcoinvolgimento di una attivazione cronica della mi-croglia (e, più in generale, della glia) nella fase croni-co-progressiva della sclerosi multipla, permettendoquindi di identificare nuovi meccanismi patogeneticie, di conseguenza, nuovi bersagli terapeutici.

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The involvement of the receptor in CGRP effectswas addressed by RCP analysis in a third model,PLP139-151-induced relapsing-remitting EAE (inSJL mice). Under physiological conditions, RCPwas expressed in microglia, astrocytes, oligoden-drocytes, vascular endothelial cells, and also in in-filtrating lymphocytes of EAE mice, in spinal cordwhite matter. In relapsing-remitting EAE RCP wassignificantly increased in lesion areas during re-lapse, whereas no significant difference was detect-ed during remission. No correlation with cell densitywas found. A nuclear localization of RCP (stimulat-ed by CGRP, in vitro) increased in microglia cells inEAE mice or after CGRP CSF application. EAE, in-stead, decreased it in astrocytes, whereas did notchange the nuclear localization of CRL (a menbranereceptor component). Finally, CGRP was increasedin motoneurons during EAE.In in vitro studies, CGRP excerted an anti-inflam-matory effects also on other pro-inflammatory stim-uli, such as amyloid-beta, by inhibiting the increaseof interleukin-6 secretion, iNOS induction and NOproduction (Consonni et al, in preparation). A tran-scriptomic analysis of glial cultures confirmed thatthe neuropeptide acts by inhibiting the process ofactivation induced by pro-inflammatory factors, re-verting the glial cells to the resting state, rather than

diverting them towards alternative (e.g. M2-like)phenotypes.A bioinformatics data analysis showed that CGRPinhibits the LPS-induced activation with a mecha-nism that implies, but is not limited to the activationof the cAMP pathway. Inhibitors of the MAPK path-ways (PD98059 for MEK and SB203580 for p38)were not able to revert the neuropeptide effects onmicroglia.

CONCLUSIONSIn conclusion, CGRP is able to inhibit microglia ac-tivation in vivo, and the peptide and its receptormay represent novel endogenous protective factorsin EAE pathogenesis, at least during the developingphase of the disease. The protective effect of CGRPcould be mediated by the differential intracellulartranslocation of RCP (dynamic during EAE) in spe-cific cell types of CNS, resulting in enhanced sig-naling from the CGRP receptor. The use of thechronic lumbar CSF delivery of the peptide mightallow to address the question of the involvement ofchronic microglia (and glia in general) activationduring the chronic-progressive phase of the dis-ease, thus possibly leading to more precise defini-tion of the pathogenetic mechanisms thus pavingthe way to new therapeutic approaches.


Sardi C, Zambusi L, Finardi A, Ruffini F, Tolun AA, Dickerson IM, Righi M, Zacchetti D, Grohovaz F, Provini L, Furlan R, Morara S. Involvement of CalcitoninGene-Related Peptide and Receptor Component Protein in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroimmunology, DOI information:10.1016/j.jneuroim.2014.03.008.

Morara S, Zambusi L, Finardi A, Ruffini F, Tolun AA, Dickerson IM, Righi M, Zacchetti D, Grohovaz F, Provini L, Furlan R, Sardi C. Involvement of CalcitoninGene-Related Peptide and Receptor Component Protein in experimental autoimmune encephalomyelitis.9th FENS Forum of Neuroscience, Milan, July 5th-9th 2014.

Sardi L, Zambusi C Bergami A, Ruffini F, Tolun AA, Dickerson IM, Righi M, Zacchetti D, Grohovaz F, Provini L, Furlan R, Morara S. Protective role of Cal-citonin Gene-Related Peptide (CGRP) in EAE pathogenesis.FISM Annual Scientific Congress, Rome, May 29th-30th 2013.

Sardi L, Zambusi C Bergami A, Ruffini F, Dickerson IM, Zacchetti D, Grohovaz F, Provini L, Furlan R, Morara S. Involvement of Calcitonin Gene-RelatedPeptide (CGRP), Adrenomedullin And Receptor Component Protein (RCP) in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).FISM Annual Scientific Congress, Rome, May 30th-31st 2012.



Laura PiccioDepartment of Neurology, Washington University in St Louis, St Louis, USA

COLLABORATORI:Anne H. Cross, Claudia Cantoni, Mike Ramsbottom, Robert Mikesell

COLLABORAZIONI CON ALTRI GRUPPI:Marco Colonna, Marina Cella, Washington University in St Louis, St Louis, USA

COMPENDIO 2014

Ruolo di TREM2 nella sclerosi multipla e nel suo modelloanimale

PREMESSE E OBIETTIVILa sclerosi multipla (SM) è una malattia autoimmu-ne (in cui il sistema immunitario reagisce contro ilself) causata da una attacco verso componenti delsistema nervoso centrale (SNC). La patologia dellaSM è caratterizzata da infiammazione cronica, de-mielinizzazione e neurodegenerazione nel SNC.Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-2(TREM2) è un recettore immunitario espresso damicroglia, macrofagi e cellule dendritiche, tutte cel-lule che modulano le risposte immunitarie e sonoimplicate nella SM. Sappiamo che TREM2 ha unaimportante funzione protettiva nel SNC perché unamutazione del suo gene nell’uomo causa neurode-generazione con perdita di mielina e assoni. Recen-temente è stato dimostrato che delle variantigenetiche di TREM2 sono associate a un maggiorerischio di sviluppare la malattia di Alzheimer e altremalattie neurodegenerative. Nel modello animaledella SM, l’encefalomielite sperimentale allergica(ESA), abbiamo dimostrato che bloccando TREM2si osserva un peggioramento clinico delle malattia.Nelle persone con SM, TREM2 è espresso ad alti li-velli dalla microglia/macrofagi nelle lesioni nel SNCe abbiamo identificato una forma solubile di TREM2i cui livelli sono aumentati nel fluido cerebrospinaledi pazienti con SM. D’altra parte poco si conoscesulla funzione di TREM2 e sul suo ligando/i. Lo sco-po di questo progetto è stato quello di caratterizza-re il ruolo regolatorio di TREM2 e della sua formasolubile nei modelli animali della SM (Scopo1 delprogetto). Abbiamo anche studiato la funzione delrecettore TREM2 e della sua forma solubile nel mo-dulare le attività di macrofagi e cellule dendritichein persone sane e con SM (Scopo 2).

RISULTATICome proposto nello Scopo 1 di questo progettoabbiamo condotto diversi studi nel modello anima-le, l’ ESA. In particolare abbiamo studiato il decorsoclinico della malattia in topi geneticamente deficien-ti per il recettore TREM2, topi TREM2 knock-out(TREM2 KO), rispetto a topi wild-type (WT) o con-trollo. Complessivamente questi studi non hannoevidenziato delle differenze nei due gruppi nel de-corso clinico dell’ESA dopo immunizzazione con di-versi componenti della mielina. Anche l’analisiistologica nel SNC non ha identificato delle diffe-renze tra i due gruppi. Abbiamo quindi testato unanuova ipotesi e cioè che TREM2 potrebbe svolgereuna funzione immunomodulatoria solo in particolaricondizioni. A questo riguardo è noto che il tratta-mento con lipopolisaccaride (LPS-un componentebatterico) prima dell’immunizzazione riduce la se-verità della malattia attraverso meccanismi solo inparte conosciuti. Abbiamo ipotizzato che TREM2possa essere implicato in questa protezione daLPS. Topi WT e TREM2 KO sono stati trattati conLPS prima delle induzione di ESA. Come atteso iltrattamento con LPS nei topi WT ha portato ad unamalattia meno severa, mentre questo effetto è statomeno pronunciato nei TREM2 KO. Questo supportal’ipotesi che TREM2 possa mediare alcuni effetti im-munomodulatori dell’LPS. In differenti esperimentidi ESA abbiamo dimostrato che il trattamento conla forma solubile di TREM2 migliora il decorso cli-nico. Successivamente, abbiamo testato il possibileruolo di TREM2 in un modello di demielinizzazione-rimielinizzazione nel SNC indotto con cuprazone. Inquesto modello non c’è attivazione di una rispostaautoimmunitaria e la microglia gioca un ruolo chia-

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ve. Abbiamo osservato nei topi TREM2 KO maggio-re danno alla mielina, agli assoni e accumulo di de-triti mielinici. Abbiamo inoltre riscontrato un numerominore di microglia nei topi TREM2 KO nelle areeinteressate dalla patologia. Questo può riflettere undifetto di proliferazione o di reclutamento delle cel-lule microgliali nei topi TREM2 KO, cosi come un di-fetto delle funzioni fagocitarie durante acutademielinizzazione.Recentemente la comunità scientifica internaziona-le ha evidenziato il ruolo critico svolto da TREM2 inmalattie neurodegenerative nell’uomo, incluse lamalattia di Alzheimer e di Parkinson. Queste evi-denze supportano gli studi nell’uomo proposti nellaScopo 2 della nostra ricerca. Abbiamo studiato invitro gli effetti di un anticorpo diretto contro TREM2e della forma solubile di TREM2 sulle funzioni fago-citarie e la produzione di citochine di macrofagi ecellule dendritiche umane senza ottenere alcun ri-sultato significativo. Abbiamo quindi intrapresoun’altra direzione per studiare la funzione di TREM2nell’uomo. In particolare, abbiamo ottenuto deicampioni di sangue da due fratelli affetti da malattiadi Nasu-Hakola (le cui cellule non esprimono

TREM2 a causa di una mutazione) e da persone sa-ne. Abbiamo caratterizzato la mutazione geneticain questa famiglia ed eseguito degli studi di micro-scopia elettronica e di espressione genica (attraver-so microarrays) utilizzando macrofagi derivati dallecellule del sangue di questi soggetti o di personesane. Non abbiamo osservato differenze da un pun-to di vista morfologico nei macrofagi derivati dai pa-zienti rispetto alle persone sane, ma abbiamoriscontrato invece differenze di espressione genica.

CONCLUSIONIIn questo progetto abbiamo utilizzato diversi mo-delli animali della SM per capire il ruolo di TREM2nella malattia. Abbiamo dimostrato che la mancan-za di TREM2 non ha un impatto importante sul de-corso clinico e la patologia della ESA. Al contrario,nel modello di demielinizzazione indotto con il cu-prazone la mancanza di TREM2 si associa a mag-giore danno tissutale, molto probabilmente legatoa un difetto di funzione microgliale. Lo scopo diquesta ricerca è stato quello di capire il ruolo diTREM2 nella SM e di identificare delle nuove pos-sibili strategie terapeutiche.

Role of TREM2 in multiple sclerosis and its animal model

INTRODUCTION AND AIMSMultiple sclerosis (MS) is believed to be mediatedby an autoimmune response directed against cen-tral nervous system (CNS) components. MS pathol-ogy is characterized by chronic inflammation,demyelination, and neurodegeneration within theCNS. Triggering receptor expressed on myeloidcells-2 (TREM2) is an immune receptor expressedin microglia, macrophages (Macs) and dendriticcells (DCs), all cells that can modulate immune re-sponses and are implicated in MS pathogenesis.TREM2 has important protective functions in theCNS, as its genetic deficiency in humans causesneurodegeneration with myelin and axon loss. Re-cently it was also shown that TREM2 genetic vari-ants are associated with increased risk to developAlzheimer’s disease (AD) and other neurodegener-ative diseases. In the experimental autoimmune en-cephalomyelitis (EAE) animal model of MS, weshowed that blockade of TREM2 worsened the dis-

ease. In MS patients, we demonstrated that TREM2is highly expressed by Macs/microglia in active MSlesions, and we identified a novel soluble form ofTREM2 which was elevated in the cerebrospinal flu-id of MS subjects. However, TREM2 biology is notfully understood; its function is still elusive and itsnatural ligand is unknown. The goal of this applica-tion was to further characterize the regulatory roleof TREM2 receptor and its soluble counterpart inMS animal models (Aim 1). We also evaluated thefunction of TREM2 receptor and soluble TREM2 inmodulating the activities of human Macs and DCsin healthy people compared to MS subjects (Aim 2).

RESULTSAs proposed in Aim 1 of our application, we haveperformed several studies in the EAE model. Wehave compared EAE clinical course in TREM2knock-out (TREM2 KO) and wild-type (WT) mice.Overall these studies did not show any consistent

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difference in EAE clinical course in the two groupswhen they were immunized with different myelin anti-gens. Analyses of the pathology in the spinal cord al-so did not detect significant differences in the twogroups. Therefore, we tested a novel hypothesis con-sidering that TREM2 might exert an immunomodu-latory function only in particular conditions. It isknown that treatment with lipopolysaccharide (LPS-a bacterial component) before EAE induction re-duces disease severity through partially understoodmechanisms. We postulated that TREM2 might beimplicated in this protection by LPS. We performedexperiments in which WT and TREM2 KO mice weretreated with LPS before EAE induction. As expectedin WT mice treated with LPS, EAE was less severecompared to the control group treated with PBS. InTREM2 KO mice the protection given by LPS treat-ment was less pronounced compared to WT mice.This supports the hypothesis that TREM2 mediates,at least in part, some of the immunomodulatory ef-fects of LPS in EAE. In separate experiments wehave demonstrated that treatment with solubleTREM2 was able to ameliorate EAE clinical course.Next, we decided to test a possible role for TREM2in a less complicated animal model (not mediated byan autoimmune response) of demyelination-remyeli-nation, the cuprizone-toxicity model, where microgliaplay a key role. In TREM2 KO mice, we observedmore pronounced myelin damage and more axonalbeading with greater accumulation of myelin debriscompared to WT. Fewer microglia were observed inthe TREM2 KO mice at sites of pathology. This mayreflect a defect of proliferation or recruitment of mi-croglia in TREM2 KO mice, as well defective phago-cytic function during acute demyelination.During the period of funding several lines of evidence

suggested a critical role of TREM2 in neurodegener-ative diseases, including AD and Parkinson’s dis-ease. This lend further support for the human studiesproposed in Aim 2 of the original proposal. We havetested the effects of an antibody against TREM2 andsoluble TREM2 on human Mac and DC cytokine pro-duction and phagocytic function in vitro. We did notdetect any effect that could justify further pursuingthese studies. Therefore we have undertaken anotherdirection to evaluate TREM2 functions in humans.Specifically, we have obtained blood samples fromtwo Italian siblings affected by Nasu-Hakola disease(NHD), a rare genetic disease characterized my mu-tations in the TREM2 gene. We have characterizedthe genetic mutation in the two affected siblings. Invitro derived macrophages from these subjects wereused for different studies including electron mi-croscopy and gene expression analyses by microar-rays. We did not observe differences by electronmicroscopy in NHD cells compared with healthysubjects, but there was differential gene expressionnoted.

CONCLUSIONSThis project has used different MS animal modelsand human specimens to understand the possiblerole of TREM2 in MS. TREM2 genetic deficiency didnot have a robust impact on EAE disease clinicalcourse and pathology. In contrast, in the cuprizone-induced model of demyelination, TREM2 deficiencywas associated with more tissue damage very likelydue to defective microglial functions. The goal ofthese studies was to expand our understanding onthe role of TREM2 in MS, and potentially to identifynovel therapeutic strategies that target TREM2pathways.

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Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2009 per il periodo di 2 anni (prorogato di 12 mesi)e l’ammontare di 120.000 €

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PREMESSE E OBIETTIVIL’ambiente condivide con la genetica la responsabi-lità dello sviluppo della sclerosi multipla (SM), proba-bilmente almeno in parte grazie alla capacità diagenti infettivi di modulare il sistema immune. Unruolo importante nel determinare l’esito delle infezioniè giocato da recettori degli organismi superiori, spe-cifici per i patogeni infettivi, tra i quali la famiglia me-glio studiata ed essenziale allo sviluppo della EAE (ilmodello sperimentale della SM) è quella dei TLR. Noiabbiamo dimostrato in precedenza che prodotti de-rivati dal micobatterio della tubercolosi sono in gradodi modulare la mobilità delle cellule T coinvolte nellapatogenesi della EAE, e avevamo dati preliminari cheindicavano che varianti spontanee in ceppi di topi diuno dei TLR (TLR2) regolano sia la mobilità delle cel-lule T e modulano l’andamento clinico della EAE. Gliobbiettivi di questo progetto erano definire la loca-lizzazione cellulare di TLR2 rilevante per la mobiliz-zazione delle cellule T e per la modulazione dell’EAE,di definire i meccanismi molecolari attraverso cuiTLR2 influenza la mobilità e l’EAE e definire il ruolodi TLR2 nel nostro modello di EAE post-infettiva.

RISULTATINel corso del progetto abbiamo raccolto una grandequantità di informazioni sul ruolo di TLR2 come mo-dulatore della EAE. Per prima cosa abbiamo dimo-strato che TLR2 regola la mobilità delle cellule Tdirettamente sulle stesse cellule T specifiche per il si-stema nervoso centrale (CNS). Mentre l’analisi dellecellule T mediante microarray di mRNA non ha fornitoalcuna informazione sui meccanismi molecolari che

sottendono a questo ruolo di TLR2, abbiamo trovatoche le varianti di TLR2 regolano finemente i livelli diespressione di una molecola (denominata CD44)coinvolta sia nella mobilità delle cellule attraverso itessuti , sia nella patogenesi della EAE. Anche questaazione di TLR2 é mediata dal TLR2 espresso diretta-mente sulle cellule T stesse. Successivamente abbia-mo confermato ed approfondito il ruolo delle variantidi TLR2 nell’andamento clinico della EAE. Infatti, ab-biamo dimostrato che le varianti di TLR2 influenzanodifferenti aspetti della malattia attraverso meccanismiindipendenti. La severità di malattia sembra legata al-la capacità di TLR2 di modulare l’attività delle cellulepresentanti l’antigene (cellule B e cellule dendritichenei linfonodi, microglia nel SNC) che a loro volta pro-muovono o ostacolano la capacità delle cellule T disostenere l’infiammazione che in ultima analisi dan-neggia il SNC. Dall’altra parte, l’abilità della malattiadi andare incontro ad una spontanea e transitoria re-missione dei sintomi è anch’essa influenzata da va-rianti di TLR2, ma sembra piuttosto legata allacapacità di TLR2 espresso direttamente sulle celluleT di modularne lo sviluppo verso il fenotipo regolato-rio. Un’altra osservazione interessante è che le va-rianti di TLR2 influenzano anche la frequenza con cuivengono trovate lesioni di tipo infiltrativo nel cervello.Sebbene sia intrigante l’idea che lo stesso meccani-smo influenzi la mobilità delle cellule T ed la distribu-zione degli infiltrati nel SNC, non abbiamo per oraevidenze in questa direzione. Infine, abbiamo osser-vato che le varianti di TLR2 non modulano il nostromodello di EAE post-infettiva, che dipende principal-mente dalle cellule T CD8+ autoreattive, rispetto ai

Meccanismi molecolari del trasferimento delle informazioniambientali alle cellule T nella patogenesi dell’EAE:ruolo del TLR2

Francesco RiaIstituto di Patologia Generale, Università Cattolica del S. Cuore, Roma

COLLABORATORI:Chiara Nicolò, Gabriele Di Sante, Giuseppe Migliara, Alessia Piermattei,Mariagrazia Valentini, Monica Becattini

COLLABORAZIONI CON ALTRI GRUPPI:Gabriela Constantin, Università di Verona, VeronaMaria Foti, Università Milano “Bicocca”, Milano

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Molecular mechanism transmitting informationfrom environment to encephalitogenic T cellsin the pathogenesis of EAE: role of TLR2

INTRODUCTION AND AIMSEnvironment shares the responsibility in the deter-mination of multiple sclerosis (MS) with genetic,possibly in part because of the ability of infectiousagents to modulate the immune system. A majorrole in determining the outcome of infections isplayed by host’s receptors specific for pathogens,among which Toll like Receptors (TLRs) is the beststudied family and essential to development of EAE,the experimental model for MS. We had previouslyshown that motives derived from Mycobacteriumtuberculosis regulate the trafficking of T cells in-volved in the determination of EAE, and had prelim-inary information that variants of one of this TLRs(TLR2) naturally occurring in mice regulated T cellmobility and modulated clinic of EAE. The aims ofthis project were to define the cellular localizationof TLR2 relevant for mobilization T cells and EAE,to define the molecular mechanisms by which it af-fects trafficking and EAE, and to address the role ofTLR2 in our model post-infectious EAE.

RESULTSDuring this project, we collected a wealth of infor-mation about the role of TLR2 as a modulator ofEAE. First, we demonstrated that TLR2 regulatesmobility of T cell directly on CNS-specific T cells.While microarray analysis of T cells did not provideany hint on the molecular mechanisms of this abilityof TLR2, we found that TLR2 variants finely regulatethe levels of expression of a molecule (named CD44)involved in T cell mobility through tissues and in thepathogenesis of EAE. Also this action is mediatedby TLR2 expressed on the very same T cells. Next,

we confirmed and extended our preliminary obser-vation about clinic of EAE. In fact we showed thatthe variants of TLR2 dictate several aspects of thedisease, apparently through independent mecha-nisms. The severity of the disease appears linked tothe ability of TLR2 variants to modulate the activityof cells called APC (DC and B cells in the lymphnodes and mainly microglia in the CNS) that in turnenhance or hinder the pro-inflammatory attitude ofT cells that ultimately damages the CNS. On the oth-er hand, the ability of disease to achieve a sponta-neous and transient remission of symptoms is alsodictated by TLR2 variants, but appears rather linkedto the ability of TLR2 (expressed directly by T cells)to modulate their development towards a down-reg-ulatory phenotype. Intriguingly, we find that variantsof TLR2 influence also the frequency of lesions with-in the brain. Although it is suggestive to hypothesizethat the same mechanism influences T cell mobilityand distribution of the infiltrates in the CNS, we haveno evidences in this direction. Finally, we found thatTLR2 variants do not modulate clinic of our modelpost infectious EAE, a model EAE that relies mainlyon CD8+ CNS specific T cells, instead of CD4+ cellsas most EAE models.Thus, we can conclude that TLR2 behaves as a rel-evant modulator of clinic of EAE through multiplemechanisms.

CONCLUSIONSThe role of environment in the development of MShas been largely demonstrated. It is also well knownthat a large variability exist in course of the diseaseat the individual level. The work performed in this

modelli classici di EAE che dipendono prevalente-mente dalle cellule T CD4+.

CONCLUSIONIIl ruolo dell’ambiente nello sviluppo della SM è statoampiamente dimostrato. È anche noto che esisteuna ampia variabilità individuale del decorso dellamalattia. Il lavoro compiuto nel corso del presenteprogetto evidenzia un nuovo meccanismo attraver-

so cui agenti infettivi (indipendentemente dalla lorocapacità intrinseca di causare malattie) possonomodulare l’andamento clinico della SM. Questomeccanismo patogenetico può divenire un bersa-glio per interventi terapeutici che abbiano l’obbiet-tivo di influenzare la velocità di progressione dellamalattia, attraverso la modificazione dell’ambientemicrobico o farmaci in grado di interferire con i varicomponenti del meccanismo stesso.

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Di Sante G, Rolla S, Patanella AK, Paolini L, Valentini M, Nicolò C, Migliara G, Piermattei A, Novelli F, Mirabella M, Ria F. MBP85-99-specific TCR repertoirein DRB1*15 patients affected by multiple sclerosis. Frontiers in Immunology, ISSN 1664-3224, doi: 10.3389/conf.fimmu.2013.02.01025 - 15th ICI, Milan,Italy, 22 Aug - 27 Aug, 2013

Migliara G, Di Sante G, Piermattei A, Nicolò C, Valentini M, Procoli A, Concetta Geloso M, Corbi M, Sgambato A, Ria F. A single non-synonymous poly-morphism of TLR2 is sufficient to recapitulate the variability of Experimental Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology, ISSN: 1664-3224, doi:10.3389/conf.fimmu.2013.02.00963 - 15th ICI, Milan, Italy, 22 Aug - 27 Aug, 2013 (Selected for Oral Presentation)

Di Sante G, De Paolis E, Piermattei A, Valentini M, Migliara G, Tolusso B, Constantin G, Nicolò C, Delogu G, Ria F. Impact of infectious agents ontrafficking of effector T cells is mediated by a polymorphic site of TLR2 and CD44 isoforms expression. Frontiers in Immunology, ISSN: 1664-3224, doi:10.3389/conf.fimmu.2013.02.00725. - 15th ICI, Milan, Italy, 22 Aug - 27 Aug, 2013 (Selected for Oral Presentation)

Nicolò C, Di Sante G, Migliara G, Piermattei A, Valentini M, Procoli A, Delogu G, Constantin G, Ria F. A single non-synonymous polymorphism of TLR2is responsible for the variability of Experimental Multiple Sclerosis in SJL and B6 mice. Abstract Book I joint meeting SIPMET/ASIP, Udine (UD), 12-15/09/12 (Selected for Oral Presentation)

Nicolò C, Di Sante G, Procoli A,.Migliara G, Piermattei A, Valentini M, Delogu G, Pani G, Fusco S,. Borrello S, Cittadini AM, Constantin G and Ria F. My-cobacterium Tuberculosis in the adjuvant modulates trafficking of effector T cells through a polymorphic site of TLR2. Abstract book I joint meeting SIP-MET/ASIP, Udine (UD), 12-15/09/12

Piermattei A, Nicolò C, Di Sante G, Migliara G, Valentini M, Geloso MC, Constantin G, Ria F. TLR2 haplotype regulates severity and course of EAE bymodulating the proinflammatory attitude of CNS-specific T-cells. Abstract Book. XXII AINI congress Catania (CT) 26 – 29/09/2012 (Selected for OralPresentation)

Di Sante G, Nicolò C, Migliara G, Piermattei A, Valentini M, Procoli A, Delogu G., Constantin G, Ria F. Impact of infectious agents on trafficking of effectorT cells is mediated by a polymorphic site of TLR2. Abstract Book. XXII AINI congress Catania (CT) 26 – 29/09/2012 (Selected for Oral Presentation)

Nicolò C, Di Sante G, Migliara G, Piermattei A, Valentini M, Geloso MC, Constantin G, Ria F. TLR2 haplotype and M. Tuberculosis in the adjuvant co-modulate trafficking of CNS-specific effector cells. 8th National Conference SIICA Riccione (RN) 28 Sept – 01 Oct 2011

Nicolò C, Di Sante G, Migliara G, Piermattei A, Valentini M, Geloso MC, Constantin G, Ria F. TLR2 haplotype modulates CD44 on activated T cells andseverity of EAE. 8th National Conference SIICA Riccione (RN) 28 Sept – 01 Oct 2011

Migliara G, Nicolò C, Piermattei A, Di Sante G, Valentini M, Santucci MB, Greco E, Fraziano M, Ria F. Analysis of T cells repertoire and clinical course ofEAE after pretreatment with CNS antigens with asymmetric liposomes. Abstracts Book XXI AINI congress Cuneo (CN) 22 – 24/09/2011

Nicolò C, Di Sante G, Migliara G, Piermattei A, Valentini M, Geloso MC, Constantin G, Ria F. TLR2 haplotype modulates CD44 on activated T cells andseverity of EAE. Abstract Book. XXI AINI congress Cuneo (CN) 22 – 24/09/2011

Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2010 per il periodo di 2 anni e l’ammontare di 120.000 €

COMPENDIO 2014

project highlights a newly identified pathway thatcan allow infectious agents (independently fromtheir intrinsic pathogenic ability) to modulate clinicof MS. This mechanism of pathogenesis can also

become a target for a therapeutic intervention aim-ing at influencing the pace of progression of the dis-ease, by modifying the microbial environment or byblocking this pathway itself.

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PREMESSE E OBIETTIVILa sclerosi multipla (SM) è una malattia complessacausata dall’interazione tra molteplici fattori geneticie ambientali. Tra questi ultimi, il virus di Epstein-Barr(EBV) è l’agente infettivo che in studi epidemiologicie immunologici mostra l’associazione più forte conla malattia. EBV è un virus erpetico molto diffusonella popolazione, responsabile di una infezionepersistente e asintomatica generalmente tenutasotto stretto controllo dal sistema immunitario. Seb-bene i meccanismi che legano l’infezione con EBVal processo infiammatorio cerebrale della SM sianoancora sconosciuti, una ipotesi oggetto di studio èche questo virus stabilisca una infezione persistentenel sistema nervoso centrale stimolando una rispo-sta immunitaria inappropriata e dannosa per la mie-lina e le cellule gliali e neuronali.Al fine di comprendere se e in che modo l’infezionecon EBV contribuisce alla patologia della SM ab-biamo valutato l’esistenza di possibili correlazionitra stato dell’infezione, attivazione immunitaria e pa-rametri clinici, di laboratorio e strumentali attraversolo studio dell’espressione di geni virali e geni cellu-lari implicati nella risposta immunitaria nel liquor e

nel sangue di una popolazione di pazienti con SMrecidivante remittente non sottoposti a terapia.

RISULTATII 35 pazienti che hanno partecipato a questo studio(età media 30 anni, valore medio EDSS=1,6, duratamedia di malattia 32 mesi) sono stati arruolati e ven-gono seguiti nei tre Centri Regionali per la SM affe-renti al progetto; l’indagine molecolare è stataeffettuata nei laboratori dell’Istituto Superiore di Sa-nità e dell’Ospedale S. Luigi Gonzaga. A seguito dicontrolli di qualità, cellule del liquor e del sangueperiferico prelevate da 31 pazienti (13, dei quali 10in ricaduta clinica, presentavano lesioni attive cap-tanti gadolinio alla risonanza magnetica) sono stateanalizzate con una metodica altamente sensibile especifica (denominata real-time RT-PCR con pre-amplificazione di specifici geni bersaglio) che hapermesso di studiare il livello di espressione di settegeni virali e 41 geni cellulari in entrambi i comparti.In cinque dei 31 pazienti studiati (16%), di cui trecon risonanza attiva e in ricaduta clinica e 2 in faseinattiva di malattia, è stata rilevata l’espressione digeni virali nelle cellule del liquor, del sangue o di en-

Analisi dell’infezione con virus di Esptein-Barr e dellarisposta immunitaria nel fluido cerebrospinale e nel sanguedi pazienti con sclerosi multipla mediante tecnichealtamente sensibili di PCR

Francesca AloisiDipartimento di Biologia Cellulare, Istituto Superiore di Sanità, Roma

COLLABORATORI:Caterina Veroni, Maria Puopolo

COLLABORAZIONI CON ALTRI GRUPPI:Fabiana Marnetto, Antonio Bertolotto, Letizia Granieri, Federica Brescia,Claudia Carcione, Francesca Sperli, Maria Malentacchi, Manuela Matta,Centro di Riferimento Regionale per la Sclerosi Multipla (CRESM), Istituto di NeuroscienzeCavalieri Ottolenghi (NICO), Ospedale S. Luigi Gonzaga, OrbassanoClara Ballerini, Alessandra Aldinucci, Annamaria Repice, Luca Massacesi,NEUROFARBA, Università di Firenze, FirenzeEleonora Cocco, Giuseppe Fenu, Giancarlo Coghe, Gianna Costa, Cristina Melis,Lucia Schirru, Maria Antonietta Secci, Marta Melis, Centro di Sclerosi Multipla,Dipartimento di Salute Pubblica e Medicina Clinica e Molecolare, Cagliari

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INTRODUCTION AND AIMSMultiple sclerosis (MS) is a complex disease causedby the interaction between multiple genetic and en-vironmental factors. Among the latter, Epstein-Barrvirus (EBV) is the infectious agent that in epidemio-logical and immunological studies shows thestrongest association with the disease. EBV is a hu-man herpesvirus very common in the population andis responsible of a persistent and asymptomatic in-fection that is generally kept in check by immunesurveillance. Although the mechanisms linking EBVinfection to the immune-mediated inflammatoryprocess targeting the central nervous system in MSare still unknown, one of the hypotheses underscrutiny is that this virus establishes a persistent in-fection in the central nervous system and stimulatesan inappropriate immune response that is detrimen-tal for myelin, glial cells and neurons.

Aiming at understanding whether and how EBV in-fection contributes to MS pathology we havesearched for possible correlations among EBV in-fectious status, immune activation and clinical andradiological parameters by studying and quantifyingexpression of viral genes and cellular genes in-volved in the immune response in the cerebrospinalfluid (CSF) and peripheral blood of therapy free pa-tients with relapsing remitting MS.

RESULTSThirty five patients were enrolled for this study(mean age 30 years, mean EDSS score = 1,6, meandisease duration 32 months) in the three RegionalMS Centres participating to this project; the molec-ular analysis was performed in the laboratories ofIstituto Superiore di Sanità and S. Luigi GonzagaHospital. Following quality controls, CSF cells and

Analysis of Epstein-Barr virus infection and immune responsein the cerebrospinal fluid and blood of patients with multiplesclerosis using highly sensitive PCR techniques

COMPENDIO 2014

trambi i comparti (due pazienti). In quattro dei pa-zienti EBV-positivi, è stata rilevata una infezione ditipo latente mentre geni espressi nel corso dellariattivazione virale sono stati riscontrati in un solopaziente in fase attiva, sia nel liquor che nel sangue.Solo nei pazienti EBV+ in fase attiva di malattia, inparticolare in corso di riattivazione virale, sono statiriscontrati livelli marcatamente più elevati rispettoalla popolazione studiata, di alcuni geni indicatori diattivazione immunitaria, in particolare della rispostamediata da linfociti T citotossici e macrofagi. Quat-tro pazienti, tutti EBV-negativi, con risonanza inat-tiva e in remissione clinica, si distinguevano dalresto della popolazione studiata per una maggioreespressione coordinata, sia nel liquor che nel san-gue, di geni che regolano e mediano l’azione degliinterferoni di tipo 1, essenziali per il controllo delleinfezioni virali, e di geni implicati nella funzione dilinfociti T e macrofagi attivati. Ulteriori differenze neilivelli di espressione genica cellulare e correlazionitra geni legati alla maturazione delle cellule B e allarisposta pro-infiammatoria nei pazienti in fase attivae inattiva di malattia emergono dall’analisi statisticae dall’elaborazione dei dati ancora in corso al mo-mento della stesura di questo testo.

CONCLUSIONINonostante la durata relativamente breve dello stu-dio, la sinergia dei quattro centri coinvolti in questoprogetto ha permesso di evidenziare la fattibilità eil potenziale di una metodica di analisi dell’espres-sione genica avanzata, al fine di ottenere un quadrocomprensivo dello stato di infezione con EBV edell’attivazione di specifiche componenti del siste-ma immunitario nel liquor e nel sangue periferico dipazienti con SM. Ad oggi, il numero limitato di pa-zienti analizzati e la bassa percentuale di campionicontenenti segnali rilevabili dell’infezione con EBVnon permettono di stabilire un nesso tra latenza oriattivazione virale, qualità o forza della risposta im-munitaria e attività o inattività di malattia. Uno stu-dio multicentrico condotto in una coorte più ampiadi pazienti, comprendente anche pazienti con formeclinicamente isolate e forme primariamente pro-gressive di SM, verrà proposto al fine di verificarel’esistenza di tale nesso e identificare potenzialimarcatori di diversi decorsi di malattia e con valorepredittivo.

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peripheral blood mononuclear cells from 31 pa-tients [13, of which 10 in clinical relapse, hadgadolinium-enhanced lesions on magnetic reso-nance imaging (MRI)] were analyzed with a highlysensitive and specific method (quantitative real-time RT-PCR with pre-amplification of target genes)that allowed to measure the level of expression ofseven EBV genes and 41 cellular genes in bothcompartments. In five patients (16% of the cohort),of which three had an active MRI and were in clini-cal relapse and two in the inactive phase of disease,we found a detectable expression of EBV genes inCSF, blood or both compartments (two patients). Infour EBV positive patients EBV infection was latentwhile a productive infection was detected in one re-lapsing patient with active MRI, both in CSF andblood. Only in EBV positive patients in the activephase of disease, particularly during viral reactiva-tion, we detected markedly higher levels of somegenes involved in immune activation, particularly inthe response mediated by cytotoxic T cells andmacrophages. Four patients, all lacking a de-tectable EBV signal, with an inactive MRI and inclinical remission, showed a higher, coordinated ex-pression, both in CSF and blood, of genes that reg-ulate and mediate the action of type-1 interferons,which are essential to control viral infections, andof genes supporting or mediating T-lymphocyte and

macrophage functions. Significant differences ingene expression levels and gene signatures indica-tive of B-cell maturation and a pro-inflammatory re-sponse between patients in the active and inactivephases of disease are emerging from statisticalanalysis and further elaboration of data which is stillongoing while writing this report.

CONCLUSIONSDespite the relatively short duration of the study, thesynergy of the four centers contributing to this proj-ect has allowed to show the feasibility and potentialof an advanced method of gene expression analysisto obtain a comprehensive picture of the EBV infec-tion status and activation of specific componentsof the immune system in the CSF and peripheralblood of patients with MS. To date, the limited num-ber of samples analyzed and the low prevalence ofEBV signals in such samples do not allow to estab-lish a link between EBV latency/reactivation, qualityor strength of immune activation and disease activ-ity or inactivity. A study performed in a larger cohortof patients, including also clinically isolated syn-dromes and primary progressive forms of MS, willbe proposed with the aim to verify further the exis-tence of such a link and identify biomarkers asso-ciated with different MS courses and/or withpredictive value.

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Giuseppe ChiappettaIstituto Superiore di Sanita, Roma

MENTORE: Barbara Serafini

COMPENDIO 2014

Ricerca di interazioni patogeneticamente rilevanti tra EBVe il retrovirus endogeno della famiglia W MSRV nel cervellocon sclerosi multipla

PREMESSE E OBIETTIVILa sclerosi multipla (SM) è una malattia cronica delsistema nervoso centrale (SNC) dovuta ad una pro-gressiva perdita della mielina che riveste gli assonie alla disregolazione del sistema immunitario che simanifesta con l’entrata e il persistente accumulo dicellule infiammatorie nel cervello e nel midollo spi-nale. La conseguenza è una continua e gradualedegenerazione delle cellule nervose.Per quanto riguarda le cellule infiammatorie, fino aqualche anno fa, solo il ruolo dei linfociti T era statoritenuto importante, mentre negli ultimi anni diverseevidenze hanno determinato un ruolo fondamentaleanche per i linfociti B. Infatti, la loro presenza è stataosservata all’interno del SNC intorno ai vasi cere-brali sia nella sostanza bianca che in quella grigia enello spazio subaracnoideo delle meningi di pazienticon SM. È stato visto, proprio nelle meningi di per-sone con SM, che i linfociti B che penetrano nelSNC sono capaci di aggregarsi e formare strutturesimili a follicoli linfonodali, chiamate follicoli ectopicimeningei, dove avviene la loro proliferazione ed at-tivazione.È risaputo che la sclerosi multipla è una malattiamultifattoriale che deriva dall’interazione di fattorigenetici ed ambientali. Uno dei fattori ambientali piùstudiati è l’infezione da Epstein-Barr virus (EBV), as-sociato alla malattia da diverse evidenze scientifi-che. Molto interessante è stata l’osservazione dellapresenza di questo virus all’interno delle cellule B in-filtranti il cervello di persone con SM secondaria pro-gressiva (SMSP). Questo fa ipotizzare che EBV,grazie alle sue capacità possa garantire la sopravvi-venza, la proliferazione e l’attivazione di questi lin-fociti B, aumentandone le potenzialità infiammatorieproprio nel cervello di pazienti con SM. Un altro viruslegato alla malattia da diverse osservazioni scienti-fiche, è il retrovirus associato alla SM (MSRV) cheappartiene ai retrovirus endogeni umani (HERV). Co-

me la maggior parte degli HERV, MSRV è integratonel genoma umano ma normalmente non è attivo,quindi non esprime nessun antigene e non è infetti-vo. Tuttavia è stata osservata l’espressione di anti-geni proinfiammatori di MSRV e la presenza diparticelle retrovirali infettive nel cervello, nel fluidocerebrospinale e nel sangue di pazienti con SM.Questo significa che MSRV è fisiologicamente silen-te, ma in alcune condizioni patologiche, probabil-mente interagendo con altri cofattori, potrebberiattivarsi ed esprimere la sua patogenicità.Poiché alcuni autori hanno osservato che EBV, tra-mite alcune sue proteine, può riattivare alcuni HERV,è stato ipotizzato che tra i meccanismi di azione diEBV possa esserci anche quello di attivare MSRVnei linfociti B infiltranti il SNC dei pazienti con SM,scatenando in questo modo, una catena di eventiinfiammatori capaci di aggravare il danno del tes-suto nervoso, contribuendo alla persistenza dellamalattia e all’aumento della sua severità. Partendoda questa ipotesi lo scopo del nostro lavoro è statoquello di dimostrare attraverso tecniche istologichee, in minor misura, molecolari, la co-presenza diEBV e MSRV nei linfociti B all’interno del SNC dipersone con SM.

RISULTATILo studio è stato condotto mediante tecniche di im-munoistochimica ed immunofluorescenza su ottopazienti con SM secondariamente progressiva(SMSP) e due pazienti di controllo. Solo nei pazienticon SM è stata osservata la co-presenza di due an-tigeni di MSRV e due di EBV nei linfociti B, presentisia nei vasi all’interno di lesioni della sostanza bian-ca, sia nei follicoli ectopici meningei e, più in gene-rale, nelle meningi fortemente infiammate.Lo studio molecolare è stato condotto su 16 pa-zienti con SMSP e sette di controllo. Abbiamo os-servato che solo nei pazienti con SM e soprattutto

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Searching for pathogenically relevant interactions betweenEBV and MSRV/human endogenous retrovirus-Win the multiple sclerosis brain

INTRODUCTION AND AIMSMultiple sclerosis (MS) is a chronic disease of thecentral nervous system (CNS) caused by a progres-sive loss of myelin surrounding the axons and bythe immune system dysregulation that occurs withthe entrance and the persistent accumulation of in-flammatory cells in the brain and spinal cord. Theresult is a continuous and gradual degeneration ofthe nerve cells.There is wide consensus in defining multiple scle-rosis a multifactorial disease resulting from the in-teraction of genetic and environmental factors.Among the latter, Epstein-Barr virus (EBV), an ubiq-uitous γ-herpesvirus, has been strongly associatedwith MS through epidemiological, serological andimmunological data. Furthermore, together with thenew relevance tribute to B cell inflammation in theMS brain, we and others have found a high frequen-cy of EBV infected B cells in the MS brain. This sug-gests that EBV, by its capacities could ensure thesurvival, proliferation and activation of infected Bcells, increasing their inflammatory potential in thebrains of patients with MS.Among other viruses for which a pathogenic role inMS has been hypothesized, consistent data supportthe involvement of a viral element belonging to thehuman endogenous retroviruses (HERVs) named MS-associated retrovirus (MSRV). As most of HERVs,MSRV is integrated in the human genome but it’s notphysiologically active, so doesn’t express any antigenand is not infective. Nevertheless, significantly higher

levels of MSRV antigens, RNA and DNA are presentin serum, blood cells, brain tissue and cerebrospinalfluid of patients with MS compared to controls and acorrelation between MSRV load and disease progres-sion and prognosis has been described. It has alsobeen shown that the envelope antigen (env) of MSRVis able to induce a pro-inflammatory response. Thismeans that MSRV is physiologically silent, but in par-ticular pathological conditions, probably by interact-ing with other cofactors, could be reactivated andexpress its pathogenicity.About pathological interactions, there are severalevidences supporting a possible relationship be-tween EBV, MSRV and MS. Interestingly, some Au-thors have shown that EBV through its latentmembrane proteins (LMPs), is able to activate somehuman endogenous retroviruses, inducing the re-lease of new retroviral particles from infected cells.The aim of this study has been to investigate by his-tological and molecular studies the possible inter-action between MSRV and EBV in the inflamedbrain of persons with MS, assuming that, amongthe EBV pathological mechanisms, the MSRV acti-vation could play a role in sustaining and aggravat-ing intracerebral inflammation. To this purpose, weanalysed expression of the MSRV antigens env andgag in the brain of patients with secondary progres-sive (SP) MS and asked if MSRV antigens and EBVlatency proteins are co-expressed in B cells infiltrat-ing the brain of MS patients, focusing our attentionon B cell-enriched immune infiltrates, like intra-

in quelli con una maggiore presenza di infiamma-zione da linfociti B nel cervello, ci fosse una mag-giore frequenza di espressione di un antigeneretrovirale di MSRV.

CONCLUSIONIQuesti dati confermano un effetto patologico diMSRV nella SM e contribuiscono a suggerire che ilvirus di Epstein Barr possa agire nella SM anchecon un altro meccanismo patologico. MSRV, attra-verso l’azione attivatrice di EBV, non solo divente-rebbe capace di esprimere antigeni proinfiammatori

sulla membrana delle cellule ospiti, in questo casoi linfociti B, ma riattivandosi per azione dell’herpesvirus, potrebbe anche assumere la forma di parti-cella extracellulare infettiva e scatenare così una ri-sposta infiammatoria ancora più potente e difficileda controllare da parte del sistema immunitario al-l’interno del SNC. Da qui il danno tissutale che siosserva nei pazienti con SM. Con questi dati si po-trebbero contribuire ad aprire nuove frontiere tera-peutiche, come lo sviluppo di farmaci antivirali chepossano interferire con lo stabilirsi dell’infezione vi-rale da EBV nel cervello di pazienti con SM.

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meningeal B cell follicles and perivascular inflam-matory infiltrates in active lesions, where EBV infec-tion was described in previous studies.

RESULTSThe immunohistochemistry and immunofluores-cence study was performed on eight patients withSPMS and two control patients. We observed theco-presence of two MSRV and two EBV antigens inB cells infiltrating the brain of patients with MS, andnot in control patients. The MSRV/EBV double pos-itive B cells were found in the perivascular inflam-matory infiltrates within white matter lesions, inectopic meningeal follicles and generally, in highlyinflamed meninges.Molecular study was performed on 16 patients withSPMS and seven control patients. A difference inthe expression of one MSRV antigen (env) was ob-served between MS and control patients and

among the patients with MS there was an increasedMSRV antigens expression in those with a higherdegree of B cell inflammation.

CONCLUSIONSThe showed results confirm a pathological effect ofMSRV in MS and contribute to suggest another EBVneuropathologic mechanism in patients with MS. Infact the MSRV activation by EBV would make theretrovirus able to express proinflammatory antigenson the B lymphocytes plasmamembrane and to bereleased as an infective extracellular particle trigger-ing an even more powerful inflammatory responsehard to be controlled by the immune system, withinthe CNS.These data may pave the way for new therapeuticadvances, such as the development of antiviraldrugs that may interfere with the establishment ofEBV viral infection in the brain of patients with MS.

COMPENDIO 2014


Chiappetta G, Rosicarelli B, Veroni C, Magliozzi R, Rizzo F, Coccia E, Reynolds R, Perron H, Aloisi F, Serafini B. Searching for pathogenically relevant in-teractions between EBV and MSRV/human endogenous retrovirus-W in the multiple sclerosis brain. Congresso Scientifico Annuale FISM, 29 – 30 Maggio2013, Roma

Chiappetta G, Rosicarelli B, Sotgiu S, Reynolds R, Perron H, Aloisi F, Serafini B. High frequency of cells expressing multiple sclerosis(MS)-associatedretrovirus (MSRV) antigens and co-expression of MSRVenv and Epstein Barr virus latent protein LMP1 in inflammatory infiltrates of MS brains. Presen-tazione orale al XXII Congresso AINI, 26 – 29 Settembre 2012, Catania

Borsa di studio finanziata con il bando 2011 per il periodo di 1 anno e l’ammontare di 22.000 €

CLASSIFICAZIONE EDIAGNOSI DELLA MALATTIA

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COMPENDIO 2014

PREMESSE E OBIETTIVIÈ un problema dire alla singola persona con SM co-me sarà il suo decorso clinico, la progressione deldanno e l’efficacia terapeutica, dato che per ora sipuò solo rilevare il danno già verificato.L’eziologia della SM è complessa. Tra i cofattori ipotiz-zati ci sono i retrovirus endogeni umani HERV-W ed ilvirus di Epstein Barr (EBV). Anche il batterio C.pneu-moniae è stato proposto. Svariati studi dell’Unità Ope-rativa (UO) Dolei hanno evidenziato un parallelismo neipazienti tra espressione di MSRV/HERV-W e andamen-to della SM. L’UO Rassu ha trovato un’ elevata presen-za di C.pneumoniae nel cervello dei pazienti con SM.L’obiettivo di questo studio è stato quello di definireapplicazioni pratiche di MSRV/HERV-W come mar-catori e il suo ruolo come cofattore nella SM.-FILONE 1: HERV-W/MSRV come marcatore pro-gnostico, per monitorare in tempo reale la progres-sione e la risposta terapeutica della singola personacon SM, prevenendo un’ulteriore disabilità e ridu-cendo i costi di assistenza, tramite la sua rilevazio-ne, in parallelo con altri parametri.- FILONE 2: chiarire se HERV-W/MSRV sia un co-fattore della SM, dato il suo potenziale neuro-im-muno-patogeno e la sua attivazione dipendente dastimoli SM-correlati.Il piano sperimentale ha previsto in vivo di monito-rare nel tempo pazienti con SM sotto terapia, e invitro coltivare ed analizzare cellule del sangue(PBMC) da pazienti e controlli e di astrociti, trattaticon diversi stimoli SM-correlati.

RISULTATIFILONE 1: Analisi dell’’espressione di HERV-W inpazienti con SM nel corso di un anno di trattamentocon natalizumab. Nessuna persona ha avuto rica-dute e la proteina HERV-Wenv è risultata espressada cellule B, NK e monociti, ma non dai linfociti T.L’espressione di HERV-W era ridotta dal sesto me-se di trattamento in poi (p=0.0001). Questi risultatiindicano che l’espressione di HERV-W si riduce an-che con la terapia con natalizumab (Arru et al. Mult.Scler. 2013, Jul 22,Epub ahead of print).C’è stato un forte ritardo nell’arruolamento di paziential S. Bortolo, per l’attesa dell’approvazione del Comi-tato Etico locale. Per questo, lo studio non è ancoraconcluso. Sono stati arruolati 28 pazienti per lo studioprospettico nell’UO Rassu: 7 con sindrome clinica-mente isolate (CIS -Clinically Isolated Syndrome) e 19con sclerosi multipla recidivante remittente (SMRR);una paziente è ora incinta. Sono stati raccolti almenotre campioni post-terapia con glatiramero acetato(Copaxone®), interferon 1a (Rebif22®, Avonex®), in-terferon 1b (Betaferon®), fingolimod (Gilenya®). I datinon definitivi indicano che MSRV è presente in tutti ipazienti. Due pazienti hanno avuto una ricaduta sottoterapia, con aumentata espressione di MSRV.In un altro studio, la presenza di proteina HERV-Wenv è risultata fortemente aumentata in pazientinon trattati, e fortemente ridotta sotto terapia, indi-cando di nuovo che la misurazione di HERV-W è unindicatore dell’andamento clinico (Mameli et al.PLoS One. 2012; 7:e44991).

Studio del retrovirus associato alla sclerosi multipla(MSRV)/HERV-W come marcatore prognostico di progressionee del suo contributo alla patogenesi

Antonina DoleiDipartimento di Scienze Biomediche, Università di Sassari, Sassari

COLLABORATORI:Caterina Serra, Giuseppe Mameli (trasferito altrove), Alessandra Mei (trasferita altrove),Luciana Poddighe, Elena Uleri, Giuseppe Delogu, Edmondo Manca, Roberto Manetti

COLLABORAZIONI CON ALTRI GRUPPI:Mario Rassu, Martina Stevan, Dipartimento di Patologia Clinica, Unità di Microbiologiae Virologia, Ospedale S. Bortolo - ULSS 6 VicenzaFranca Bortolon, Responsabile del Centro Sclerosi Multipla, Dipartimento di Neurologia,Ospedale S. Bortolo - ULSS 6 Vicenza

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FILONE 2: Dato che EBV è stato correlato alla SM,astrociti e PBMC sono stati infettati in vitro con EBV,o esposti alla proteina EBVgp350. Si è osservataun’aumentata espressione di MSRVenv e sincitina1,con coinvolgimento di NF-κB, in astrociti, cellule Be monociti, ma non in cellule T ed NK. (Mameli etal, PLos One 2012,7:e44991)*.I legami EBV-SM certi sono risultati indiretti (storiadi mononucleosi infettiva, MI, e alti livelli di anticorpianti-EBNA prima dell’esordio della SM). Pertantoabbiamo deciso di studiare HERV-W anche in pa-zienti con MI e controlli sani EBV(-) o con EBV laten-te, con alto/basso titolo di anticorpi anti-EBNA-1. Idati indicano che tutti e due i legami certi EBV-SMsono affiancati dall’attivazione di HERV-W/MSRVpotenzialmente neuropatogena. Ciò fa pensare chel’attivazione di HERV-W/MSRV possa essere l’anellomancante tra EBV e SM e questo può aprire nuovispazi di intervento (Mameli et al. PLoS One. 20132013; 8:e78474)*.

CONCLUSIONIFILONE 1: nei nostri studi le terapie anti-SM (natali-zumab, interferon β1a, azatioprina, glatiramero ace-tato) abbattono l’espressione di HERV-W, in parallelocon il successo clinico; il carico virale è parallelo allericadute e alla progressione di SM. Vicinanza alla cu-ra: il complesso dei dati rafforza la nostra ipotesi cheMSRV possa essere usato in tempo reale come mar-catore prognostico di efficacia terapeutica.FILONE 2: si hanno interazioni tra HERV-W e EBV invitro e in vivo, in cellule del sangue e del cervello.Per cui è concreta la possibilità di attivazione del po-tenziale neuropatogeno di HERV-W da cellule EBVsuperinfettante, sia nel sangue che nel cervello.Vicinanza a trovare nuovi meccanismi patogenetici:l’ipotesi a due virus’: ipotizziamo un contributo siadi EBV (innesco di futura SM) e di HERV-W (effettorediretto di patogenicità). La nostra ipotesi è stata ri-battezzata “l’ipotesi a due virus” da altri autori, o“partita doppia genomica”, discussa nel web (*), ecitata nelle rassegne sull’argomento SM-EBV.

(*):http://multiple-sclerosis-research.blogspot.it/2012/10/ebv-and-herv-dual-viral-hyppothesis.htmlhttp://www.consultantlive.com/nervous-system-diseases/epstein-barr-virus-and-multiple-sclerosis-missing-link-foundhttp://www.msdiscovery.org/news/new_findings/8948-genomic-double-play#comment-43

INTRODUCTION AND AIMSIt is hard to predict to the patient HER/HIS clinicalcourse, progression, and therapy outcomes, as sofar we only can detect already established damage.MS etiology is complex. Among the proposed co-factors are human endogenous retroviruses (HERVs)of the W family and EBV (Epstein Barr virus). Also C.pneumoniae has been proposed. Several studies ofthe OU Dolei in MS patients have found a direct par-allel between MSRV/HERV-W expression and MSbehavior. The OU Rassu found a high presence ofC.pneumoniae in MS brains.AIM: To investigate MSRV/HERV-W practical appli-cations and cofactor role in MS.-ARM 1: HERV-W as prognostic BIOMARKER, tomonitor in real times the patient for progression &response to therapy, preventing further disabilityand reducing the costs for care, through the evalu-

ation of HERV-W/MSRV/syncytin expression, inparallel with other parameters.-ARM 2: whether HERV-W might be a COFACTORin MS, due to its potentially neuro-immuno-patho-genic properties and to its activation by MS-relatedtriggers.Design in vivo: follow up of patients along therapy;in vitro: cultures of PBMC from patients & controls,and of astrocytes, +/- MS-related stimuli.

RESULTSARM 1: HERV-W expression in MS patients under na-talizumab along 12 months. None of the patients re-lapsed. B cells, NK and monocytes but not by T cellsexpress the HERV-Wenv protein. The HERV-W ex-pression is reduced from month 6 onward (p=0.0001).Conclusion: efficacious natalizumab therapy down-regulates MSRV/syncytin-1/HERV-W expression (Ar-

Study of multiple sclerosis-associated retrovirus(MSRV)/HERV-W as disease progression marker,and of its contribution to pathogenesis

CLASSIFICAZIONE E DIAGNOSI DELLA MALATTIA

(*):http://multiple-sclerosis-research.blogspot.it/2012/10/ebv-and-herv-dual-viral-hyppothesis.htmlhttp://www.consultantlive.com/nervous-system-diseases/epstein-barr-virus-and-multiple-sclerosis-missing-link-foundhttp://www.msdiscovery.org/news/new_findings/8948-genomic-double-play#comment-43

COMPENDIO 2014

ru et al. Mult. Scler. 2013, Jul 22,Epub ahead of print).The enrollment of patients was delayed, as the S.Bortolo ethics committee took >ten months.Thus the study still must be concluded. 28 patientswere enrolled for the prospective study in the OURassu, 7 with CIS (Clinically Isolated Syndrome) and19 with RRMS, one patient became pregnant. Thepatients had at least three samples after therapy withglatiramer acetate (Copaxone®), Interferon 1α(Rebif22®,Avonex®), Interferon 1β (Betaferon®) orfingolimod (Gilenya®). Preliminary results confirmMSRV presence in all patients. Two patients relapsedafter therapy with increase of MSRV expression.In another study, the positivity for HERV-Wenv pro-tein is strongly increased in naïve patients, and dra-matically reduced during therapy, indicating onceagain that the evaluation of HERV-W expression isan indicator of clinical trend (Mameli et al. PLoSOne. 2012; 7:e44991).ARM 2: Since EBV has been related to MS, astro-cytes and PBMC in vitro were either infected by EBV,or exposed to its major envelope protein,EBVgp350.This protein increases the expression of MSRVenvand syncytin-1, in both cells; the effect requires theNF-κB pathway, and occurs in B cells and mono-cytes, but not in T cells, nor in the highly expressingNK cells. The latter cells, but not the T cells, are ac-tivated by proinflammatory cytokines. (Mameli et al,PLos One 2012,7:e44991)*.Since confirmed EBV-MS links are indirect (historyof infectious mononucleosis, IM, and high anti-EBNA IgG titers before MS onset), we decided tostudy HERV-W in hospitalized IM patients and

healthy donors either EBV(-) or latently EBV-infect-ed with/without high titers of anti-EBNA-1 IgG. Thedata indicate that both two main EBV-MS links areparalleled by activation of the potentially neuropath-ogenic HERV-W/MSRV. These novel findings sug-gest HERV-W/MSRV activation as the missing linkbetween EBV and MS, and may open new avenuesof intervention. (Mameli et al. PLoS One. 2013 2013;8:e78474)*.

CONCLUSIONSARM 1 conclusion: in our hands, efficacious anti-MStherapies (natalizumab, interferon 1α, azathioprine,glatiramer acetate) strongly reduce HERV-W expres-sion, paralleling the clinical benefit, and its load isdirectly related to relapses and MS progression.Proximity to cure: overall data strengthen our hy-pothesis that MSRV could be used in real times asprognostic biomarker marker of treatment efficacy.ARM 2 conclusions: interactions among HERV-Wand EBV occur in vitro and in vivo, in cells fromblood and from brain. Thus the possibility of the ac-tivation of the neuropathogenic potential of HERV-W by superinfecting EBV is concrete, both in bloodand in brain.Proximity to find new pathogenic mechanisms: “thedual virus hypothesis”: We hypothesize a contributeof both EBV and HERV-W to MS, with a direct role ofMSRV as effector of pathogenicity, and EBV as an ini-tial trigger of future MS. Our hypothesis was namedas “the dual virus hypothesis” from other Authors, or“genomic double play”, discussed in the web(*), andquoted in Reviews on the MS-EBV topic.

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Vincenzo BarnabaDipartimento di Medicina Interna e Specialità Mediche, Sapienza, Università di Roma, Roma

COLLABORATORI:Helene Martini, Alessandra Citro, Carmela Martire, Silvia Piconese, Ylenia Pacella,Chiara Focaccetti

COLLABORAZIONI CON ALTRI GRUPPI:Francesco Lolli, Università degli Studi di Firenze, Azienda Ospedaliero Universitariadi Careggi, Firenze

PREMESSE E OBIETTIVIL’apoptosi delle cellule T attivate genera antigeniself che possono essere cross-presentati dalle cel-lule dendritiche ad un ampio repertorio di linfociti TCD8+ autoreattivi.Abbiamo dimostrato che nelle infezioni croniche, comel’HIV o l’epatite C (HCV), la frequenza di tali celluleCD8+ autoreattive correla rispettivamente con la per-centuale di linfociti T CD4+ apoptotici circolanti nel san-gue periferico e con la cronicizzazione della malattia.Studi precedenti suggeriscono che queste rispostecontro gli antigeni self apoptotici contribuiscono amantenere e ad amplificare l’immunopatologia me-diante la loro capacità di produrre alti livelli di citochinepro-infiammatorie.Gli obiettivi di questo studio sono: determinare se ilinfociti T CD8+ specifici per gli epitopi apoptoticihanno un ruolo nella patogenesi della sclerosi mul-tipla; caratterizzarne il fenotipo al fine di valutare sequalcuno si associa più degli altri alla gravità di ma-lattia; caratterizzare i meccanismi attraverso i qualiqueste risposte sono indotte e mantenute; verificarese possano essere considerati marcatori di predizio-ne della risposta al trattamento con l’analogo dellasfingosina 1-fosfato (Fingolimod) o l’anticorpo mo-noclonale anti-integrina α4β1 (Natalizumab) nei pa-zienti con sclerosi multipla.

RISULTATIAbbiamo visto che la frequenza delle cellule T CD8+

specifiche per gli epitopi apoptotici è significativa-mente più alta nei pazienti con sclerosi multipla ri-spetto ai donatori sani. Tali cellule autoreattive hannoun forte potenziale di produrre IFN-γ o IL-17 in rispo-sta alla stimolazione con specifici peptidi apoptotici.

Esse si accumulano significativamente nel liquidocerebrospinale degli stessi pazienti e correlano conil grado di disabilità della malattia (EDSS). Mediantesaggi di cross-presentazione abbiamo inoltre dimo-strato che i linfociti T CD8+ specifici per gli epitopiapoptotici sono attivati ex-vivo dai frammenti deri-vanti dal taglio caspasico delle proteine cellulari. Datipreliminari in pazienti con sclerosi multipla in terapiacon Fingolimod o Natalizumab indicano che, dopo 4settimane di terapia, la frequenza delle cellule auto-reattive aumenta soltanto nei pazienti che non ri-spondono al trattamento.

CONCLUSIONIAbbiamo dimostrato che i linfociti T CD8+ specificiper gli epitopi apoptotici sono reclutati nel fluido ce-rebrospinale dei pazienti con sclerosi multipla e cor-relano con il grado di disabilità della malattia. Questosuggerisce che tali cellule, con un forte potenziale in-fiammatorio, si espandono nel sito di infiammazionee mediante la produzione di citochine contribuisconoalla immunopatologia. Il fatto che il processamentoe la cross-presentazione delle proteine cellulari siaindispensabile per l’attivazione dei linfociti CD8+ au-toreattivi indica che questi ultimi partecipano al dan-no cerebrale attraverso la produzione di citochinepro-infiammatorie (IFN-γ e IL-17) in seguito allacross-presentazione dell’enorme numero di celluleapoptotiche presenti nel tessuto infiammato. I nostririsultati preliminari in pazienti in terapia con Fingoli-mod o Natalizumab suggeriscono inoltre che i linfocitiT CD8+ specifici per gli epitopi apoptotici essendopiù alti dopo un mese di terapia solo nei pazienti chenon rispondono, potrebbero essere considerati unmarcatore precoce di risposta al trattamento.

Immuno-attivazione cronica nella sclerosi multipla

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INTRODUCTION AND AIMSIn previous studies, we demonstrated that the pro-teome of apoptotic T cells include prominent cas-pase-cleaved cellular proteins. A high proportion ofdistinct epitopes in these fragments (apoptotic epi-topes) can be cross-presented by DCs via the classi-cal major histocompatibility complex (MHC) class Ipathway to a wide repertoire of autoreactive CD8+ Tcells. In chronic HIV and acute hepatitis C virus (HCV)infections, the frequency of resulting autoreactiveCD8+ T cells correlates with the proportion of circulat-ing apoptotic CD4+ T cells in vivo and with the diseaseprogression respectively. These studies have suggest-ed that the emergence and the maintenance of theseresponses contribute to amplification of the im-munopathology through their capacity to producehigh levels of inflammatory cytokines.The aims of the present study are: to determinewhether CD8+ T cells specific for apoptotic self-epi-topes are prominent in MS patients; to verify whetherthey have a distinct effector phenotype; to distin-guish which of them is associated with the diseaseseverity, and to ascertain the mechanisms wherebythese responses are induced and maintained; to ver-ify if they are predictive markers of favourable re-sponse to second line treatment with the structuralanalogue of sphingosine 1-phosphate (Fingolimod)or the anti-alpha4 integrin monoclonal antibody (Na-talizumab) in multiple sclerosis (MS) patients.

RESULTSWe found that polyfunctional (IFN-γ and/or IL-17 pro-ducing) autoreactive CD8+ T cells specific for apop-totic epitopes were represented in MS patients atfrequencies significantly higher than in healthy donors(HD). These autoreactive CD8+ T cells with a strongpotential to produce IFN-γ or IL-17 in response to therelevant apoptotic epitopes were significantly accu-

mulated in the cerebrospinal fluid (CSF) from thesame patients. In addition, the frequencies of theseautoreactive CD8+ T cells correlated with the diseasedisability (EDSS). Cross-presentation assay revealedthat caspase-cleaved cellular proteins are required toactivate apoptotic epitope-specific CD8+ T cells exvivo.Preliminary data in MS patients in therapy with fin-golimod or natalizumab show that apoptotic epitope-specific CD8+ T cells were significantly higher inpatients than in HD. Notably, they increased after on-ly four weeks of therapy, being significantly higher innon-responder (NR) patients than in responders (R).

CONCLUSIONSThe demonstration that mixed polyfunctional (type-1 and -17) CD8+ TEM cells specific for apoptotic Tcell associated self-epitopes are recruited in theCSF of MS patients and are associated with theclinical score of disease disability, suggests thatapoptotic self-antigen- specific T cells with stronginflammatory potential largely expand at the level ofthe inflammatory site, and may contribute, throughthe production of high levels of inflammatory cy-tokines, to MS immunopathology. Crosspresenta-tion of caspase-cleavage of apoptotic antigens isrequired to activate these autoreactive CD8+ TEMcells ex vivo, suggesting that the latter may partici-pate to the CNS damage through the production ofpro-inflammatory IFN-γ and IL-17 cytokines uponcross-presentation of the huge number of apoptoticcells present in the inflamed tissue.Our preliminary results in MS patients in treatmentwith Fingolimod or Natalizumab suggest that AE-specific CD8+ T cells may be considered as an earlymarker of response to therapy, being their frequen-cies significantly higher in NR compared to R sincethe 4th week of therapy.

Chronic immune activation in multiple sclerosis


F. Lolli, H. Martini, A. Citro, D. Franceschini, E. Portaccio, M. P. Amato, R. Mechelli, V. Annibali, J. Sidney, A. Sette, M. Salvetti and V. Barnaba IncreasedCD8+ T cell responses to apoptotic T cell-associated antigens in multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation 2013; 10:94

F. Lolli, H. Martini, A. Citro, D. Franceschini, E. Portaccio, M. P. Amato, R. Mechelli, V. Annibali, J. Sidney, A. Sette, M. Salvetti and V. Barnaba. ChronicImmune Activation in Multiple Sclerosis. Congresso Scientifico Annuale FISM, Roma, 29-30 Maggio 2013


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PREMESSE E OBIETTIVIAlcuni studi hanno analizzato il ruolo e la funziona-lità delle cellule NKT e iNKT (cellule NKT invarianti,che regolano fenomeni autoimmuni) durante la SM.Le cellule iNKT sono una rara (<1%) popolazione dilinfociti T che esprimono recettori NK insieme a unrecettore di tipo Va24-Ja18, producono IL-4 e/oIFN-gamma, e sono attivate da lipidi come l’alfa-galattosilceramide (a-GalCer) presentato dalla mo-lecola CD1d. Ci sono dati contrastanti su possibilidifetti delle iNKT nella SM, per lo più dovuti alla ete-rogeneità dei pazienti esaminati, al loro numero oanche a problemi tecnici causati dalla difficoltà dianalizzare queste rare cellule, o all’uso di diversimarcatori di superficie. L’espressione della moleco-la CD161 non è mai stata analizzata sulle celluleiNKT. Il CD161 è un recettore natural killer lectino-simile, espresso in circa il 15% dei linfociti T, non-ché su alcuni linfociti iNKT. Per chiarire meglio ilruolo delle cellule iNKT nella SM, è necessaria unamigliore caratterizzazione fenotipica delle loro sot-topopolazioni, in particolare durante la ricaduta enelle fasi di remissione della malattia. Esistono po-chi dati anche sulla funzionalità di queste cellulenella SM, che per lo più riguardano la produzione disingole citochine. Pertanto, l’obiettivo principale delnostro progetto pilota è stato quello di ottimizzaree standardizzare una nuova metodologia per stu-diare le cellule iNKT nel sangue periferico nei pa-

zienti con SM, al fine di identificare eventuali varia-zioni del loro fenotipo e della funzione. A questoscopo, abbiamo sviluppato metodiche basate sullacitometria a flusso policromatica.

RISULTATIAbbiamo ottimizzato una nuova metodologia per lostudio delle cellule iNKT usando un citofluorimetroa focalizzazione acustica (Attune, Life Technolo-gies), che utilizza ultrasuoni per allineare le celluledurante il loro flusso, e permette di identificare finoa 20.000 cellule/secondo. Questo permette di ana-lizzare e meglio caratterizzare cellule rare e di stu-diarne le funzioni. Dopo la iniziale messa a puntodella metodologia, il progetto pilota (dove abbiamopotuto analizzare solo un numero limitato di pazien-ti) è proseguito, e, a gennaio 2014, abbiamo studia-to un totale di 106 pazienti seguiti dal Centro per laSM (presso il NOCSAE, Modena): 74 con forma re-cidivante-remittente [RR, 14 trattati con interferone1-beta (IFN1-b), 15 con Natalizumab (Nat), 13 conGlatiramer Acetato (Gla), 32 non trattati]. Di questi74, 14 pazienti di nuova diagnosi (RRN) sono statiseguiti per un anno. Altri 32 hanno una forma pro-gressiva di MS (PR): 17 Primaria Progressiva (PP),15 Secondaria Progressiva (SP). Come controlli(CTR) sono stati studiati 32 soggetti sani confron-tabili per sesso e per età. È stata eseguita un’analisidettagliata del fenotipo delle cellule iNKT: la stati-

Polifunzionalità delle cellule iNKT periferiche come markerimmunologico delle diverse forme della sclerosi multipla

Andrea CossarizzaDipartimento Chirurgico, Medico, Odontoiatrico e di Scienze Morfologiche,Università di Modena e Reggio Emilia, Modena

COLLABORATORI:Sara De Biasi, Milena Nasi, Lara Gibellini, Marcello Pinti, Elena Bianchini,Regina Bartolomeo

COLLABORAZIONI CON ALTRI GRUPPI:Diana Ferraro, Francesca Vitetta, Anna Maria Simone, Patrizia Sola,Centro per la Sclerosi Multipla, Clinica Neurologica, Nuovo Ospedale Civile Sant’Agostino Estense(NOCSAE), ModenaAndrea De Maria, Università di Genova, Genova

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stica, eseguita tramite l’analisi delle componentiprincipali (PCA), ha rivelato che alcuni parametri im-munologici potrebbero essere utilizzati per raggrup-pare i pazienti e identificare la forma di SM. Infatti,i pazienti RR e PR hanno meno cellule T CD8+ e piùcellule CD8+CD161++ rispetto ai CTR; tali cellule so-no più rappresentate nei pazienti RR. La percentua-le e il livello di cellule iNKT non variano tra i diversigruppi, ma i pazienti RR e PP presentano percen-tuali più elevate di cellule iNKT che esprimono CD4,e di cellule iNKT che sono CD161-. I pazienti PRhanno minori livelli di iNKT CD4-,CD8- (definiti dop-pio negativi, DN) e di iNKT che esprimonoCD8+,CD161++ rispetto ai CTR. I pazienti RR trattaticon Nat hanno livelli maggiori di cellule T CD3+ eCD8+ rispetto a quelli che assumono IFN, e, rispettoa tutti gli altri trattamenti, anche maggiori livelli diiNKT che esprimono CD4+,CD8+. I pazienti RRNmostrano meno cellule iNKT e CD8+CD161+ dopo6 mesi di trattamento e una diminuzione di DN iNKT.

CONCLUSIONIAbbiamo osservato che è possibile raggruppare i pa-zienti con SM sulla base di parametri immunologicilegati alle cellule CD8+ e alle diverse sottopopolazionidi cellule iNKT. Se il ruolo delle cellule T CD4+ nel cor-so della SM è ben studiato, è poco conosciuto quellodelle cellule T CD8+ e delle iNKT, così come l’impor-tanza della loro polifunzionalità. L’utilizzo della PCAsuggerisce però che tali cellule abbiano un ruolo pa-togenetico che merita ulteriori studi. Al fine di trovarenuovo meccanismo patogenetico, l’integrazione delfenotipo cellulare e della funzionalità delle iNKT nellediverse forme di SM potrebbe condurre all’identifi-cazione di profili immunologici caratteristici di una fa-se della malattia. Lo studio potrebbe essere utile permeglio caratterizzare e comprendere le diverse formedi malattia, per selezionare il tipo d’intervento tera-peutico, per ridurre errori di selezione dei pazienti ne-gli studi clinici e per identificare possibili bersagliimmunoterapia selettiva.

INTRODUCTION AND AIMSIn the last years few studies have analyzed the roleand functionality of NKT and iNKT cells during MS.NKT cells are a population of T lymphocytes thatbear NK receptors and link innate and adaptive im-munity. A subgroup named “invariant NKT-cells”(iNKT, expressing a Va24-Ja18 T-cell receptor) canregulate autoimmunity. iNKT-cells are very rare in pe-ripheral blood (typically, <1% of T cells), produce IL-4 and/or IFN-gamma, are activated by lipids suchas alpha-galactosylceramide (a-GalCer) presentedby CD1d, and were mainly studied in patients withRR-MS or assuming IFN-ß therapy. Contrasting dataexist on iNKT cell defects in MS, probably due to thedifferent phases of disease analyzed, number of pa-tients, or to technical problems due to the paucityof such cells (that requires the cytometric analysisof a huge number of cells) and to the use of differentsurface markers. Almost no studies have investigat-ed the expression of CD161 molecule, the killer celllectin-like receptor subfamily B-member 1, which isexpressed on about 15% of human T cells as wellas on iNKT lymphocytes. A detailed phenotypic

characterization of iNKT cell subsets is needed tobetter clarify their role in MS, particularly during therelapse and remission phases of disease. Few dataalso exist on the functionality of these cells in MS,that regard the production of single cytokines. Thus,the main aim of our pilot project was to set up andstandardize a new methodology to study peripheralblood iNKT cells in MS patients, and to show thepresence of eventual changes in their phenotypeand function. For this purpose, we had to developnovel assays based upon polychromatic flow cy-tometry.

RESULTSWe set up a new methodology for investigating therare iNKT cells by using an acoustic focusing flowcytometer (Attune, Life Technologies), which usesultrasonic waves (over 2 MHz), rather than hydro-dynamic forces, to position cells into a single, fo-cused line along the central axis of a capillary andcan reach a very high speed of acquisition (up to20,000 cells per second). This allowed us to analyzeand better characterize rare cells, such as iNKT

Polyfunctionality of peripheral blood iNKT cells as animmunological marker of different forms of multiple sclerosis

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Ferraro D, De Biasi S, Vitetta F, Simone AM, Federzoni L, Borghi V, Cossarizza A, Nichelli PF, Sola P. Recurrent Varicella following Steroids and Fingolimodin a multiple sclerosis Patient. Journal of Neuroimmune Pharmacology, 8(5):1059-1061, 2013.

Vitetta F, De Biasi S, Simone AM, Ferraro D, Nasi M, Gibellini L, Pinti M, Del Giovane C, Sola P, Cossarizza A. Complex changes in invariant Natural KillerT (iNKT) cells in patients with different clinical forms and treatments of multiple sclerosis. European Committee for Research and Treatment in MultipleSclerosis (ECTRIMS), Copenaghen (Denmark), 2-5 October 2013.

De Biasi S, Nasi M, Simone AM, Ferraro D, Vitetta F, Gibellini L, Pinti M, Del Giovane C, Sola P, Cossarizza A. Complex changes in invariant Natural KillerT (iNKT) cells in patients with different clinical forms and treatments of Multiple Sclerosis. XV International Congress of Immunology, Milan (Italy), 22-27August 2013.

De Biasi S, Nasi M., Simone AM, Ferraro D, Vitetta F, Gibellini L., Pinti M, Del Giovane C, Sola P, Cossarizza A. Complex changes in invariant NaturalKiller T (iNKT) cells in patients with different clinical forms and treatments of Multiple Sclerosis. Conference of the International Society for Advancementin Cytometry “Cyto 2013”, San Diego (CA, USA), 19-22 May 2013.


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cells, and to study their functions, by considering>5 million cells per blood sample.After the initial set up of the methodology, the pilotproject (where we could analyze only a limited num-ber of patients) was continued, and, as of January2014, we have studied a total of 106 patients, fol-lowed by the MS Center (NOCSAE, Modena, Italy):74 with a Relapsing Remitting [RR; 14 treated withInterferon 1-b (IFN), 15 with Natalizumab (Nat), 13with Glatiramer Acetate (Gla), 32 without treatment].Among these 74 RR patients, 14 newly-diagnosedRR patients (RRN) were followed up to one year; 32had a Progressive (PR) MS: 17 Primary Progressive(PP), 15 Secondary Progressive (SP). 32 age- andsex-matched subjects were used as healthy con-trols (CTR). A detailed analysis of iNKT cells wasperformed along with lymphocyte phenotype, andthe principal component analysis (PCA) revealedthat some immunological parameters could be usedto cluster patients, and identify their MS form. In-deed, RR and PR MS patients displayed less CD8+T cells and more CD8+,CD161++ T cells if comparedto CTR; such cells were more represented in RR pa-tients. The percentage and level of iNKT cells did notvary among different groups, but RR and PP pa-tients had higher percentages of iNKT expressingCD4 and of iNKT,CD161-. Levels of CD4-,CD8- (dou-ble negative, DN) iNKT and iNKT expressing

CD8+,CD161++ were decreased in PR patients whencompared to CTR. CD3+ and CD8+ T cells in RR pa-tients treated with Nat increased if compared tothose assuming IFN, while levels of CD4+,CD8+ iNKTwere increased if compared to all other treatments.RRN patients displayed a decrease of iNKT cellsand CD8+,CD161dim cells after 6 months of treat-ments and a decrease of DN iNKT.

CONCLUSIONSWe found that is possible to cluster MS patientsbased upon immunological parameters related toCD8+ and iNKT cell subsets. If the role of CD4+ Tcells during MS is quite established, much less isknown about CD8+ T or iNKT cells, and their poly-functionality in MS. The use of PCA strongly suggestthat such cells have a pathogenetic role, that de-serves further studies. A far as the proximity to findnew pathogenic mechanism, integrate analysis ofiNKT cell phenotype and functionality in different MSforms may lead to the identification of distinct im-munological profiles. Our investigation could be use-ful for better characterize the disease, for a bettercomprehension of the pathogenesis of the differentdisease forms, for the selection of the type of thera-peutic intervention, for reducing selection bias whenenrolling patients in clinical trials and for identifyingpossible targets for selective immunotherapy.

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PREMESSE E OBIETTIVIL’imaging di risonanza magnetica (MRI) ha contribuitoin maniera significativa alla comprensione della pato-genesi della sclerosi multipla (SM). Purtroppo, il dannofocale (cioè, le lesioni) nella sostanza bianca (SB) nonspiega pienamente i processi patologici che portanoalla progressione della disabilità. Nei pazienti con SM,il danno della sostanza grigia (SG) è presente fin dalleprime fasi di malattia ed è clinicamente rilevante. Tut-tavia, è ancora poco chiaro come il danno della SB edella SG siano correlati con lo stato clinico dei pazienticon SM e come progrediscano nel lungo termine. Ab-biamo quindi utilizzato misure di MRI per valutare inun ampio gruppo di pazienti con SM seguiti per 10anni: i) l’evoluzione a lungo termine della riduzione divolume (atrofia) della SB e della SG e ii) il loro rapportocon la disabilità fisica.

RISULTATIDa una popolazione iniziale di 163 pazienti affetti daSM, reclutati tra gennaio 2000 e marzo 2002, 106 pa-zienti con SM hanno eseguito, dopo 10 anni, una va-lutazione clinica e di MRI, acquisita utilizzando lostesso scanner e protocollo. 57 pazienti sono statipersi al follow-up per diverse ragioni (non disposti apartecipare [n=21], trasferiti in altra sede [n=14], noncontattabili [n=10], grave disabilità [n=9], morte [n=3]).Nel primo studio, pubblicato sul Multiple SclerosisJournal, i dati MRI di 58 pazienti con SM a ricadute eremissioni (RR) sono stati acquisiti al basale e dopo10 anni, e correlati con le modifiche della disabilità mi-

surata con l’Expanded Disability Status Scale (EDSS).La crescita annua del volume lesionale (VL) nell’arcodi 10 anni è stata +6.7±8.7% per le lesioni in T2 e+11.5±12.3% per le lesioni ipointense in T1. Nell’ana-lisi di regressione multipla, il peggioramento dell’EDSSa 10 anni era significativamente associato sia con ilnumero di lesioni in T1 al basale sia con l’aumento delVL delle lesioni in T1 nell’arco dei 10 anni.Nel secondo studio, nell’arco dei 10 anni l’atrofia cere-brale globale annualizzata è stata maggiore nei pazienticon SM rispetto ai controlli normali (CN) (-0.5±0.2% vs-0.3±0.1%, p=0.009), soprattutto in quei pazienti conun più alto numero di ricadute. Inoltre, i pazienti con SMavevano anche una maggiore atrofia della SG rispettoai CN (-1.10±0.52% vs -0.73±0.19%, p=0.008). Nell’ar-co dei 10 anni, la correlazione tra atrofia cerebrale glo-bale e modifiche dell’EDSS era più alta nei pazienti conmaggiore disabilità ed era spiegata dall’atrofia della SG.

CONCLUSIONINei pazienti con SMRR, l’accumulo del carico lesio-nale a lungo termine risulta essere associato ad unpeggioramento della disabilità clinica, in particolare inpresenza di lesioni distruttive e ipointense alla MRI.Nell’arco di 10 anni, l’atrofia cerebrale nei pazienti conSM è significativamente correlata con le modifichedell’EDSS, suggerendo così che l’atrofia cerebralepuò fornire nel lungo termine un valido marcatore didisabilità e progressione di malattia.

Modifiche nell’arco di 10 anni della sostanza bianca e grigiacerebrale in pazienti con sclerosi multipla in rapportoalla loro disabilità fisica

Nicola De StefanoDipartimento di Scienze Mediche, Chirurgiche e Neuroscienze, Università di Siena, Siena

COLLABORATORI:Antonio Giorgio, Maria Laura Stromillo, Francesca Rossi, Marco Battaglini, Ales-sandro De Leucio, Antonio Federico, Irina Efimenko, Giacomo Demurtas

COLLABORAZIONI CON ALTRI GRUPPI:Maria Letizia Bartolozzi, Leonello Guidi, Patrizia Maritato, Unità di Neurologia,Ospedale di Empoli, EmpoliEmilio Portaccio, Maria Pia Amato, Dipartimento di Neurologia, Università di Firenze, Firenze

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INTRODUCTION AND AIMSMagnetic resonance imaging (MRI) has greatly con-tributed to understanding the pathogenesis of mul-tiple sclerosis (MS). Unfortunately, focal damage(i.e., lesions) in the white matter (WM) does not fullyexplain the pathologic processes leading to disabil-ity progression. Cortical grey matter (GM) pathologyis present from the earliest stages and is clinicallyrelevant to MS patients. However, there is limitedknowledge on how WM and GM pathology affectsthe clinical status of MS patients and how it pro-gresses in the long term. Against this background,we used MRI metrics to assess in a large group ofMS patients followed up for 10 years: i) the long-term evolution of WM and GM pathology and ii) itsrelationship with physical disability.

RESULTSFrom an original population of 163 MS patients, re-cruited between January 2000 and March 2002,106 MS patients had, after 10 years, clinical assess-ment and brain MRI, acquired using the same scan-ner and protocol. Indeed, 57 patients were lost tofollow-up for different reasons (unwilling to partici-pate [n=21], moved [n=14], not contactable [n=10],unable to participate due to severe disability [n=9],died [n=3]).In the first study, published on the Multiple SclerosisJournal, MRI data of 58 RRMS patients were ac-

quired at baseline and after 10 years, and correlatedwith disability changes as measured by the Expand-ed Disability Status Scale (EDSS). The annualized10-year lesion volume (LV) growth was +6.7±8.7%for T2-weighted (T2-W) lesions and +11.5±12.3% forT1-weighted (T1-W) hypointense lesions. In the mul-tiple regression analysis, EDSS worsening over 10years was best correlated with the combination ofbaseline T1-W lesion count and increasing T1-W LV.In the second study, submitted, we found that an-nualized global brain atrophy was higher in MS pa-tients than in normal control (NC) (-0.5±0.2% vs.-0.3±0.1%, p=0.009), especially in those patientswith higher number of relapses. Moreover, MS pa-tients had also higher annualized GM atrophy thanNC (-1.10±0.52% vs. -0.73±0.19%, p=0.008). Over10 years, correlation of global brain atrophy withEDSS change was closer in patients with worseningdisability and driven by change in GM volume.

CONCLUSIONSIn RRMS patients, long-term brain lesion accrualturned out to be associated with worsening in clini-cal disability, particularly in presence of hypointense,destructive lesions. Over 10 years, brain atrophy inMS patients significantly correlated with EDSSchange, thus suggesting that long-term brain vol-ume change may provide a valuable outcome oflongstanding disability and progression.

Ten-year changes in the cerebral white and grey matterof patients with multiple sclerosis and their relevanceto physical disability

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Giorgio A, Stromillo ML,. Bartolozzi ML,. Rossi F, Battaglini M, De Leucio A, Guidi L, Maritato P, Portaccio E, Sormani MP, Amato MP, De Stefano N. “Re-levance of hypointense brain MRI lesions for long-term worsening of clinical disability in relapsing multiple sclerosis”. Mult Scler. 2014 Feb;20(2):214-9

Giorgio A, Stromillo ML,. Bartolozzi ML,. Rossi F, Battaglini M, De Leucio A, Guidi L,,. Baldini M, Federico A, Portaccio E,. Amato MP, De Stefano N.“Ten-year global and tissue-type brain atrophy rate and relevance to disability progression in patients with multiple sclerosis”. Article submitted

Giorgio A, Stromillo ML,. Bartolozzi ML,. Rossi F, Battaglini M Guidi L., Maritato P,. Portaccio E, Amato MP, Federico A, De Stefano N. “Ten-Year brainatrophy and disability changes in patients with multiple sclerosis”. Neurology April 22, 2012 78:P03.065, Annual Meeting of the American Academy ofNeurology (AAN), May 2012, New Orleans, USA

Giorgio A, Stromillo ML,. Bartolozzi ML,. Rossi F, Battaglini M, Blandino A, Guidi L, Maritato P, Federico A, De Stefano N. “Progression of brain atrophyover 10 years and its relationship to disability change in patients with multiple sclerosis” Poster at 21st Meeting of the European Neurological Society(ENS), 28-31 May 2011, Lisbon, Portugal

Giorgio A, Stromillo ML,. Bartolozzi ML,. Rossi F, Battaglini M, Blandino A, Guidi L, Maritato P, Federico A, De Stefano N. “Ten-year brain atrophy rateand its relevance to disability in multiple sclerosis” Oral communication at International Society for Magnetic Resonance in Medicine (ISMRM) 2011, 7-13 May 2011, Montreal, Canada

A. Giorgio, ML. Stromillo, ML. Bartolozzi, F. Rossi, M. Battaglini, A. Blandino, L. Guidi, M. Patrizia, A. Federico, N. De Stefano. “Ten-year brain atrophyrate and its relevance to disability progression in patients with Multiple Sclerosis”. Oral communication at XLI Congresso della Società Italiana di Neu-rologia (SIN), 23-27 October 2010, Catania, Italy

Giorgio A, Stromillo ML,. Bartolozzi ML,. Rossi F, Battaglini M, Blandino A, Guidi L, Maritato P, Federico A, De Stefano N. “Ten-year brain atrophy rateand its relevance to disability progression in patients with Multiple Sclerosis”. Poster at the Congress of the European Committee for Research and Tre-atment in Multiple Sclerosis (ECTRIMS), 13-16 October 2010, Goteborg, Sweden

Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2010 per un periodo di 2 anni e l’ammontare di 100.000 €


Franca DeriuDipartimento di Scienze Biomediche, Università di Sassari, Sassari

COLLABORATORI:Immacolata Magnano, Giovanni Mario Pes, Giovanna Pilurzi, Maria Paola Cabboi,Francesca Ginatempo, Elena Giaconi, Edoardo Rosario de Natale, Maurizio Conti,Antonio Achene, Andrea Salis, Giulio Rosati, Eusebio Tolu, John C. Rothwell

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Studio neurofisiologico, neuroradiologico e clinico del troncoencefalico in pazienti con sclerosi multipla

PREMESSE E OBIETTIVILe funzioni del tronco encefalico (TE) vengono stu-diate comunemente mediante i potenziali evocatimultimodali (PE: BAEP, SEP del nervo mediano e ti-biale), la risonanza magnetica convenzionale (RM) el’esame clinico (CLIN). Nella Sclerosi Multipla (SM)crescenti evidenze dimostrano un coinvolgimentodel TE che spesso non è documentato dalle meto-diche standard. Recentemente i riflessi del TE (RTE),hanno ricevuto grande attenzione come strumentoper valutare il TE nei pazienti con SM, in particolareil riflesso vestibolocollico (VCR). Al contrario, i riflessivestibolomasseterino (VMR), acusticomasseterino(AMR) e trigeminocollico (TCR) non sono mai statistudiati sistematicamente nella SM. Il presente pro-getto si proponeva i seguenti obiettivi: 1) studiare sela sensibilità diagnostica di CLIN, EP e RM può es-sere migliorata aggiungendo la valutazione del VMR,AMR, VCR e TCR, sia come singoli riflessi che inbatteria; 2) documentare variazioni delle disfunzionidel TE nel tempo, attraverso una valutazione di RTE,EP, RM e CLIN prima e dopo un periodo medio diosservazione di un anno.

RISULTATILa batteria dei quattro RTE è stata registrata in 60pazienti con SM (età 33,3±8,3 anni; durata malattia8,2±6,4 anni). La distribuzione delle anomalie deiRTE e dei PE era la seguente: VMR 62,1%, AMR55,1%, TCR 58,6%, VCR 25,9%; BAEPs 37,3%,SEP del mediano 60,3% e SEP del tibiale 58,6%.Nel complesso, disfunzioni del TE sono state rilevatecome segue: RTE 86.9%, PE 82,7%, RM 71,7%,CLIN 37,7%. Mentre la performance dei RTE e deiPE, presi separatamente, non era significativamentemigliore della combinazione di RM/CLIN (70%), l’as-

sociazione dei RTE/EP raggiungeva una sensibilitàdel 93,3%, significativamente maggiore in un sotto-gruppo di pazienti con una durata di malattia ≤6,4anni.Dopo 15,1±4,2 mesi dalla valutazione iniziale, sonostati ritestati 45/60 pazienti, di cui nessuno avevapresentato ricadute, in linea con la stabilità della fre-quenza di alterazioni alla RM e all’esame CLIN. IRTE ed i PE, invece, hanno mostrato un peggiora-mento delle funzioni del TE. In particolare, sebbenele percentuali di alterazioni della batteria dei RTEnon fosse cambiata, è stato osservato un significa-tivo peggioramento dei punteggi di gravità (score)per VMR, AMR e TCR. Per quanto riguarda la bat-teria dei PE, la frequenza di alterazioni riscontrateera significativamente aumentata al follow up, cosìcome pure lo score di gravità, in particolare per l’on-da P14 del SEP del mediano.

CONCLUSIONIQuesto studio dimostra che la valutazione del VMR,AMR, TCR e del VCR è una procedura affidabile einformativa nello studio della funzione del TE nei pa-zienti con SM. La loro valutazione combinata, comebatteria, offre una prestazione complessiva parago-nabile a quella dei PE ed è capace di rilevare disfun-zioni del tronco encefalico, altrimenti nonevidenziate dall’esame clinico e dalla RM. È di rilievoil fatto che l’associazione dello studio della batteriadei quattro RTE con i PE standard, ha mostratoun’accuratezza significativamente più elevata nel ri-velare un eventuale coinvolgimento del TE, specienei casi clinicamente e radiologicamente silenti. Sot-to questo aspetto, la registrazione dei RTE potrebbeessere d’aiuto nella valutazione funzionale delle sin-dromi clinicamente silenti, in cui il rilievo di lesioni

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Neurophysiologic, neuroimaging and clinical studyof brainstem in patients with multiple sclerosis

INTRODUCTION AND AIMSBrainstem (BS) functions are conventionally studiedby multimodal evoked potential (EP: BAEPs, medi-an and tibial SEPs) recordings, conventional MRIand clinical examination (CLIN). In multiple sclerosis(MS), increasing evidence accounts for a BS in-volvement, often undetected by standard testing.Recently, BS reflexes (BSRs) have drawn attentionin evaluating BS dysfunction in MS especially thevestibulocollic (VCR) reflex. In contrast, the vestibu-lomasseteric (VMR), acousticmasseteric (AMR) andtrigeminocollic (TCR) reflexes have never beenstudied systematically in MS. This project proposedthe following objectives: 1) to investigate whetherthe diagnostic sensitivity of CLIN, EPs and MRI canbe improved adding the assessment of VMR, AMR,TCR and VCR either as single reflexes or in a four-BSR battery; 2) to document BS changes over timethrough the assessment of BSRs, EPs, MRI andCLIN before and after at least one year of follow up.

RESULTSThe four-BSR battery was recorded in 60 patients(aged 33.3±8.3 years) with MS (illness duration8.2±6.4 years). Distribution of BSR and EP abnor-malities was: VMR 62.1%, AMR 55.1%, TCR 58.6%,VCR 25.9%; BAEPs 37.3%, median SEPs 60.3%and tibial SEPs 58.6%. Overall, BS dysfunction wasdetected as follows: BSRs 86.9%, EPs 82.7%, MRI71.7%, CLIN 37.7%. While the performance of BSRsand EPs, taken separately, was not significantly bet-ter than that of combined MRI/CLIN testing (70%),the paired use of BSRs/EPs had a sensitivity of

93.3%, which was significantly superior in a subsetof patients with a disease duration ≤6.4 yrs.Forty-five out of 60 patients underwent BSRs, EPs,MRI and CLIN reassessment after 15.1±4.2 monthsfrom initial evaluation. No relapses had been report-ed by any patient, in line with the stability of CLINand MRI abnormality rates at the follow up. Despitethis, BSRs and EPs revealed a worsening of BSfunction. In particular, although the proportion of al-tered BSRs did not change, a significant worseningof scores was observed for VMR, AMR and TCR.Similarly to BSRs, the prevalence rate of EP abnor-malities did not increased significantly, but theanalysis of cumulative score showed a significantworsening for the whole EP set with special regardto the P14 wave of the mSEP.

CONCLUSIONSThis study shows that the assessment of VMR,AMR, TCR and VCR is a reliable and informativetool for the investigation of BS function in patientswith MS. Their combined recording of a four-reflexbattery has an overall performance comparable tothat of multimodal EPs and is able to spot BS dys-function, otherwise undetected by CLIN and MRIexaminations. Interestingly, the addition of the four-BSR assessment to the standard EP testing provedto be associated to a significantly higher accuracyin revealing early BS involvement, especially inthose cases with clinically and radiologically silentlesions. In this perspective, BSR recording might bevaluable in the functional assessment of clinicallyisolated syndromes, where spotting a silent involve-

del TE subcliniche, può avere un ruolo chiave nellastima del rischio di sviluppare disabilità futura.Le valutazioni di follow up non hanno mostrato al-cuna variazione sostanziale del quadro clinico eneuroradiologico, in accordo con l’assenza di rica-dute durante il periodo di osservazione. Cionono-stante, la rivalutazione sia dei PE che dei RTE haevidenziato un deterioramento complessivo dei cir-cuiti del TE, confermando la capacità dei test neu-rofisiologici di svelare alterazioni funzionali spesso

non rilevate né clinicamente né con la RM. Apparedi interesse il fatto che i risultati dei due test neuro-fisiologici, tendano a variare nel tempo in manieraunivoca come suggerito dalle correlazioni positiveosservate sia alla valutazione basale che al followup, nonostante il breve lasso di tempo intercorso.Ciò suggerisce che la registrazione combinata deiRTE/PE potrebbe fornire indicazioni aggiuntivesull’evoluzione temporale della malattia, anche nelbreve termine.

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ment of the BS may have a key value in the estima-tion of the risk for developing future disability.The assessments after the follow-up did not showany substantial modification of both CLIN and MRIdata according to the lack of relapses in any patientwithin the observation period. In spite of this, bothmEP and BSR reassessments suggested an overallfunctional deterioration of BS circuits. This findingconfirms the ability of neurophysiological tests to spotfunctional alterations of BS relays, which are often un-

derestimated by CLIN and MRI. Interestingly, the twocomposite neurophysiological scores showed thetendency to deteriorate jointly over time, as suggest-ed by the positive correlation between mEP and BSRabnormalities observed both at baseline and follow-up, despite the short lag time between the two eval-uations. This indicates that the association of BSRand mEP recordings might provide additional insightin the temporal evolution of the disease even in a trulyshort period of observation.

COMPENDIO 2014


Magnano I, Pes GM, Pilurzi G, Cabboi MP, Ginatempo F, Giaconi E, Tolu E, Achene A, Salis A, Rothwell JC, Conti M and Deriu F. Exploring brainstemfunction in multiple sclerosis by combining brainstem reflexes, evoked potentials, clinical and MRI investigations. Clinical Neurophysiology, 2014 inpress

Deriu F, Pilurzi G, Magnano I, Ginatempo F, Cabboi MP, Pes GM, Conti M. Brain stem reflex abnormalities in patients with multiple sclerosis. 5th Interna-tional Conference on Non-Invasive Brain Stimulation. 19-21 March 2013, Leipzig (Germany). Clinical Neurophysiology 124 (2013) e39–e187

Magnano I, Cabboi MP, Pilurzi G, Conti M, Achene A, Salis A, Pes G, Ginatempo F, Deriu F. Exploring brainstem functions in MS patients by combiningneurophysiological and neuroradiological approaches. 57th Meeting of the Italian Society of Clinical Neurophysiology (SINC). Mantova 16th-19th May2012

Giaconi E, Pilurzi G, Coiana J, Magnano I, Cabboi MP, Achene A, Salis A, Conti M, Pes G, Tolu E, Deriu F. Exploration of brainstem function through ve-stibular and trigeminal reflexes in healthy people and in patients with multiple sclerosis. 62nd National Congress of Italian Physiological Society; Sorrento25-27th September 2011. Acta Physiologica 203 (suppl. 688): p. 103, 2011

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Magnano I, Cabboi MP, Cossu P, Conti M, Achene A, Salis A, Sau GF, Deriu F, Aiello I. L’onda P14 nello studio del tronco dell’encefalo (TE) in pazientiaffetti da Sclerosi Multipla Recidivante-Remittente (SMRR). Abstract Book Congresso Nazionale della Società Italiana di Neurofisiologia Clinica (SINC)Siena, 13-15 mag 2010 pag.294

Magnano I, Cabboi MP, Pilurzi G, Conti M, Achene A, Salis A, Giaconi E, Ortu E, Cossu P, Sau GF, Pes GM, Aiello I, Tolu E, Deriu F. (2009). Alterazionitronco-encefaliche nella Sclerosi Multipla (SM): risultati di uno studio Neurofisiologico e Neuroradiologico. Abstract Book, Congresso Nazionale SINC,Salerno 28-30 maggio 2009, pag 248.

Pilurzi G, Magnano I, Giaconi E, Ortu E, Cossu P, Ruiu E, Pes GM, Tolu E, Deriu F. Vestibulo masseteric reflex and jaw acoustic reflex: a new tool toassist exploration of brainstem function in multiple sclerosis? Abstract book of International Workshop and Conference on Human Reflexes – Wiringand Firing of Motoneurones 11-15 May 2009, Izmir (Turkey), pag 71-72.

Pilurzi G, Giaconi E, Ortu E, Deriu S, Ruiu E, Magnano I, Cossu P, Achene A, Salis A, Conti M, Pes G, Tolu E, Deriu F. The acoustic masseteric reflex(AMR) and the vestibulo masseteric reflex (VMR): a new tool to explore brainstem (BS) function in man. Acta Physiologica 2009, 197(Supplement 672):96.


VERSO NUOVI TRATTAMENTI

Ruolo delle cellule MAIT nella sclerosi multipla:come la flora intestinale influenza le risposte autoimmuni

Luca BattistiniUnità di Neuroimmunologia, Fondazione Santa Lucia, Roma

COLLABORATORI:Giovanna Borsellino, Daniela F Angelini, Eleonora Piras, Gabriella Ruocco,Marco De Bardi

COLLABORAZIONI CON ALTRI GRUPPI:Marco Salvetti, Sapienza Università di Roma, RomaBarbara Serafini, Istituto Superiore di Sanità, ISS, Roma

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PREMESSE E OBIETTIVIIl miglioramento delle condizioni igieniche, l’usomassiccio di antibiotici, e un’alimentazione ricca ingrassi e carboidrati hanno portato, nei paesi occi-dentali, a un brusco aumento nell’incidenza di ma-lattie autoimmuni. Un’ipotesi per spiegare questacorrelazione suggerisce che la ridotta esposizioneai microbi comporti un cambiamento nella compo-sizione della flora batterica intestinale, che ha unruolo fondamentale nell’istruire e dare forma al si-stema immunitario. Per alcune malattie autoimmuni,come il morbo di Crohn, l’associazione tra flora bat-terica intestinale e insorgenza di patologie infiam-matorie e autoimmuni è intuitiva; tuttavia è menochiaro come i microbi dell’intestino possano in-fluenzare patologie autoimmuni in organi distanti.Alcuni recenti lavori hanno però dimostrato chequesta influenza è possibile: alcuni ceppi batterici,inoculati nell’intestino di animali da laboratorio, so-no in grado di indurre l’espansione selettiva di lin-fociti produttori di IL-17, che quindi possono poisostenere l’infiammazione anche fuori dall’intestino;altri ceppi, al contrario, attivano ed espandono lin-fociti T regolatori, generando quindi una rispostaimmunitaria anti-infiammatoria.Un indizio che suggerisce che anche nella sclerosimultipla (SM) la risposta autoimmune possa esseresostenuta da situazioni non immediatamente cor-relate con il sistema nervoso centrale è il dato, ot-tenuto nel nostro laboratorio di una netta esignificativa espansione, nei pazienti con SM, di unapopolazione cellulare particolare coinvolta nelle ri-sposte antibatteriche a livello della muscosa inte-

stinale, i linfociti MAIT (mucosal associated invariantT cells).In questo progetto abbiamo studiato il possibile le-game tra flora intestinale e SM attraverso lo studiodelle cellule MAIT per valutare il loro ruolo nel pro-cesso infiammatorio alla base della malattia : questirisultati potrebbero fornire indicazioni su approcciterapeutici mirati a ristabilire una flora batterica chenon sostenga l’infiammazione e l’autoimmunità.

RISULTATIIn questo studio è stato inizialmente confermatoche i linfociti T CD8+CD161high sono presenti nelsangue periferico dei pazienti con SM con maggiorefrequenza rispetto ai controlli sani, e che queste cel-lule corrispondono ai linfociti MAIT Vα7.2+. Questecellule esprimono, i marker IL18R e CCR6 coeren-temente con il loro target tissutale, la mucosa inte-stinale; tra l’altro, l’espressione del CCR6 permetteanche a queste cellule di penetrare nel sistema ner-voso centrale.Abbiamo studiato pazienti SM con la forma recidi-vante-remittente della malattia. Durante la fase sta-bile della malattia la frequenza delle cellule MAIT nelsangue periferico è significativamente maggiore ri-spetto a quella misurata nei pazienti nella fase acutadella malattia e nei soggetti sani. Inoltre, la frazionedi linfociti MAIT aumenta con l’aumentare dell’indi-ce di progressione della malattia, un valore dato dalrapporto tra la disabilità (EDSS) e la durata di ma-lattia.Questi dati sono stati confermati anche nelle coppiedi gemelli omozigoti discordanti per malattia: i ge-

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Role of MAIT cells in multiple sclerosis:how can the gut flora influence autoimmune responses?

INTRODUCTION AND AIMSTo explain the significant increased frequency of au-toimmune diseases observed in western societies,the hygiene hypothesis speculates that modern lifestyles and wide spread use of antibiotics have re-duced the exposure of humans to microbialpathogens. This decreased microbial load contrastswith the situation observed in humans in third worldcountries where infections with pathogens are highlyprevalent. In diseases such as inflammatory boweldisease or asthma, alterations in the composition ofthe gut flora seem also to be a critical factor for thedevelopment of inflammatory T cell responses. Linksbetween gut microbiota and inflammatory boweldisease are intuitive and easy to understand, buthow intestinal commensals may influence immunityat distant sites needs to be clarified. However, con-vincing reports are been now published which showinstances in which certain microbes, through theirability to promote a specific T cell subset, can driveautoimmunity at a distant organ. Recently, a novel Tcell subset with anti-microbial activity has been de-scribed: the mucosal associated invariant T (MAIT)cells. These cells expand after birth after contactwith the commensal flora, and they are character-

ized by the expression of a semi-invariant TCR, highlevels of CD161 and IL18R, and high levels of IFN-γand IL-17: most, if not all, IL-17-producing CD8+ Tcells are MAIT cells. Given the established link be-tween this cytokine and MS, this population of cellsare worth investigating in MS patients. We have in-vestigated the involvement of MAIT cells in MS, bystudying their frequency and phenotype, and theirproinflammatory capabilities.

RESULTSIn this study we initially confirmed thatCD8+CD161high T cells correspond to MAIT cells,and that they are significantly expanded in the pe-ripheral blood of MS patients. These cells expressIL18R and CCR6, in agreement with their target tis-sue; CCR6 expression also enables MAIT cells withthe ability to enter the central nervous system (CNS).We studied patients with the relapsing-remittingform of MS, and we noted that during the stablephase of the disease the frequency of MAIT cells issignificantly higher than that measured in the acutephase or in healthy subjects. Moreover, the fractionof MAIT cells within PBLs increases with the MSProgression Index, the ratio between disability

melli affetti presentano frequenze maggiori di celluleMAIT nel sangue periferico rispetto ai gemelli sani.È stato poi studiato lo stato di attivazione e il po-tenziale citotossico e pro-infiammatorio delle celluleMAIT. Queste cellule analizzate ex vivo hanno un fe-notipo attivato, e dopo stimolazione massimale pro-ducono IFN−γ e IL-17, una citochina proinfiammatoriache sembra avere un ruolo nella SM; inoltre produ-cono GM-CSF e TNF-α. Gli studi funzionali hannodimostrato che la frazione di cellule MAIT che pro-duce queste citochine è maggiore nei pazienti ri-spetto ai sani.Infine, abbiamo esaminato gli infiltrati cellulari neitessuti cerebrali dei pazienti SM che mostravano le-sioni attive nella sostanza bianca, e i dati hanno mo-strato, per la prima volta, la presenza di numerosecellule MAIT Vα7.2+ positive anche per IL-17 in tut-te le lesioni analizzate.

CONCLUSIONII risultati ottenuti in questo studio e in particolare la di-mostrazione che negli infiltrati cellulari del tessuto ce-rebrale post mortem di pazienti con SM sono presentinumerose cellule MAIT IL-17+ dà forza all’ipotesi diun ruolo di queste cellule nella patogenesi della SM.La citochina IL17 ha potenti attività proinfiammatoriee promuove quindi il mantenimento dell’infiammazio-ne. Il nostro studio ha dimostrato che le cellule MAITproducono anche altre citochine proinfiammatorie, eche sono presenti in misura maggiore e in forma atti-vata nei pazienti rispetto ai soggetti sani.Le potenziali implicazioni terapeutiche che emergo-no da questo studio sono che un controllo sull’edu-cazione alimentare potrebbe modificare l’ambienteintestinale da pro-infiammatorio ad uno anti-infiam-matorio, influenzando la risposta adattativa anchein altri distretti dell’organismo, come nel cervello.

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Camperio C, Muscolini M, Volpe E, Di Mitri D, Mechelli R, Buscarinu MC, Ruggieri S, Piccolella E, Salvetti M, Gasperini C, Battistini L, Tuosto L. CD28ligation in the absence of TCR stimulation up-regulates IL-17A and pro-inflammatory cytokines in relapsing-remitting multiple sclerosis T lymphocytes.Immunol Lett. 2014 Jan 8;158(1-2):134-142.

Picozza M, Battistini L, Borsellino G. Mononuclear phagocytes and marker modulation: when CD16 disappears, CD38 takes the stage. Blood. 2013 Jul18;122(3):456-7.

Abrahamsson SV, Angelini DF, Dubinsky AN, Morel E, Oh U, Jones JL, Carassiti D, Reynolds R, Salvetti M, Calabresi PA, Coles AJ, Battistini L, MartinR, Burt RK, Muraro PA. Non-myeloablative autologous haematopoietic stem cell transplantation expands regulatory cells and depletes IL-17 producingmucosal-associated invariant T (MAIT) cells in multiple sclerosis. Brain. 2013 Sep;136(Pt 9):2888-903 Epub 2013 Jul 17.

Angelini DF, Serafini B, Piras E, Severa M, Coccia EM, Rosicarelli B, Ruggieri S, Gasperini C, Buttari F, Centonze D, Mechelli R, Salvetti M, Borsellino G,Aloisi F, Battistini L. Increased CD8+ T cell response to Epstein-Barr virus lytic antigens in the active phase of multiple sclerosis. PLoS Pathog.2013;9(4):e1003220. Epub 2013 Apr 11.

Chiurchiù V, Cencioni MT, Bisicchia E, De Bardi M, Gasperini C, Borsellino G, Centonze D, Battistini L, Maccarrone M. Distinct modulation of humanmyeloid and plasmacytoid dendritic cells by anandamide in multiple sclerosis. Ann Neurol. 2013 May;73(5):626-36. Epub 2013 Apr 17.

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Rossi S, Motta C, Studer V, Monteleone F, De Chiara V, Buttari F, Barbieri F, Bernardi G, Battistini L, Cutter G, Stüve O, Salvetti M, Centonze D. A geneticvariant of the anti-apoptotic protein Akt predicts natalizumab-induced lymphocytosis and post-natalizumab multiple sclerosis reactivation. Mult Scler.2013 Jan;19(1):59-68 Epub 2012 May 10.

Piras, E.; Annibali, V.; Mechelli, R.; et al. MAIT cells display proinflammatory characteristics in multiple sclerosisJournal of Neuroimmunology. Volume: 253 Issue: 1-2 Pages: 163-164 Published: DEC 15 2012


COMPENDIO 2014

(EDSS) and disease duration. This data was con-firmed also in pairs of homozygous twins discor-dant for disease: the affected twin consistentlyshowed higher frequencies of circulating MAIT cellscompared to their healthy counterparts.The activation state and cytotoxic potential of MAITcells was also determined. These cells, analyzed ex-vivo, have an activated phenotype, and followingmaximal stimulation they release large amounts ofproinflammatory cytokines: : IFN-γ, TNF-α, GM-CSF,and, most of all, IL-17. Moreover, in MS patients thefraction of cytokine-producing MAIT cells was signif-icantly higher compared to healthy individuals.Finally, we show for the first time that Vα7.2+ MAITcells are present in the cellular infiltrates of the whitematter which surround the MS lesions, and thatthese cells colocalize perfectly with the IL-17 de-tected in the same lesions.

CONCLUSIONSThe results obtained in this study and in particularthe demonstration that in post-mortem brains from

MS patients the cellular infiltrates surrounding thelesions there is a large component of Vα7.2+ MAITcells loaded with IL17 strengthens the hypothesisthat these cells are involved in disease pathogene-sis. IL-17 has potent proinflammatory properties,and the finding that IL17-secreting MAIT cells areexpanded also in the peripheral blood of MS pa-tients is particularly intriguing. Moreover, our datashows that in patients these cells are not only ex-panded: they also are more efficient producers ofproinflammatory cytokines such as IFN-γ, TNF-α,and GM-CSF.Since IL-17 cells are expanded in the intestine fol-lowing interactions with microbial antigens, it ispossible that changes in diet may modify the intes-tinal environment from proinflammatory to anti-in-flammatory, thus influencing immune responsesalso at distant sites, such as the CNS.Novel therapeutic approaches aimed at reestablish-ing of a “healthy” gut microenvironment may bebeneficial for the treatment of MS.

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Paolo RiccioDipartimento di Scienze, Università della Basilicata, Potenza

COLLABORATORI:Rocco Rossano, Marilena Larocca

COLLABORAZIONI CON ALTRI GRUPPI:Ghislain Opdenakker, Jennifer Vandooren, Dept. of Microbiology and Immunology,KU Leuven, Rega Institute for Medical Research, University of Leuven, Leuven, BelgiumAnnamaria Colangelo, Dipartimento di Biotecnologie e Bioscienze,Lab. di Neuroscienze “Rita Levi-Montalcini”, Università di Milano-Bicocca (UNIMIB), MilanoM. Gabriella Coniglio, Clinica Neurologica, Centro per la Sclerosi Multipla,Ospedale “Madonna delle Grazie”, MateraMichele Ettorre, Centro di Nutrizione Applicata, Statte, TarantoVincenzo Fogliano WU Agrotechnology and Food Sciences, Food Quality and Design,Wageningen, NL

Le basi molecolari per un intervento nutrizionalenella sclerosi multipla

PREMESSE E OBIETTIVIQuando, con il nostro primo progetto, abbiamo co-minciato i nostri studi sulla nutrizione nella sclerosimultipla (SM), non esisteva neanche il più piccoloindizio che ci fosse un collegamento fra loro. Ai queitempi si definiva la SM come multifattoriale, conpossibili implicazioni virali o dietetiche, ma senzache queste fossero chiare. Noi stessi abbiamo ini-ziato a interessarci dell’alimentazione nella SM sol-tanto perché avevamo scoperto che una proteinadel latte, la butirofilina, è molto simile alla MOG, ilprincipale autoantigene della guaina mielinica.Sconsigliammo quindi di assumere latte bovino in-tero.I nostri studi stanno ora chiarendo che la sclerosimultipla è in realtà una malattia cronica infiammato-ria e neurodegenerativa con un forte collegamentofra alimentazione, microflora intestinale, infiamma-zione intestinale e sistemica, e decorso della SM.

RISULTATILe attività principali svolte nel nostro progetto sonostate quattro. Qui di seguito, i risultati ottenuti.

Studi sulla correlazione fra nutrizione e SMIl primo obiettivo è stato quello di fornire delle solide

basi molecolari per un intervento nutrizionale nella SMe favorire con cognizione di causa il benessere dei pa-zienti. Allo stato attuale, le abitudini alimentari e lo sta-to nutrizionale del paziente con SM non sono presi inconsiderazione. I nostri lavori hanno chiarito perchéuna dieta ipercalorica, ricca di sale, grassi animali, car-ni rosse, bevande zuccherate, e fritture, favorisca l’au-mento dell’infiammazione e peggiori il corso dellamalattia; e perché, al contrario, una dieta ipo- o nor-mo-calorica basata sull’assunzione di pesce, verdure,frutta fresca o con guscio, ortaggi, legumi, e fibre,possa agire favorevolmente sul nostro organismo esulla nostra popolazione batterica intestinale, contra-stando la malattia. In breve, specifici fattori della dietaagiscono su “interruttori” cellulari: i nutrienti da evitarefavoriscono la sintesi di molecole lipidiche e/o pro-in-fiammatorie, quelli da preferire la loro inibizione. Perquanto riguarda la microflora intestinale, questa ècomposta, semplificando, da batteri “buoni” e da bat-teri “cattivi”, il cui rapporto è influenzato dallo stile divita. Con la dieta basata su pesce, verdure, assunzio-ne di fibre e moderata attività fisica si selezionano ibatteri buoni, che contrastano l’infiammazione intesti-nale. Con la dieta ipercalorica si favorisce invece lacrescita della popolazione batterica disbiotica che sameglio smaltire le calorie in eccesso, ma favorisce an-

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INTRODUCTION AND AIMSWhen, with our first project, we began our studieson the impact of nutrition in multiple sclerosis (MS),there was not even the slightest clue that there wasa link between them. MS was seen as a multifacto-rial disease, with possible implications for viral ordietary supplements, just to justify the difficulty tounderstand its etiopathogenesis. We ourselves be-gun to take an interest in the nutrition in SM onlybecause we had found that a milk protein, buty-rophilin, is very similar to MOG, the major myelinauto-antigen. Consequently, we discouraged theassumption of whole cow’s milk. Our studies arenow proving that multiple sclerosis is actually achronic inflammatory and neurodegenerative disor-

der with a strong link between nutrition, intestinalmicrobiota, intestinal and systemic inflammation,and progression of MS.

RESULTSThe main activities in this project have been four.Below, the results obtained.

Studies on the relationship between nutrition and MS.The first objective was to provide a solid molecularbasis for a nutritional intervention in MS, aimed toimprove the wellness of MS patients. At present, di-etary habits, life style and nutritional status of pa-tients with MS are not taken into account. Our workshave explained why a high-calorie diet, rich in salt,

The molecular basis of nutritional interventionin multiple sclerosis

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che l’infiammazione intestinale, l’autoimmunità e laneurodegenerazione.

Studi su colture cellulari.In questi studi abbiamo dimostrato che alcuni fattoridella dieta possono influenzare l’attività delle cellulegliali (astrociti e microglia) e dei neuroni di ratto e to-po. Molecole come i polifenoli dei vegetali (anti-os-sidanti) o gli acidi grassi poli-insaturi omega-3 deipesci hanno un’azione neuroprotettiva già a basseconcentrazioni, agendo sui fattori di trascrizionecoinvolti nella regolazione del metabolismo e dell’in-fiammazione. Quindi l’uso combinato di integratoridietetici può rappresentare un potente strumento dineuroprotezione in corso di SM.

Trials clinici.A Matera è stata effettuata una sperimentazione cli-nica nutrizionale su pazienti con SM recidivante re-mittente (RR), in terapia con IFN-beta (T), o con SMprimariamente progressiva (PP). I pazienti, tutti condeficienza di vitamina D, ricevevano colecalciferoloinsieme a una dieta (D) ipocalorica con vegetali,frutta e pesce, e integratori (I) (olio di pesce, polife-noli, composti tiolici e complesso multivitaminico).In tutti i gruppi si è osservata una forte resistenzaall’aumento dei livelli di 25(OH)D (calcidiolo), chesono rimasti bassi nonostante l’assunzione di pe-

sce (nei gruppi TD) e olio di pesce (nei gruppi TDI).I pazienti erano in genere soddisfatti del trattamentonutrizionale.

Analisi delle gelatinasi nei sieri dei pazienti con SM.Il nostro gruppo di ricerca a Potenza ha messo suuna nuova metodica [zimografia bidimensionale (2-DZ)] che ha permesso di identificare tutte le diverseisoforme e varianti delle gelatinasi, enzimi che sonocoinvolti nella rottura della barriera emato-encefalicae nella degradazione della mielina nella SM. In par-ticolare, è stato possibile osservare per la prima vol-ta gli isomeri della 65 kDa MMP-9, una isoforma cheaumenta con l’infiammazione ed è difficile da distin-guere dalla MMP-2. L’analisi delle gelatinasi può es-sere utile per valutare l’efficacia della terapia.

CONCLUSIONII nostri studi stanno dimostrando l’importanza dellanutrizione nella SM, sia per quanto riguarda le im-plicazioni a breve, che la caratterizzazione di nuovimeccanismi patogenetici. Abitudini alimentari, tesea ridurre l’infiammazione e la disbiosi intestinale,possono migliorare il corso della malattia e preve-nire l’insorgenza di ricadute.Il nostro primo obiettivo è ora rappresentato dalladivulgazione di questa conoscenza in campo bio-medico e fra gli stessi pazienti.

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animal fats, red meat, sweetened drinks and friedfood, favors the increase of inflammation and worsenthe course of the disease, and why, on the contrary,a hypo- or standard caloric diet based on the as-sumption of fish, vegetables, fruit or nuts, legumes,and fiber, may act favorably on our body and our in-testinal bacterial population, counteracting the dis-ease. In short, specific dietary factors act on a sortof cellular switches enabling one or the other meta-bolic fate: the nutrients to avoid are those favoringthe synthesis of lipids and/or pro-inflammatory mol-ecules, those to prefer their inhibition. Regarding theintestinal microflora, this is made in simple terms by“good” bacteria and “bad” bacteria, whose relation-ship is affected by lifestyle. With the diet based onfish, vegetables, dietary fiber and moderate physicalactivity it is possible to select the good bacteria,which counteracts intestinal inflammation. With thehigh-calorie diet, instead, is favored the growth of thedysbiotic bacterial population, which is good forcalorie disposal, but promotes intestinal inflamma-tion, autoimmunity and neurodegeneration.

Studies on cell cultures.In these studies we have shown that specific dietaryfactors can influence the activity of glial cells (as-trocytes and microglia) and neurons of rat andmouse. Molecules such as polyphenols of plants(anti-oxidants) or omega-3 polyunsaturated fattyacids from fish or fish oil have neuroprotective ac-tion already at low concentrations, by acting on thetranscription factors (the “switches” above) involvedin the regulation of metabolism and inflammation.Thus the combined use of dietary supplements mayrepresent a powerful tool to neuroprotection in thecourse of MS.

Clinical trials.We have performed a nutritional clinical study at the

Hospital in Matera on RR-MS patients, under treat-ment with IFN-beta (T), or with PP-MS. The pa-tients, all with deficiency of vitamin D, receivedcholecalciferol along with low-calorie diet (D) basedon vegetables, fruit and fish, and supplements (I)(fish oil, polyphenols, thiol compounds and multivi-taminic complex). In all groups there was a strongresistance to the increase of 25 (OH) D (calcidiol),whose levels remained unchanged or even de-creased, despite the intake of fish (in groups TD)and fish and fish oil (groups TDI). Patients were gen-erally satisfied with the nutritional treatment.

Assessment of gelatinases in the sera of MS patients.Our research group in Potenza has developed a newmethod [two-dimensional zymography (2-DZ)],which allow the detection of all the different isoformsand variants of gelatinases, the enzymes that are in-volved in the disruption of blood brain barrier andthe breakdown of myelin in MS. In particular, it hasbeen possible to observe for the first time the iso-mers of 65 kDa MMP-9, an isoform which increaseswith inflammation and is usually difficult to distin-guish from the other gelatinase MMP-2. The analysisof the isoforms and the variants of gelatinases maybe useful to study the effectiveness of therapy.

CONCLUSIONSOur studies are showing the relevance of nutritionin MS. The achievements obtained have importantimplications in the short term, and open new per-spectives in the characterization of new patho-genetic mechanisms. Healthy dietary habits andphysical exercise aimed at reducing inflammationand intestinal dysbiosis may improve the course ofthe disease and prevent the onset of relapse.Our first objective is now represented by the dis-semination of this knowledge in the biomedical fieldand among MS patients.


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Rossano R, Larocca M, Riviello L, Coniglio MG, Vandooren J, Liuzzi GM, Ghislain Opdenakker Gh, Riccio P. Heterogeneity of serum gelatinases MMP-2 and MMP-9 isoforms and charge variants in multiple sclerosis. J. Cell. Mol. Med. 2013; 18 (2), 242–252.doi:10.1111/jcmm.12181, 2013

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The molecular basis for a nutritional intervention in multiple sclerosis. ISN satellite Meeting on: "Myelin: From Basic to Translational Research" Cancun,Mexico. 18 April 2013

Tipo di alimentazione e stile di vita nella sclerosi multipla Conv. della sez. AISM di Matera su: "Funzionare bene ovunque. Sclerosi multipla e sistema di-gerente: alimentazione e digestione", Chiesa di San Giacomo, Matera. 1 Febbraio 2013

Nutrizione e Sclerosi Multipla: Una storia da scrivere. Convegno Sezione AISM di Potenza "Giovani oltre la SM: Convivere con la SM"Museo Provincialedi Potenza. 24 Novembre 2012

Le basi molecolari per un intervento nutrizionale nelle malattie croniche infiammatorie e nella sclerosi multipla Convegno sulla "Qualità di vita nellaSclerosi Multipla", AOSG Moscati, Sezione AISM di Avellino. 17 Novembre 2012

The Molecular Basis for Nutritional Intervention in multiple sclerosis 2012 International Symposium: The multiple sclerosis BRAIN Mandell Center forMultiple Sclerosis, Hartford CT 06112, 6 October 2012. Invited talk.

Le basi molecolari per un intervento nutrizionale nella sclerosi multipla, nelle malattie infiammatorie croniche e nel cancro Convegno ENPAB su “La dia-gnostica molecolare clinica: Attualità e prospettive” Mercure Hotel, Rende, Cosenza. 14 Luglio 2012

Progetto di ricerca finanziato con il bando 2010 per il periodo di 2 anni (prorogato di 5 mesi)e l’ammontare di 60.000 €

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PREMESSE E OBIETTIVILe cellule staminali mesenchimali (MSC) mostranouna notevole capacità di modulare la risposta im-munitaria e proteggere il sistema nervoso centraleprincipalmente attraverso il rilascio di fattori solubiliin modo paracrino, influenzando il comportamentofunzionale delle cellule nei tessuti. Qui abbiamo stu-diato l’effetto dell’interazione tra MSC e microgliain vitro, e abbiamo sezionato i meccanismi cellularie molecolari di questa interazione.

RISULTATIAbbiamo dimostrato che le MSC sono in grado dicompromettere l’attivazione della microglia da stimoliinfiammatori, attraverso l’inibizione dell’espressionee rilascio di molecole infiammatorie e proteine asso-ciate allo stress. Abbiamo dimostrato che le MSC au-mentano significativamente l’espressione microglialee il rilascio di molecole associate con un fenotiponeuroprotettivo come CX3CR1. Le MSC possono po-tenziare i cambiamenti funzionali sulla microglia comerappresentato dall’incremento della concentrazionedi calcio intracellulare e dell’attività fagocitaria. Gli ef-fetti osservati sull’espressione di CX3CR1 da partedella microglia sono dovuti al rilascio di CX3CL1 daparte delle MSC, guidato da segnali infiammatori, co-me dimostrato dal capovolgimento dei risultati quan-do CX3CL1 è reso silente sulle MSC o il suo rilascioè stato bloccato. Infine, abbiamo dimostrato cheCX3CL1 esogeno induce cambiamenti fenotipici efunzionali della microglia simili a quelli indotti da MSC.Questi risultati dimostrano che le MSC, attraverso ilrilascio di CX3CL1, determinano un cambiamentodella risposta microgliale ai segnali proinfiammatori,modulando i recettori “calming” costitutivi tipicamen-te espressi dalla microglia in stato stazionario, com-mutando così il fenotipo della microglia da dannosoa neuroprotettivo.

CONCLUSIONIAbbiamo dimostrato che le MSC, un sottogruppodi cellule progenitrici che mostrano una notevolecapacità di modulare le funzioni effettrici delle cel-lule dell’immunità innata e adattativa, possono in-fluenzare diverse caratteristiche della microgliadopo l’attivazione di stimoli proinfiammatori. In pri-mo luogo abbiamo dimostrato che le MSC riduconol’aumento dell’espressione di TNF, iNOS e proteineassociate allo stress ossidativo, indotte da LPS ealtre molecole infiammatori, da parte della micro-glia. In secondo luogo abbiamo dimostrato che leMSC possono indurre una significativa up-regola-zione di molecole di superficie che gioca un effettocalmante sulla microglia ed è associata ad un feno-tipo neuroprotettivo. Abbiamo rilevato una signifi-cativa up-regolazione di IL-1β, una citochina nonsolo coinvolta nella risposta infiammatoria, ma an-che considerata svolgere un ruolo chiave nel pro-muovere la riparazione del SNC, probabilmenteinducendo la sintesi e il rilascio di IGF dalle cellulegliali. L’up-regolazione delle molecole sopra ripor-tate suggerisce che le MSC possono istruire la ri-sposta microgliale a segnali proinfiammatorie qualiLPS, IFNy, e CpG. Abbiamo dimostrato che le MSCpossono anche indurre modificazioni funzionali del-la microglia, come illustrato dal rilevamento dell’au-mento della concentrazione di calcio intracellularee dell’attività fagocitaria, senza intaccare la capacitàdi proliferazione della microglia. Questo ultimoevento è associato con l’acquisizione di un fenotiponeuroprotettivo da parte della microglia come ulte-riormente confermato dall’espressione up-regolatadi TREM2, un recettore immunitario innato espressodalla microglia coinvolta nella fagocitosi in assenzadi infiammazione. Ancora più importante, abbiamodimostrato che, in seguito a stimolazione con LPSe IFNy, due molecole coinvolte in eventi infiamma-

Le cellule mesenchimali staminali influenzanol’ambiente microgliale? Implicazioni per il trattamentodella sclerosi multipla

Simona CasazzaDipartimento di Neuroscienze, Riabilitazione, Oftalomologia, Genetica e Scienze Materno-InfantiliUniversità degli studi di Genova, Genova

MENTORE: Antonio Uccelli


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COMPENDIO 2014

INTRODUCTION AND AIMSMesenchymal stem cells (MSC) display a remarka-ble ability to modulate the immune response andprotect the central nervous system mainly throughthe release of soluble factors in a paracrine fashion,affecting the functional behavior of cells in the tis-sues. Here we investigated the effect of the interac-tion between MSC and microglia in vitro, and wedissected the molecular and cellular mechanismsof this crosstalk.

RESULTSWe demonstrated that MSC impair microglia acti-vation by inflammatory cues through the inhibitionof the expression and release of inflammatory mo-lecules and stress-associated proteins. We showedthat MSC significantly increase microglial expres-sion and release of molecules associated with aneuroprotective phenotype such as CX3CR1. MSCcan enhance functional changes on microglia asdepicted by the increase of intracellular calciumconcentration and phagocytic activity. The obser-ved effects on CX3CR1-expressing microglia are

due to the release of CX3CL1 by MSC, driven by in-flammatory signals, as demonstrated by the rever-sal of the observed results when CX3CL1expression was silenced in MSC or its release wasblocked. Finally, we showed that exogenousCX3CL1 induce phenotypic and functional changesof microglia similar to those induced by MSC. The-se findings demonstrate that MSC instruct, throughthe release of CX3CL1, microglia responsiveness toproinflammatory signals by modulating constitutive"calming" receptors, typically expressed by "stea-dy-state microglia" thus switching microglia from adetrimental phenotype to a neuroprotective one.

CONCLUSIONSWe demonstrate that MSC, a subset of progenitorcells displaying a remarkable ability to modulate ef-fector functions of cells of the innate and adaptiveimmunity , can affect several features of microgliafollowing activation with proinflammatory stimuli.First, we observed that MSC reduce the increase ofthe expression of TNF, iNOS and oxidative stress-associated proteins, induced by LPS and other

Do mesenchymal stem cells impact microglia behavior?Implications for the treatment of multiple sclerosis

tori del sistema nervoso centrale, le MSC modulanole funzioni effettrici microgliali attraverso il rilasciodi CX3CL1. La capacità di CX3CL1 rilasciato daMSC di promuovere il cambiamento della microgliada un fenotipo dannoso, neurotossico dominato dalrilascio di molecole proinfiammatorie, ad uno un fe-notipo benefico, neuroprotettivo associato alla pro-duzione di fattori anti-infiammatori e trofici,espressione di recettori “calming”, aumento delleconcentrazioni di calcio intracellulare e fagocitosi,è stata confermata da esperimenti in cui CX3CL1 èstato aggiunto in modo esogeno alla microglia atti-vata con LPS in assenza di MSC. Questi risultati so-no in linea con l’evidenza corrente che le MSCagiscono principalmente attraverso il rilascio di fat-tori solubili in modo paracrino, forse influenzando ilcomportamento funzionale delle cellule dei tessutiresidenti. È interessante notare che le MSC posso-no indurre le cellule dendritiche ad acquisire un fe-notipo tollerogenico in vitro e in vivo ed educare

macrofagi attivati in modo alternativo, che hannodimostrato di essere attori essenziali nella ripara-zione del SNC. Inoltre le MSC esercitano effetti neu-roprotettivi sui neuroni dopaminergici attraverso unmeccanismo anti-infiammatorio mediato dalla mo-dulazione dell’attivazione della microglia.Questi risultati dimostrano che le MSC sono in gra-do di influenzare funzionalmente il comportamentodelle cellule mieloidi compresa la microglia, che vie-ne indotta verso un fenotipo protettivo, possibil-mente tenendo conto di alcuni degli effetti beneficiche sono stati associati con la plasticità terapeuticadelle MSC nel modello sperimentale di SM (ence-falite sperimentale autoimmune, ESA) e in altri mo-delli sperimentali di malattie neurologiche. Nelcomplesso questi risultati confermano ulteriormen-te l’importanza di trasferire la terapia cellulare delleMSC dai modelli sperimentali a malattie neurologi-che umane dove la microglia può svolgere un im-portante ruolo patogenetico.

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Giunti D, Parodi B, Usai C, Vergani, L,Casazza, S, Bruzzone S, Mancardi G, Uccelli A. Mesenchymal stem cells shape microglia effector functions throughthe release of CX3CL1. Stem Cells. 2012 Sep;30(9):2044-53.

Borsa di studio finanziata con il Bando 2010 per il periodo di 2 anni e l’ammontare di 64.000 €

proinflammatory molecules, by microglia. Second,we demonstrated that MSC can induce a significantupregulation of surface molecules playing a calminginfluence on microglia and associated with a neu-roprotective phenotype. We detected a significantupregulation of IL-1β, a cytokine not only often in-volved in the inflammatory response but also con-sidered to play a key role in promoting repair of theCNS, possibly inducing the synthesis and releaseof IGF by glial cells. The reported upregulation ofthe above-mentioned molecules suggests thatMSC can instruct microglia responsiveness toproinflammatory signals such as LPS, IFNγ, andCpG.We demonstrated that MSC also induce functionalmodifications of microglia as depicted by the de-tection of enhanced intracellular calcium concen-tration and phagocytic activity without affecting theproliferation capacity of microglia. This last event isassociated with the acquisition of a neuroprotectivephenotype by microglia as further confirmed by theupregulated expression of TREM2, an innate im-mune receptor expressed by microglia involved inphagocytosis in the absence of inflammation. Moreimportantly, we demonstrated that, following stim-ulation with LPS and IFNγ, two molecules involvedin CNS inflammatory events, MSC modulate mi-croglia effector functions through the release ofCX3CL1.The ability of CX3CL1 released by MSC to promotethe switch of microglia from a detrimental, neurotox-ic phenotype dominated by the release of proinflam-

matory molecules to a beneficial, neuroprotectivephenotype associated with the production of anti-inflammatory and trophic factors, enhanced expres-sion of calming receptors, increased intracellularcalcium concentrations, and phagocytosis was con-firmed by experiments where CX3CL1 was addedexogenously to microglia activated with LPS in theabsence of MSC.These results are also in line with the current evi-dence that MSC act mainly through the release ofsoluble factors in a paracrine fashion, possibly af-fecting the functional behavior of tissue-residentcells. Interestingly, MSC can induce dendritic cellsto acquire a tolerogenic phenotype in vitro and in vi-vo and educate alternatively activated macrophageswhich have been demonstrated to be essential play-ers in CNS healing. In addition, MSC exert neuro-protective effects on dopaminergic neurons via ananti-inflammatory mechanism mediated by themodulation of microglia activation.These findings demonstrate that MSC are capableof functionally affecting myeloid cells behavior in-cluding microglia which is induced toward a protec-tive phenotype, possibly accounting for some of thebeneficial effects that have been associated withthe therapeutic plasticity of MSC in experimentalautoimmune encephalomyelitis, EAE, and other ex-perimental models of neurological diseases. Overallthese results further confirm the incumbent trans-lation of MSC cell therapy from experimental mod-els to human neurological diseases where microgliamay play a major pathogenic role.


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COMPENDIO 2014

PREMESSE E OBIETTIVIIl trapianto di cellule staminali del sangue è da con-siderare una terapia immunosoppressiva ad alta in-tensità da attuare in pazienti selezionati chepresentano caratteristiche di particolare aggressivitàdella malattia e che progrediscono nella loro disabi-lità nonostante la somministrazione di terapie con-solidate. I dati riportati fino ad ora nella letteraturascientifica indicano che la maggior parte dei pazienticon sclerosi multipla (SM) sottoposti a questa pro-cedura hanno mostrato un arresto nella progressio-ne della disabilità con spunti di miglioramento neipazienti trapiantati in fase precoce e molto attiva.In un precedente studio abbiamo dimostrato checellule staminali mesenchimali (MSC) isolate dal mi-dollo osseo (MO) di pazienti con SM prima del tra-pianto producono una maggiore quantità dellachemochina CXCL10 rispetto a soggetti sani, sug-gerendo che un’alterata funzionalità delle MSC po-trebbe giocare un ruolo nella eziopatogenesi dellaSM. Tale chemochina ha un ruolo chiave nella in-fiammazione e nel reclutamento dei linfociti T ed èstata trovata aumentata nel liquor di pazienti conSM. Il primo obiettivo del progetto è stato quindiquello di caratterizzare funzionalmente e fenotipi-camente MSC isolate da MO di pazienti con SMche si sono sottoposti a trapianto e correlare i datiottenuti con il risultato clinico. Il secondo obiettivoè stato caratterizzare il compartimento B del MO edel sangue periferico, prima e dopo trapianto neipazienti con SM. Il MO è infatti un organo linfoidecentrale per lo sviluppo delle cellule B, contenentele nicchie cellulari in cui si realizza sia la fase pre-

coce che quella tardiva della loro maturazione. Stu-di recenti hanno dimostrato l’efficacia di terapie checolpiscono selettivamente le cellule B nel tratta-mento della SM, supportando la teoria che i linfocitiB giochino un ruolo nella patogenesi della malattia.Non ci sono ad oggi studi sul compartimento mi-dollare e periferico dei linfociti B in pazienti con SMprima e dopo trapianto.

RISULTATILo studio è stato condotto sul sangue midollare di19 pazienti con SM prelevato un mese prima deltrapianto, e di 7 pazienti prelevato ad una distanzamediana di 4,5 anni (range 3-6) dal trapianto. I risul-tati ottenuti dall’analisi istologica delle biopsie mi-dollari hanno dimostrato che il microambientemidollare, sia prima che dopo il trapianto, presentauna morfologia con caratteristiche simili e compa-rabili a quelle di un midollo sano.È stato inoltre possibile isolare e caratterizzare leMSC dal MO di tutti i pazienti arruolati, sia prima chedopo trapianto. Le MSC hanno dimostrato caratte-ristiche comparabili in termini di crescita, fenotipo,potenziale differenziativo e immunosoppressivo. Inparticolare, dopo il trapianto rimane inalterata la pro-duzione della chemochina proinfiammatoriaCXCL10 in quantità significativamente più elevata ri-spetto alle MSC isolate da donatori sani. Questaproduzione avviene anche in altri distretti dell’orga-nismo, in particolare, è stata dimostrata a carico deimonociti del sangue periferico (SP) e dipende dauna alterazione del signaling pathways del recettoreTLR4, uno dei principali recettori dell’immunità in-

Valutazione immunologica del midollo osseo in pazientiaffetti da sclerosi multipla severa sottoposti ad autotrapiantodi cellule staminali ematopoietiche

Riccardo SaccardiSezione Ematologia, Azienda Ospedaliero Universitaria Careggi, Firenze

COLLABORATORI:Benedetta Mazzanti, Massimo Di Gioia, Irene Donnini, Simone dal Pozzo,Valentina Carrai

COLLABORAZIONI CON ALTRI GRUPPI:Clara Ballerini, Dipartimento NEUROFARBA Università di Firenze, FirenzeElisabetta Traggiai, Dipartimento di Scienze Pediatriche, Istituto G. Gaslini, Genova

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INTRODUCTION AND AIMSAutologous hematopoietic stem cells transplanta-tion (AHSCT) has been considered as a novel the-rapy for the treatment of multiple sclerosis (MS)patients who are resistant to conventional treat-ments, but so far no data are available on bone mar-row (BM) of MS patients before and after AHSCT.AHSCT may re-induce a condition of self-toleranceleading the patient to a condition of clinical latency.We have already demonstrated that bone marrow(BM) mesenchymal stem cells (MSC) isolated fromMS patients before AHSCT have a significantly dif-ferent cytokine profile in comparison to healthy do-nors (HD). In particular, we demonstrated thatMS-MSC show a higher production of the CXCL10chemokine, suggesting that an altered MSC fun-ction in MS patients may play some role in the de-velopment of the disease. The first aim of thepresent project was to characterize functionally andphenotypically MSC, isolated from BM of MS pa-tients who have undergone AHSCT and to correlatethe results with the clinical outcome. The second

aim of this study was to characterize BM and peri-pheral blood B cell compartment before and afterAHSCT in MS patients. BM is a crucial lymphoid or-gan for B cell development, containing the cellularniches not only for the early phases of B cell deve-lopment but also for the late effector phases of Bcell differentiation. Recent studies have demonstra-ted a potential effect of B cells targeted therapies inthe treatment of MS. These findings have supportedthe concept that B cells play a role in the pathoge-nesis of multiple sclerosis, not only as precursors ofantibody-producing cells, but also as important re-gulators of the T-cell activation process. No studieshave been so far published to investigate BM andperipheral B cell compartment in MS patients beforeand after AHSCT.

RESULTSThe study has been carried out on BM of 19 MS pa-tients one month before transplantation and on 7patients at a median follow-up of 4,5 years (range3 – 6) post-transplantation. Morphological analysis

Immunological evaluation of bone marrow in severemultiple sclerosis patients undergoing autologoushaematopoietic stem cell transplantation

nata. Soprattutto, abbiamo dimostrato una aumen-tata fosforilazione dei fattori (p38, CREB, JNK eSTAT1) che formano la cascata delle molecole re-sponsabili della produzione e della secrezione diCXCL10. Tali risultati sono indicativi di un ambienteinfiammatorio alterato in due compartimenti coinvoltinel trapianto: il midollo e il sangue periferico.Su 5 pazienti di questa stessa coorte, è stata con-dotta un’analisi citofluorimetrica multiparametricache ci ha permesso di quantificare le sottopopola-zioni di linfociti B e T sia nel MO che nel SP nellostesso momento. Globalmente la frequenza dei lin-fociti B totali è aumentata nel MO nei pazienti dopotrapianto. I progenitori pro-B midollari non sono al-terati nei pazienti con MS rispetto ai controlli sia pri-ma che dopo trapianto. Invece il compartimentodelle cellule mature B residenti nel MO mostra unsignificativo aumento dei linfociti B naive nei pazien-ti dopo trapianto, mentre le cellule B della memoriae le plasmacellule non sono alterate. La parallelaanalisi del SP ha permesso di evidenziare un au-

mento della frequenza dei linfociti B transitional im-maturi nei pazienti rispetto ai controlli che diminui-scono normalizzandosi dopo trapianto.

CONCLUSIONILa produzione di CXCL10 in due diversi comparti-menti anatomici (MO e SP) rimane inalterata dopotrapianto autologo di cellule staminali ematopoieti-che, nonostante che la maggior parte dei pazienti sitrovi in fase di remissione clinica e in assenza di at-tività di malattia. Questo dato sembra quindi una ca-ratteristica strettamente associata al sottogruppo dipazienti con una forma aggressiva di malattia chenon rispondono alle terapie convenzionali. Inoltre ilnostro è il primo studio condotto sulla caratterizza-zione delle sottopopolazioni di linfociti B midollari eperiferici in pazienti affetti da SM prima e dopo tra-pianto i cui risultati forniscono importanti e nuove in-formazioni per la comprensione del meccanismod’azione del trapianto e della patogenesi della ma-lattia.


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COMPENDIO 2014

of BM biopsies revealed a normal microenviron-ment in BM of MS patients both before and aftertransplantation. In addition, no differences werefound in colony forming efficiency, as well as ingrowth potential, expression of MSC surface mar-kers, differentiation potential toward osteo- and adi-pocytes and immunosuppressive ability of MSC preand post AHSCT. MS MSCs showed significant in-creased production of CXCL10, a T cell recall che-mokine, compared to MSC isolated from normaldonors. This altered production is maintained afterAHSCT and is due to altered signaling pathways ofinnate immune reaction mediated by TLR4. We ob-served an increased phosphorylation of p38, CREB,JNK, and STAT1, factors forming signaling cascaderesponsible of CXCL10 production and secretion.We further analyzed CXCL10 production in periphe-ral blood (PB), and we found in a sample of 19 MSpatients refractory to conventional therapies, aug-mented CXCL10 production in monocytes. This ob-servation indicates an altered inflammatoryenvironment in the two compartment involved inAHSCT: bone marrow and blood circulating cells.Multicolor flow cytometer analysis has been perfor-med in 5 MS patients on BM and PB to enumeratethe frequencies of B and T lymphocytes subsets.Total CD19+ B cells are increased after HSCT in MSpatients. Naïve B cells show a tendency to increasewhile memory and plasma cell compartment are

decreased in BM after HSCT but also compared toHD BM samples. Pro-B cell subsets were equallyrepresented in BM of MS and HD samples with nochanges after HSCT. Overall the immature B cellcompartment was not altered after HSCT. Also inthe periphery we observed an increase in totalCD19+ B cells after HSCT in MS patients. Transitio-nal B cells are increased in MS patients beforeHSCT compared to age matched control, while theydecreased after HSCT. Naïve and memory B cellsdo not show any change, while plasma cells alreadyincreased in MS before HSCT, show a tendency toincrease after HSCT.

CONCLUSIONSDespite in almost all patients no further disease ac-tivity has been detected by MRI at a median follow-up of 4.5 years (range 3– 6) post-transplantation theincreased production of CXCL10 in two differentcompartments (BM and PB) persisted after AHSCT.This data seems therefore a characteristics of thissubgroup of patients refractory to conventionaltreatments. Notably this is the first study conductedin parallel in BM and PB of MS patients before andafter transplantation aimed at evaluating B cellcompartment. Results of this analysis provide noveland important informations on the mechanism ofaction of transplantation as well as on the patho-genesis of this aggressive form of the disease.


Carrai V, Donnini I, Mazzanti B, Alterini R, Amato MP, Barilaro A, Bosi A, Massacesi L, Portaccio E, Repice AM, Rotunno G, Saccardi R. Immunohisto-chemistry analysis of bone marrow biopsies in multiple sclerosis patients undergoing autologous haematopoietic stem cells transplantation. Clin NeurolNeurosurg. 2013 Jul;115(7):1044-8.

Mazzanti B, Aldinucci, A; Bonechi, E, et al. Bone marrow mesenchymal stem cell characterization in severe multiple sclerosis patients treated with au-tologous haematopoietic stem cell transplantation. 39th Annual Meeting of the European-Group-for-Blood-and-Marrow-Transplantation (EBMT) London,UK: Apr 07-10, 2013 Bone Marrow Transplantation volume 48, Supplement: 2: S39-S39 Published: Apr 2013

Aldinucci A; Bonechi E; Galante A; et al. Mesenchymal stem cells and autoimmune diseases: the case of multiple sclerosis. 38th Annual Meeting of theEuropean-Group-for-Blood-and-Marrow-Transplantation (EBMT) Location: Geneva, Switzerland April 01-04, 2012. Bone Marrow Transplantation volu-me:47, Supplement:1:S229-S229; April 2012


Strategie rimielinizzanti innovative per la sclerosi multipla:focus su GPR17, nuovo recettore coinvoltonel differenziamento oligodendrocitario

Maria Pia AbbracchioDipartimento di Scienze Farmacologiche e Biomolecolari, Università degli Studi di Milano, Milano

COLLABORATORI:Marta Fumagalli, Elisabetta Bonfanti, Davide Lecca, Chiara Parravicini,Gianluca Menichetti, Giusy Coppolino

COLLABORAZIONI CON ALTRI GRUPPI:Roberto Furlan, Istituto Scientifico San Raffaele, Milano, Milano

PREMESSE E OBIETTIVILa sclerosi multipla (SM) secondaria progressiva èuna malattia ancora incurabile per la quale la stimo-lazione della rimielinizzazione rimane tuttora il piùimportante obiettivo terapeutico. Nostri studi pre-cedenti suggeriscono che il recettore di membranaGPR17 possa guidare la transizione di precursorioligodendrogliali (OPC) a cellule mielinizzanti. È tut-tavia necessario comprendere il ruolo di GPR17, ilsuo sistema di segnalazione e le sue variazioni du-rante la maturazione degli OPC. Su queste basi, gliobiettivi del nostro progetto sono stati: (1) compren-dere il ruolo di GPR17 nel differenziamento degliOPC; (2) definire la via di segnalazione di GPR17 ele sue alterazioni durante la maturazione degli OPC;(3) analizzare GPR17 nel topo ESA, un modello spe-rimentale di SM.

RISULTATIIn relazione all’obiettivo 1, abbiamo dimostrato cheGPR17 appare precocemente negli OPC NG2-po-sitivi, raggiunge la sua massima espressione allostadio O4 ed è poi progressivamente spento. Anchein vivo, GPR17 è presente in OPC esprimenti NG2 oOlig2, ma non negli oligodendrociti maturi MBP-po-sitivi. Analogamente, durante lo sviluppo nel ratto,l’espressione di GPR17 è massima al decimo giornopostnatale e diminuisce col procedere della mieli-nizzazione. L’esposizione precoce degli OPC agliagonisti di GPR17 promuove il loro differenziamento,mentre il trattamento con antagonisti o con RNA in-terferenti ne riduce la maturazione. Inoltre, la sovra-espressione forzata del recettore a stadi tardivi del

differenziamento compromette la maturazione cel-lulare, suggerendo la necessità di un silenziamentospontaneo del recettore affinché gli OPC completinoil loro differenziamento. Abbiamo poi identificato ladesensibilizzazione indotta da agonisti e successivainternalizzazione come un potenziale meccanismoalla base dello spegnimento fisiologico di GPR17negli OPC e dimostrato che questo avviene via fo-sforilazione da parte di chinasi dei recettori a G-pro-teine. Abbiamo anche messo a punto co-colture diOPC con neuroni dei gangli dorsali, dimostrandoche gli agonisti di GPR17 promuovono la mieliniz-zazione degli assoni.Per rispondere all’obiettivo 2,abbiamo identificato il sistema di trasduzione nativodi GPR17, dimostrando che gli agonisti recettorialiinibiscono specificatamente la formazione di cAMP.Abbiamo inoltre descritto che, in pre-oligodendrocitiimmaturi, UDP-glucosio aumenta le correnti dei ca-nali di potassio (K+) rettificanti-ritardati senza alcuneffetto sulle cellule mature, a suggerire che (i) la sti-molazione delle correnti di K+ partecipi al differen-ziamento degli OPC indotto da GPR17 e che (ii) siala stimolazione delle correnti di K+ sia GPR17 sonogradualmente spenti nel corso della maturazioneterminale. Infine, l’attivazione di GPR17 stimola lamigrazione degli OPC.In accordo con l’obiettivo 3, abbiamo caratterizzatoil fenotipo di OPC esprimenti GPR17 nel midollospinale di topi ESA. In questi midolli, il numero dicellule GPR17 e CC1-positive diminuisce sia nellasostanza grigia che nella bianca, a causa della mor-te cellulare generalizzata correlata alla malattia. Tut-tavia, è stato osservato un incremento del numero

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INTRODUCTION AND AIMSSecondary progressive chronic multiple sclerosis(MS) is an unmet medical need for which re-myelina-tion still remains a desired therapeutic goal. Our pre-vious studies suggested that the membrane receptorGPR17 orchestrates the transition from immatureoligodendrocyte precursor cells (OPCs) to maturemyelinating cells. However, more data were neededto understand the exact roles and signaling of GPR17in OPCs and their changes during OPC maturationand under demyelinating conditions, like MS. On thisbasis, our project aimed at (1) unveiling GPR17 rolesin OPC specification; (2) defining GPR17 signalingpathways and changes during OPC maturation; (3)analysing GPR17 in the EAE MS model in mice.

RESULTSTo fulfill Aim 1, we showed that GPR17 is alreadypresent in early NG2-positive cells, reaches its max-imal expression levels at the O4 stage and is thenprogressively downregulated. Consistent with thesedata, in vivo, GPR17 was present in early OPCs ex-pressing NG2 or Olig2, but was never found in cellsexpressing mature myelin markers like MBP. Similarly,

during rodent brain development, GPR17 expressionwas maximal at postnatal day 10 and then progres-sively declined along with myelination. In early cul-tured OPCs, activation of GPR17 by its endogenousagonists promoted cell differentiation, while its inhi-bition by either receptor antagonist or acute knockdown with small interfering RNAs markedly impairedcell maturation. Moreover, interference with the timelyphysiological downregulation of GPR17 by forcing itsexpression at late OPC stages markedly impairedcells’ terminal maturation, suggesting that sponta-neous receptor silencing is needed for cells to com-plete their differentiation program. We then identifiedagonist-induced GPR17 desensitization and internal-ization as a potential mechanism at the basis of itsphysiological silencing in late OPCs, and demonstrat-ed that this occurred by phosphorylation via G-pro-tein receptor kinases. We also established the DorsalRoot Ganglia neuron-OPC co-cultures and demon-strated that GPR17 agonists significantly increase ax-onal myelination index compared to control. To fulfillAim 2, we identified GPR17 native transduction path-way, demonstrating that GPR17 agonists specificallyinhibit cAMP formation.

Innovative re-myelinating strategies for multiple sclerosis viathe exploitment of the new oligodendrocyte receptor GPR17

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di OPC esprimenti GPR17 in prossimità delle areedel midollo spinale infiammate e infiltrate da celluledel sangue, in parallelo ad un marcato aumento deltrascritto di GPR17. In linea con questi risultati, nellamaggioranza (66,7%) dei pazienti con trauma cra-nico deceduti per complicazioni intracraniche, siosserva un aumento di GPR17 negli OPC molto piùalto rispetto al 20% dei pazienti deceduti per com-plicazioni extracraniche. Non abbiamo isolato e ca-ratterizzato gli OPC da topi ESA, a causa del temponecessario per la messa a punto del modello ani-male di SM, ma prevediamo di farlo utilizzando untopo reporter GPR17iCreERT2, in cui dopo induzionecon tamoxifene, le cellule esprimenti GPR17 (e laloro progenie) risultano fluorescenti. Questa lineamurina agevolerà notevolmente l’isolamento e lapurificazione di OPC esprimenti GPR17 e permet-terà di seguire il loro destino finale.

CONCLUSIONIIn conclusione, abbiamo proposto un nuovo ap-proccio terapeutico che prevede una strategia di ri-mielinizzazione basata su GPR17. I dati in vitro,ottenuti finora, stabiliscono inequivocabilmente unruolo cruciale per GPR17 nel differenziamento emielinizzazione degli OPC. Tuttavia, nel modello ditopo ESA e nei pazienti con trauma cranico, si os-serva un aumento aberrante di GPR17 in prossimitàdelle lesioni. Sulla base dei nostri dati in vitro, chedimostrano che la sovra-espressione di GPR17 astadi tardivi del differenziamento degli OPC com-promette la loro maturazione, ipotizziamo che que-sta alterazione possa contribuire al difetto dirimielinizzazione nella SM e rappresentare un nuovomeccanismo patogenetico della malattia. Proponia-mo, inoltre, che agenti farmacologici in grado dicorreggere l’espressione aberrante di GPR17 pos-sano favorire la rimielinizzazione nella SM.

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We also showed that, in pre-immature oligodendro-cytes, UDP-glucose enhanced delayed rectifier K+

currents with no effect on mature cells, to suggest that(i) stimulation of K+ currents participates to GPR17-in-duced OPC differentiation and (ii) stimulation of bothK+ currents and GPR17 are gradually dowregulatedalong with cells’ terminal maturation. GPR17 activa-tion also stimulated OPC migration.According to Aim 3, we characterized the pheno-type of GPR17 expressing OPCs in the spinal cordof EAE mice. The total number of both GPR17- andCC1-positive cells was decreased in both the greyand white matter of EAE mice compared to control,likely due to generalized disease-related cell loss.However, increased numbers of GPR17-expressingOPCs were found to accumulate around spinal cordinflamed areas where circulating blood cells wereinfiltrating the tissue. To confirm that this actuallyreflected receptor up-regulation, we showed amarked increase of GPR17 mRNA in EAE com-pared to control spinal cord tissue. In line with thesefindings, the majority (66.7%) of patients with trau-matic brain injury (TBI) deceased from intracranialcomplications showed increased GPR17 in OPCs,compared to only 20% in patients deceased fromextracranial complications. Globally, these findingssuggest that GPR17 is up-regulated in both rodentand human OPCs as a result of injury. Due to the

time required to set up the EAE model, we have notbeen able to characterize the in vitro behavior ofOPCs from EAE mice, but plan to address this issuein our new GPR17iCreERT2 fluorescent reportermouse where, upon tamoxifen induction, cells ex-pressing GPR17 (and their progeny) become green.This mouse line will greatly facilitate the isolationand purification of GPR17 expressing OPCs and al-low to follow their final destiny.

CONCLUSIONSWith this project, we have proposed a new therapeu-tic approach based on a GPR17-based re-myelinat-ing strategy. The in vitro data produced so far haveunequivocally established a crucial role of GPR17 inphysiological OPC differentiation and myelination.However, our data in both a rodent EAE model andin human TBI have highlighted an aberrant upregu-lation of GPR17 at lesion sites. Based on our in vitrodata demonstrating that interferences resulting in in-appropriate GPR17 expression in late OPCs impairprogression to myelinating phenotypes, we proposethat this dysfunction may contribute to defective re-myelination in MS and represent a new pathogenicdisease mechanism. We also propose that pharma-cological agents that are able to revert GPR17 aber-rant expression may induce OPCs to resumemyelination and prove effective in MS.


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Bonfanti E, Fumagalli M, Daniele S, Margaroli N, Lecca D, Martini C, Trincavelli ML, Abbracchio MP (2013). Oral communication titled: “The mammaliantarget of rapamycin (mTOR) controls oligodendrocyte maturation by fine-tuning the activity of GPR17 receptor via G protein-coupled receptor kinases”.36° Congresso Nazionale SIF, Torino 23-26 Ottobre 2013.


Lecca L, Coppolino G, Menichetti G, Marangon D, Bonfanti E, Fratangeli A, Fumagalli M, Rosa P, Abbracchio MP (2013). Oral communication titled:“Gene regulation of the receptor GPR17 in oligodendroglial cells: expression pattern and pathological alterations in a mouse model of multiple sclerosis”.36° Congresso Nazionale SIF, Torino 23-26 Ottobre 2013.

Lecca L, Coppolino G, Menichetti G, Marangon D, Bonfanti E, Fratangeli A, Fumagalli M, Rosa P, Abbracchio MP (2013). Poster titled: “Gene regulationof the P2Y-like receptor GPR17 in oligodendrocytes, and pathological alterations in a mouse model of multiple sclerosis”. 5th Joint Italian-German PurineClub Meeting – Fostering translational research on Purines by Italian-German joint efforts, Rimini 18-21 Settembre 2013.

Bonfanti E, Fumagalli M, Daniele S, Margaroli N, Lecca D, Martini C, Trincavelli ML, Abbracchio MP. Oral communication titled: “The mammalian targetof rapamycin (mTOR) controls oligodendrocyte maturation by fine-tuning the activity of GPR17 receptor via G protein-coupled receptor kinases”. NextStep 4, la giovane ricerca avanza, Milano 17 luglio 2013.

Fumagalli M, Bonfanti E, Daniele S, Lecca D, Coppolino GT, Trincavelli ML, Martini C, Abbracchio MP (2013). Dysregulation of GPR17, a key receptorinvolved in oligodendrocyte maturation, as a novel potential pathogenetic mechanism in demyelinating diseases. Euroglia 2013 XI European Meeting onGlial cells in Health and Disease, Berlin July 3-6, 2013. Glia, Volume: 61, Supplement: 1, Pages: S137-S137, Published: Jul 2013.

Fumagalli M, Bonfanti E, Coppolino G, Parravicini C, Menichetti G, Furlan R, Lecca D, Abbracchio MP (2013). Poster titled: “Innovative re-myelinatingstrategies for multiple sclerosis via the exploitment of the new oligodendrocyte receptor GPR17”. Congresso Scientifico Annuale FISM 29-30 Maggio2013.

Abbracchio MP, Fumagalli M, Lecca D, Bonfanti E, Parravicini C, Coppolino G, Daniele S, Trincavelli M, Martini C. “Extracellular purine and pyrimidinenucleotide as local extrinsic regulators of adult neural progenitor cells in the diseased CNS”. 24th Biennial Meeting of the International and the AmericanSociety for Neurochemistry, April, 20-24, 2013, Cancun, Mexico, Invited Lecturer.

Fumagalli M, Daniele S, Bonfanti E, Parravicini C, Lecca D, Rosa P, Verderio C, Trincavelli ML, Martini C, Abbracchio MP. Oral communication titled:“The P2Y-like GPR17 receptor regulates the differentiation of NG2+ neural precursor cells into mature oligodendrocytes” at Purine 2012, Fukuoka,Japan, May 31-June 2, 2012.

Bonfanti E, Fumagalli M, Daniele S, Parravicini C, Lecca D, Trincavelli L, Abbracchio MP. Poster presentation titled: “Time-dependent and critical role ofthe P2Y-like GPR17 receptor at distinct stages of oligodendrocyte” at NEXT STEP3, la giovane ricerca avanza, Dipartimento di Scienze Farmacologichee Biomolecolari, via Balzaretti 9, 20133, Milan, June 26, 2012.

Bonfanti E, Fumagalli M, Daniele S, Parravicini C, Lecca D, Trincavelli L, Abbracchio MP. Poster presentation titled: “Time-dependent and critical role ofthe P2Y-like GPR17 receptor at distinct stages of oligodendrocyte” at XVI seminario nazionale SIF dottorandi ed assegnisti in Farmacologia ed affini, Ri-mini, September 16-19, 2012.

Bonfanti E, Fumagalli M, Parravicini C, Daniele S, Lecca D, Coppolino G, Martini C, Trincavelli L, M.P. Abbracchio. Oral communication titled: “Dysregu-lation of GPR17, a key receptor involved in NG2+ progenitor cells differentiation to mature oligodendrocytes, as a novel potential pathogenetic mechanismin demyelinating diseases” at VII convegno monotematico SIF 2nd meeting “Opportunity and challenges in the pharmacological modulation of adultneural stem cells”, Novara, December 14-15, 2012.

Abbracchio MP, Fumagalli M, Lecca D, Bonfanti E, Parravicini C, Daniele S, Trincavell L, Martini C. Regulation of oligodendrocyte precursor cells diffe-rentiation by the P2Y-like GPR17 receptor. Society for Neuroscience Annual Meeting, New Orleans, Oct. 13-17, 2012, Selected oral communication.

Fumagalli M, Bonfanti E, Daniele S, Parravicini C, Lecca D, Rosa P, Verderio C, Trincavelli ML, Martini C, Abbracchio MP. Oral communication titled:“Role of the P2Y-like receptor in neural precursor cells”, “IV convegno monotematico SIF”, Immunity and Inflammation in brain diseases”, Milan, No-vember 14, 2011.

Fumagalli M, Daniele S, Parravicini C, Lecca D, Bonfanti E, Lee PR, Fields RD, Rosa P, Verderio C, Trincavelli ML, Martini C, Abbracchio MP. Poster pre-sentation titled: “Biotechnological and pharmacological in vitro approaches unveil the role of GPR17 signaling in regulating the timing of oligodendroglialdifferentiation” at 35^ SIF national conference, Bologna, September 14-17, 2011.

Parravicini C, Eberini I, Daniele S, Sensi C, Trincavelli ML, Martini C and Abbracchio MP. Poster presentation titled: “An integrated pipeline for the iden-tification of novel GPCR ligands: lessons from GPR17, a promising therapeutic target for neurodegenerative diseases” at 35^ SIF national conference,Bologna, September 14-17, 2011.

Bonfanti E, Fumagalli M, Parravicini C, Lecca D, Abbracchio MP. Poster presentation titled: “Pharmacological and biotechnological in vitro approachesunveil the role of GPR17 signaling in regulating the timing of oligodendroglial differentiation” at NEXT STEP2, la giovane ricerca avanza, Dipartimento diScienze Farmacologiche, via Balzaretti 9, 20133, Milan, June 24, 2011.


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Marilena PalmisanoDivisione di Genetica e Biologia Cellulare, Ospedale San Raffaele, MilanoHunter James Kelly Research Institute, University at Buffalo, Buffalo (NY), USA

MENTORE: M. Laura Feltri

Ruolo delle MAP chinasi p38 nella mielinizzazione

PREMESSE E OBIETTIVILa mielina è una guaina che avvolge gli assoni nelsistema nervoso. È costituita da strati di membranaplasmatica ed è prodotta dalle cellule gliali, che nelsistema nervoso centrale (SNC) sono gli oligoden-drociti. Vari segnali assonali e gliali cooperano du-rante lo sviluppo per indurre la formazione di mielina.La mielina è danneggiata in pazienti con SM ed altremalattie demielinizzanti. Nella SM, dopo fasi inizialiin cui gli assoni sono de-mielinizzati e ri-mielinizzati,gli oligodendrociti non sono più in grado di ri-mieli-nizzare gli assoni, provocando perdita assonale einabilità funzionale. Si ipotizza che nel cervello deipazienti con SM in stadi avanzati vengano espressiinibitori della mielinizzazione che ostacolano la ri-mielinizzazione. L’obiettivo principale di questo pro-getto è stato di chiarire come la cascata delle MAPchinasi p38 partecipi nei meccanismi di mielinizza-zione e ri-mielinizzazione del SNC. La famiglia dellep38 è costituita da quattro isoforme codificate daquattro geni diversi (α, β, γ, δ), con varie funzioni neldifferenziamento cellulare. In alcuni tessuti, comeper esempio nel muscolo, è stato dimostrato che di-verse isoforme hanno funzioni opposte, piuttostoche ridondanti. Studi in vitro sul ruolo di p38 nellamielinizzazione da parte degli oligodendrociti sug-geriscono che p38α favorisca la mielinizzazione.Dato che p38α in vitro sembra promuovere la mieli-nizzazione, ma si sa poco sulla funzione di ciascunaisoforma e sul loro ruolo in vivo, ci siamo chiesti qualiisoforme della famiglia di p38 siano espresse nelSNC e come esse siano coinvolte nello sviluppo delSNC e nei meccanismi di ri-mielinizzazione.

RISULTATIL’analisi del pattern di espressione di p38 ha mostratoche p38α e β sono espresse nel cervello, ma γ e δ so-no arricchite in regioni di sostanza bianca. Abbiamoanche analizzato oligodendrociti in coltura in condizioniproliferanti o differenziati. p38α è espressa in entrambi

gli stadi di differenziamento, mentre γ e δ sono espres-se dinamicamente durante lo sviluppo, suggerendofunzioni specifiche. Inoltre, l’espressione di p38γ nelcervello di ratto risulta piuttosto bassa 5-15 giorni dopola nascita (P5-P15), durante la fase di mielinizzazioneattiva, ed aumenta dopo che la mielinizzazione è com-pletata. Visto l’interessante pattern di espressione, ab-biamo analizzato il SNC di topi nulli per p38γ e δ. Icervelli nulli per p38δ non hanno mostrato alcun feno-tipo. Al contrario, l’analisi Western Blot su lisati di cer-vello ha mostrato che in topi P15 nulli per p38γ sonopresenti più proteine mieliniche che nei wildtype. Daun’analisi morfologica di sezioni di cervello abbiamoosservato una diffusa mielinizzazione precoce a P15nel cervello in assenza di p38γ. Il livello di proteine dimielina e mielinizzazione ritorna a condizioni normalinell’adulto. Questi risultati in vivo suggeriscono chep38γ sia un inibitore del differenziamento degli oligo-dendrociti. Per testare quest’ipotesi abbiamo utilizzatoun sistema in vitro che consente di purificare via im-munopanning precursori degli oligodendrociti, chepossono poi essere tenuti in coltura con mezzi di cre-scita che inducono la proliferazione o il differenziamen-to. Lo stadio di differenziamento di singole cellule puòessere stabilito effettuando colorazione con vari mar-ker. Per verificare che p38γ sia un inibitore del differen-ziamento degli oligodendrociti, abbiamo trasfettatoprecursori degli oligodendrociti con un plasmide con-tenente p38γ fusa a GFP, abbiamo poi indotto il diffe-renziamento delle cellule trasfettate e contato il numerodi oligodendrociti immaturi e maturi. Il numero di oli-godendrociti differenziati diminuisce quando p38γ vie-ne over-espressa, dimostrando che p38γ inibisce ildifferenziamento. La mielinizzazione precoce osserva-ta a P15 nei cervelli in assenza di p38γ potrebbe di-pendere da alterazioni nel numero di oligodendrociti,o nella loro capacità di differenziarsi o mielinizzare. Perverificare se la quantità di oligodendrociti cambia in as-senza di p38γ, abbiamo effettuato esperimenti di im-munostaining con CC1, un marker di oligodendrociti

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differenziati, su sezioni di cervello e midollo spinale edabbiamo contato il numero di cellule positive nelle re-gioni di sostanza bianca. Questa conta ha mostratoche in assenza di p38γ il numero totale di oligoden-drociti maturi non è alterato ad un mese di età. Infine,ci siamo chiesti se p38γ possa essere indotto in situa-zioni patologiche del SNC ed inibire la ri-mielinizzazio-ne. I nostri studi hanno mostrato che il livello di mRNAdi p38γ è aumentato nella sostanza bianca di lesionileucocorticali in cervelli post-mortem di pazienti conSM, se confrontato con regioni adiacenti non affette.Abbiamo anche analizzato un altro modello di lesionedella sostanza bianca, in cui il rallentamento della cre-scita intrauterina nei ratti causa un ritardo nella mieli-nizzazione da parte degli oligodendrociti, dovuto astress ossidativo. Anche in queste condizioni, i livelliproteici di p38γ aumentano, suggerendo che questamolecola possa essere uno dei fattori che causano unritardo nella mielinizzazione.Il nostro studio ha mostrato che p38γ è un nuovo re-golatore della mielinizzazione, e un potenziale targetmolecolare nella SM. Infatti p38γ è regolata durantelo sviluppo del SNC ed inibisce il differenziamentodegli oligodendrociti. In assenza di p38γ la mieliniz-

zazione del cervello avviene precocemente, per poiprocedere normalmente nell’adulto, indicando chela sua assenza non genera alcun effetto dannoso, ilche rende questa molecola un target farmacologicomolto promettente. Infine, p38γ è over-espressa incondizioni patologiche del SNC riguardanti la mie-linizzazione, come per esempio nel caso di SM,suggerendo che la sua up-regolazione negli oligo-dendrociti possa essere una delle cause che impe-discono la ri-mielinizzazione.

CONCLUSIONII nostri studi hanno permesso di identificare p38γcome un nuovo inibitore della mielinizzazione. Poi-ché p38γ può essere indotto da citochine infiam-matorie e da stress ossidativo, è possibile chequesta molecola possa inibire la rimielinizzazioneda parte degli oligodendrociti nel contesto dellaSM. Questa idea è supportata dal fatto che l’mRNAdi p38 è up-regolato nelle placche di SM. Studi fu-turi saranno condotti allo scopo di determinare sep38γ possa rappresentare un nuovo target farma-cologico al fine di promuovere la ri-mielinizzazionein caso di SM.

INTRODUCTION AND AIMSMyelin is a sheath that envelops axons in the nerv-ous system. It consists of layers of plasma mem-brane and is produced by glial cells, which areoligodendrocytes in the central nervous system(CNS). Various axonal and glial signals cooperateduring development to induce myelin formation.Myelin is damaged in MS and other demyelinatingdiseases. In MS, after initial stages where the axonsare de-myelinated and re-myelinated, oligodendro-cytes are not able to re-myelinate axons, leading toaxonal loss and functional disability. It is postulatedthat myelin inhibitors are induced in later stages inMS brain, preventing re-myelination. The goal of thisproject was to elucidate how the p38 MAP kinasespathway participates in CNS myelination and re-myelination. p38 family is comprised of four iso-forms coded by different genes (α, β, γ, δ), playingfunctions in cellular differentiation. In certain tissues,such as muscle, different isoforms have distinctrather than redundant functions. Studies in vitro an-

alyzed the role of p38 signaling in oligodendrocytesmyelination, and suggested that p38α promotesmyelination. Since p38α in vitro seems to promotemyelination, but little is known about the function ofeach isoform and about their role in vivo, we haveasked which p38 isoforms are expressed in the CNSand how they are involved in CNS development andin the mechanisms of re-myelination.

RESULTSAnalysis of p38 expression pattern showed thatp38α and β isoforms are expressed in the brain, butγ and δ are enriched in white matter regions. We al-so analyzed proliferating and differentiated oligo-dendrocytes. p38α is expressed at both the stages,while γ and δ are expressed dynamically during de-velopment, suggesting specific functions. More-over, p38γ expression in the rat brain is low at 5-15days after birth(P5-P15), during active myelination,and increases when myelination is completed. Giv-en the interesting expression patterns, we analyzed

Role of p38 MAP kinases in myelination

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the CNS of p38γ and δ null mice. p38δ null brainsshowed no phenotype. In contrast, western blot onbrain lysates showed that p38γ null brains at P15contain more myelin proteins than the wildtype.Morphological examination of the mutant brain sec-tions showed widespread earlier myelination at P15in p38γ null brains. Myelin protein levels and extentof myelination go back to normal in the adult. Thesein vivo results suggest that p38γ is an inhibitor ofoligodendrocytes differentiation. To test this hy-pothesis we set up an in vitro system consisting ofimmunopanning-purified oligodendrocytes precur-sors, kept in culture with proliferating or differenti-ating growth media. The differentiation state can berecognized by staining with various markers. To testif p38γ is an inhibitor of oligodendrocytes differen-tiation, we transfected purified oligodendrocytesprecursors with a plasmid containing a GFP-taggedp38γ, we induced differentiation of transfected cellsand counted the number of immature and matureoligodendrocytes. The number of differentiatedoligodendrocytes decreases when overexpressingp38γ, proving that p38γ inhibits differentiation. Theearlier myelination observed at P15 in the p38γ nullbrains could arise from changes in the number ofoligodendrocytes, their ability to differentiate or toinitiate myelination. To examine if the amount ofoligodendrocytes changes in the absence of p38γ,we performed immunostaining with CC1, a markerof differentiated oligodendrocytes, on sections ofbrain and spinal cord and we counted the numberof positive cells in white matter tracts. The countsindicate that the absence of p38γ does not alter the

total number of mature oligodendrocytes at onemonth. Finally, we asked if p38γ could be inducedin pathological situations and inhibit re-myelination.We found that mRNA level of p38γ is upregulatedin white matter leukocortical lesions of post-mortembrains from MS patients compared to normal ap-pearing areas. We also looked at another model ofwhite matter injury, where intrauterine growth retar-dation induced in rats triggers delay in oligodendro-cytes myelination due to oxidative stress. In theseconditions p38γ protein level increases, suggestingthat it may be one of the factors that delay myeli-nation.Our study revealed that p38γ is a novel player in themechanism of myelination and a possible moleculartarget to promote re-myelination in MS. p38γ is reg-ulated during oligodendrocytes development and in-hibits their differentiation. In the absence of p38γ,myelination in the brain occurs earlier and proceedsnormally in the adult. Finally, p38γ is overexpressedin myelin-related pathological conditions of the CNS,such as MS, suggesting that its over-expression inthe oligodendrocytes could prevent re-myelination.

CONCLUSIONSOur study identified p38γ as a novel inhibitor ofmyelination. Because p38γ is induced by inflamma-tory cytokines and oxidative stress, it could inhibitoligodendrocytes re-myelination in the context ofMS. Indeed, p38γmRNA is induced in MS plaques.Future studies will determine if p38γ represents anew pharmacological target to promote re-myelina-tion in MS.


Palmisano M, Abiko K, Hurley E, Taveggia C, Cuenda A, Grinspan J, Trapp B, Wrabetz L, Feltri ML. Role of p38 MAP kinases in central myelination.Poster presentation. 43rd Society for Neuroscience meeting, San Diego, CA (USA), November 9-13 2013

Palmisano M, Cuenda A, Taveggia C, Abiko K, Wrabetz L, Feltri ML. Role of p38 MAPKs in peripheral and central myelination. Poster presentation. 42ndSociety for Neuroscience meeting, New Orleans, LA (USA) October 13-17, 2012

Borsa di studio finanziata con il Bando 2010 per un periodo di 2 anni e l’ammontare di 50.000 €


Pasquale AnnunziataDipartimento di Scienze Mediche, Chirurgiche e Neuroscienze, Università degli Studi di Siena, Siena

COLLABORATORI:Chiara Cioni

COLLABORAZIONI CON ALTRI GRUPPI:Federico Corelli, Dipartimento di Biotecnologie, Chimica e Farmacia, Università degli Studidi Siena, Siena

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Studio degli effetti immunomodulatori di un nuovocannabinoide agonista selettivo per il recettore CB2 su celluleimmunocompetenti nella sclerosi multipla

PREMESSE E OBIETTIVILa discrepanza tra i risultati in vitro ed in vivo riguardoagli effetti anti-infiammatori di estratti di cannabinoidiin pazienti con sclerosi multipla (SM) e nell’encefalo-mielite sperimentale autoimmune può dipendere dal-la presenza di agonisti che si legano ad entrambi irecettori CB1 e CB2 attenuando il ruolo del singolotipo di recettore. Scopo di questo progetto è statoquello di caratterizzare gli effetti immunomodulatoried anti-infiammatori di un nuovo agonista cannabi-noide (COR167), che presenta un’alta affinità di le-game esclusivamente per il recettore CB2 e non peril sottotipo CB1. Tali effetti sono stati testati su celluleT, monociti e linee cellulari T reattive alla proteinamielinica basica, di persone con SM remittente-reci-divante in fase di stabilità e di attività di malattia ecomparati con quelle di soggetti sani.

RISULTATICOR167 è risultato capace di esercitare in vitro unpotente effetto inibitorio sulla proliferazione dellecellule immunocompetenti a concentrazioni più bas-se di quelle riportate per altri agonisti CB2. Tale at-tività inibitoria era significativamente maggiore diquella mostrata dal JWH133, un CB2 agonista pre-

cedentemente usato in modelli murini di SM ed eraesercitata attraverso un significativo shift del fenoti-po proinfiammatorio Th1 e Th17 verso il fenotipo an-tiinfiammatorio Th2. Il COR167 è, inoltre, risultato ingrado di ridurre la migrazione delle cellule immuno-competenti attraverso l’endotelio cerebrale umanoin un modello in vitro di barriera emato-encefalicamediante una significativa diminuzione dei livelli dichemochine, noti fattori di regolazione del trafficocellulare immunologico.

CONCLUSIONIQuesti dati dimostrano che il COR167 è capace diesercitare un potente effetto anti-infiammatorio intermini anti-proliferativi ed anti-migratori a dosi si-gnificativamente più basse e in entità maggiore ri-spetto ad altri agonisti noti del recettore CB2. Taleattività è legata alla sua alta selettività per il recet-tore CB2 che si conferma essere un nuovo efficacebersaglio farmacologico per contrastare la neuroin-fiammazione. Questi risultati sono incoraggianti perfuturi sviluppi della molecola volti a creare una for-ma farmaceutica non tossica utilizzabile in soggettiumani e per esplorare altre proprietà farmacologi-che utili nel trattamento della SM.

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Annunziata P, Cioni C, De Santi L, Mugnaini C, Pasquini S, Corelli F. Immunomodulatory effects of a new CB2-selective cannabinoid agonist on T-cellsfrom multiple sclerosis patients. J. Neurol. 2013; 260 (Suppl.1) P390.

Annunziata P, Cioni C, De Santi L, Mugnaini C, Pasquini S, Corelli F. Immunomodulatory effects of a new CB2-selective cannabinoid agonist on T-cellsfrom multiple sclerosis patients.Twenty-third Meeting of the European Neurological Society, 8-11 June, 2013 Barcelona, Spain.

Progetto di ricerca finanziato con il bando 2011 per il periodo di 1 anno e l’ammontare di 40.000 €

Study of immunomodulatory effects of a new cannabinoidCB2-selective agonist on immunocompetent cellsfrom multiple sclerosis patients

INTRODUCTION AND AIMSThe discrepancy between in vitro and in vivo resultsregarding anti-inflammatory effects of cannabinoidmixtures or extracts both in multiple sclerosis (MS)patients and in animal models such as experimentalautoimmune encephalomyelitis may partly depend onthe availability of mixtures containing agonists bind-ing to both cannabinoid CB1 and CB2 receptors thatcould attenuate the respective role played by singlereceptor type. The lack of conclusive results as to theexact role of CB2 agonists in MS may at least in partreflect the lack of synthetic molecules exclusively act-ing at CB2 receptor, being devoid of any affinity forthe CB1 receptor. Aim of this project was to charac-terize the immunomodulatory and anti-inflammatoryeffects of a new cannabinoid CB2-selective agonist(COR167) displaying high affinity for CB2 but notaffinity at all for CB1 receptor on immunocompetentcells including T lymphocytes, monocytes and myelinprotein- reactive T cell lines isolated from relapsing-remitting MS patients with different disease activityas well as from healthy control subjects.

RESULTSThe cannabinoid CB2-selective agonist COR167was able to exert a powerful in vitro inhibitory effecton T cell proliferation at lower concentrations thanthose reported for other less specific CB2 agonistsin similar in vitro models. In addition, this inhibitory

activity was significantly higher than those shownby JWH133, another CB2 agonist previously usedin murine models of MS, providing strong evidencethat COR167 represents one of the most selectiveand powerful CB2 agonists ever synthesized. Theanti-inflammatory activity of COR167 on T cells wasexerted through a substantial and significant shiftof proinflammatory Th1 and TH17 phenotype to-wards Th2 phenotype as demonstrated by strongreduction of levels of Th1- and TH17-related cy-tokines and significant increase of levels of Th2-re-lated cytokines. COR167 was also able to reducemigration of immunocompetent cells through hu-man brain endothelium in a reliable model of humanblood-brain barrier model.

CONCLUSIONSThese findings demonstrate that COR167 is able toexert potent anti-inflammatory and anti-migratoryeffects at significantly lower doses and to greaterextent than other known CB2 agonists. This activityis likely to be linked to its high selectivity for thecannabinoid CB2 receptor that is confirmed to bea novel pharmacological target for counteractingneuroinflammation. These data encourage furtherwork to achieve a pharmaceutical form suitable foruse in human subjects for future clinical trials andto explore any other pharmacological property tobe used in treatment of MS.

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PREMESSE E OBIETTIVINegli ultimi anni è stato evidenziato il ruolo del si-stema endocannabinoide (SE) nella regolazione didiversi aspetti della fisiopatologia umana, mediantel’attivazione dei recettori cannabici e vanilloidi, e/oattraverso un’azione diretta non recettoriale. Dati re-centi suggeriscono il coinvolgimento del SE non so-lo nel processo infiammatorio tipico della sclerosimultipla (SM), ma anche nella sua componente neu-rodegenerativa. Il nostro obiettivo è stato quello difornire ulteriori dettagli sul ruolo del SE in un mo-dello sperimentale di SM (noto come encefalomie-lite sperimentale autoimmune, ESA), per verificarecome il SE moduli la neurodegenerazione infiam-matoria caratteristica di questa patologia. Inoltre,abbiamo cercato d’indentificare all’interno del SEalterazioni funzionali, da sfruttare come biomarca-tori periferici di SM utili nella diagnosi della malattiae/o come potenziale bersagli farmacologici per te-rapie innovative. A questo scopo, abbiamo eseguitosu topi ESA analisi biochimiche, valutazioni clinichee misure neurofisiologiche della trasmissione sinap-tica che ci hanno permesso di acquisire indicazionisulla relazione tra l’entità del danno infiammatorioe quello degenerativo, ed anche di ottenere ulterioriinformazioni sui meccanismi di azione del SE nellafisiopatologia della SM. L’ESA è stata indotta anchenei seguenti topi geneticamente modificati: i) ani-mali privi del recettore CB1 in tutti i tessuti, solamen-te sulle terminazioni nervose glutammatergiche o

solo su quelle GABAergiche; ii) topi privi dei recet-tori CB2; iii) topi privi dei recettori TRPV1; iv) topi pri-vi dell’enzima FAAH. In aggiunta agli obiettivioriginali del progetto, nel secondo anno abbiamoavuto l’opportunità di analizzare il profilo delle cito-chine di due diverse sottopopolazioni di cellule den-dritiche (CD) umane, isolate dal sangue di soggettisani o di pazienti affetti da SM.

RISULTATINel primo anno del progetto abbiamo caratterizzatol’espressione genica e proteica dei principali com-ponenti del SE nello striato di topi con ESA a diversistadi di progressione della malattia. I nostri datihanno mostrato un aumento significativo dei livellidi mRNA solo per la FAAH (l’enzima di degradazio-ne dell’anandamide) durante la fase cronica dellamalattia, ed una lieve alterazione delle altre compo-nenti del SE a livello proteico. È interessante sotto-lineare che i risultati hanno dimostrato che il SE nonè alterato nella fase di esordio della malattia. Suc-cessivamente, le analisi biochimiche sono stateeseguite su animali ESA geneticamente modificati.I dati hanno mostrato una riorganizzazione degli ele-menti del SE striatale dipendente dall’espressionedei recettori CB1. In particolare, abbiamo trovato un in-cremento del TRPV1 nei topi CB1

-/- e Glu-CB1-/-, ma

non nei GABA-CB1-/-. Inoltre, abbiamo rilevato un au-

mento dei livelli di mRNA dell’enzima FAAH e del re-cettore GPR55 nei topi CB1

-/- rispetto agli animali

Ruolo del sistema endocannabinoide nel processoneurodegenerativo della sclerosi multipla sperimentale

Mauro MaccarroneFacoltà di Medicina e Chirurgia e Centro Integrato di Ricerca, Università Campus Bio-Medicodi Roma, Roma

COLLABORATORI:Silvia Rossi, Natalia Battista, Sergio Oddi, Mariangela Pucci, Manuela Talamonti,Valerio Chiurchiù, Luca Battistini, Domenico Tallarida

COLLABORAZIONI CON ALTRI GRUPPI:Benjamin Cravatt, Department of Chemical Physiology - The Skaggs Institute for ChemicalBiology, The Scripps Research Institute, La Jolla, California, USABeat Lutz, Department of Physiological Chemistry, Johannes Gutenberg University MainzMainz,Germany

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controllo (WT), mentre abbiamo misurato una dimi-nuzione dell’espressione di questi elementi nei topiGABA-CB1

-/- e Glu-CB1-/-.

Nel secondo anno di attività, i dati ottenuti dalle ana-lisi delle citochine di due diverse sottopopolazioni dicellule dendritiche (CD) isolate dal sangue di sog-getti sani e pazienti affetti da SM hanno rivelato unoscenario interessante, in cui le CD mieloidi (mCD)dei pazienti SM producono livelli significativamentepiù elevati di IL-12 e IL-6 rispetto ai controlli sani,mentre quelle plasmacitoidi (pCD) mostrano una ca-pacità ridotta di produrre IFN-α. Abbiamo succes-sivamente dimostrato che l’anandamide (AEA) ècapace d’inibire la produzione di TNF-α, IL-12 e IL-6 dalle mCD isolate sia dai controlli sani che dai pa-zienti SM, mediante un meccanismo dipendente dalCB2; invece, l’effetto immunosoppressivo dell’AEAsulle pCD risulta evidente nei soggetti sani, ma nonnei pazienti affetti da SM. Considerato il diverso ef-fetto dell’AEA nel modulare la produzione di citochi-ne in ciascuna sottopopolazione di CD, abbiamoanche evidenziato che l’immunomodulazione del-l’AEA avviene principalmente a livello di inibizionedel rilascio di citochine piuttosto che di riduzionedell’espressione dei marcatori di attivazione. Va in-fine notato che le mCD e le pCD presentano livellidiversi di espressione genica di CB2 e FAAH, soloquando isolate da pazienti affetti da SM.Inoltre, sulla base di precedenti evidenze sperimen-tali, che hanno dimostrato un potenziamento dellatrasmissione sinaptica glutammatergica a livello deineuroni striatali, e il ruolo modulatorio fondamentaledei CB1 su tale alterazione sinaptica, abbiamo con-dotto esperimenti elettrofisiologici per chiarire ulte-riormente la funzione dei CB1 nell’ESA.In particolare, per valutare quale sottotipo di CB1

fosse coinvolto nelle alterazioni pre e postsinapti-che indotte dall’ESA, abbiamo registrato le correntieccitatorie postsinaptiche spontanee (sEPSCs) intopi selettivamente privi dei CB1 a livello di neuroniGABAergici striatali e a livello dei neuroni glutam-matergici corticali durante la fase acuta dell’ESA.I nostri dati dimostrano che i CB1 localizzati sui ter-minali GABAergici e glutammatergici sono coinvoltiin maniera differente nelle alterazioni pre- e postsi-naptiche della trasmissione glutammatergica.

Dopo l’induzione dell’ESA, infatti, i topi selettiva-mente privi di CB1 sui neuroni GABAergici hannopresentato un più evidente incremento della duratadelle sEPSC registrate da neuroni striatali, come dapotenziamento postsinaptico della trasmissioneglutammatergica. Il medesimo effetto è stato ri-scontrato anche in preparati striatali incubati in pre-senza di tumor necrosis factor.Al contrario, le alterazioni della frequenza dellesEPSC indotte dall’ESA sono risultate potenziatesolo in topi privi del CB1 sui neuroni glutammatergi-ci, indicando che questo specifico sottotipo di re-cettori modula gli effetti dell’infiammazione sulrilascio di glutammato.I nostri risultati confermano, quindi, il coinvolgimentodei CB1 nella patofisiologia dell’ESA, e suggerisconoche alterazioni della trasmissione sinaptica glutamma-tergica sia a livello presinaptico che postsinapticoconcorrono alla realizzazione della neurodegenerazio-ne su base eccitotossica tipica di questa patologia.

CONCLUSIONII nostri dati supportano un ruolo chiave per la FAAHnel controllo del tono endogeno (e quindi della suaattività biologica) dell’AEA nella SM. Infatti, la ridu-zione di questo enzima nello striato dei topi ESAcorrela con l’aumento dei livelli di AEA, e con le di-verse risposte elettrofisiologiche nei topi con abla-zione dei recettori CB1 su terminazioni nervoseselettive. Quindi, questi risultati possono riflettere unmeccanismo adattativo finalizzato a limitare il dannoneuronale. In accordo con i risultati ottenuti sul mo-dello sperimentale, l’immunomodulazione differentedelle mCD e delle pCD umane da parte dell’AEA sipuò attribuire ad un’alterata espressione della FAAH.Pertanto, i nostri risultati rappresentano una baseper il disegno razionale di nuovi trattamenti farma-cologici, orientati verso gli elementi del SE (soprat-tutto la FAAH) per poter rallentare il decorso dellaSM, esercitando un ruolo neuroprotettivo in aggiuntaalla convenzionale azione immunomodulante. Inquesto modo la progressione di malattia viene limi-tata. Ciò potrebbe rivelarsi utile anche in altre pato-logie del sistema nervoso centrale in cui processineurodegenerativi mediati dall’infiammazione svol-gono un ruolo fondamentale.

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INTRODUCTION AND AIMSThe last few years have remarked the involvementof the endocannabinoid system (ECS) in the regu-lation of several aspects of human (patho)physiol-ogy, through the activation of cannabinoid andvanilloid receptors, and/or through non-receptormediated actions. Increasing evidence supports theinvolvement of the ECS not only in the inflammatoryprocess typical of multiple sclerosis (MS), but alsoin the neurodegeneration related to this disease.Our aim was to provide further details on the role ofthe ECS in experimental MS (namely experimentalautoimmune encephalomyelitis, EAE), to see howthe ECS modulates inflammatory neurodegenera-tion typical of this disorder, and to identify, withinthe ECS, new biomarkers to be used for MS diag-nosis and follow-up. Additionally, we aim at identi-fying distinct elements of the same system aspossible targets for novel immunomodulatory andneuroprotective therapies. In order to reach theseaims, we performed on animal models biochemicalstudies, clinical evaluations and neurophysiologicalmeasures of synaptic transmission analyses, thatallowed us to increase our understanding on the re-lationship between inflammation and degenerativedamage, and to gain insights into modulation of MSpathophysiology by ECS. EAE was induced in micelacking CB1 receptors in all tissues, in mice with theselective ablation of CB1 receptors on glutamatenerve terminals, in mice lacking CB1 receptor onlyon GABAergic neuronal elements, as well as in micelacking CB2 receptors or TRPV1 receptors, and fi-nally in mice lacking FAAH in all tissues or only atthe periphery. In addition to the planned experimen-tal activity, in the second year of this project we hadthe chance to also obtain blood samples from MSpatients and healthy subjects, and to perform sev-eral studies on critical immune cells where we ana-lyzed the cytokine profile of the dendritic cell (DC)subsets in MS pathogenesis.

RESULTSDuring the first year of this project, we evaluatedgene and protein expression of the main ECS ele-ments, at presymptomatic, acute and chronicstages of MS progression. Our mRNA results in

striatum showed that only FAAH levels increased inEAE mice during the chronic phase of the disease,whereas all other ECS elements were slightly, butnot significantly, modulated at translational level. In-terestingly, none of ECS components was affectedduring the early phases of the disease. We next per-formed biochemical analyses in striatum obtainedfrom wild-type (WT) and knock-out (KO) mice, af-fected by MS. Our mRNA results showed a differentrearrangement of striatal ECS elements in EAEmice, depending on the expression of CB1. In par-ticular, we found an increase of TRPV1 in CB1

-/- andGlu-CB1

-/-, but not in GABA-CB1-/-. We also detected

an increased mRNA of FAAH (the main responsiblefor AEA hydrolysis) and of GPR55 receptor in CB1

-/-

mice with respect to WT animals, but decreasedmRNA of both elements in GABA-CB1

-/- and Glu-CB1

-/- EAE mice.In the second year of research activity, data ob-tained from the analyses of cytokine profile of thedendritic cell (DC) subsets isolated from the bloodsamples of healthy subjects and MS patients, de-picted an interesting scenario, where myeloid DC(mDC) from MS patients produced significantlyhigher levels of IL-12 and IL-6 compared to healthysubjects, whereas plasmacytoid DC (pDC) showeda reduced capacity to produce IFN-α. We nextdemonstrated that AEA was able to inhibit TNF-α,IL-12 and IL-6 production from mDC of both healthysubjects and MS patients, and that these effectswere specifically mediated by CB2. Instead, the im-munosuppressive effect of AEA in pDC was only ev-ident in healthy subjects, but not in MS patients.Given the distinct effect of AEA in modulating cy-tokine production in each DC subset, we alsodemonstrated that immunomodulation by AEAmainly occurred at the level of cytokine inhibition,rather than at that of downregulation of activationmarkers. Interestingly, mRNA analysis showed a dif-ferent expression of CB2 and FAAH in mDC andpDC of MS patients.Furthermore, on the base of previous experimentalevidences, revealing that EAE induces an enhance-ment of glutamate transmission of striatal neurons,and that CB1 plays a fundamental modulatory roleon these synaptic alterations, we performed elec-

Role of the endocannabinoid system in the neurodegenerativeprocess of experimental multiple sclerosis

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trophysiological experiments aimed at better clari-fying CB1 function in EAE.In particular, in order to investigate the CB1 subsetinvolved in the modulation of EAE-induced pre- andpostsynaptic alterations, we recorded spontaneousexcitatory postsynaptic currents (sEPSCs) in micelacking CB1 in forebrain GABAergic and in corticalglutamatergic neurons, respectively, during theacute phase of EAE.Interestingly, our data demonstrated that CB1 locat-ed on GABAergic and glutamatergic terminals aredifferentially involved in the pre- and postsynapticalterations of glutamate transmission caused byEAE. After induction of EAE, mice selectively lack-ing CB1 on GABAergic neurons showed exacerbat-ed alterations of sEPSC duration in GABAergicstriatal neurons, indicating a postsynaptic enhance-ment of glutamatergic transmission. This effect wasalso seen in striatal brain slices incubated with TNFα.On the other hand, EAE-induced alterations of cor-ticostriatal sEPSC frequency were exacerbated onlyin mice lacking CB1 on glutamatergic neurons, indi-cating that this subset of receptors controls the ef-fects of inflammation on glutamate release.Our results provided further evidence that CB1 areinvolved in EAE pathophysiology, and suggested

that both pre- and postsynaptic alterations of glu-tamate transmission are necessary to drive excito-toxic neurodegeneration typical of this disorder.

CONCLUSIONSAltogether, our findings support a key-role of FAAHin controlling the endogenous tone (and hence thebiological activity) of AEA in MS. Indeed, the reduc-tion of this enzyme in the striatum of EAE mice isparalleled by an increase of AEA levels, and henceby different electrophysiological responses in mu-tant mice lacking CB1 on selected neurons. Theseevents might reflect an adaptive mechanism aimedat limiting neuronal damage. In line with this, the dis-tinct immunomodulation of mDC and pDC by AEAin MS patients is attributable to an altered expres-sion of FAAH, thus affecting the endogenous toneand subsequent immunomodulatory activity of AEAon these cells. Therefore, the present findings mightform the basis for the rational design of new ECS-oriented therapeutics, able to slow-down MS, exert-ing neuroprotective effect other than conventionalimmunomodulatory action, thus limiting disabilityprogression. This might be helpful also in other dis-orders of central nervous system in which inflamma-tion-driven neurodegeneration process plays a role.


Chiurchiù V, Cencioni MT, Bisicchia E, De Bardi M, Gasperini C, Borsellino G, Centonze D, Battistini L, Maccarrone M. Distinct modulation of humanmyeloid and plasmacytoid dendritic cells by anandamide in multiple sclerosis. Ann Neurol. 2013;73:626-36.

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Rossi S, Sacchetti L, Napolitano F, De Chiara V, Motta C, Studer V, Musella A, Barbieri F, Bari M, Bernardi G, Maccarrone M, Usiello A, Centonze D. In-terleukin-1β causes anxiety by interacting with the endocannabinoid system. J Neurosci. 2012;32:13896-905.

Rossi S, Furlan R, De Chiara V, Motta C, Studer V, Mori F, Musella A, Bergami A, Muzio L, Bernardi G, Battistini L, Martino G, Centonze D. Interleukin-1β causes synaptic hyperexcitability in multiple sclerosis. Ann Neurol. 2012;71:76-83.

Musumeci G, Grasselli G, Rossi S, De Chiara V, Musella A, Motta C, Studer V, Bernardi G, Haji N, Sepman H, Fresegna D, Maccarrone M, Mandolesi G,Centonze D. Transient receptor potential vanilloid 1 channels modulate the synaptic effects of TNF-a and of IL-1ß in experimental autoimmune ence-phalomyelitis. Neurobiol Dis. 2011;43:669-77.

Rossi S, Furlan R, De Chiara V, Muzio L, Musella A, Motta C, Studer V, Cavasinni F, Bernardi G, Martino G, Cravatt BF, Lutz B, Maccarrone M, CentonzeD. Cannabinoid CB1 receptors regulate neuronal TNFα effects in experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain Behav Immun. 2011;25:1242-8.

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Maccarrone M, Chiurchiù V, Cencioni MT, Lanuti M, Fezza F, Centonze D, Luca Battistini L and Rossi S. Role of the Endocannabinoid System in theNeurodegenerative Process of Experimental Multiple Sclerosis. FISM Scientific Congress, Rome, May 29-30, 2013.

Progetto di ricerca finanziato con il Bando FISM 2010 per un periodo di 2 anni (prorogato di 6 mesi) e l’ammontare di 130.000 €


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PREMESSE E OBIETTIVILa patogenesi della sclerosi multipla (SM), una ma-lattia infiammatoria cronica del sistema nervosocentrale (SNC) che colpisce giovani adulti, non èancora del tutto chiarita, e il successo terapeuticoper questa malattia è limitato. È quindi necessariotrovare terapie più efficaci per la SM, e possibilmen-te una cura definitiva.Le prokineticine sono due piccole proteine scopertedi recente, prokineticina-1 (PK-1) e prokineticina-2(PK-2). Ampiamente espresse in diversi tessuti,queste molecole sono coinvolte in un ampio spettrodi funzioni biologiche, tra cui la modulazione dellarisposta immunitaria. In particolare PK-2, moltoespressa nei tessuti infiammati, può indurre attiva-zione e migrazione di cellule immunitarie chiamatemacrofagi, e agire sui linfociti T promuovendo l’in-fiammazione.Le proprietà immunomodulatorie delle prokineticinerendono queste molecole particolarmente interes-santi da studiare nella SM e nel suo modello anima-le, l’encefalomielite esperimentale autoimmune(ESA), dato il ben noto squilibrio tra le risposte pro-infiammatorie Th1/Th17 e anti-infiammatorie Th2 inqueste malattie, che sono invece associate a rispo-ste Th1 e Th17 contro la mielina del SNC. Lo scopo

del nostro progetto era di investigare il ruolo di que-ste proteine nella patogenesi dell’infiammazione edella demielinizzazione nel SNC durante la SM, uti-lizzando l’ESA Questo studio è stato finanziato dallaFISM come un progetto pilota di un anno al fine diconfermare i nostri risultati preliminari che suggeri-vano che il blocco dei recettori per le prokineticinefosse terapeutico nell’ESA.

RISULTATIIl finanziamento pilota ottenuto dalla FISM è statomolto importante per portare avanti il progetto di ri-cerca proposto. Con l’aiuto di questo finanziamentosiamo riusciti ad ottenere i reagenti e gli animali ne-cessari per i nostri esperimenti, e partecipare a con-gressi per presentare i dati di questo progetto e perinteragire con persone del campo della neuro-in-fiammazione e della SM che ci hanno dato impor-tanti feedback sul progetto. Nel lavoro condottocrediamo di essere riusciti a confermare i nostri ri-sultati preliminari sul ruolo delle prokineticine nel-l’ESA, che ci permetteranno di portare avanti ilnostro progetto e di verificare l’eventualità che leprokineticine possano essere un nuovo target tera-peutico nella SM. La ricerca che abbiamo condottopuò essere riassunta come segue.

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Il sistema delle prokineticine nelle malattie demielinizzantiautoimmuni del sistema nervoso centrale:meccanismi patogenetici e possibili nuovi bersagli di terapiaper la sclerosi multipla

Rosetta PedottiUnità di Neuroimmunologia, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Milano

COLLABORATORI:Mohamad Abou-Hamdan, Silvia Musio, Massimo Costanza

COLLABORAZIONI CON ALTRI GRUPPI:Gianfranco Balboni, Dipartimento di Scienze della Vita e dell’Ambiente, Università di Cagliari,CagliariPietro Luigi Poliani, Dipartimento di Patologia, Università of Brescia, Ospedali Civili of Brescia,BresciaLawrence Steinman, Department of Neurology and Neurological Sciences, Stanford University,Stanford, CA, USAGabriela Constantin, Dipartimento di Patologia, Università di Verona, Verona

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INTRODUCTION AND AIMSThe pathogenesis of multiple sclerosis (MS) is stillnot completely understood, and the success of im-mune intervention in this disease is limited. Thus,tremendous clinical need exists for more effective,and fundamentally curative, therapies for MS.Prokineticins are relatively newly discovered secret-ed proteins. They comprise two distinct small mol-ecules, prokineticin 1 (PK-1) and prokineticin 2

(PK-2). Prokineticins are widely expressed in differ-ent tissues and involved in a wide spectrum of bio-logical and pathological functions. Recently theywere found to modulate the immune response. Inparticular PK-2 , highly expressed in inflamed tis-sues, can induce macrophage activation and migra-tion, and can act on lymphocytes T to promoteinflammation. The immune-modulating properties ofprokineticins make these novel molecules particu-

The prokineticin system in autoimmune demyelinating diseaseof the central nervous system: pathogenetic mechanisms andpossible novel target of therapy for human multiple sclerosis

Abbiamo studiato l’espressione di PK-2 e dei suoirecettori nelle cellule linfonodali ottenute da topinaïve o topi con ESA I linfonodi sono noti per essereun sito di priming dei linfociti T autoreattivi che at-taccano la mielina del SNC durante lo sviluppodell’ESA. Nel nostro lavoro, abbiamo usato il mod-ello murino di ESA cronico indotto con la glicopro-teina myelin oligodendrocyte 35-55 (MOG35-55).L’espressione di PK-2 non era rilevabile nelle cellulelinfonodali di topi naïve. Tuttavia, PK-2 era signifi-cativamente aumentato nelle cellule linfonodali du-rante le fase di “priming” di ESA e dello sviluppo deisintomi neurologici della malattia. I recettori per PK-2 sono stati entrambi espressi nelle cellule linfondalidi topi naïve. Nelle cellule linfonodali di topi conESA, l’espressione di PK-R1 non era cambiata,mentre quella di PK-R2 è stata significativamenteridotta. Abbiamo misurato anche le concentrazionidelle proteina PK-2 nel siero di topi con ESA e os-servato un significativo aumento di PK-2 rispetto aitopi naïve Successivamente abbiamo studiato ilruolo di PK-2 in ESA interferendo farmacologica-mente su PK2 e i suoi recettori. Abbiamo utilizzatonegli studi ESA il PC-7, un potente antagonista nonpeptidico dei recettori delle prokineticine, che bloc-ca preferenzialmente PK-R1. Topi con ESA cronicasono stati trattati con iniezioni quotidiane di PC7,oppure solo con soluzione fisiologica (controllo).Abbiamo osservato una significativa riduzione diespressione di ESA in topi trattati con PC7 rispettoai topi di controllo. In seguito, abbiamo esaminatose l’antagonista PC7 poteva ridurre la gravità dellamalattia in un altro modello di sperimentale. Abbi-amo usato il modello murino di ESA recidivante-re-

mittente indotto con myelin proteolipid protein 139-151 (PLP 139-151). Il trattamento con PC7 ha significa-tivamente ridotto la gravità della malattia anche inquesto modello.La riduzione di espressione della malattia in topicon ESA trattati con l’antagonista PC7 era accom-pagnata da un’alterazione dell’attivazione delle cel-lule T e della regolazione delle cellule Th. Perentrambi i modelli di ESA, cronica e recidivante-re-mittente, abbiamo esaminato la risposta specificadelle cellule linfonodali alla stimolazione con il pep-tide usato per l’immunizzazione. Le cellule linfono-dali dei topi ESA trattati con PC7 mostravano unaproliferazione cellulare ridotta rispetto a quelli dicontrollo. Inoltre, la secrezione di citochine proin-fiammatorie, IFN-γ e IL-17A, era ridotta, mentrequella della citochina soppressiva IL-10 era aumen-tata nelle cellule linfonodali di topi trattati con PC7,rispetto a quelle dei topi di controllo. Questi risultatidimostrano che il blocco di PK-Rs induce un’impor-tante modulazione delle risposte delle cellule T ecompromette nel complesso lo sviluppo di rispostepro-infiammatorie contro la mielina del SNC in duemodelli murini di ESA. Questo deterioramento ècoerente con la riduzione della gravità della malattiaosservata in entrambi i modelli di EAE dopo il trat-tamento con PC7.

CONCLUSIONIQuesti dati supportano significativamente l’ipotesiche la prokineticina-2 e i suoi recettori abbiano unruolo importante nel modello sperimentale di SM.Sulla base dei dati ottenuti il progetto è stato finan-ziato da FISM per atri due anni.


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larly interesting to be studied in MS and in its animalmodel, experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE), given the well known imbalance between Th1and Th2 responses in these diseases, where Th1and Th17 responses against CNS myelin play a cru-cial role.The aim of our project was to investigate the role ofprokineticins in the pathogenesis of CNS inflamma-tion and demyelination of multiple sclerosis by us-ing the animal model EAE. This project was fundedfrom FISM as a one-year pilot grant in order to con-firm the observed our preliminary results that block-ing the receptors for Prokineticins was beneficial inEAE.

RESULTSThe one-year pilot grant received from FISM hasbeen a very important funding to perform our stud-ies and to develop the project. With the help of thisgrant, we have been able to obtain the neededreagents and animals to carry on the different ex-periments, and participate to meetings to eitherpresent the data of the project or interact with peo-ple of the field of neuroinflammation and MS thatgave important feedbacks and suggestions on thisresearch. We trust that in the work performed weconfirmed our preliminary results about the role ofprokineticins in EAE. This work will permit us to car-ry on our project, which has been funded from FISMfor another two years. The research that we per-formed can be summarized as follows.We evaluated the expression of PK-2 and its recep-tors in lymph node cells (LNC) of mice with EAE andnaïve mice. Lymph nodes are known to be a site forpriming of lymphocyte T targeting self-antigens ofthe CNS during the development of EAE. We usedthe chronic mouse model of EAE induced withmyelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55(MOG35-55). The expression of PK-2 was undetectablein LNC of naïve mice. However, PK-2 expression wassignificantly increased in LNC during the primingphase of EAE and onset of neurological symptoms.

The receptors for PK-2 were both expressed in naïveLNC. While the expression of PK-R1 did not changein LNC during EAE, that of PK-R2 was dramaticallyreduced during EAE. We measured also by ELISA theconcentrations of PK-2 protein in the sera of micewith EAE and observed a significant increase of PK-2 compared with naïve mice. Next we investigatedthe potential role of PK-2 in CNS demyelinating dis-ease by pharmacological interfering with PK2 andPK2 receptors. We used in EAE studies the antago-nist PC-7, a potent nonpeptidic PK-Rs antagonistthat blocks preferentially PK-R1. We treated micewith chronic-EAE with daily intraperitoneal injectionsof PC7 (0.5 mg/kg/day). As controls, mice were treat-ed with vehicle alone. Treatment with PC7 signifi-cantly reduced the clinical expression of chronicEAE. We next examined whether PK-Rs antagonismwith PC7 was effective in reducing disease severityin a different EAE model. We used the relapsing-re-mitting mouse model of EAE induced with MyelinProteolipid Protein 139-151 (PLP 139-151). Treatmentwith PC7 significantly reduced disease severity andCNS inflammation also in this model.This reduction of the disease expression observedin EAE mice treated with PC7 were accompaniedby an alteration of T cell activation and Th regula-tion. Indeed, LNC from animals treated with PC7displayed a significantly reduced proliferation in re-sponse to peptide-stimulation if compared withmice treated with the vehicle alone. Moreover, inLNC of PC7-treated mice the secretion of proin-flammatory cytokines (i.e. IFN-γ and IL-17A) was re-duced, while that of the suppressor cytokine IL-10was increased compared with vehicle treated mice.

CONCLUSIONSTaken together, these data strongly support the hy-pothesis of an important role for prokineticin-2 andits receptors in the pathobiology of EAE, the exper-imental model of multiple sclerosis. Based on thesedata the research project has been funded fromFISM for other two years.

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Bosticardo M§, Silvia Musio§, Elena Fontana, Stefano Angiari, Elena Draghici, Gabriela Constantin, Pietro Luigi Poliani, Rosetta Pedotti * and Anna Villa *.Development of central nervous system autoimmunity is impaired in the absence of Wiskott-Aldrich syndrome protein. PLoS One. 2014 Jan23;9(1):e86942. § Equal contribution as first authors * Equal contribution as last authors.

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Abou-Hamdan M, Costanza M, Fontana E, Di Dario M, Musio S, Congiu C, Onnis V, Negri L, Poliani PL, Farina C, Balboni GF, Pedotti R. The Prokineticinsystem in EAE: possible novel target for immune intervention.XXIII AINI Congress (Associazione Italiana Neuroimmunologia), 22 September 2012, Milan – Italy.

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Abou-Hamdan M, Costanza M, Musio S, Fontana E, Pokiani PL, Balboni GF, Pedotti R. The Prokineticin system in EAE: possible novel target for immuneintervention. XXII AINI Congress (Associazione Italiana Neuroimmunologia), 26-29 September 2012, Catania-Italy.


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Carlo AvolioDipartimento Scienze Mediche e Chirurgiche, Università degli Studi di Foggia, Foggia

COLLABORATORI:Maria Blonda, Roberta Grasso, Luigi Maria Specchio

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Recettore purinergico P2X7 su monociti di pazienticon sclerosi multipla ed effetti degli attuali trattamentiimmunomodulanti per la malattia

PREMESSE E OBIETTIVIL’ATP, la più comune fonte di energia del metabolis-mo cellulare, ed i suoi recettori sono certamentecoinvolti nel processo infiammatorio. In particolare,il recettore P2X7 (P2X7R) si suppone giochi un ruoloimportante nella funzione dei macrofagi, cellule del-l’infiammazione con funzione di fagocitosi e di pre-sentazione dell’ antigene, regolando la produzione dicitochine ed i meccanismi di morte cellulare. Poichél’espressione di P2X7R è incrementata durante l’in-fiammazione, suoi antagonisti potrebbero possibil-mente agire come nuovi agenti antiinfiammatori.Evidenze sperimentali mostrano che il P2X7R è cer-tamente coinvolto nel processo patologico dellaSclerosi Multipla (SM). Abbiamo per questo pianifi-cato di studiare l’espressione del recettore P2X7,della citochina IL-1beta (prodotta dall’attivazione delrecettore) e dell’enzima CD39 (capace di distruggereATP e dunque ridurre lo stimolo del recettore) sumonociti di sangue periferico, cellule con proprietàsimili ai macrofagi, in pazienti con SM e in una popo-lazione di controllo e di seguito vedere se gli effettiterapeutici del Glatiramer Acetate (GA) e dell’ Inter-feron beta (IFNB), i due farmaci immunomodulanti diprima linea registrati per il trattamento della malattia,possano essere mediati da meccanismi che inter-feriscano con dette molecole.

RISULTATIAbbiamo condotto sia uno studio in vitro che in vivo.Studio in vitro. Dodici pazienti con SM a decorsorecidivante-remittente e liberi da trattamento sonostati selezionati e prelevati per ottenere monociti disangue periferico. Si è studiata (mediante PCR) suimonociti l’espressione di P2X7R, IL-1beta e CD39e, successivamente, gli effetti in vitro di GA su dettaespressione. Nella stessa maniera sono stati stu-diati 10 donatori sani.

Studio in vivo. A cinque pazienti con SM veniva in-iziata terapia con GA e i monociti venivano prelevatial pretrattamento, a 3 e 12 mesi di trattamento perstudiarne l’ espressione di P2X7R, IL-1beta e CD39.Ancora a 6 pazienti veniva iniziata terapia con IFNB(Rebif44) e a 4 con natalizumab (Tysabri) e nellastessa maniera venivano studiati i monociti ricavatial pretrattamento, a 3 e 6 mesi.Abbiamo osservato che, sia in vitro che in vivo, imonociti sia di pazienti che di donatori sani es-primevano P2X7R, IL-1beta e CD39 e che sia il GAche altri trattamenti correnti per la malattia sembra-vano interferire con detta espressione.In vitro, abbiamo osservato che il GA riduceva l’espressione di P2X7R e IL-1beta su monociti stimolaticon ATP sia di pazienti che di donatori sani laddove l’espressione di CD39 tendeva ad incrementare. Sullabase di questi risultati potevamo concludere che il GAera in grado di contrastare gli effetti proinfiammatoridi P2X7R mentre era forse in grado di indurre una viaregolatoria (CD39) che specificamente demolisce ATPconsentendo così di abolire lo stimolo del recettoreP2X7.I risultati dello studio in vivo erano per lo più in lineacon quelli dello studio in vitro. Infatti, i pazientimostravano un decremento di espressione monoci-taria di P2X7 e IL-1beta dopo 12 mesi di trattamento.Anche il CD39 decrementava a 12 mesi di trattamen-to, comportandosi così in maniera differente in corsodi GA se confrontato al dato in vitro e per questo for-nendo evidenze contro un possibile ruolo regolatoreevidenziato in vitro. Volendo interpretare questa dis-crepanza, una decrementata espressione potrebbeessere dovuta al fatto che P2X7R non aveva bisognodi essere protetto da ATP poiché già sotto-espressoesso stesso.In entrambi i casi il piccolo numero di pazienti cer-tamente rappresentava un limite dello studio al fine

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P2X7 purinergic receptor on monocytes of patientswith multiple sclerosis and effects of current immunetreatments of the disease

INTRODUCTION AND AIMSATP represents the main source of energy for thecellular metabolism and its receptors are certainlyinvolved in the inflammatory process. Especially theP2X7 receptor (P2X7R) is supposed to have a mainrole in the macrophage functions, inflammationcells with capacity of phagocitosis and antigenpresentation, regulating cytokine production andcell death mechanisms. Since P2X7R expression isincreased during inflammation, its antagonists maypossibly act as new antinflammatory agents. Exper-imental evidences show that P2X7R is certainly in-volved in the Multiple Sclerosis (MS) pathologicalprocess. We have therefore planned to studyP2X7R, IL-1beta (a cytokine produced by the re-ceptor activation) and CD39 (an enzyme able to de-stroy the ATP and therefore to reduce the receptorstimulation) expression on peripheral blood mono-cytes, cells with properties similar to macrophages,from MS patients and healthy donors and to seethereafter whether therapeutical effects of Glati-ramer Acetate (GA) and Interferon beta (IFNB), thetwo first line approved drugs for MS, may be pos-sibly mediated by mechanisms interfering with suchmolecules.

RESULTSWe performed both an in vitro and in vivo study.In vitro study. Twelve relapsing-remitting and treat-ment-free MS patients have been selected and pe-

ripheral blood monocytes have been obtained. Weinvestigated (by PCR) the expression of P2X7R, IL-1beta and CD39 on monocytes and, following, thein vitro effects of GA on such expression. Tenhealthy donors (HDs) were similarly investigated.In vivo study. Five MS patients were given GA ther-apy and monocytes were obtained before, at 3 and12 months of treatment in order to study the ex-pression of the P2X7R, IL-1beta and CD39. More-over, six MS patients were given IFNB (Rebif44) andfour Natalizumab (Tysabri) and monocytes obtainedbefore, at 3 and 6 months of treatment were simi-larly studied.We observed that, either in vitro or in vivo, mono-cytes from both MS and control subjects expressedP2X7R, IL-1beta and CD39, and GA as well as othercurrent MS therapies seem to interfere with suchexpression.In vitro, we observed that GA downregulated P2X7Rand IL-1beta expression in both MS and HDs ATP-stimulated cultured monocytes whereas CD39trended to be upregulated. Based on these resultswe concluded that GA was able to contrast theP2X7R-mediated proinflammatory effect while it waspossibly able to induce a regulatory pattern (CD39)that specifically hydrolyses ATP so allowing theP2X7R stimulation to terminate.In vivo results were mostly in line with those in vitro.In fact, patients showed a decrease in monocyteP2X7R and IL-1beta expression after 12 months of

di delineare chiare conclusioni che per questo ne-cessitano di essere confermate su una più ampiapopolazione di pazienti.

CONCLUSIONII monociti sia di pazienti con SM che donatori sani es-primono P2X7R insieme con IL-1beta e CD39. L’im-munomodulazione da parte di GA sembra interferirecon l’ espressione di P2X7R ma anche con IL-1betae CD39 su monociti sia di SM che di donatori sani.Non erano indotti fenomeni di morte cellulare nellecolture di monociti da parte del GA e dunque gli effettiosservati sembrano rappresentare effetti netti del GA.

Per il fatto che sono stati ottenuti risultati simili conaltri due trattamenti immunomodulanti per la SM, qualiIFNB e Natalizumab, un meccanismo d’azione sull’apparato di P2X7R può essere ipotizzato da parte didifferenti trattamenti immunomodulanti. Uno studiopiù sistematico di dette espressioni su monociti disangue periferico su una coorte più ampia di pazientiche assumono detti trattamenti potrebbe auspicabil-mente fornire tale risposta. Questo appare rilevantedal momento che una possibile migliore compren-sione dei meccanismi d’azione dei farmaci attual-mente in uso potrebbe migliorare la qualità della sceltaterapeutica per ogni singolo paziente.

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Progetto di Ricerca finanziato con il Bando 2010 per il periodo di 1 anno e l’ammontare di 30.000 €

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GA treatment. CD39 decreased in expression after12 months as well, so it behaved differently in vivounder GA compared to in vitro, therefore providingevidence against a possible regulatory role shownin vitro. Interpreting this discrepancy, the decreasedexpression could maybe due because P2X7Rwould no longer need to be protected from ATPsince it was downexpressed itself.In both cases the small number of patients certainlyrepresented a limitation of the present study in or-der to draw clear conclusions that therefore needto be confirmed in a wider population of patients.

CONCLUSIONSMonocytes either from MS or controls expressP2X7R, together with IL-1beta and CD39. GA im-mune modulation seems to interfere with the P2X7R

but also with IL-1beta and CD39 expression onmonocytes of both patients and controls. No celldeath phenomena are induced on cultured mono-cytes by GA conditioning, therefore the observedchanges seem to represent a GA net effect. Be-cause of the similar results obtained with other twoimmunomodulatory treatments for MS, such asIFNB and Natalizumab, a mechanism of action onthe P2X7R machinery by different immunomodula-tory treatments in MS might be speculated. A moresystematic study of such expression on peripheralblood monocytes of a larger cohort of patients as-suming such treatments may hopefully providesuch a response. This appears to be relevant sincepossibly to better understand the mechanisms ofaction of the current drugs may improve the thera-peutical choice for each single patient.

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PREMESSE E OBIETTIVILa somministrazione di nerve growth factor (NGF)o il trapianto di cellule in grado di produrre NGF nelcervello ha dimostrato essere in grado di ridurre laprogressione patologica nel modello animale di SM,cioè l’encefalite sperimentale allergica (ESA), sup-portando e prospettando l’uso terapeutico del NGF.Malgrado le premesse sperimentali, l’invasività delleprocedure chirurgiche per inoculare NGF nel cervel-lo rimane di difficile applicazione nei pazienti conSM che necessiterebbero di un continuo o ripetutotrattamento durante il corso della loro vita. Strategiealternative per innalzare i livelli di NGF endogeno ofacilitarne la penetrazione nel cervello appaionoquindi più applicabili.Lavorando in collaborazione con medici oculisti, ilnostro gruppo di ricerca ha dimostrato la capacitàdel NGF somministrato come collirio (c-NGF) di sti-molare il recupero del danno strutturale e funzionalein pazienti affetti da patologie oculari. Nei modellianimali è stato dimostrato che il c-NGF agisce sullaretina ed il nervo ottico, ed è in grado di stimolarel’attività neuronale nel cervello ed esercitare un’azio-ne trofica e neuroprotettiva.Lo scopo del nostro progetto è stato di validare l’ef-ficacia di questo nuovo e non invasivo mezzo disomministrazione del NGF nell’ ESA con il principa-le obiettivo di raccogliere informazioni utili agli studipre-clinici e clinici per il trattamento della SM conNGF umano ricombinante o molecole mimetiche.Per raggiungere questo obiettivo, il progetto – finan-ziato come progetto pilota- ha avuto lo scopo distudiare gli effetti della somministrazione di c-NGFsullo sviluppo e la progressione della forma mono-fasica di ESA in ratti del ceppo Lewis, che è il mo-dello sperimentale indicato per lo sviluppo disostanze che contrastino la fase infiammatoria acu-ta della malattia.

In analogia con i precedenti studi sugli effetti dellasomministrazione cerebrale di NGF, i nostri esperi-menti sono stati focalizzati sugli effetti della reazioneimmunitaria nel cervello durante il picco infiamma-torio della ESA che normalmente interviene durantele prime due settimane dopo l’induzione.

RISULTATII dati mostrano che il trattamento con c-NGF alterail corso della ESA limitandone le manifestazione cli-niche. Infatti, a differenza degli animali trattati conc-NGF, i ratti con ESA non trattati mostrano una ri-duzione del peso corporeo ed una precoce atassiache culmina nella paralisi degli arti entro 15 giornidall’induzione della patologia. Anche i livelli di ansiarisultano elevati nei ratti non trattati, mentre nessu-na alterazione comportamentale è osservabile neiratti a cui e stato somministrato c-NGF.In accordo con l’andamento dei segni clinici, i risul-tati dell’analisi istologica e biochimica dei tessuti ce-rebrali indicano una diminuzione dell’infiammazionea seguito del trattamento con c-NGF. Infatti, mentrei tessuti cerebrali dei ratti ESA non trattati mostranoun intensa concentrazione di cellule macrofagiche eleucocitarie in particolare nel cervelletto, nella regio-ne del setto e dell’ippocampo e nelle aree periven-tricolari del terzo e quarto ventricolo cerebrale, inquelli dei ratti trattati con c-NGF si osserva una limi-tata distribuzione degli infiltrati infiammatori.L’analisi, mediante tecniche di Elisa e Western blot,dell’espressione dei marcatori di attività delle celluleimmunitarie e degli endoteli vasali nelle aree cerebralidel cervelletto, dell’ippocampo e della corteccia fron-tale confermano i dati istologici. Inoltre, utilizzandodei test che contemporaneamente analizzano 8 cito-chine, è stato osservato che nelle regioni come il cer-velletto dove si ha la massima infiammazione, ilc-NGF è in grado di contrastare l’induzione di TNF,

Il nerve growth factor somministrato in forma di collirio inun modello animale di sclerosi multipla: uno studio prospetticosul trattamento durante le fasi precoci della malattia

Paola TirassaIstituto di Biologia Cellulare & Neurobiologia, CNR, Roma

COLLABORATORI:Mattia Maccarone, Valentina Carito, Sara De Nicolò, Marco Fiore

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INTRODUCTION AND AIMSNerve Growth Factor (NGF) administration ortrasplantation of NGF-producing cells in the brainhas proved to reduce disease progression in animalmodels of experimental allergic encephalitis (EAE)supporting and prospecting the NGF use in thetreatment of multiple sclerosis (MS). In spite of theexperimental promise, the invasiveness of the sur-gical procedure to injected NGF in brain is unlikelyto be feasible in patients who might need early, re-peated and/or continuous treatment during theirlife. Alternative strategies for enhancing endoge-nous NGF or facilitate NGF penetration in brain ap-pear therefore more attractive.Recently, working in collaboration with clinicians, wehave demonstrated that NGF applied as eye drops(eNGF) stimulates tissue repair and functional recov-ery in patients with ocular pathologies. In animalmodels, eNGF has proved to act both at the retinal

and post-retinal visual pathway levels, exerts repar-ative effects in brain visual areas and forebrain, andstimulates the neuronal and behavioral functions.Scope of our project was to validate the efficacy ofthis novel safe and not invasive route of NGF ad-ministration in EAE with the main objective to pro-vide information to support the preclinical/clinicalstudies using human recombinant NGF or NGFmimetic drugs as new agents for the treatment ofMS patients.To achieve this objective, the project - funded as pi-lot study – was addressed to validate the efficacy ofeNGF treatment to influence disease developmentin a model of monophasic acute EAE in adult femaleLewis rats, which is suggested for drug discoverydirected against acute inflammatory processes.In analogy with our previous evidences on the intrac-erebral NGF injection in EAE, the experiments werefocused on inflammatory-mediated events in brain

Nerve growth factor given as eye drops in the animal modelof multiple sclerosis: a prospective study of treatmentin early stage of disease

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IFNr e dei marcatori di attivazione dell’endotelio va-sale. Nessun effetto così significativo è stato eviden-ziato nell’ippocampo, dove comunque l’ESA produceun innalzamento delle citochine suggerendo una di-versa attività del c-NGF nelle aree cerebrali.Nelle nostre condizioni sperimentali non sono stati os-servati chiari segni di demielinizzazione nel cervellodei ratti ESA così come nei ratti trattati con c-NGF.Ma, a differenza di questi ultimi, negli ESA si osservauna significativa diminuzione del marcatore degli oli-godendrociti nel cervelletto, nell’ippocampo ed in altrearee del prosencefalo, inclusa la regione subventrico-lare (SVZ) e dorso laterale dei ventricoli laterali, cono-sciuta come una delle aree germinative del cervello.Nella SVZ, comparati agli animali sani ed a quelli trat-tati con c-NGF, i ratti ESA mostrano diminuzione dellecellule neuroblastiche ed un aumento delle cellule im-mature e mature che esprimono marcatori degli astro-citi. Questi dati sono in linea con l’idea che le fasiprecoci della ESA non sono caratterizzate da demie-linizzazione nel cervello e suggeriscono una compro-missione degli oligodendrociti e dei precursorineuronali che potrebbero quindi rappresentare deibersagli del trattamento con c-NGF.

CONCLUSIONII nostri dati indicano che il trattamento oculare conNGF è in grado di alterare lo sviluppo dell’ESA mol-to probabilmente contrastando l’infiammazione ce-rebrale che favorisce la neurodegenerazione ancheinterferendo con i processi di neurogenesi e remie-linizzazione.Sono necessari ulteriori studi per consolidare edapprofondire questi risultati ed identificare i mecca-nismi di azione e/o le cellule responsive al c-NGFnel cervello ESA a differenti stadi della patologia.I risultati di questo e di studi futuri possono aiutarea caratterizzare marcatori prognostici ed individuareefficaci finestre di trattamento degli stati precocidella SM. In particolare, la possibile applicazionedel trattamento con collirio NGF per la terapia dellaneurite ottica e del deficit visivo nella SM potrebbeessere di notevole rilevanza per migliorare la qualitàdi vita delle persone con SM.Il recente sviluppo della forma ricombinante umanadi NGF, che rappresenta la condicio sine qua nonper l’applicazione clinica, lascia immaginare un fu-turo non così lontano per l’uso di NGF umano neitrials clinici.

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at the peak of inflammatory phase of disease, nor-mally occurring two weeks after disease induction.

RESULTSThe data show that eNGF treatment affects the EAEcourse by limiting its clinical manifestations. Indeed,at variance with the other experimental rat groups,EAE rats show body weight reductions, manifestataxia early after induction and rich the limb paralysis.A different trend is observable in EAE rats receivingNGF, which show ataxia and limp tail later that EAErats and no paralysis. No signs of ataxia or paralysiswas reported in Control rats also receiving NGF.EAE group also show a significant increase of anx-iety, while a behavioural recovery is notable inEAE+NGF rats, which behaved similar to Controlgroups without manifest anxiety. No behaviouralchanges were reported in healthy rats receiving oc-ular NGF.In accordance with the clinical manifestations, boththe histological and biochemical data indicate re-duced signs of inflammation in brain of EAE ratstreated with eyeNGF. A limited amount of immuneinfiltrates were detectable in the brain of EAE+NGFrats when compared to EAE rats, which show manymacrophages and CD8-CD4 cells in the parenchy-ma and vascular proximity particularly in cerebel-lum, septo-hippocampal area and periventricularzones (III and IV ventricles). No inflammation wasobserved in brain areas of control healthy rats, alsoafter NGF treatment.The expression of inflammatory markers for im-mune and vassal endothelial cells in different brainareas, such as the hippocampus, the cerebellum,and the frontal cortex - analyzed by Western blotand Elisa techniques - confirm the histological ob-servations, showing that eNGF is able to reduce theeffects of EAE-induced inflammation in cerebellumand hippocampus, but not in the Frontal cortex.Further, using a multi assay detecting contempora-neously eight cytokines to profile the immune reac-tion, it was observed that in the cerebellum - which isthe most inflamed brain area in our experimental con-

dition - eNGF counteracts the EAE-induced enhance-ment of TNF, IFNr, IL1b, Rantes and MIP expressionsupporting an involvement of vassal endothelium ac-tivation. No recovery or changes were observed in thehippocampus of EAE+NGF rats, suggesting a region-al specific response to the treatment.Although no clear sign of demyelination were ob-served, decreased expression of NG2 oligodendro-cyte marker was noted in the Cerebellum andForebrain of EAE rats but not in EAE+NGF. ReducedNG2 cell distribution was also observed in dorso-lat-eral corner of the lateral ventricle, of EAE rats com-pared to control and eNGF groups. In the same area,the confocal studies show a decreased presence ofneuroblasts and an increase of mature and immaturecells committed versus the glia phenotypes in EAErats, respect to the healthy and EAE+NGF rats. Con-firming previous investigations, these results suggestthat demyelination is not featuring the early stage ofmonophasic EAE, but that oligodendrocytes and/orimmature brain cells might be affected, and thereforerepresent a targets for the eNGF treatment.

CONCLUSIONSeNGF is able to affect the disease developmentmost probably by contrasting the brain inflamma-tory events, which favour the white and grey matterdegeneration also by interfering with neurogenesisand re-myelination. New experiments are going tobe performed to consolidate the obtained resultsand identify the mechanism of action and the celltargets of the eNGF in the EAE brain at the differentdisease stages.The results might be relevant to individuate prog-nostic markers and select efficacy windows fortreatment in early stages of MS. In particular, theeventual use of eye drop NGF to treat optic neuritisand visual impairment occurring in MS might be ofextreme relevance to decrease the life discomfort inpatients. The recent development of human NGF re-combinant, which is a condicio sine qua non to en-dorse the clinical applications, lead to speculate anot so far human NGF availability for clinical trials.



NEURORIABILITAZIONE ENEUROPLASTICITÀ

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NEURORIABILITAZIONE E NEUROPLASTICITÀ

PREMESSE E OBIETTIVIL’encefalomielite sperimentale autoimmune (abbre-viata con ESA) rappresenta un modello affidabile perla forma cronico-progressiva della sclerosi multiplaed è stata ampliamente studiata tramite tecnicheconvenzionali di Risonanza Magnetica (RM). Sorpren-dentemente le moderne tecniche di RM funzionale,che permettono di mappare in modo non invasivo learee attivate durante un certo stimolo, non sono an-cora state utilizzate nell’ESA. Questo nonostante unaampia letteratura clinica abbia dimostrato come laRM funzionale fornisca importanti informazioni circala riorganizzazione corticale e/o la risposta alle tera-pie. Il principale scopo di questo studio è stato quellodi definire ed ottimizzare protocolli di RM funzionaleper studiare la plasticità cerebrale in ratti con ESA edi studiare la possibile correlazione con esami pato-logici.

RISULTATIIn questo progetto abbiamo applicato la tecnica diRM funzionale con stimolazione somatosensorialedella zampa anteriore destra e studiato le alterazioninella risposta funzionale in ratti con ESA cronica. Ab-

biamo dimostrato, per la prima volta in letteratura,che la risposta corticale evocata è fortemente alteratanei cervelli di ratto con ESA, rispetto ai controlli. Siaa 30 che a 60 giorni dopo l’induzione di ESA, la RMfunzionale ha mostrato un forte aumento del volumeattivato coinvolgendo anche la corteccia ipsilateralealla zampa stimolata ed alcune aree extra-corticali.

CONCLUSIONIIn questo studio è stato dimostrato, per la primavolta ed utilizzando la tecnica non invasiva di RMfunzionale, che la plasticità corticale è osservabilenel modello sperimentale di ESA, uno dei modellianimali più usati nella sclerosi multipla. Questo la-voro rappresenta un primo tentativo di definire unmodello sperimentale affidabile per studiare la pla-sticità cerebrale che si riscontra nei pazienti. Abbia-mo definito uno strumento che potrà essereutilizzato come un indicatore sensibile ed innovativodell’efficacia terapeutica negli studi preclinici. Rap-presentando una piattaforma innovativa per testarenuovi farmaci, il metodo proposto potrebbe miglio-rare, sebbene a lungo termine, la qualità della vitadelle persone con sclerosi multipla.

Imaging funzionale nello studio della plasticità neuronalein un modello sperimentale di sclerosi multipla su ratto

Pasquina MarzolaDipartimento di Informatica, Università di Verona, Verona

COLLABORATORI:Pietro Bontempi, Dipartimento di Informatica, Università di Verona, VeronaStefano Tambalo Silvia Fiorini, Andrea Sbarbati, Dipartimento di Scienze Neurologiche edel Movimento, Università di Verona, Verona

COLLABORAZIONI CON ALTRI GRUPPI:Guido Cavaletti, Roberta Rigolio, Dipartimento di Chirurgia e Medicina Traslazionale,Università di Milano Bicocca, Milano

INTRODUCTION AND AIMSExperimental autoimmune encephalomyelitis (EAE)represents a reliable model of chronic-progressivevariant of multiple sclerosis (MS) and has been ex-tensively characterized by conventional magneticresonance imaging (MRI) techniques. Modern MRItechniques, as functional MRI (fMRI), allowing non-invasive mapping of the cerebral areas activatedduring a certain stimulus have not been used yet inEAE, regardless of wide clinical evidence that fMRIprovides important information about cortical reor-ganization and/or response to a given therapy.The major aim of the present study was to designand optimize fMRI protocols to study brain plastic-ity in rats affected by chronic EAE and to investigatethe possible correlation between brain damage, asobserved by ex vivo examinations, and brain plas-ticity.

RESULTSIn the present work we have applied fMRI tech-niques with somatosensory stimulation of the rightforepaw and investigated the alterations in function-

al response that occur in rats with chronic EAE. Wedemonstrate for the first time that the evoked cor-tical activation is strongly altered in EAE rat brain,compared to controls. At both 30 and 60 after EAEinduction, fMRI showed a strong increase in the ac-tivated volume compared to the pre-induction valueinvolving also the cortex ipsilateral to the stimulatedforelimb and some extra-cortical areas.

CONCLUSIONSWe have demonstrated that cortical plasticity doesoccur in EAE, one of the most widely used animalmodels for MS, for the first time by using the non-invasive fMRI technique. This work represents thefirst attempt to define a reliable experimental modelto dissect the brain plasticity phenomenon occur-ring in MS patients. Moreover such a tool could bealso used as a sensitive and innovative indicator oftherapeutic intervention in preclinical studies. As aninnovative platform for testing the efficacy of newdrug efficacy, the method developed could im-prove, although in the long term, the quality of lifeof patients with multiple sclerosis.

Functional MRI to study brain plasticity in an experimentalmodel of MS in rats

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Tambalo S, Fiorini S, Rigolio R, Sbarbati A, Pluchino S, Marmiroli P, Cavaletti G,. Marzola P, Functional magnetic resonance imaging reveals brain cortexremodeling in a rat model of chronic multiple sclerosis, ISMRM Italian Chapter, Annual Meeting, Perugia 24-25 Ottobre 2013

Rigolio R, Tambalo S, Fiorini S, Sbarbati A, Marmiroli P, Pluchino S, Cavaletti G, Marzola P, Functional Magnetic Resonance Imaging reveals brain cortexremodeling in a rat model of chronic multiple sclerosis. Manuscript in preparation.


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PREMESSE E OBIETTIVINella sclerosi multipla (SM) i fenomeni di plasticitàcerebrale potrebbero giocare un ruolo cruciale. Incorso di SM, la plasticità cerebrale può essere me-diata da diversi processi, come ad esempio le formedi plasticità sinaptica a lungo termine, la formazionedi nuove terminazioni sinaptiche ed infine la modu-lazione e la variazione dell’espressione dei canali io-nici di membrana. Questi fenomeni potrebberoridurre le conseguenze funzionali legate alle lesionicerebrali in corso di SM, prevenendone o limitando-ne l’espressione clinica. Il potenziale plastico cere-brale è soprattutto correlato all’abilità delle sinapsineuronali di modificare a lungo termine la loro capa-cità di trasmettere informazioni, un processo chia-mato “long-term potentiation” (LTP). Come parte diun Progetto Pilota FISM 2010, il nostro gruppo avevagià studiato, utilizzando tecniche di elettrofisiologiasperimentale (registrazioni extracellulari di potenzialidi campo o “field potentials”), l’abilità delle sinapsieccitatorie ippocampali di esprimere LTP durante lafase di acuta della malattia, in un modello sperimen-tale di sclerosi multipla (ESA, encefalite autoimmunesperimentale). Oltre alle indagini elettrofisiologiche,erano state indagate le possibili alterazioni molecolari(come le variazioni di composizione del recettore glu-tammatergico NMDA e l’aumentata espressione dicitochine pro-infiammatorie) associate all’alterazionedella plasticità sinaptica, sempre nello stesso model-lo sperimentale. I principali risultati ottenuti duranteil Progetto FISM 2010 evidenziavano come la plasti-cità sinaptica sia conservata negli animali di control-lo, ma sia alterata nell’ippocampo dei topi con ESA.In particolare nei topi affetti da ESA, il deficit del po-

tenziamento post-sinaptico (LTP) osservato nell’ip-pocampo è risultato essere associato ad una selet-tiva iper-espressione di interleuchina-1-β ed alriarrangiamento del recettore glutammatergicoNMDA, in particolare alla riduzione della subunitàNR2B. Pertanto, l’obiettivo del Progetto 2011 è statoquello di approfondire i risultati ottenuti nel prece-dente anno, continuando lo studio elettrofisiologicodelle principali forme di plasticità sinaptica, LTP eLTD, nel modello sperimentale di sclerosi multipla.Tale studio è stato effettuato in due differenti strutturecerebrali, l’ippocampo ed il nucleo striato. Sono statiinoltre indagati i meccanismi potenzialmente alla ba-se dell’alterata plasticità sinaptica ippocampale, po-nendo particolare attenzione al possibile ruolo svoltonel processo infiammatorio centrale dalla microgliaattivata. Inoltre, la plasticità sinaptica è stata studiatanon solo durante la fase acuta della malattia, ma an-che durante la fase di remissione clinica, dopo la ri-soluzione dei deficit motori correlati all’ESA.

RISULTATIDurante il Progetto FISM 2011 abbiamo utilizzato latecnica elettrofisiologica del “patch-clamp” per regi-strare l’attività elettrica dei singoli neuroni nell’areaCA1 dell’ippocampo, in topi affetti da ESA. Le regi-strazioni sono state effettuate per confermare i datiottenuti precedentemente con la tecnica extracellu-lare di registrazione dei potenziali di campo (“field po-tentials”). Le registrazioni sono state effettuate siadurante la fase acuta, che durante la remissione cli-nica dell’ESA. Da questo studio è emerso che il po-tenziamento sinaptico a lungo termine (LTP) èsignificativamente ridotto nei neuroni dei topi affetti

Uno studio elettrofisiologico dei meccanismi di alterataplasticità sinaptica in modelli sperimentali di sclerosi multipla

Paolo CalabresiDipartimento di Medicina, Clinica Neurologica, Università degli Studi di Perugia, Perugia

COLLABORATORI:Massimiliano Di Filippo, Paola Sarchielli, Cinzia Costa, Davide Chiasserini,Antonio de Iure, Alessandro Tozzi, Michela Tantucci, Cristiano Spaccatini

COLLABORAZIONI CON ALTRI GRUPPI:Francesca R. Fusco, Carmela Giampà, IRCCS Fondazione S. Lucia, Roma


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da ESA, rispetto ai controlli sani (controllo 174 ± 19%; ESA 120 ± 3 %, P<0.001). Inoltre, è stato possibiledimostrare che l’alterazione dell’LTP nei neuroni ip-pocampali persiste anche durante la fase di remis-sione clinica del modello sperimentale, quando nonsono presenti manifesti deficit neurologici. Infatti,l’LTP registrato nei neuroni ippocampali dei topi affettida ESA in fase di remissione è risultato significativa-mente ridotto rispetto a quello osservato nei controllisani (controllo 174 ± 19 %; ESA in remissione 128 ±3 %; P<0.001). Al fine di analizzare i possibili mecca-nismi legati alla perdita della fisiologica plasticità si-naptica abbiamo effettuato, con la collaborazione delgruppo di ricerca della Professoressa Fusco (IRCCS,Fondazione S. Lucia), un’analisi immunoistochimica,per verificare se il deficit di plasticità sinaptica fosseassociato ad una concomitante attivazione microglia-le nell’ippocampo. Da tale analisi è emerso comenell’ippocampo dei controlli sani (n=4) era presentesolo una popolazione quiescente e sparsa di cellulemicrogliali, a fronte di un’intensa reazione microgliale,con aspetti di attivazione cellulare come arborizza-zioni ed aumento del volume citoplasmatico(P<0.005) nell’ippocampo dei topi affetti da ESA(n=4). Abbiamo pertanto somministrato ad un gruppodi animali affetti da ESA la minociclina, un inibitoredell’attivazione microgliale. La somministrazione diminociclina per via peritoneale (alla dose di 50 mg/kgdue volte al giorno per i primi due giorni, una volta algiorno fino al settimo giorno, seguita da una sommi-nistrazione giornaliera di 25mg/kg per i successivigiorni) si è dimostrata in grado di ripristinare la plasti-cità sinaptica a livello ippocampale. Infatti il potenzia-mento sinaptico registrato a livello ippocampale neitopi affetti da ESA dopo trattamento con minociclina,non era significativamente ridotto rispetto ai controllisani (controllo 172.8 ± 15.68%; ESA trattato con mi-nociclina 156.7 ± 9.5%; n.s.). Infine abbiamo verifica-to se l’alterazione della plasticità sinaptica osservatain ippocampo fosse presente anche in altre aree ce-rebrali durante il corso della malattia nel modello spe-rimentale ESA. In particolare è stata effettuataun’analisi elettrofisiologica dell’attività sinaptica deineuroni del nucleo striato, una struttura particolar-mente coinvolta da processi neurodegenerativi du-rante la SM. A questo livello è stata valutata lacapacità delle sinapsi dei neuroni spinosi striatali disviluppare una depressione della loro attività a lungotermine (depressione a lungo termine, LTD). Come ri-sultato delle registrazioni di “patch clamp” è emersocome la capacità di esprimere LTD dei neuroni spi-nosi striatali di topi affetti da ESA (durante la fase acu-ta della malattia), non sia significativamente differenteda quella osservata nei controlli sani (controllo 32.7 ±6%; ESA 34.9 ± 7.5%; P>0.05).

CONCLUSIONIIn conclusione, i risultati ottenuti confermano la pre-senza di un’alterazione della plasticità sinaptica ip-pocampale durante la fase acuta di malattia delmodello ESA. Questo dato, già descritto con regi-strazioni extracellulari di potenziali di campo, è sta-to ora confermato con l’utilizzo della tecnica diregistrazione “patch clamp” su singola cellula, inparticolare valutando la capacità delle cellule ippo-campali di sviluppare potenziamento sinaptico alungo termine (LTP). È stata così rinforzata l’eviden-za che le cellule ippocampali, durante il decorsodella malattia in un modello sperimentale di SM,perdono la loro capacità di esprimere questa formadi plasticità a lungo termine. Questo è un risultatodi particolare rilevanza, considerando che la perditadella plasticità neuronale può essere determinantenel ridurre la capacità cerebrale di fronteggiare ildanno infiammatorio durante il decorso della SM.Inoltre, dato che il potenziamento post sinapticorappresenta un meccanismo possibilmente alla ba-se della memoria e delle funzioni cognitive, un dan-no alla plasticità potrebbe spiegare la frequentepresenza di un deficit cognitivo nei pazienti con SM,ed il suo rapporto con la neuroinfiammazione. Infattiun’intensa reazione microgliale è stata osservatanell’ippocampo dei topi affetti da ESA. La microgliaattivata è in grado di secernere molte molecole im-muni, che si sono dimostrate in grado di influenzarei processi di plasticità sinaptica, come l’interleuchi-na-1-β. Per questo si può ipotizzare come la pre-senza di una reazione microgliale abbia un ruolocentrale nel processo che porta al deficit plasticoneuronale. In accordo con ciò, dal nostro studioemerge come l’utilizzo di farmaci che inibisconol’attivazione microgliale (minociclina) sia in grado diripristinare e prevenire il danno sinaptico ippocam-pale. Da ultimo è importante sottolineare come ildeficit dei meccanismi di plasticità sinaptica sia sta-to osservato anche durante la fase di remissione cli-nica della SM sperimentale, quando nessun deficitneurologico era evidente nell’animale. Questo risul-tato sperimentale ha due importanti implicazioni.Come prima cosa, suggerisce che il processo pa-tologico che danneggia la plasticità sinaptica per-mane a quel livello anche dopo la risoluzione clinicadella fase acuta. È possibile ipotizzare che, in as-senza di deficit motori nella fase di remissione, ildanno sinaptico ippocampale possa essere inveceassociato ad un’alterazione nella sfera cognitiva. In-fine, lo studio della funzione sinaptica a livello delnucleo striato ha rivelato come la principale formadi plasticità a questo livello (LTD) non sia alteratadurante la fase acuta della malattia sperimentale.Questo può indicare come le alterazioni della pla-

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An electrophysiological study of the mechanisms of synapticplasticity impairment in experimental multiple sclerosis

INTRODUCTION AND AIMSA large amount of evidence suggests the potentiallycrucial role of neuroplasticity processes in multiplesclerosis (MS). During MS, functional brain plasticitymay be mediated by various processes, such aslong-term forms of synaptic plasticity, new synaps-es formation and ion channel redistribution and mayreduce the functional consequences of MS lesions,preventing or limiting the clinical expression of thesymptoms. The plastic potential of the brain isbased on the ability of the synapses to undergolong-term changes in the efficacy of synaptic trans-mission, such as long-term potentiation (LTP). As apart of a 2010 FISM Pilot Project, we investigated,by utilizing electrophysiological techniques (fieldpotential extracellular recordings) the ability of hip-pocampal excitatory synapses to undergo LTP dur-ing the acute relapse of an experimental model ofMS (chronic relapsing experimental autoimmuneencephalomyelitis, EAE,) and the molecular alter-ations (modifications of NMDA receptor subunitcomposition and overexpression of pro-inflamma-tory cytokines) associated with synaptic plasticityimpairment in experimental MS. The main resultsobtained during the 2010 FISM PROJECT suggest-ed that synaptic plasticity was normal in controlmice but impaired in the hippocampus of EAE mice.In EAE mice the LTP deficit was found to be asso-ciated with a selective overexpression of inter-leukin-1-β and with the rearrangement of NMDAglutamate receptors (selective reduction of theNR2B subunit) in the hippocampus. Thus, the aimof the 2011 project, as a prosecution of the 2010Project, was to continue to investigate, by utilizingexperimental electrophysiological techniques, theability of excitatory synapses to undergo the mainforms of synaptic plasticity, named LTP and LTD. In

particular, we investigated synaptic plasticity in twodifferent neural structures (hippocampus and stria-tum) during the course of EAE and the potentialmechanisms underlying their impairment, with par-ticular regard to the role played by activated mi-croglial cells. Moreover, we investigated thepresence of synaptic plasticity abnormalities notonly during the acute disease relapse but also dur-ing the remission phase of the experimental dis-ease, after the resolution of EAE-associated motordeficits.

RESULTSDuring the 2011 FISM project we performed patchclamp electrophysiological recordings of hip-pocampal neurons in the CA1 area of relapsing EAEmice, in order to confirm the data previously ob-tained with field potential electrophysiologicalrecordings on the presence of abnormalities in theinduction of long-term potentiation (LTP) in this spe-cific neuronal population, that is crucial for cognitiveand memory mechanisms. These specific experi-ments have been performed in order to have a moreprecise electrophysiological analysis of the ob-served deficit in synaptic plasticity and to compareit with the electrophysiological parameters recordedwith the same technique in another neural structure(the striatum) and in another stage of the experi-mental disease (remission phase). Interestingly, LTPrecorded in neurons from EAE was significantly re-duced with respect to that observed in neuronsfrom control animals (control 174 ± 19 %; EAE 120± 3 %, P<0.001). We also investigated if the alter-ation of CA1 hippocampal LTP persists in the remis-sion phase of the experimental disease, when noapparent neurological deficits are visible. The re-sults of patch-clamp electrophysiological experi-

sticità sinaptica durante il decorso della malattiasiano struttura-specifiche.I meccanismi della plasticità sinaptica hanno la ca-pacità di prendere parte ai processi riparativi cerebralied al perfezionamento dei circuiti neuronali. I risultatiottenuti in questo studio rafforzano l’ipotesi secondo

cui il deficit della plasticità sinaptica giochi un ruolonel modello sperimentale di SM. Gli studi futuri do-vranno focalizzarsi su quali possibili strategie possa-no essere utilizzate per contrastare il danno a caricodella plasticità, al fine di avere un nuovo approccioterapeutico contro la progressione della malattia.

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ments suggest that also in the remission phase ofEAE, hippocampal LTP is altered. Indeed, hip-pocampal CA1 LTP recorded in neurons from remit-ting EAE mice was significantly reduced withrespect to that observed in neurons from controls(control 174 ± 19 %; EAE in remission phase 128 ±3%; P<0.001). In order to analyse the potentialmechanisms underlying the loss of physiologicalplasticity at hippocampal synapses we performed,in collaboration with the group of Professor Fuscoin Rome (IRCCS S Lucia Foundation), an immune-histochemical analysis, to explore if the alteration inhippocampal synaptic plasticity observed in thehippocampi of EAE mice was associated with anactivation of microglia, the CNS resident immunecells. We found that only scattered, quiescent mi-croglia was observed in the healthy control mice ex-perimental group (n = 4). Conversely, during EAE (n= 4) an intense microglial reaction was observedwith numerous microglial cells showing coarse ar-borizations and enlarged cell bodies (P<0.005). In-terestingly, the intraperitoneal treatment with theinhibitor of microglial activation minocycline (50mg/kg twice a day for the first 2 days, once daily forthe next 5 days, followed by 25 mg/kg once dailyfor the subsequent days) was found to be able torestore synaptic plasticity in the hippocampus. Hip-pocampal CA1 LTP recorded in neurons fromminocycline-treated EAE mice was not significantlyreduced with respect to that recorded in neuronsfrom controls (control 172.8 ± 15.68 %; m.t. EAE156.7 ± 9.5%; n.s.). Finally, we investigated if an al-teration of synaptic plasticity also exists in anotherneural structure during the course of EAE. In partic-ular, we investigated synaptic plasticity in the nu-cleus striatum, a subcortical brain structureparticularly prone to develop neurodegenerativechanges during the course of MS. In particular, weinvestigated the presence of alterations of long-term depression (LTD) in striatal medium spiny neu-rons (MSNs). In striatal spiny neurons recorded fromEAE mice during the acute clinical attack (clinicalscore 3-4) with patch clamp techniques, the HFSprotocol induced a LTD of 34.9 ± 7.5%, that wasnot significantly different from the LTD observed incontrol mice (32.7 ± 6%, P>0.05).

CONCLUSIONSIn conclusion the main results obtained suggest thatthe presence of an altered synaptic LTP in hip-pocampal neurons of EAE mice during the first neu-rological attack, already described withelectrophysiological field potential recordings, is

confirmed by single cell patch clamp recordings.This evidence strengthen the observation that duringthe course of experimental MS, excitatory synapsesin the CA1 region of the hippocampus lose theirphysiological ability to express this specific form oflong-term plasticity. This result is of particular rele-vance. Indeed, the impairment of long-term synapticplasticity associated with clinical disease may exerta deleterious effect on the long-term ability of theEAE/MS brain to cope with inflammatory injuries.Moreover, since LTP represents a widely-acceptedsynaptic model of memory and cognitive functions,its impairment could represent a molecular con-tributing factor explaining the high prevalence ofMS-associated cognitive dysfunction and their closerelation with active neuroinflammation. Interestingly,the presence of activated microglia in the hippocam-pus of EAE mice was found to be associated withthe LTP deficit. Activated microglia is able to releasemany immune molecules that are known to influencesynaptic plasticity, such as interleukin 1-beta. Thus,it is possible to hypothesize that the presence of anactivated microglia may represent a cause of the ob-served deficit in synaptic plasticity. Accordingly, theresults of our experiments demonstrate that the in-hibition of microglial activation prevents hippocam-pal synaptic plasticity deficits. Interestingly, thehippocampal LTP deficit was found to persist in theremission phase of EAE, when no apparent motordeficits are present. This experimental result has twomain implications. First of all, the synaptic alteration(LTP impairment) is also evident when no apparentneurological deficit are present, suggesting that thepathological process persists at the synaptic siteeven after the clinical resolution of the acute relapse.Second, it is possible to hypothesize that even if nomotor deficits are observed in the remission phaseof the experimental disease, the LTP deficit at hip-pocampal synapses may be associated with cogni-tive alterations. Finally, we found that the main formof synaptic plasticity in the nucleus striatum is notaltered during EAE. These results suggest that thealteration of synaptic plasticity occurring during thecourse of experimental MS might be structure-spe-cific.Synaptic plasticity mechanisms have the potentialto participate to repair mechanisms in the brain andto refine neuronal circuits. The obtained resultsstrengthen the possible pathogenetic role played bysynaptic plasticity alterations in experimental MS,suggesting that future studies may investigate indetail strategies aimed to counteract synaptic ab-normalities with therapeutic potential.

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Di Filippo M, Chiasserini D, Gardoni F, Viviani B, Tozzi A, Giampà C, Costa C, Tantucci M, Zianni E, Boraso M, Siliquini S, de Iure A, Ghiglieri V, ColcelliE, Baker D, Sarchielli P, Fusco FR, Di Luca M, Calabresi P. Effects of central and peripheral inflammation on hippocampal synaptic plasticity. NeurobiolDis. 2013 Apr;52:229-36.

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Alleviare la fatica nella sclerosi multipla: un interventocon stimolazione transcranica in corrente continua(studi FaMuSNe e FaReMuS DiCDiT)

Franca TecchioLaboratory of Electrophysiology for Translational neuroScience (LET’S)–ISTC–CNR,Dipartimento di Neuroscienze, Ospedale Fatebenefratelli, Roma

COLLABORATORI:Andrea Cancelli, Carlo Cottone

COLLABORAZIONI CON ALTRI GRUPPI:Filippo Carducci, Sapienza Università di Roma, RomaMaria Filippi, Marina Di Giorgio, Domenico Lupoi, Ospedale Fatebenefratelli, RomaDorian Landi, Anna Ghazaryan, Università Campus Bio-Medico di Roma, RomaPatrizio Pasqualetti, Paolo M. Rossini, Giancarlo Zito, Associazione Fatebenefratelliper la Ricerca (AFaR)Alberto Priori, Roberta Ferrucci, Fondazione IRCCS Cà Granda, Ospedale Maggiore Policlinico

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PREMESSE E OBIETTIVILa fatica è un sintomo frequente e altamente invali-dante nella sclerosi multipla, con grave impatto sullavita quotidiana dei soggetti sin dalle prime fasi dellamalattia. Precedenti risultati raccolti da progetti di ri-cerca concessi dalla FISM al nostro laboratorio (pro-getti FaMuS-e FaMuSNeP) indicano che modelli diconnettività alterata all’interno del sistema sensomo-torio, specie coinvolgenti le reti parieto-frontali, gio-cano un ruolo patogenetico rilevante nella faticalegata alla SM. Pazienti con un minimo deficit neuro-logico [punteggio EDSS (Extended Disability StatusScale) < 3,5], in fase di remissione ed affaticati [pun-teggio MFIS (Modified Fatigue Impact Scale > 15] so-no stati sottoposti a stimolazione transcranica concorrente anodica diretta (tDCS) in uno studio rando-mizzato, in doppio cieco, controllato verso sham (ov-vero un controllo con falsa stimolazione). Sono statiarruolati 18 pazienti sottoposti ad un ciclo iniziale dicinque giorni di trattamento con tDCS (1,5 mA d’in-tensità, durata 15 minuti) in corrispondenza della cor-teccia somatosensoriale primaria bilaterale, cheinteressa la proiezione dell’intera rappresentazionedel corpo (elettrodo S1wb personalizzato, 10 pazien-ti), oppure delle aree sensorimotorie dedicate al con-trollo del movimento volontario delle mani (elettrodoSM1h standard ,7x5 cm2, 8 pazienti). Per stimolareS1wb, abbiamo sviluppato una procedura non inva-

siva, sia per modellare che per posizionare un elet-trodo personalizzato sulla proiezione di S1 sullo scal-po di ciascun individuo, derivata dalle immagini dirisonanza magnetica ad alta risoluzione del cervello.Abbiamo valutato la fatica dei pazienti con scale fi-sica e totale della MFIS (MFIS Phys finali totali). Ipunteggi MFIS sono stati raccolti prima del tDCS(T0), alla fine di un ciclo di trattamento di 5 giorni(T1), e quattro (T4) ed otto (T8) settimane dopo, inaccordo alla scala MFIS che si riferisce alle ultime 4settimane.In mancanza di dati definitivi dalla letteratura circala possibile durata degli effetti del nostro trattamen-to tDCS, abbiamo raccolto MFIS ogni 4 settimane,oltre T8 per verificare che un valore simile a quellodi riferimento (definito come la differenza rispetto albasale < 50% del T1-T0 differenza) fosse raggiuntoprima di indirizzare i pazienti alla seconda sessione(cioè assicurare la scomparsa dell’effetto del primotrattamento tDCS).Per testare le modifiche di eccitabilità corticale in-dotte dall’intervento tDCS di 5 giorni e l’eventualeassociazione a cambiamenti della sensazione di fa-tica, sono stati registrati i potenziali motori evocati(MEP) da stimolazione magnetica transcranica(TMS) e i potenziali evocati somatosensoriali (SEP)valutati con elettroencefalografia (EEG) durante lastimolazione galvanica del nervo mediano.

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Fatigue relief in multiple sclerosis by neuromodulation:a transcranial direct current stimulation intervention[FaMuSNe & FaReMuS DiCDiT]

INTRODUCTION AND AIMSFatigue is a frequent and highly disabling symptomin multiple sclerosis, severely impacting patients’ dai-ly lives from the early stages of the condition. Previ-ous findings gathered from research projects grantedby FISM to our lab (projects FaMuS and FaMuSNeP)indicate that altered connectivity patterns within thesensorimotor system, especially involving the pari-eto-frontal networks, play a relevant pathogenic rolein MS-related fatigue. Patients with minimal neuro-logical deficit (Extended Disability Status Scale,EDSS < 3.5), in remission phase and experiencingfatigue (physical items score of the Modified FatigueImpact Scale MFIS > 15) received sham (false) or realanodal transcranial Direct Current Stimulation (tDCS)in a randomized, double blind, sham-controlledstudy. Five-day tDCS treatment (1.5 mA intensity, 15min duration) was applied in 18 patients on bilateralprimary somatosensory cortices covering either thewhole body representation (personalized S1wb, 10patients) or sensorimotor areas devoted to the handcontrol (standard 7x5 cm2 SM1h, 8 patients). To tar-get S1wb, we implemented a non-invasive proce-dure to shape and position a personalized electrodeon the individual S1 strip derived by high-resolutionbrain magnetic resonance images.We assessed patients’ fatigue through the physicaland total items of MFIS (Total end Phys). The MFIS

scores were collected before tDCS (T0), at the endof 5-day treatment cycle (T1) and at four (T4) andeight (T8) weeks later, according to MFIS (referringto the past 4 weeks). Since no definitive data aboutthe possible effects of our tDCS treatment could beretrieved from the literature, we collected MFISevery 4 weeks even after T8 to check that a valuesimilar to the baseline (defined as a difference frombaseline < 50% of the T1-T0 difference) wasreached before directing patients to the secondsession (i.e. ensuring an effective washout of thefirst tDCS treatment effect).To test for the excitability changes induced by the5-day tDCS intervention at cortical level andwhether they were associated to fatigue symptoms’changes, motor potentials evoked (MEP) by tran-scranial magnetic stimulation (TMS) and so-matosensory evoked potentials (SEP) assessed byelectroencephalography (EEG) during galvanic me-dian nerve stimulation were collected.

RESULTSThe real neuromodulation reduced fatigue by about25%, which did not change after accounting for thesham. We also observed an increase of bilateral M1excitability measured by MEP amplitude increase(Stimulation*Time p=.073), with a 38% increase ofthe baseline level after Real stimulation only. No

RISULTATIL’affaticamento è risultato ridotto di circa il 25% do-po tDCS reale, mentre l'affaticamento non si modi-ficava con la stimolazione sham.Abbiamo anche osservato un aumento bilateraledell’eccitabilità di M1 misurata dall’aumento di am-piezza del MEP (p=0,073), con un incremento del38% del livello basale solo dopo stimolo reale. Nonsono stati rilevati cambiamenti di ampiezza del po-tenziale N20 del SEP. Da notare inoltre l’incrementodell’eccitabilità di M1 correlata alla riduzione deipunteggi MFIS (r di Pearson=-0,728, p=.022).La procedura di neuromodulazione personalizzataproposta selettivamente su S1 bilaterale è in grado

di modificare l’eccitabilità corticale in associazionecon il sollievo da fatica.

CONCLUSIONII nostri risultati supportano il concetto che gli inter-venti capaci di modificare gli equilibri tra le attivitàdi reti neuronali all’interno del sistema sensomotoriopossono costituire un valido trattamento non far-macologico della fatica correlata alla SM.Questi risultati migliorano la comprensione dei mec-canismi patogenetici della fatica lamentata dallepersone con SM, e pongono le basi per terapie nonfarmacologiche efficaci, da utilizzare anche a casa.

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changes of N20 SEP amplitude were detected.Noteworthy, the increase of M1 excitability correlat-ed with the reduction of MFIS (Pearson’s r=-.728,p=.022).The proposed personalized neuromodulation pro-cedure selectively targeting bilateral S1 is able tomodify the cortical excitability in association withfatigue relief.

CONCLUSIONSPresent results support the concept that interven-tions capable of modifying the balances amongneuronal network activities within the sensorimotorsystem could be a suitable non-pharmacologicaltreatment of MS-related fatigue. Our results stronglypoint towards the finding of new strategies to un-derstand either the pathogenic mechanisms be-neath the fatigue complained by patients with MSand to lay the groundwork to develop easy and af-fordable devices to be used by the patients at hometo treat it.

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Cancelli A, Cottone C, Tomasevic L, Zito G, Devigus B, Pasqualetti P, Tecchio F. “Inhibitory vs. excitatory neuromodulation by regional personalizedelectrodes”. Congresso SISMEC, Sapienza - Università di Roma Dipartimento di Scienze Odontostomatologiche e Maxillo Facciali, 25-28 settembre2013.

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Cancelli A, Carducci F, Cottone C, Cogiamanian F, Devigus B, Di Giorgio M, Ferrucci R, Filippi M, Ghazaryan A, Landi D, Lupoi D, Pasqualetti P, PorcaroC, Priori A, Rango M, Rossini PM, Salustri C, Squitti R, Tomasevic L, Tecchio F. Ventriglia MC, Zito G. “Fatigue Relief in Multiple Sclerosis by transcranialDirect Current stimulation (tDCS): can we Differentiate stimulation Targets within the primary sensorimotor cortices?”, Congresso Scientifico AnnualeFISM, Roma, 29 -30 maggio 2013.

Cancelli A, Carducci F, Cottone C, Cogiamanian F, Devigus B, Di Giorgio M, Ferrucci R, Filippi M, Ghazaryan A, Landi D, Lupoi D, Pasqualetti P, PorcaroC, Priori A, Rango M, Rossini PM, Salustri C, Squitti R, Tomasevic L, Tecchio F.MC Ventriglia, G Zito. “Fatigue Relief in Multiple Sclerosis by Neuromodulation: a transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) Intervention”, CongressoScientifico Annuale FISM, Roma, 29 -30 maggio 2013.

Progetto di ricerca finanziato nel 2010 per il periodo di 1 anno (prorogato di 1 anno) e l’ammontare di 30.000 €&Progetto di ricerca finanziato nel 2011 per il periodo di 1 anno (prorogato di 6 mesi) e l’ammontare di 24.000 €

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Valutazione dell’immaginazione motoria e degli effettidella pratica mentale di un compito motorio in pazienti consclerosi multipla

Valentina TomassiniInstitute of Psychological Medicine and Clinical Neurosciences, School of Medicine,University Hospital of Wales, Cardiff, UK & Fondazione Santa Lucia, Roma, Italia

COLLABORATORI:Emilia Sbardella, Nikolaos Petsas, Fondazione Santa Lucia, RomaValentina Bianchi, Laura Leonardi, Carlo Pozzilli, Ospedale Sant’Andrea,Sapienza Università di Roma, Roma

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PREMESSE E OBIETTIVINonostante i recenti progressi terapeutici nella pre-venzione della disabilità clinica, la maggior partedella gestione della sclerosi multipla (SM) si basaancora sul controllo dei sintomi. La neuroriabilita-zione è un approccio terapeutico non farmacologi-co che migliora la qualità di vita dei pazienti conSM. Sono stati compiuti molti sforzi per migliorarele tecniche riabilitative già esistenti. La pratica men-tale è stata proposta come potenziale interventoche facilita gli effetti della riabilitazione. Essa con-siste nella ripetizione mentale di atti motori e si basasulla capacità di immaginazione motoria (motorimagery, MI) che rappresenta la capacità del cer-vello di simulare le azioni motorie senza eseguirle.Poiché le attività simulate e quelle eseguite coinvol-gono circuiti cerebrali simili, la pratica mentale incombinazione con l’esercizio fisico potrebbe facili-tare i miglioramenti delle performance motorie nellaSM. Questo progetto si propone di valutare la ca-pacità di MI che sottende la pratica mentale nei pa-zienti con SM e di verificare se la pratica mentalepossa potenziare l’effetto dell’esercizio fisico.

RISULTATIDei 40 volontari sani e degli 80 pazienti con SM, fi-nora abbiamo reclutato consecutivamente 24 vo-lontari sani e 77 pazienti con SM destrimani di etàcompresa tra i 18 e i 50 anni. I pazienti sono staticonsiderati eleggibili se clinicamente e farmacolo-gicamente stabili nei 3 mesi precedenti l’ingressonello studio e se il loro punteggio EDSS era inferiorea 6.5. I volontari sani sono stati considerati eleggibilise la loro età, il loro sesso e il loro livello di scolarità

era comparabile con quello dei pazienti.Tutti i partecipanti hanno eseguito un compito mo-torio della durata di circa 13 minuti detto serial re-action time (SRT). Durante il SRT, ai partecipanti erarichiesto di rispondere a stimoli visivi che apparivanosullo schermo del computer in una delle 5 possibiliposizioni, premendo il tasto corrispondente su unatastiera. La latenza tra la presentazione dello stimoloe la risposta, così come il numero di risposte corret-te, era registrato per verificare i miglioramenti dovutiall’esercizio. Dopo la fase iniziale di pratica motoria,i partecipanti sono stati randomizzati nel gruppo dipratica mentale (G1) o nel gruppo di controllo (G2)in un rapporto 1:1. Nella fase di intervento, i parte-cipanti del gruppo G1 hanno eseguito l’esercizio dipratica mentale che consisteva nell’osservare lo sti-molo visivo sullo schermo e nell’immaginare se stes-si mentre eseguivano il SRT senza compiere alcunaazione. L’immaginazione motoria era guidata da unricercatore esperto. I partecipanti del gruppo G2eseguivano il conto alla rovescia a partire da 100,guidati dagli stimoli visivi sullo schermo. Dopo la fa-se di intervento, tutti i partecipanti eseguivano dinuovo il SRT per circa 13 minuti. Tutti i partecipantierano valutati anche con scale di capacità di imma-ginazione motoria, scale cognitive e motorie, scaleper la fatica e per il tono dell’umore.Complessivamente, in un’analisi preliminare, i pazientie i volontari sani non si sono rivelati significativamentediversi nelle scale di immaginazione motoria.Finora, 41 pazienti e 14 volontari sani sono stati as-segnati al gruppo G1, 36 pazienti e 10 volontari sanial gruppo G2. Non è stato trovata una significativadifferenza tra i 4 gruppi nelle caratteristiche demo-

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Assessing motor imagery and the effects of mental practiceof a motor task in patients with multiple sclerosis

INTRODUCTION AND AIMSDespite recent therapeutic advances in preventingclinical disability, most of the management in multiplesclerosis (MS) is still based on symptom control. Neu-rorehabilitation is a non-pharmacological approachthat improves quality of life in MS. Many efforts havebeen made to improve the existing rehabilitation tech-niques. Mental practice has been proposed as a po-tential intervention to facilitate the effects ofrehabilitation. It consists of the mental rehearsing ofmotor acts and is based on motor imagery (MI) thatis the brain’s ability to simulate motor actions withoutexecuting them. Since simulated and executed ac-

tions involve similar brain networks, mental practicein combination with physical practice may facilitateimprovements in motor performance in MS. Here weaim to assess the capacity for MI that underlies men-tal practice in MS patients and to test whether mentalpractice enhances the effect of motor practice.

RESULTSOut of the planned 40 healthy volunteers and 80 MSpatients, so far we have consecutively recruited 24right-handed healthy volunteers and 77 right-hand-ed MS patients aged between 18 and 50 years. Pa-tients were eligible if clinically and pharmacologically

grafiche. I pazienti del gruppo G1 non differivano si-gnificativamente nel punteggio EDSS (p=0.48) enella durata di malattia (p=0.71) rispetto a quelli delgruppo G2, sebbene questi ultimi avessero un piùalto numero di ricadute nei due anni precedenti l’in-clusione (media ± DS 0.34 ± 0.58 vs 0.03 ± 0.19,p<0.001).Non è stata trovata una differenza significativa tra ipazienti del gruppo G1 e quelli del gruppo G2 neltempo medio di latenza (p=0.20) e nel numero di ri-sposte corrette (p=0.27) nella fase di pratica moto-ria pre-intervento. I cambiamenti nella latenzamedia e nel numero medio di risposte corrette era-no più pronunciati nella fase post-intervento rispet-to a quella pre-intervento sia in G1 (p=0.02 ep<0.001 rispettivamente), sia in G2 (p<0.001 ep<0.001, rispettivamente).Allo stesso modo, non è stata trovata una differenzasignificativa tra i gruppi G1 e G2 di volontari saninella media del tempo di latenza e nella media delnumero di risposte corrette (p=0.32 e p=0.09, ri-spettivamente) nella fase di pratica motoria pre-in-tervento. Comparando le fasi pre- e post-interventonei due gruppi di volontari sani, i volontari sani diG1 mostravano miglioramenti significativi più pro-nunciati nella media della latenza e nel numero me-dio di risposte corrette nella fase post-intervento(p<0.001 e p<0.001, rispettivamente), mentre i vo-lontari sani di G2 mostravano miglioramenti signifi-cativi solo nel numero medio di risposte corrette

(p=0.09 e p<0.02, rispettivamente).Questa analisi preliminare ha consentito di esplorarei cambiamenti delle performance motorie dovuti al-l’esercizio fisico nei pazienti con SM e nei volontarisani. Ulteriori analisi sulla coorte completa consen-tiranno di testare se la capacità di immaginazionemotoria che sottende la pratica mentale sia preser-vata nei pazienti con SM anche a livelli crescenti didisabilità, così come se questa capacità di immagi-nazione conferisca ai pazienti con SM una maggioreabilità di migliorare le performance con l’esercizio fi-sico e potenzi l’effetto dell’esercizio stesso.

CONCLUSIONILa riabilitazione rappresenta un’importante strate-gia terapeutica nella gestione della SM. Pertanto, losviluppo di interventi di recupero che promuovanoi suoi effetti è un obiettivo primario della ricerca cli-nica nella SM. I risultati del nostro studio contribui-scono direttamente allo sviluppo di nuove strategiedi recupero, chiarendo se la pratica mentale possapotenziare l’effetto dell’esercizio fisico nei pazienticon SM. Essi, perciò, avranno un impatto sulla ge-stione clinica dei pazienti con SM. I risultati di que-sta analisi preliminare suggeriscono che la capacitàdi immaginazione motoria è preservata nei pazienticon SM. Ciò supporta l’ipotesi che la capacità diimmaginazione motoria possa costituire una riservaindividuale che può essere sfruttata dalla praticamentale per potenziare il recupero funzionale.

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Sbardella E, Bianchi V, Petsas N, Pozzilli C, Tomassini V. Assessing motor imagery and the effects of mental practice of a motor task in patients withMultiple Sclerosis. Congresso Scientifico Annuale FISM, Roma, 29-30 Maggio 2013


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stable in the 3 months prior to inclusion and if theirEDSS score was lower than 6.5. Healthy volunteerswere eligible if matched by age, sex and education.All participants practised a right hand serial reactiontime task (SRT) lasting about 13 minutes. DuringSRT subjects were asked to respond to visual cuesappearing on a computer screen in one of 5 possiblepositions by pressing the corresponding key on apad. The latency between the stimulus presentationand the response, as well as the number of correctresponses, were recorded to assess improvementson the task with practice. After this initial phase ofmotor practice, they were randomised to the mentalpractice group (G1) or to the control group (G2) in a1:1 ratio. The intervention phase lasted for about 13minutes. During this phase, G1 participants per-formed the mental practice consisting of observingthe visual cue on the screen that moved sequentiallyand imagining themselves performing the SRT with-out executing any action. The imagery was guidedby a trained researcher. The G2 participants per-formed a count-down from 100, paced by the visualcues on the screen. After the intervention phase, allsubjects performed the SRT again for about 13 min-utes. All participants were also assessed usingscales testing motor imagery capacity, cognitive andmotor performances, fatigue and mood.Overall, from a preliminary analysis, motor imageryscores did not differ significantly between patientsand healthy volunteers.So far, 41 patients and 14 healthy volunteers havebeen assigned to G1, 36 patients and 10 healthyvolunteers to G2. There was no significant differencein the demographic characteristics among the 4groups. G1 patients did not differ significantly in theEDSS score (p=0.48) and in the disease duration(p=0.71) when compared to G2 patients, althoughthey had higher number of relapses in the previoustwo years (mean ± SD number of relapses in G1 vs.G2 0.34 ± 0.58 vs 0.03 ± 0.19, p<0.001).There was no difference between G1 and G2 patientsin the mean latency and in the mean number of cor-rect responses (p=0.20 and p=0.27, respectively) inthe pre-intervention motor practice. Changes in themean latency and in the mean number of correct re-

sponses were more pronounced in the post-interven-tion than in the pre-intervention phase in both G1(p=0.02 and p<0.001 respectively) and G2 (p<0.001and p<0.001, respectively).Similarly, there was no difference between G1 and G2healthy volunteers in the mean latency and in the meannumber of correct responses (p=0.32 and p=0.09, re-spectively) in the pre-intervention motor practice.Comparing the pre- and the post-intervention phasesbetween the two groups of healthy volunteers, G1healthy volunteers showed improvements significantlymore pronounced in the mean latency and in the meannumber of correct responses in the post-interventionphase (p<0.001 and p<0.001, respectively), whereasG2 healthy volunteers showed significant improve-ments in the mean number of correct responses only(p=0.09 and p<0.02 respectively).This preliminary analysis allowed us to explorechanges in motor performance with practice in thepatients and in the healthy volunteers. Furtheranalysis on the completed cohorts will allow testingof whether the behavioural capacity for motor im-agery underlying mental practice is preserved in MSpatients despite increasing levels of disease bur-den, as well as whether this capacity confers agreater ability to improve performance with motorpractice in patients and enhances the effect of mo-tor practice on performance improvements in MS.

CONCLUSIONSRehabilitation represents a major therapeutic strat-egy in MS management. Therefore, developing nov-el recovery-oriented strategies that promote itseffects is a major goal in MS clinical research. Re-sults from this study contribute directly to the de-velopment of novel recovery strategies by clarifyingwhether mental practice can enhance the effects ofmotor practice in patients with MS. They, therefore,will have an impact on the clinical management ofMS patients. The results of this preliminary analysissuggest a preserved motor imagery capacity in MSpatients. This supports the hypothesis that the ca-pacity for motor imagery may form an individual re-serve that can be exploited by mental practice forenhancing functional recovery.

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Nino BasagliaUnità di Medicina Riabilitativa, Azienda Ospedaliero-Universitaria di Ferrara, Ferrara

COLLABORATORI:Sofia Straudi, Carlotta Martinuzzi, Claudia Pavarelli, Livio Balugani, Daniela Ripa

COLLABORAZIONI CON ALTRI GRUPPI:Carmelo Chisari, Irene Sabella, Martina Venturi, Chiara Fanciullacci,Unità di Neuroriabilitazione - Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana, PisaFederica Aprigliano, Unità di Neuroriabilitazione - Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisanae Istituto di BioRobotica, Scuola Superiore Sant’Anna, Pisa

PREMESSE E OBIETTIVILe disabilità del cammino sono una problematicaassai frequente nella sclerosi multipla (SM), con unimpatto negativo sulle attività quotidiane e la qualitàdi vita. Nell’80% dei casi, la malattia causa l'altera-zione della funzionalità deambulatoria, con un’au-mentata percezione di fatica, dolore, declino operdita di mobilità e partecipazione. L’alterazionedella funzione motoria dovuta ad un danno del si-stema nervoso centrale è una delle principali con-seguenze della SM, che può portare a significativicambiamenti nei distretti periferici, come ad esem-pio la debolezza muscolare. Inoltre, è stata osserva-ta una maggiore percezione di fatica nei pazienti conSM in parte dovuta all’alterazione dell’attivazionemotoria centrale, anche in assenza di un evidenteaffaticamento muscolare. La valutazione elettromio-grafica (EMG) ha mostrato delle alterazioni nei pat-tern di reclutamento muscolare, ovvero un ridottonumero di potenziali d’azione di unità motoria di nor-male ampiezza (MUAPs). Recentemente è stata di-mostrata la necessità di fornire un allenamentointenso e specifico per ottenere il recupero della fun-zionalità motoria. Per questo motivo l’utilizzo di di-spositivi robotici è considerato dai ricercatori unmezzo per garantire un’alta intensità e specificità diallenamento. Nello studio proposto è stata utilizzataun’ortesi per il cammino (Lokomat, Hocoma, Sviz-zera) che consiste in un esoscheletro robotizzatocon un sistema di sgravio del peso corporeo e untapis roulant. Le gambe della persona sono guidatein uno schema fisiologico di cammino pre-imposta-

to. Abbiamo ipotizzato che un programma persona-lizzato che prevede un sostegno del peso corporeoe movimenti assistiti del cammino possa diminuirela percezione di fatica dei pazienti con SM, consen-tendo un periodo di trattamento più lungo. Gli obiet-tivi di questo studio randomizzato controllato sonostati la verifica degli effetti di un allenamento robot-assistito del cammino in pazienti con SM; inoltre,abbiamo indagato gli effetti di questo intervento sul-la fatica, la qualità di vita e l’attivazione delle unitàmotorie.

RISULTATISono stati reclutati 58 pazienti con SM e grave di-sabilità deambulatoria (EDSS 6-7) in due clinicheitaliane. Di questi, 49 hanno completato lo studio(15 maschi e 34 femmine, 53.2 ± 11.01 anni, EDSS6.40 ± 0.39, esordio SM 15 ± 7.83 anni). I parteci-panti sono stati randomizzati nel gruppo di cammi-no robot-assistito (Lokomat, Hocoma, Svizzera) onel gruppo di fisioterapia convenzionale (12 sessio-ni in sei settimane). Per osservare i potenziali bene-fici sono stati condotti test clinici e neurofisiologici.I test clinici hanno rilevato la velocità del cammino(Test dei 10m), la resistenza deambulatoria (Test deisei minuti), l’equilibrio (Berg Balance Test) e la mo-bilità (Up and Go Test); sono state inoltre valutatela fatica percepita (Fatigue Severity Scale), il tonodell’umore (Patients Health Questionnaire) e la qua-lità di vita (SF-36). I principali risultati di questo studiosono stati osservati nella resistenza deambulatoriaed equilibrio: i pazienti sottoposti a rieducazione ro-

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Gli effetti della rieducazione robot-assistita sulla funzionalitàdeambulatoria e sull’attivazione delle unità motorie in personecon sclerosi multipla. Uno studio randomizzato controllato


INTRODUCTION AND AIMSGait disabilities are very common in multiple sclero-sis (MS) with a negative impact on personal activitiesand quality of life. It has been shown that 80% ofthem experience a loss of ambulation function, withan increased prevalence of fatigue, pain, decline orloss of mobility and participation. Central motor im-pairment is a primary consequence of MS, and sig-nificant peripheral changes like muscle weakness,may arise from chronically altered central motorfunction. In addition, it has been suggested that im-paired central motor activation is associated with thesymptomatic fatigue of MS patients even in absenceof overt muscle fatigue. Electromyographic (EMG)abnormalities have been shown in multiple sclerosispatients, such as abnormal recruitment patterns withdecreased numbers of motor unit action potentials(MUAPs) of normal amplitude. Ongoing researchesshow that the intensity and specificity of motor train-ing is necessary to achieve recovery of motor func-tions. For this reason robotics has been introducedby researchers as a tool to achieve high intensity andspecific motor training. In the proposed project weused a robotic driven gait orthosis (Lokomat, Hoco-

ma, Switzerland) to deliver motor training therapy.The system consists of a robotic gait orthosis with abody weight support system that is used in combi-nation with a treadmill. The subject’s legs are guidedaccording to a pre-programmed physiological gaitpattern. We assumed that individually adjusted bodyweight support and assisted walking movementsmight reduce central fatigability in multiple sclerosispatients, allowing a longer effective treatment time.The aims of this randomized controlled study wereto test the effects of robot-assisted gait training inimproving locomotors function in multiple sclerosispatients with gait impairments; moreover, we ex-plored its effects on fatigue, quality of life and motorunit firing rate.

RESULTSWe enrolled 58 multiple sclerosis patients with mod-erate to severe gait impairment (EDSS 6-7) in twoItalian outpatient clinics. 49 of them (15 men and 34females, 53.2 ± 11.01 years, EDSS 6.40 ± 0.39, MSonset 15 ± 7.83 years) completed the study. Partic-ipants were randomized to Robot-assisted gaittraining (Lokomat, Hocoma, Switzerland) or conven-

The effects of robot-assisted gait training on locomotorfunction and motor unit firing in multiple sclerosis subjects.A randomized control trial

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bot-assistita dopo sei sedute hanno ottenuto mi-glioramenti in questi parametri con ulteriori incre-menti alla fine del trattamento(p<0,01). Tuttavia, nonabbiamo rilevato effetti significativi sulla velocità delcammino e sulla mobilità. Per quanto riguarda la fa-tica non abbiamo osservato cambiamenti nella per-cezione di questo sintomo al termine deitrattamenti. Tutti i pazienti hanno riportato un mi-glioramento del tono dell’umore (p<0,01) e dellaqualità di vita. A distanza di tre mesi i risultati otte-nuti non sono stati mantenuti. In diciannove pazientiè stato possibile studiare le caratteristiche di atti-vazione dell’unità motoria attraverso l’analisi EMGdi superficie del muscolo vasto mediale durantel’estensione isometrica del ginocchio. Abbiamo re-gistrato sia la contrazione volontaria massimale(CVM) che a diverse percentuali di forza. Al terminedella riabilitazione, i pazienti erano in grado di evo-care una CVM maggiore rispetto alle valutazioni ini-

ziali; per quanto riguarda l’analisi di frequenza dellospettro di potenza, abbiamo osservato un aumen-tato reclutamento di unità motorie in entrambi igruppi.

CONCLUSIONILa rieducazione robot-assistita del cammino puòessere considerata un valido trattamento nei pa-zienti con SM e grave disabilità del cammino. Al ter-mine di questo trattamento intensivo e specifico, ipazienti hanno migliorato la capacità deambulatoriae l’equilibrio. Tali effetti non sono stati mantenuti adistanza di tre mesi. La riabilitazione motoria, sia ro-bot-assistita che convenzionale, ha portato a un mi-glioramento del tono dell’umore e della qualità divita. Inoltre, i nostri dati preliminari circa le caratte-ristiche di attivazione delle unità motorie ci fornisco-no interessanti considerazioni riguardo ai possibilimeccanismi di recupero motorio in pazienti con SM.

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tional therapy and they received 12 sessions oversix weeks (two sessions/week). To reveal potentialbenefits on motor function, mobility and gait abilitieswe performed both clinical and neurophysiologicaltests (motor unit firing rate characteristics). Clinicaltests explored gait speed (10m walking test), walk-ing endurance (Six minute walking test), balance(Berg Balance Test) and mobility (Up and Go Test);furthermore, motor fatigue (Fatigue Severity Scale)depression (Patients Health Questionnaire) andquality of life (SF-36) were assessed. Our main find-ings regarded walking endurance and balance: pa-tients who underwent robot-assisted gait trainingsignificantly improved their walking endurance aftersix sessions (p<0.01) with additional gains at the endof the training (p<0.01). We highlighted similar ef-fects on balance as well. On the other hand wedidn’t find significant effects on gait speed or mo-bility. Focusing on fatigue, which is a highly disablingsymptom in multiple sclerosis patients, we didn’tfind any detrimental or beneficial effects of motortraining on perceived fatigue. After rehabilitation, wefound a significant improvement in mood in bothgroups (p<0.01). In addition to functional gains, re-habilitation might seem to offer a positive impact ondifferent Quality of Life domains.

At three month follow-up, there was no retention ofall clinical gains. In 19 patients, motor unit firing rateanalysis was performed by recording the surfaceEMG signal of the vastus medialis, during isometricknee extension. Each patient performed two differ-ent types of exercise: a maximum voluntary contrac-tion (MVC) and subsequent contractions at differentforce level. After rehabilitation, patients were able todeliver a MVC greater than at the baseline; concern-ing the analysis of frequency power spectrum weobserved an increased trend in motor unit firing afterthe rehabilitation protocol in both groups.

CONCLUSIONSOur main findings suggested that robot-assistedgait training could be a valuable option in motor re-habilitation for MS patients with severe gait impair-ments. After this high-intensity and task-specificintervention, they increased their walking compe-tency and balance activities with no retention afterthree months. Motor rehabilitation, both robot-as-sisted and conventional, had positive effects onmood and Quality of Life. Moreover, our preliminarydata on motor firing unit rate characteristics, gaveus an insight into mechanisms underlying the motorimpairment and recovery in MS patients.


Venturi M, Straudi S, Martinuzzi C, Pavarelli C, Simonella C, Fanciullacci C, Martelli D, Micera S, Rossi B, Basaglia N, Chisari C: Riabilitazione roboticadel cammino con ortesi robotica Lokomat: effetto sulla deambulazione e sul firing motoneuronale in pazienti affetti da sclerosi multipla. XIV SIAMOC,26-28 Settembre 2013, Pisa, Italy

Venturi M, Straudi S, Martinuzzi C, Pavarelli C, Martelli D, Fanciullacci C, Simonella C, Manca M, Chisari C, Basaglia N: The effects of robot-assistedgait training on locomotor function and motor unit firing in multiple sclerosis subjects. A randomized control trial. Congresso Scientifico Annuale FISM,29-30 Maggio 2013, Roma, Italy

Venturi M, Fanciullacci C, Simonella C, Rossi B, Straudi S, Basaglia N, Chisari C: Effects of robot-assisted gait training on locomotor function and motorunits firing rate in Multiple Sclerosis. 40 SIMFER, Società Italiana di Medicina Fisica e Riabilitazione, 21-25 Ottobre 2012, Sorrento, Italy.

Martinuzzi C, Pavarelli C, Straudi S, Ferraresi G, Balugani L, Manca M, Monaco V, Venturi M, Fanciullacci C, Simonella C, Chisari C, Basaglia N: Theeffects of robot-assisted gait training on locomotor function and motor unit firing in multiple sclerosis subjects with severe gait impairments. CongressoScientifico Annuale FISM, 30-31 Maggio 2012, Roma, Italy

Straudi S, Venturini E, Ferraresi G, Manca M, Benedetti MG, Muscari S, Sabbagh Charabati A, Bonato M, Basaglia N: Influenza del training dambulatoriorobot-assistito sul pattern di cammino in pazienti con sclerosi multipla. XII SIAMOC, 20-1 Ottobre 2011, Bosisio Parini, Italy

Zancato E, Venturini E, Balugani L, Ripa D, Straudi S, Basaglia N: Gli effetti della rieducazione robot-assistita del cammino vs la rieducazione motoriaconvenzionale nella sclerosi multipla: uno studio cross-over. 39 SIMFER, Società Italiana di Medicina Fisica e Riabilitazione, 16-19 Ottobre 2011, ReggioCalabria, Italy

Straudi S, Venturini E, Balugani L, Ripa D, Ferraresi G, Marchi P, Manca M, Basaglia N: Gli effetti della rieducazione robot-assistita del cammino inpazienti affetti da sclerosi multipla. Studio pilota. Congresso Scientifico Annaule FISM, 25-26 Maggio, Roma, Italy



QUALITÀ DELLA VITA

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QUALITÀ DELLA VITA

Marta BassiDipartimento di Scienze Biomediche e Cliniche Luigi Sacco, Università degli Studi di Milano, Milano

COLLABORATORI:Antonella Delle Fave, Dipartimento di Fisiopatologia Medico-Chirurgica e dei Trapianti,Università degli Studi di Milano, Milano

COLLABORAZIONI CON ALTRI GRUPPI:Monica Falautano, Mauro Comola, Vittorio Martinelli, Rosalinda Cardamone,Eleonora Minacapelli, Giancarlo Comi, Dipartimento di Neurologia, Ospedale San Raffaele,MilanoBenedetta Goretti, Emilio Portaccio, Bahia Hakiki, Maria Pia Amato, Dipartimentodi Neuroscienze, Area del Farmaco e Salute del Bambino (NEUROFARBA), Università degli Studidi Firenze, FirenzeMonica Grobberio, Miriam Benin, Samuela Turati, Manuela Valsecchi,Monica Rezzonico, Franco Di Palma, Azienda Ospedaliera S. Anna di Como, ComoMarianna Pattini, Francesca Cenci, Beatrice Allegri Rossi, Ilaria Pesci,Angelica Guareschi, Enrico Montanari, Centro di Sclerosi Multipla, UOC di Neurologia,Ospedale di Vaio-Fidenza, FidenzaErika Pietrolongo, Daniela Travaglini, Giovanni De Luca, Alessandra Lugaresi,Dipartimento di Neuroscienze e Imaging, Università G. d’Annunzio, ChietiSabina Cilia, Francesco Patti, Centro Sclerosi Multipla, Azienda Ospedaliero-UniversitariaPoliclinico G. Rodolico, CataniaRosa Gemma Viterbo, Pietro Iaffaldano, Maria Trojano, Dipartimento di Scienze Medichedi Base, Neuroscienze ed Organi di Senso, Università di Bari, Bari

Il sistema della cura: promozione del benessere tra personecon sclerosi multipla, caregiver ed operatori sanitari.Uno studio pilota

PREMESSE E OBIETTIVIUna delle sfide più attuali per la ricerca è la promo-zione del benessere di persone con sclerosi multi-pla (SM). Lo studio scientifico del benessere è statoavviato solo di recente, e deriva dalla constatazioneche le persone che vivono una condizione proble-matica non sviluppano solo malessere, ma anchecapacità, risorse e strategie adeguate a fronteggiarela situazione. Nonostante queste evidenze di ricer-ca, gli interventi volti alla promozione della qualitàdi vita privilegiano l’analisi delle dimensioni fisichedel benessere e sono finalizzati alla riduzione delleinfermità e difficoltà anziché alla costruzione e con-solidamento delle risorse personali e sociali. Il be-nessere in realtà è un fenomeno complesso, cheinclude componenti fisiche, psicologiche e sociali.Inoltre è un concetto soggettivo: ogni individuo va-

luta il proprio livello di benessere in base alla perso-nale rappresentazione delle proprie condizioni di vi-ta. Obiettivo di questo studio pilota è quindi fornireper la prima volta nella ricerca su SM una visione in-tegrata del benessere percepito dai protagonisti delsistema della cura: persone con SM, caregiver eoperatori sanitari. Il benessere dei partecipanti è sta-to studiato sia in relazione alla salute che alla per-cezione della vita in generale.

RISULTATILo studio ha coinvolto 168 partecipanti reclutati insette centri italiani: 71 persone con SM, 71 caregi-ver e 26 operatori sanitari. Tutti gli obiettivi del pro-getto sono stati raggiunti. In particolare lo studio hafornito due contributi importanti.Il primo riguarda la percezione dell’impatto della ma-

INTRODUCTION AND AIMSOne of the challenges research has to face todayinvolves well-being promotion of persons with mul-tiple sclerosis (MS). The scientific investigation ofwell-being has just recently started, and stems fromthe evidence that individuals living under adverseconditions do not only develop ill-being, but alsocapacities, resources and adequate strategies tocope with the situation. In spite of this research ev-idence, intervention to promote quality of life tends

to privilege the analysis of the physical aspects ofwell-being, and to focus on impairment and difficul-ties reduction rather than on the construction andstrengthening of personal and social resources.Well-being is a complex phenomenon, includingphysical, psychological and social components.Moreover, it is a subjective concept: individuals ap-praise their well-being level according to their per-sonal representation of living conditions. For thefirst time in MS research, the present pilot study

The care system: well-being promotion among peoplewith multiple sclerosis, caregivers and health professionals.A pilot study

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lattia sul benessere da parte delle persone con SM.I risultati hanno mostrato che la percezione di faticaconnessa alla malattia influenza il benessere perso-nale più di misure oggettive quali il tipo di SM, la suadurata e il livello di disabilità (EDSS). Coloro che ri-portano livelli di fatica più elevati attribuiscono allamalattia conseguenze più negative sui livelli di fun-zionamento fisico, cognitivo e sociale, sulle limita-zioni fisiche ed emotive, sui livelli percepiti di energiae di benessere emotivo e sul dolore fisico. La faticapercepita ha anche un impatto negativo sulla perce-zione di benessere psicologico e si associa a livellidi depressione più elevati. Tuttavia alcuni ambiti del-la vita non risultano influenzati dalle condizioni og-gettive e percepite di malattia. Essi sono inparticolare la sfera delle relazioni familiari e sociali,il lavoro e la dimensione della spiritualità/religione.Il secondo contributo della ricerca è costituito dal-l’analisi comparativa del benessere percepito dapersone con SM, loro caregiver e operatori. Le prin-cipali differenze tra i gruppi riguardano l’ambito dellasalute. Rispetto a caregiver e operatori, le personecon SM riportano livelli inferiori di funzionamento fi-sico, salute generale e vitalità, e maggiori limitazionidovute a problemi fisici. Rispetto ai caregiver ripor-tano, inoltre, livelli inferiori di funzionamento sociale,maggiori limitazioni a livello emotivo e livelli più ele-vati di depressione. Per contro, i tre gruppi di parte-cipanti non differiscono per livelli di benesserepsicologico. Inoltre, rispetto ai caregiver i pazientipercepiscono maggior supporto sociale e maggioriopportunità di reperire nella vita quotidiana espe-rienze ottimali, cioè condizioni di coinvolgimento,

gratificazione ed impegno nel fronteggiare sfide per-cepite come significative.

CONCLUSIONIQuesto studio apre nuove e promettenti prospetti-ve. I risultati evidenziano l’importanza di valutare,anche in condizioni di malattia, il benessere perce-pito dagli individui e di analizzarne non solo limiti edeficit ma anche risorse e punti di forza. Benché,come atteso, le persone con SM riportino livelli dibenessere inferiori agli altri gruppi nella sfera dellasalute fisica, esse percepiscono maggior supportosociale rispetto ai caregiver e maggiori opportunitàdi investire le proprie capacità in sfide complesse esignificative. Ciò mette in luce la coesistenza di li-mitazioni e malessere con risorse personali e con-testuali che possono compensare le problematichelegate alla salute, supportando il concetto di perso-na quale insieme di componenti fisiche, psichichee sociali il cui funzionamento è il risultato integratodelle parti. I risultati evidenziano inoltre l’utilità di va-lutare il benessere percepito da parte degli altri pro-tagonisti della cura. A livello di intervento, questostudio enfatizza la necessità di un’analisi integratache si articoli su diversi ambiti di vita, per apportaremodifiche a quelli maggiormente associati a males-sere e compromissione del funzionamento, ma an-che per valorizzare quelli che alimentano risorsepersonali e sociali. In particolare, l’investimento dirisorse in ambiti di vita percepiti come gratificantipermette di compensare le limitazioni percepite inaltri ambiti, contribuendo così a promuovere il be-nessere generale.

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thus aimed at providing a comprehensive analysisof well-being among the major characters of the MScare system: persons with MS, their caregivers andhealth professionals. It investigated participants’well-being, focusing on both health-related andgeneral life evaluations.

RESULTSA group of 168 participants were enrolled in sevenMS centers in Italy: 71 persons with MS, 71 care-givers and 26 health professionals. The studyachieved all the initial project aims and providedtwo main relevant contributions.The first one concerns the perceived illness impacton well-being among persons with MS. Resultshighlighted that the perception of illness-related fa-tigue influences personal well-being more than ob-jective assessments of MS type, disease duration,and disability level (EDSS). Those persons who per-ceive higher fatigue levels attribute to disease morenegative consequences in terms of lower physical,cognitive and social functioning, more limitationsdue to physical and emotional problems, lower en-ergy and emotional well-being as well as higherbodily pain. Perceived fatigue also has a negativeimpact on the perception of psychological well-be-ing and is associated with higher levels of depres-sion. However, findings show that there are somelife areas which are not affected by illness condi-tions, be they evaluated subjectively or objectively.These include family and interpersonal relations,work and spirituality/religion.The second important contribution stems from thecomparative analysis of perceived well-beingamong persons with MS, caregivers and health pro-fessionals. Differences between the groups mainlyregard the health domain. Compared to caregiversand professionals, persons with MS report lowerlevels of physical functioning, general health, and vi-tality, as well as more limitations due to physicalproblems. Compared to caregivers, persons with

MS also report lower social functioning, more limi-tations due to emotional problems, and higher levelsof depression. By contrast, the three groups do notdiffer in their levels of psychological well-being. Inaddition, compared to caregivers, patients perceivereceiving more social support and retrieve more op-portunities for optimal experiences in their lives,namely conditions of deep involvement, gratificationand committment in facing meaningful challenges.

CONCLUSIONSAltogether, this pilot study opens up new and prom-ising perspectives. Results stress the importance ofevaluating perceived well-being among individualscoping with disease and analyzing not only theirweaknesses and impairments but also their re-sources and strengths. Even though persons withMS expectedly report lower health-related well-be-ing levels compared to the other groups, they per-ceive more social support than caregivers as wellas more opportunities to invest their skills in com-plex and meaningful challenges. Findings point tothe coexistence of limitations and ill-being with per-sonal and contextual resources which can compen-sate for health-related difficulties, thus supportingthe concept of a person as a set of physical, psy-chological and social components whose function-ing is the integrated result of her parts. Resultsfurther stress the need to assess the perceived well-being of the other characters involved in the caresystem. At the level of intervention, this study em-phasizes the need to carry out an integrated analy-sis of well-being encompassing the whole life ofindividuals, not just health, in order to help mendareas of impaired functioning, but also to enhancethose areas that contribute to personal and socialresources. In particular, resource investment in lifedomains that are perceived as gratifying can allowindividuals to compensate for limitations in otherdomains, thus contributing to promote their generalwell-being.

QUALITÀ DELLA VITA


Bassi M, Falautano M, Cilia S, Goretti B, Grobberio M, Pattini M, Pietrolongo E, Viterbo RG, Amato MP, Benin M, Lugaresi A, Martinelli V, Montanari E,Patti F, Trojano M, Delle Fave A. The coexistence of well- and ill-being in persons with multiple sclerosis, their caregivers and health professionals.Journal of the Neurological Sciences, 2014;337:67-73

Bassi M, Pietrolongo E, Falautano M, Cilia S, Goretti B, Grobberio M, Pattini M, Viterbo RG, Amato MP, Lugaresi A, Martinelli V, Montanari E, Patti F,Trojano M, Delle Fave A. Well-being and health-related quality of life among persons with MS, caregivers and health professionals: A comparative study.29th Congress of the European Committee for Research and Treatment in Multiple Sclerosis (ECTRIMS), Copenhagen, 2-5 October 2013.

Bassi M, Falautano M, Cilia S, Goretti B, Grobberio M, Pattini M, Pietrolongo E, Viterbo RG, Amato MP, Lugaresi A, Martinelli V, Montanari E, Patti F,Trojano M, Delle Fave A. Il sistema della cura: promozione del benessere tra persone con sclerosi multipla, caregiver ed operatori sanitari. CongressoScientifico Annuale FISM, Roma, 29-30 maggio 2013.

Bassi M, Falautano M, Cilia S, Goretti B, Grobberio M, Pattini M, Pietrolongo E, Viterbo RG, Amato MP, Lugaresi A, Martinelli V, Montanari E, Patti F,Trojano M, Delle Fave A. The care system: Well-being promotion among people with multiple sclerosis, caregivers, and health professionals. XLIII Con-gresso della Società Italiana di Neurologia, Rimini, 6-9 ottobre 2012. Neurological Sciences, 33, 148.


COMPENDIO 2014

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Graziella FilippiniUnità di Neuroepidemiologia, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Milano

COLLABORATORI:Paolo Confalonieri, Irene Tramacere

COLLABORAZIONI CON ALTRI GRUPPI:Paola Mosconi, Cinzia Colombo, IRCCS-Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri,MiIanoRoberta Amadeo, Isabella Baroni, Silvia Traversa, Paola Zaratin,Associazione Italiana SM (AISM), GenovaAnneliese Synnot, Sophie Hill, Centre for Health Communication and Participation,La Trobe University (CHCP), AustraliaMichael Summers, MS Australia, The Nerve Centre, Melbourne, AustraliaSue Shapland, MS Australia, Perth, Australia

PREMESSE E OBIETTIVILe informazioni di salute basate su evidenze sonosempre di più facile reperibilità per i cittadini. Glisforzi della ricerca si sono focalizzati sulle diversemodalità di presentare i dati scientifici ad un pub-blico non specialista. Tuttavia, la disponibilità di datisu come le persone integrino le informazioni di sa-lute basate sui risultati della ricerca con le loro pre-ferenze personali e i propri valori sono ad oggiscarse. Il progetto IN-DEEP è una collaborazionetra ricercatori australiani e italiani, le associazionidei pazienti, e le persone con sclerosi multipla (SM).Lo scopo è quello di esplorare come le persone conSM integrino le informazioni di salute con le proprienecessità, esperienze, preferenze e valori, e comequeste caratteristiche possano essere incorporatein uno strumento informativo online accessibile allepersone con SM e familiari.

RISULTATIUtilizzando un disegno a quattro stadi, è stato svi-luppato un modello informativo via internet per per-sone con SM e familiari. In un primo stadio,abbiamo organizzato sei focus-group ed un forumonline al fine di documentare e analizzare le espe-

rienze dei pazienti con SM nel trovare, valutare eintegrare informazioni di salute basate sui risultatidella ricerca tenuto conto delle preferenze perso-nali e dei propri valori, finalizzando il tutto al pren-dere decisioni per la propria salute. A tale fasehanno partecipato 40 persone con SM e 20 fami-liari. La disponibilità di informazioni aggiornate enon distorte e informazioni di carattere pratico è unbisogno informativo riportato da molti partecipanti.Il comportamento informativo cambia nel tempo inbase ai bisogni, allo stato emotivo e alla conoscen-za della malattia. Molti dei partecipanti hanno ri-portato una certa sfiducia riguardo alla veridicitàdelle informazioni online e il desiderio di impararea valutare qualità e credibilità dei siti sulla salute.Dai risultati della prima fase, abbiamo sviluppatoun modello (template) di informazione scritta dei ri-sultati della ricerca. Il modello deve permettere aipazienti/familiari SM di usare le informazioni in mo-do significativo per la propria condizione/esperien-za (Stadio 2). Nel primo template sono statiutilizzati revisioni sistematiche, studi clinici di buo-na qualità e report delle agenzie regolatorie sull’in-terferone. Il template è stato revisionato efinalizzato con l’aiuto di persone/familiari SM, neu-

Integrare le esperienze e le preferenze dei pazienticon sclerosi multipla con i risultati della ricerca scientificaper sviluppare informazioni sulla salute utili per decisioniinformate e condivise

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QUALITÀ DELLA VITA

INTRODUCTION AND AIMSIncreasingly, evidence-based health information isbeing made available to lay audiences, in additionto health professionals. Research efforts have fo-cused on different formats for the lay presentationof health information. However, there is a paucity ofdata on how people integrate evidence-basedhealth information with other factors such as theirpreferences for information and experiences with in-formation-seeking. The IN-DEEP project is an Aus-tralian-Italian collaboration between researchers,multiple sclerosis (MS) societies and people with MS(PwMS). The aim is to explore how PwMS integratehealth information with their needs, experiences,

preferences and values and how these factors canbe incorporated into an online resource of health in-formation provision for PwMS and their families.

RESULTSUsing a four-stage design, an information modelwas developed on the Internet for PwMS and theirfamilies. In Stage one six focus groups and an on-line forum to analyse the experiences of PwMS andfamilies in finding, assessing and integrating healthinformation with personal values were organised.Forty PwMS and 20 family members participated.The availability of up-to-date and unbiased infor-mation on treatments, including practical informa-

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rologi ed esperti AISM di informazione, ed è statocaricato in internet (http://indeep.istituto-besta.it/)dopo un pre-test (Stadio 3). Il formato del sito webè stato sviluppato su tre livelli di complessità (“Inbreve”, “Nel dettaglio”, e “Per approfondire”), cia-scuno caratterizzato da una combinazione di frasi,numeri e figure per spiegare benefici e rischi deltrattamento, e ulteriori sezioni con informazioni dicarattere pratico, questioni di metodo, esperienzein prima persona e un glossario. È stata realizzataun’indagine online per valutare il modello e il sitoweb con la collaborazione di AISM e pazienti affe-renti a centri SM in Italia. (Stadio 4). Agli utilizzatoridel sito, persone/familiari/amici SM, è stato chiestodi compilare un questionario online sul grado dicomprensione delle informazioni, sulla loro utilitànel prendere decisioni, e se avessero compresoperché l’informazione fosse di buona qualità. Ilquestionario è stato compilato da 374 persone. Irisultati principali sono stati: (i) la maggior parte del-le persone ha risposto positivamente alle domanderiguardanti la struttura del sito web, giudicandolodi facile navigabilità e comprensibilità delle infor-mazioni; (ii) la maggior parte aveva chiari quali fos-sero i rischi e i benefici dell’interferone; (iii) piùdell’80% riportava che le informazioni riportateavevano soddisfatto i loro bisogni e si sentivano

ora più sicuri nel prendere decisioni riguardo al trat-tamento; (iv) oltre l’80% pensava che il sito webproposto fosse affidabile e si augurava che venisseampliato con altri argomenti.

CONCLUSIONIQuesto progetto ha raggiunto lo scopo che si eraprefissato, ovvero di fornire informazioni di salutebasate sull’evidenza, accessibili e significative perpersone con SM. I partecipanti hanno manifestatoentusiasmo per una risorsa informativa indipenden-te basata sulle evidenze. A breve verrà messo onli-ne un modulo sui trattamenti e le strategie pergestire e prevenire la fatica. In accordo con i sug-gerimenti emersi dall’indagine effettuata, uno svi-luppo futuro del progetto includerà nuovi moduli sutrattamenti farmacologici e non-farmacologici. Unnuovo modello verrà dedicato al confronto tra trat-tamenti, dati i numerosi trattamenti disponibili e l’in-certezza su quale sia il migliore. Tali risultativerranno mostrati attraverso grafici ed analisi dellanetwork meta-analisi, con modalità accessibili ecomprensibili ai pazienti. Infine, all’interno di un pro-getto che mette in luce cosa è conosciuto e cosanon lo è, sarà possibile sviluppare un modello con-diviso tra medici e pazienti per valutare quali sianoad oggi le priorità della ricerca sulla SM.

COMPENDIO 2014

IN-DEEP-integrating and deriving evidence, experiences,preferences: developing research-based health informationapplicable to decision making and self-managementby people with multiple sclerosis

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tion, was important to many. Information-seekingbehaviour changed over time with relation tochanging needs, emotional state and growing ex-pertise about MS. Most people reported their inabil-ity to trust online health information and desire tolearn about good quality websites. Using the datafrom Stage 1, a template to help people understandthe summarizing evidence, apply it to their personalcircumstances, and use it when making health-re-lated decisions was developed (Stage 2). The tem-plate was created using systematic reviews andgood quality clinical studies on interferon treatmentas a first topic. Data from national regulatory agen-cies were also used. The template was reviewedand finalized with PwMS, family members, neurol-ogists and AISM staff and was uploaded to the In-ternet (http://indeep.istituto-besta.it/) after a shortpre-test (Stage 3). The website format reflectedpreferences for layered information complexity (i.e.‘The short answer’, ‘The detailed answer’, ‘Thedeep answer’) and a combination of words, num-bers and pictures to explain benefits and adverseevents, with additional sections on practical infor-mation, research methodology, and personal histo-ries. Three sections strongly endorsed by PwMS-’Does this apply to me?’ ‘Questions for my neurol-ogist’ ‘How to assess information’- and a glossarywere added. An online survey was developed toevaluate the web site (Stage 4). Web-site users –PwMS and family members/friends of PwMS – wereasked to complete an online questionnaire aboutthe degree to which they understood the informa-tion; if the information was helpful; if they used orplanned to use the information in discussions withneurologists or to make decisions about treatmentwith interferon; and if they understood why the in-formation was of good quality. The questionnairewas completed by 374 people. The main results

were: (i) most people evaluated positively the website, considering it easy to navigate and the infor-mation easy to understand; (ii) the majority consid-ered clear information about the risks and benefitsof interferon; (iii) more than 80% of responders stat-ed that the available information met their needsand felt they can decide about the treatment; (iv)over 80% thought the website was a trustworthysource of information and they hoped it will be en-riched and grow.

CONCLUSIONSThis project hits the goal to produce accessible andmeaningful evidence-based health information toPwMS for use in the varied decision making andmanagement situations they encounter in everydaylife. There is enthusiasm among participants for anItalian, independent evidence-based MS resource.Summary on treatments and strategies to manageor prevent fatigue will soon be uploaded to the site.This new online resource will allow to present infor-mation on a topic most relevant to PwMS but withfew available evidence and still many uncertainties.According to the main themes arising from the sur-vey, the future development of the project will in-clude new modules on pharmacological andnon-pharmacological treatments. A new model willbe dedicated to treatments comparison becauseseveral competitive treatments are available for MSand uncertainty about which intervention is betterto use. For this reason results from multiple inter-ventions, such as network graphs and networkmeta-analyses, will be presented and summarisedin an accessible way for laypeople. Moreover in theframework of this project that highlights what isknown and what is not known it will be possible todevelop a sharing model to evaluate research pri-orities involving patients and clinicians.

QUALITÀ DELLA VITA

ACKNOWLEDGMENTS

The authors thank the Advisory Committee, people with MS and family members participating in the focus groups and the forum, people with MSinterviewed at the IRCCS Foundation "Carlo Besta" Neurological Institute, Milano, Italy. Advisory Committee: Amadeo Roberta, Battaglia Mario Alberto, Borla Paolo, Simi Silvana, Trevisan Silene, Zaratin Paola. Neurologists involving patients for focus groups: Benedetti Maria Donata, Dipartimento Universitario Neurologia Azienda Ospedaliera Uni-versitaria Integrata di Verona; Giuliani Giorgio, Ospedale provinciale di Macerata; Leone Maurizio, Ospedale Maggiore della Carità Novara; Salemi Giu-seppe, Azienda Ospedaliera Universitaria Paolo Giaccone Palermo.


Filippini G, Beecher D, Simi S, Mosconi P, Colombo C, Battaglia MA, Hill S, Summers M, Osborne RH, Shapland S. Integrating and deriving evidence,experiences and preferences (IN-DEEP): developing research-based health information applicable to decision making and self-management by peoplewith multiple sclerosis. Cochrane Database Syst Rev Suppl 121–2 (2010) DOI:10.1002/14651858.CD000002.

Hill S, Filippini G, Summers M, Beecher D, Synnot A, Mosconi P, Shapland S, Colombo C, Baroni I, Osborne R, Traversa S. Treatment information-seeking by people with multiple sclerosis in the internet age: Stage 1 findings of the IN-DEEP project. Cochrane Database Syst Rev Suppl 3–233 (2011)DOI:10.1002/14651858.CD000003.

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Colombo C, Hill S, Filippini G, Mosconi P, Synnot A, Summers M, Osborne R, Hawkins M, Shapland S, Confalonieri P, Traversa S, Baroni I. TranslatingCochrane Reviews to lay people through the web: the IN-DEEP project. Cochrane Database Syst Rev Suppl 128 (2013)DOI:10.1002/14651858.CD201300.

Colombo C, Mosconi P, Confalonieri P, Baroni I, Traversa S, Hill S, Synnot A, Oprandi N, Filippini G. Web search behavior and information needs ofpeople with multiple sclerosis: analysis of focus groups in the Italian IN-DEEP project. Journal of Medical Internet Research (submitted)

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Filippini G, Colombo C, Amadeo R, Baroni I, Battaglia MA, Borla F, Confalonieri P, Hill S, Oprandi NC, Synnot A, Traversa S, Zaratin P, Mosconi P. Inte-grating and deriving evidence, experiences and preferences (IN-DEEP): developing research-based health information applicable to decision makingand self-management by people with multiple sclerosis. Congresso Scientifico Annuale FISM, Roma 30-31 maggio 2012.

Synnot A, Hill S, Filippini G, Summers M, Shapland S, Osborne R. Knowledge translation for consumers: development of an evidence-based health in-formation website. Communication, Medicine & Ethics (COMET) Conference. Melbourne, Australia July 11th- 13th, 2013

G Filippini, C Colombo, R Amadeo, I Baroni, MA Battaglia, PA Confalonieri, S Hill, A Synnot, S Traversa, P Zaratin, P Mosconi. Integrating and derivingevidence, experiences and preferences (IN-DEEP): Developing research-based health information applicable to decision making and self-managementby people with multiple sclerosis (MS). Congresso Scientifico Annuale FISM, Roma 29-30 maggio 2013.

Progetto di ricerca finanziato con il bando 2010 per un periodo di 3 anni e l’ammontare di 110.680 €

COMPENDIO 2014

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Alessandra SolariUnità di Neuroepidemiologia, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Milano

COLLABORATORI:Andrea Giordano, Monica Kleinefeld, Giusi Ferrari

COLLABORAZIONI CON ALTRI GRUPPI:Paolo Confalonieri, Carlo Antozzi, Unità di Neuroimmunologia, Fondazione IRCCSIstituto Neurologico C. Besta, Milano, ItaliaAlessandra Lugaresi, Erika Pietrolongo, Deborah Farina, Marco Onofrj,Dipartimento di Neuroscienze e Imaging, Università di Chieti-Pescara ‘’G. d’Annunzio’’, Chieti, ItaliaMaria Trojano, Carla Tortorella, Damiano Paolicelli, Dipartimento di ScienzeNeurologiche e Psichiatriche Università di Bari, Bari, ItaliaMaura Pugliatti, Veronica Piscedda, Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale,Università di Sassari, Sassari, ItaliaClaudia Goss, Dipartimento di Sanità Pubblica Medicina di Comunità, Università di Verona,Verona, ItaliaChristoph Heesen, Imke Backhus, Jana Poettgen, Institute for Neuroimmunologyand Clinical MS Research (inims), University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg,GermanySascha Köpke, Institute for Social Medicine, Unviersity of Lubeck, Lubeck, GermanyJurgen Kasper, Department of Primary Medical Care, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, GermanyJelena Drulovic, Tatjana Pekmezovic. Institute of Neurology, School of Medicine, Universityof Belgrade, Belgrade, SerbiaAn van Nunen, Michelle Pirard, Anoek Symons, National MS-Centrum, Melsbroek, BelgiumLiina Vahter, Karin Kannel, Department of Neurology, West-Tallinn Central Hospital,Tallinn, Estonia

Preferenze di ruolo, conoscenza del rischio e decision-makingnelle persone con sclerosi multipla (AutoMS)

PREMESSE E OBIETTIVILe persone con sclerosi multipla (PcSM) devono af-frontare, sin dal momento della comunicazione delladiagnosi, una malattia cronica, a prognosi variabile,e complesse scelte terapeutiche e personali. Neglianni recenti hanno preso piede iniziative di promo-zione della partecipazione dei cittadini e dei pazientialla programmazione sanitaria ed alla shared deci -sion making (SDM). Vi è evidenza che la SDM possamigliorare la conoscenza dei pazienti, la loro soddi-sfazione, la concordanza/aderenza alle terapie, l’al-lineamento delle cure con I valori e le preferenze deipazienti, e la soddisfazione del personale sanitario.I nostri obiettivi erano:

(1) Validare linguisticamente il Control PreferenceScale (CPS) nei Paesi dell’AutoMS, e “migrare” laversione originale della scala, somministrata da unesaminatore, in forma elettronica, auto-sommini-strata (eCPS)(2) Produrre un questionario di conoscenza del ri-schio specifico per le PcSM remittente, chiamatoRRMS-IRKQ(3) Valutare la relazione medico-paziente mediantela scala Observing Patient Involvement (OPTION)(http://www.optioninstrument.com/).Questa collaborazione internazionale ha coinvoltoprincipalmente cinque Paesi Europei: Italia, Germa-nia, Serbia, Estonia e Belgio.

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QUALITÀ DELLA VITA

COMPENDIO 2014

RISULTATI(1) Il CPS è lo strumento maggiormente impiegato pervalutare le preferenze di ruolo dei pazienti nelle deci-sioni mediche. Un esaminatore mostra cinque carteal soggetto, ciascuna consistente in una vignetta eduna breve affermazione, e gli chiede di ordinarle in or-dine di preferenza. In base alle prime due scelte, sonopossibili sei diversi punteggi che possono essere ca-tegorizzati in: attivo, collaborativo, e passivo. Impie-gando una metodologia rigorosa, abbiamo tradottoed adattato culturalmente il testo nelle lingue dei Paesicoinvolti. Abbiamo inoltre prodotto nuove vignette,con il contributo di PcSM e personale sanitario deiPaesi partecipanti. Infine, è stata allestita una versioneelettronica, auto-somministrata (eCPS) la cui accetta-bilità e riproducibilità (kappa pesato, wK) rispetto alCPS è stata verificata in 92 PcMS che hanno ricevutoentrambe le forme (elettronica e tradizionale) in ordinerandom. La riproducibilità è risultata moderata (wK0.53, intervallo di confidenza al 95% [CI] 0.40–0.65) esimile a quella del CPS somministrato dall’esamina-tore (wK 0.65, 95% CI 0.45–0.81). Le PcSM tedeschepreferivano un ruolo attivo significativamente più diitaliani, serbi ed estoni, che presentavano invece uncomportamento piuttosto omogeneo. La scolarità ele-vata risultava anch’essa associata alla preferenza peril ruolo attivo nel modello multivariato logistico.(2) Da un pool di 197 domande, abbiamo prodotto ilquestionario RRMS-IRKQ al termine di un approcciomultifasico, che ha tenuto conto di rilevanza e diffi-coltà delle stesse. Il questionario ottenuto è statotradotto-adattato in inglese UK, Italiano, Fiammingoe Serbo. Sono state quindi valutate chiarezza, leg-gibilità e rilevanza dell’RRMS-IRKQ è stata quindivalutata in quattro focus group meeting di PcSM inItalia, Germania, Serbia ed Estonia, ed in quattro fo-cus group meeting di professionisti in UK (MS Trust),Germania, Serbia ed Estonia. È stato infine prodottoun questionario consensuale, in inglese.(3) Le registrazioni audio di prime visite, effettuatepresso quattro centri SM italiani (88 PcSM, 10 medi-ci), sono state valutate impiegando lo strumento OP-TION da un operatore terzo. L’esperienza dellePcSM che hanno effettuato la visita è stata valutata

dalle stesse mediante il questionario Perceived In-volvement in Care Scale (PICS). L’età media dellePcSM era 37.5 anni, il 66% erano donne, il 72% ave-va la SM, mentre il 28% una possibile SM o altrecondizioni. Il punteggio medio alle sottoscale delPICS (0 peggiore, 100 migliore) era 71.9 (SD 24.3)per “facilitazione da parte del medico” (PICS-F); 74.6(SD 22.9) per “informazioni al paziente” (PICS-I) e so-lo 22.5 (SD 16.2) per “decision making del paziente”(PICS-DM). Il punteggio medio OPTION (0 peggiore,100 migliore) era 29.6 (SD 10.3). La durata della visi-ta, l’essere un medico donna, la concordanza di ge-nere tra medico e paziente ed un punteggio elevatoal PICS-F sono risultati associati ad un punteggioelevato all’OPTION.La scala OPTION è stata tradotta-adattata in serboed estone (per gli altri Paesi erano già disponibiliversioni ufficiali). Il PICS è stato tradotto-adattato initaliano, tedesco, serbo ed estone.

CONCLUSIONIIl progetto AutoMS (http://www.automsproject.org/)rappresenta la principale collaborazione internazio-nale sulla SDM nella SM. È in allestimento una sot-tomissione per Horizon 2020 (progetto IteMS), checostituisce l’evoluzione dell’AutoMS. Grazie a que-sto grant FISM, strumenti come CPS, PICS e OP-TION sono ora disponibili in diverse lingue perapplicazioni cliniche e di ricerca (il CPS in una formarivista, e che non richiede l’intervento di un opera-tore esterno, eCPS). Proprio i risultati ottenuti conl’eCPS hanno evidenziato l’influenza delle caratteri-stiche culturali e della scolarità sulle preferenze diruolo delle PcSM. A tale scopo, va segnalato comein Germania, dove il ruolo autonomo è molto piùrappresentato, iniziative di SDM siano state intro-dotte a livello governativo molto prima che negli altriPaesi dell’AutoMS. Infine, ma non da ultimo, i datiottenuti impiegando l’OPTION indicano chiaramentela necessità di migliorare le abilità di coinvolgimentodei pazienti (SDM skills) da parte dei medici, ponen-do particolare attenzione alle preferenze del singoloindividuo riguardo alla modalità di ricevere informa-zioni ed al grado di coinvolgimento nelle decisioni.

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Autonomy preferences, risk knowledge and decision-makingperformance in multiple sclerosis patients (AutoMS)

INTRODUCTION AND AIMSPeople with MS (PwMS) have to cope with a chroniccondition of uncertain prognosis, and face complextherapeutic and personal decisions shortly after di-agnosis. Recently, initiatives to enhance citizen andpatient influence on health care and encourageshared deci sion making (SDM) have started to gainground. Implementation of SDM can improve patientknowledge and satisfaction, concordance/adher-ence to treatment, alignment of care with patient val-ues and preferences, and clinician satis faction.We aimed at:(1) Linguistically validate the Control PreferenceScale (CPS) in the AutoMS countries, and migratethe interview-based version into an electronic self-administered version (eCPS).(2) Produce a risk knowledge questionnaire for re-lapsing-remitting PwMS (RRMS-IRKQ).(3) Assess the patient-physician relationship usingthe Observing Patient Involvement (OPTION) scale(http://www.optioninstrument.com/).This international project involved five main EU coun-tries: Italy, Germany, Serbia, Estonia and Belgium.

RESULTSRESULTS(1) The CPS is the most used instrument to assesspatient preferences for involvement in decisionsabout their health. An interviewer asks the subjectto rank in order of preference five cards, each con-taining a cartoon and a short descriptive statement,about the different roles he/she prefers to assumewhen making medical decision. Six scores are pos-sible based on subject’s two most preferred roles,which can be grouped as: active, collaborative, orpassive. We cross-culturally translated and validatethe CPS into the languages of the participatingcountries, using recognized guidelines. New car-toons were produced, based on MS health profes-sional and PwMS input/feedback. We revised theCPS cartoons, and produced an electronic version(eCPS), whose acceptability and reliability (weight-ed kappa statistic, wK) in comparison to the originaltool, was determined in 92 PwMS who receivedboth CPS versions in random order. eCPS reliability

was moderate (wK 0.53, 95% confidence interval[CI] 0.40–0.65) and similar to the test-retest reliabil-ity of face-to-face administration (wK 0.65, 95% CI0.45–0.81). German PwMS significantly preferredan active role, while Italian, Serbian and EstonianPwMS did not differ significantly from each other.Higher education was the other variable significant-ly associated with preference for an active role in alogistic model.(2) We produced the RRMS-IRKQ from a pool of 197items, which were assessed in a multi-step approachbased on their relevance and difficulty. The question-naire obtained was translated and adapted into UKEnglish, Italian, Dutch for Belgium, Serbian and Eston-ian. The RRMS-IRKQ was assessed for legibility/read-ability, clarity, and relevance in four focus groupmeetings of PwMS in Germany, Italy, Serbia, and Es-tonia, and in four focus group meetings of health pro-fessionals carried in the UK (MS Trust), Germany,Serbia and Estonia. A consensus questionnaire wasthen prepared in English.(3) Audio recordings of first-ever consultations witha participating physician (88 outpatients, 10 physi-cians) at four tertiary MS care clinics in Italy wererated by a third observer using the OPTION scaleand by patients using the Perceived Involvement inCare Scale (PICS). Mean patient age was 37.5, 66%were women, 72% had MS, and 28% had possibleMS or other disease. Mean PICS subscale scores(range 0 poor, 100 best possible) were 71.9 (SD24.3) for “physician facilitation” (PICS-F); 74.6 (SD22.9) for “patient information exchange” (PICS-I);and only 22.5 (SD 16.2) for “patient decision mak-ing” (PICS-DM). Mean OPTION total score (0 poor,100 best possible) was 29.6 (SD 10.3). Consultationtime, woman physician, patient-physician genderconcordance and PICS-F were associated withhigher OPTION total score; older physician andsecond opinion consultation were associated withlower OPTION score. The OPTION scale was trans-lated/adapted into Serbian and Estonian (for the re-maining languages, linguistically validated versionswere already available). The PICS wastranslated/adapted into Italian, German, Serbianand Estonian.

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QUALITÀ DELLA VITA

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CONCLUSIONSThe AutoMS project (http://www.automsproject.org/)is the main international collaboration on SDM in MS.The Horizon 2020 application named IteMS, now inpreparation, is the evolution of the project. Thanks tothe present application, instruments such as theCPS, the PICS and the OPTION scale are now avail-able in several languages. The CPS is available in anexaminer-free, improved version (eCPS), and can beproperly used in clinical care and research. Our eCPS

findings have revealed that PwMS role preferencesare affected by cultural characteristics and educa-tion: it is noteworthy that SDM promotion initiativesstarted being implemented earlier in Germany thanother European countries. Last but not least, our OP-TION sub-study points to a need to empower MSphysicians with better communication and SDMskills, and show in particular that attention to MS pa-tient preferences for reception of information and in-volvement in health decisions need to be improved.

COMPENDIO 2014


Pietrolongo E, Giordano A, Kleinefeld M, Confalonieri P, Lugaresi A,Tortorella C, Pugliatti M, Radice D, Goss C, Heesen C, Solari A on behalf of theAutoMS project. Decision-making in multiple sclerosis consultations in Italy: Third observer and patient assessments. PLoS ONE 2013; 8(4): e60721.doi:10.1371/journal.pone.0060721

Heesen C, Köpke S, Solari A, Geiger F, Kasper J. Patient autonomy in multiple sclerosis - Possible goals and assessment strategies. J Neurol Sci. 2013May 25. doi: 10.1016/j.jns.2013.02.018. Epub 2013 May 25. [Epub ahead of print]

Solari A, Giordano A, Kasper J, Drulovic J, van Nunen A, et al. Role Preferences of People with Multiple Sclerosis: Image-Revised, Computerized Self-Administered Version of the Control Preference Scale. PLoS ONE 2013; 8(6): e66127. doi:10.1371/journal.pone.0066127

Kasper J, Köpke S, Fischer K, Backhus I, Schäffler N, Solari A, Heesen C. Applying the theory of planned behavior to multiple sclerosis patients’ decisionson disease modifying therapy - questionnaire concept and validation. BMC Medical Informatics and Decision Making 2012;12(1):60. [Epub ahead ofprint]

Giordano A, Kasper J, Pietrolongo E, Antozzi C, Moretti G, Pugliatti M, Van Nunen A, Drulovich Y, Vahter L, Kopke S, Heesen C, Solari A on behalf of theAutoMS project. The electronic, cartoon-revised self-administered version of the Control Preference Scale. Mult Scler 2012; 18(4): S695

Pietrolongo E, Giordano A, Kleinefeld M, Tortorella C, Confalonieri P, Pugliatti M, Goss C, Solari A, on behalf of the AutoMS project. Involving multiplesclerosis patients in medical decisions: The Italian experience. Neurol Sci 2012; 33: S141

Giordano A, Kasper J, Pietrolongo E, Antozzi C, Moretti G, Pugliatti M, Van Nunen A, Drulovich Y, Vahter L, Kopke S, Heesen C, Solari A on behalf of theAutoMS project. The electronic, cartoon-revised self-administered version of the Control Preference Scale. Neurol Sci 2012; 33: S145-146

Heesen C, Köpke S, Kasper J, Drulovic J, van Nunen A, Vahter L, Viala F, Fulcher G, Giordano A, Solari A, on behalf of the AutoMS project. Multi-language translation and cross-cultural adaptation of the patient-reported relapsing-remitting MS risk knowledge questionnaire on immunotherapy(RRMS-IRKQ): methodological issues. Neurol Sci 2012; 33: S144

Heesen C, Köpke S, Kasper J, Drulovic J, van Nunen A, Vahter L, Viala F, Fulcher G, Giordano A, Solari A on behalf of the AutoMS project. Multi-languagetranslation and cross-cultural adaptation of the patient-reported relapsing-remitting MS risk knowledge qestionnaire on immunotherapy (RRMS-IRKQ):methodological issues (#52). Mult Scler 2012; 18: S25-S28

Solari A, Giordano A, Köpke S, Kasper J, Lugaresi A, Pugliatti M, Van Nunen A, Vahter L, Drulovic J, Clanet M, Sharrack B, Fulcher G, Heesen C onbehalf of the AutoMS-group. Autonomy preferences, risk knowledge and decision making performance in ms (AutoMS): the Control Preference Scale.RIMS 2011 Conference, May 13-14 Turku, Finland

Heesen C, Köpke S, Kasper J, Giordano A, Van Nunen A, Vahter L, Drulovic J, Clanet M, Sharrack B, Fulcher G, Solari A on behalf of the AutoMS-group.Risk knowledge and planned behavior questionnaires - new tools to assess decision-making in MS. RIMS 2011 Conference, May 13-14 Turku, Finland

AutoMS Investigators’ Meeting and OPTION training. Casa Vacanze “I Girasoli”, Lucignano (Siena), Italy. 7 October 2011


PROGETTI DI RICERCA EBORSE DI STUDIO

FINANZIATI DALLA FISM


Antonio CATTANEOFondazione EBRI “Rita Levi-Montalcini”,Fattori Neurotrofici e Malattie Neurodegenerative, RomaCorrelazione fra sbilanciamento proNGF/NGF e sinaptopatiainfiammatoria in un modello animale di sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 53.000 - 1 anno

Francesco CECCONIDipartimento di Neuroscienze Sperimentali,IRCCS Fondazione Santa Lucia, RomaRuolo della proteina adattatrice pro-autofagica AMBRA1nel destino dei linfociti T e suo coinvolgimento nellasclerosi multiplaProgetto di ricerca € 180.000 - 3 anni

Maria Teresa CENCIONIWolfson Neuroscience Laboratory, Department of Medicine,Faculty of Medicine, Imperial College, London, UKRuolo dei linfociti T CD57+CD8+ nel riconoscimentodel virus Epstein-Barr e nella sclerosi multiplaBorsa di ricerca € 41.000 - 1 anno

Eliana Marina COCCIADipartimento di Malattie Infettive, Parassitarieed Immunomediate, Istituto Superiore di Sanità, RomaAnalisi dell’INTERFEROME nella SM: alla ricerca di viedi segnale alterateProgetto di ricerca € 245.000 - 2 anni

Silvia DUSIDipartimento di Patologia e Diagnostica, Sezione PatologiaGenerale, Università degli Studi di Verona, VeronaVisualizzazione e caratterizzazione della motilità dellecellule T nel sistema nervoso centrale durantel’encefalomielite autoimmune sperimentaleBorsa di addestramento € 37.000 - 2 anni

Fabia FILIPELLOLaboratorio Farmacologia e Patologia del Sistema Nervoso,Istituto Clinico Humanitas, RomaInterazione tra astrociti e cellule T nel corso della sclerosimultiplaBorsa di addestramento € 38.000 - 2 anni

Bruno GRANDivision of Clinical Neuroscience, Clinical NeurologyResearch Group, University of Nottingham, School of Medicine,Nottingham, (UK)Ruolo dei recettori TLR2 nell’attivazionedell’infiammazione da parte di infezioni nella SMProgetto di ricerca € 126.550 - 2 anni

Giuseppe MAMELIDipartimento di Scienze Biomediche, Università degli Studi diSassari, SassariStudio sulla risposta immune di HERV-W e EBV in pazientisardi con sclerosi multipla e controlliProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Luca MUZIODiaprtimento di Neuroscienze, INSPE,Fondazione Centro San Raffaele (FCSR), MilanoAcidosi nelle malattie neuroinfiammatorie: il ruolo deicanali AsicsProgetto di ricerca € 163.000 - 2 anni

Barbara ROSSIDipartimento di Patologia e Diagnostica,Università degli Studi di Verona, VeronaRuolo delle cellule T regolatorie CD4+CD25+ nellamodulazione dell’autoimmunità nel sistema nervoso centralein corso di encefalomielite sperimentale autoimmuneProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Barbara SERAFINIDipartimento di Biologia Cellualre e Neuroscienze, IstitutoSuperiore di Sanità, RomaStudio dell’espressione genica degli infiltrati immunitariisolati mediante microdissezione laserda tessuto cerebrale di persone con sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 115.000 - 2 anni

Claudio SETTELaboratorio di Neuroembriologia, Fondazione Santa Lucia, RomaCoinvolgimento della via di segnale IL-1ß/MyD88 neldifferenziamento delle cellule umane Th17 patogenichenella sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 95.000 - 2 anni

Ada Maria TATADiartimento di Biologia e Biotecnologie Charles Darwin,Sapienza Università di Roma, RomaRelazione tra l’alterazione del sistema colinergico el’infiammazione nella sclerosi multipla: studi in topi EAE ein pazienti in fase recidivante remittenteProgetto di ricerca € 133.000 - 2 anni

COMPENDIO 2014

PROGETTI DI RICERCA E BORSE DI STUDIO FINANZIATI DALLA FISM 2013

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CLASSIFICAZIONEE DIAGNOSI DELLA MALATTIA

Christian CordanoMS Center, University of California, San Francisco (UCSF )San Francisco, CA, USATomografia a coerenza ottica ad altissima risoluzionenell’encefalomielite autoimmune sperimentale -un modello per la comprensione del ruolo clinicodell’OCT nella SMBorsa di addestramento € 65.000 - 2 anni

Maria PetraccaEstelle and Daniel Maggin Department of Neurology,Mount Sinai School of Medicine, New York, NY, USADeterminazione delle concentrazioni intra edextracellullari di sodio a livello encefalico in pazienti affettida SM mediante l’impiego di RM a 7.0 TeslaBorsa di ricerca € 80.000 - 2 anni

Dario SeppiDipartimento di Biologia cellulare e Neuroscienze,Istituto Superiore di Sanità, RomaTecniche avanzate di analisi molecolare volteall’identificazione di biomarker predittori di progressionedi malattia nella sclerosi multiplaBorsa di addestramento € 41.000 - 2 anni


Maria Pia AbbracchioDipartimento di Scienze Farmacologiche e Biomolecolari,Università degli Studi di Milano, MilanoStrategie rimielinizzanti innovative per la sclerosi multipla:focus su GPR17, nuovo recettore coinvolto neldifferenziamento oligodendrocitarioProgetto di ricerca € 170.000 - 2 anni

Luca BattistiniUnità di Neuroimmunologia, Fondazione Santa Lucia, RomaRuolo delle cellule MAIT nella sclerosi multipla: come laflora intestinale influenza le risposte autoimmuniProgetto di ricerca € 110.000 - 2 anni

Bruno BonettiDipartimento di Neuroscienze, Università di Verona, OspedalePoliclinico, VeronaEsosomi da cellule staminali mesenchimali adipose: uninnovativo approccio terapeutico nell’encefalomieliteautoimmune sperimentaleProgetto di ricerca € 120.000 - 2 anni

Erica ButtiDivisione di Neuroscienze, Fondazione Centro San Raffaele,MilanoRuolo diretto e indiretto dei precursori endogeni neuralinella demielinizzazione e rimielinizzazione dopo dannoindotto da cuprizoneProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Giacomo CasellaUnità di Neuroimmunologia, INSPE, Divisione diNeuroscienze, Istituto Scientifico San Raffaele, MilanoMicrovescicole microgliali come vettore terapeutico inneuroinfiammazioneBorsa di addestramento € 40.000 - 2 anni

Emanuela ColomboIstituto di Neurologia Sperimentale (INSPE), IstitutoScientifico San Raffaele, MilanoAstrociti per la terapia cellulare della sclerosi multiplaBorsa di ricerca € 52.000 - 2 anni

Massimiliano Di FilippoClinica Neurologica, Università degli Studi di Perugia,Ospedale S. Maria della Misericordia, PerugiaInibizione mitocondriale ed encefalomielite autoimmunesperimentale: possibili strategie neuroprotettiveProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Federica Eva EspositoDipartimento di Neurologia e Istituto di NeurologiaSperimentale (INSPE), Fondazione Centro San Raffaele,MilanoUn modello predittivo di risposta a fingolimod:integrazione di clinica, neuroradiologia e geneticaProgetto di ricerca € 175.000 - 2 anni

Giovanni Luigi MancardiDipartimento di Neuroscienze, Riabilitazione, Oftalmologia,Genetica e Scienze Materno-Infantili,Università degli Studi di Genova, GenovaIntensa immunosoppressione seguita da trapiantoautologo di cellule staminali ematopoietiche emesenchimali nella encefalite autoimmune sperimentale ein forme gravi di sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 150.000 - 3 anni

Carla TaveggiaDivisione di Neuroscienze e INSPE,Fondazione Centro San Raffaele, MilanoModulazione dell’attività enzimatica di TACE nellamielinizzazione e nella rimielinizzazione del SNCProgetto di ricerca € 115.000 - 2 anni

BANDO DI RICERCA FISM

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NEURORIABILITAZIONEE NEUROPLASTICITÀ

Maura CasadioDipartimento di Infomatica Bioingegneria Robotica eIngegneria dei Sistemi (DIBRIS), Università degli Studi diGenova, GenovaInterfacce corpo-macchina basate sulle sinergie muscolariper riabilitazione neuromotoria personalizzata di personeaffette da sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Valerio ChiurchiùUnità di Neuroimmunologia, IRCCS Fondazione Santa Lucia,RomaPlasticità e polarizzazione dei macrofagi nella sclerosimultipla: in ‘ex vivo’ veritasProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Ugo Della CroceDipartimento POLCOMING, Università degli Studi di Sassari,SassariUn intervento riabilitativo basato sull’uso di realtà virtualee treadmill per migliorare il cammino in individui affetti dasclerosi multiplaProgetto di ricerca € 85.000 - 2 anni

Franca DeriuDipartimento di Scienze Biomediche, Università degli Studi diSassari, SassariValutazione neurofisiologica, dinamometrica e clinica deglieffetti del Cross-Training in pazienti con sclerosi multipla:uno studio pilotaProgetto di ricerca € 29.000 - 1 anno

Luca OstacoliDipartimento di Scienze Cliniche e Biologiche,Università degli Studi di Torino, Orbassano (TO)L’efficacia di un intervento Mindfulness-based peri sintomi depressivi e la qualità della vita nei pazienti consclerosi multipla e i loro caregivers. Uno studio clinicorandomizzato controllatoProgetto di ricerca € 60.000 - 3 anni

Nicola SmaniaDipartimento di Scienze Neurologiche, Neuropsicologiche,Morfologiche e Motorie, Università di Verona, AziendaOspedaliera Universitaria Integrata Verona, VeronaEffetti di un trattamento intensivo robot assistito sulrecupero funzionale della mano e sull’autonomia nelle ADLin persone con sclerosi multipla: studio randomizzatocontrollato in singolo ciecoProgetto di ricerca € 75.000 - 2 anni

Eleonora TavazziUnità di Neuroriabilitazione, Centro Sclerosi Multipla, IstitutoIRCCS Santa Maria Nascente, Fondazione Don Gnocchi,MilanoEffetti della riabilitazione neuromotoria sulla plasticitàcerebrale nella sclerosi multipla: studio di RM strutturale efunzionale randomizzato-controllato in doppio ciecoProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

QUALITÀ DELLA VITA

Enrico MolinariDipartimento di Psicologia, Università Cattolica del SacroCuore, MilanoMigliorare la qualità di vita di persone con sclerosimultipla e dei loro familiari tramite un interventodi Mindfulness e TelemedicinaProgetto di ricerca € 117.075 - 2 anni

Rosalba RosatoDipartimento di Psicologia, Università degli Studi di Torino,TorinoSviluppo e validazione preliminare della versioneabbreviata e computerizzata dell’MSQOL-54Progetto di ricerca € 110.000 - 2 anni

PROGETTI SPECIALI 2013

CLASSIFICAZIONE E DIAGNOSI DELLA MALATTIAAntonio BertolottoNeurologia 2, CRESM, AOU San Luigi, Orbassano (TO)Biomarcatori di diagnosi e prognosi nella sclerosi multipla:possibile ruolo delle isoforme della Vitamina D BindingProteinProgetto speciale € 80.000 - 1 anno

CLASSIFICAZIONE E DIAGNOSI DELLA MALATTIAMassimo FilippiNeuroimaging Research Unit, Università Vita-Salute SanRaffaele, MilanoNetwork Italiano di Neuroimaging (INNI)per l’ottimizzazione dell’utilizzo di tecniche avanzatedi Risonanza Magnetica in pazienti con SMProgetto speciale € 450.000 - 2 anni

VERSO NUOVI TRATTAMENTIMaria Pia Abbracchio, Ivano EberiniDipartimento di Scienze Farmacologiche, Laboratorio diFamacologia Cellulare e Molecolare della TrasmissionePurinergica, Università degli Studi di Milano, MilanoSviluppo di un brevetto di nuovi modulatori di GPR17,un recettore chiave nei processi di rimielinizzazioneProgetto speciale € 100.000 - 1 anno

COMPENDIO 2014

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Francesca BOSCIAUniversità di Napoli “Federico II”, Facoltà di Medicina,Dipartimento di Neuroscienze, NapoliStudio del ruolo dell’isoforma dello scambiatoreNa+/Ca+2 NCX3 nelle cellule oligodendrocitiche perindividuare nuove strategie terapeutiche per il controllodella demielinizzazione e rimielinizzazione nella sclerosimultiplaProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Roberta BRAMBILLAUniversity of Miami, Miller School of Medicine, The MiamiProject To Cure Paralysis, Deptartment of NeurologicalSurgery Miami, Florida, USAL’effetto di rimielinizzazione del Tumor Necrosis Factor dimembrana: studio specifico del ruolo del Tumor NecrosisFactor Receptor 2Progetto di ricerca € 236.000 - 3 anni

Marika Maria Caterina FALCONEOspedale San Raffaele, Divisione di Immunologia, Trapianti eMalattie Infettive, MilanoRuolo dei meccanismi immunoregolatori intestinali nellapatogenesi della sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Cinthia FARINAOspedale San Raffaele, Dipartimento di Neuroscienze,MilanoUn ruolo per gli astrociti nell’infiammazione edemielinizzazione del sistema nervoso centraleProgetto di ricerca € 155.000 - 2 anni

Giuseppe MATARESEFacoltà di Medicina, Università degli Studi di Salerno,Dipartimento di Medicina e Chirurgia Baronissi, SalernoParadossi nella biologia delle cellule T regolatorie: la basemolecolare per uno “switch” metabolico oscillatoriomTOR-dipendente nel controllo della tolleranzaimmunologica nella sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 300.000 - 3 anni

Claudia CANTONIWashington University School of Medicine Neurology St.Louis, Missouri, USARuolo di miR-223 nella sclerosi multipla e nel suo modelloanimaleBorsa di ricerca € 85.000 - 2 anni

Diego FRESEGNACentro Europeo di Ricerca sul Cervello (CERC), FondazioneSanta Lucia, RomaIl potenziale coinvolgimendo dell’interleuchina-1beta nellealterazioni dell’umore in un modello animale di sclerosimultiplaBorsa di addestramento € 41.500 - 2 anni

Fabrizia Claudia GUARNIERIOspedale San Raffaele, Divisione di Neuroscienze, MilanoEffetti modulatori di citochine pro- e anti-infiammatoriesulle vie di trasduzione e sulla composizione molecolaredelle terminazioni nervoseBorsa di addestramento € 38.000 - 2 anni

Liliana Elisa LUCCACentre de Physiopathologie de Toulouse-Purpan, InsermUMR 1043, Toulouse, FranceLinfociti T che co-riconoscono antigeni mielinici eneuronali: tolleranza immunologica e contributo relativoall’autoimmunità del sistema nervoso centraleBorsa di addestramento € 56.000 - 2 anni

Claudia MINICIOspedale San Raffaele, DIBIT, Divisione di Immunologia,Trapianti e Malattie Infettive, MilanoCaratterizzazione strutturale e biochimica dellapeptidil-arginina deiminasi 2, una proteina coinvoltanella destabilizzazione della guaina mielinica nellasclerosi multiplaBorsa di ricerca € 53.100 - 2 anni

Linda OTTOBONIOspedale San Raffaele, Istituto di Neurologia SperimentaleINSpe, Laboratorio di Neuroimmunologia, MilanoApproccio traslazionale per studiare il ruolo del geneZFP36L1 nella sclerosi multipla: nesso tra stomaco ecervelloBorsa di ricerca senior € 72.000 - 2 anni

Simone PATERGNANIUniversità di Ferrara, Dipartimento di medicina sperimentalee diagnosica - Sezione di patologia generale, FerraraAnalisi della funzionalità e dell’energetica mitocondrialecome caratteristiche principali del differenziamentooligodendrocitarioBorsa di ricerca € 50.000 - 2 anni


CLASSIFICAZIONE E DIAGNOSIDELLA MALATTIA

Andrea COSSARIZZAUniversità di Modena e Reggio Emilia, Dipartimento diScienze Biomediche, ModenaFenotipo e polifunzionalità delle cellule iNKT periferichecome marcatore immunologico delle diverse forme disclerosi multipla e dopo diverse terapieimmunomodulatorieProgetto di ricerca € 172.000 - 2 anni

Maria DI IOIAUniversità “G. d’Annunzio” di Chieti-Pescara, Dipartimento diScienze Biomediche, Ce.SI, CHIETISviluppo di metodi di estrazione dei lipidi liquorali edapplicazione di tecniche di spettrometria di massa per lacaratterizzazione del profilo lipidico e dei livelli dineurosteroidi nei pazienti SMBorsa di addestramento € 40.000 - 2 anni

Massimo FILIPPIUniversità Vita-Salute San Raffaele, Ospedale San Raffaele,Divisione di Neuroscienze, Istituto di NeurologiaSperimentale, Unità di Neuroimaging Quantitativo, MilanoMappatura regionale della struttura e delle funzionidell’ippocampo nella sclerosi multipla: correlazioni con leforme cliniche della malattia e con il deficit cognitivoProgetto di ricerca € 97.500 - 1 anno

Costanza GIANNÌMassachussets General Hospital (MGH), Harvard MedicalSchool (HMS), Boston, Massachussets, USATecniche multimodali di neuro-immagini per lo studiodella patologia corticale nella sclerosi multiplaBorsa di addestramento € 56.000 - 2 anni

Claudia VERDERIOIstituto CNR di Neuroscienze, Dipartimento di FarmacologiaMedica, MilanoPotenziale patogenico e diagnostico delle microvescicolerilasciate dalla microglia nella sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 170.000 - 3 anni


Sabina LUCHETTINetherlands Institute for Neuroscience (NIN), Department ofNeuroimmunology, Amsterdam, The NetherlandsNeurosteroidi come agenti neuroprotettivi,pro-mielinizzanti e anti-infiammatori nella sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 140.000 - 3 anni

Serena MARTIREIstituto di Neuroscienze della Fondazione CavalieriOttolenghi, Unità di Neurobiologia Clinica, Orbassano, TorinoLa deregolazione di microRNAs e dei loro mRNAsbersaglio causa un difetto nel circuito di retroazionenegativa che sopprime l’infiammazione in pazienti consclerosi multiplaBorsa di addestramento € 22.000 - 1 anno

Miriam MATTOSCIOImperial College London, Division of Brain Sciences, Centrefor Neuroscience, London, UKRilevanza clinica del diverso effetto della terapia conanticorpo monoclonale anti alfa-4 integrina sullamobilizzazione di cellule staminali ematopoietiche inpazienti affetti da sclerosi multiplaBorsa di ricerca € 78.000 - 2 anni

Rosetta PEDOTTIFondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta,Unità di Neuroimmunologia e Patologia Muscolare, MilanoLe prokineticine nelle malattie demielinizzanti autoimmunidel sistema nervoso centrale: possibili nuovi target diterapia per la sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 87.000 - 2 anni


Letizia LEOCANIOspedale San Raffaele, Dipartimento Neurologico, MilanoEffetto della stimolazione magnetica ripetitiva sulladeambulazione nella SM: studio di fase III controllato,randomizzato, in doppio ciecoProgetto di ricerca € 178.000 - 2 anni

Patrizia PANTANOSapienza Università di Roma, Dipartimento di Neurologia ePsichiatria, RomaPlasticità strutturale in pazienti con SM e atassia:variazioni longitudinali della microarchitettura dellasostanza bianca associate con il training propriocettivoProgetto di ricerca € 50.000 - 2 anni

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COMPENDIO 2014

Maria Assunta ROCCAOspedale San Raffaele, Neuroimaging Research Unit Instituteof Experimental Neurology, MilanoEffetti della action observation therapy sulla riabilitazionedei deficit motori dell’arto superiore destro dominante neipazienti con SM: uno studio esplorativo con RM strutturalee funzionaleProgetto di ricerca € 183.200 - 2 anni

Domenico Antonio RESTIVOUnità Operativa di Neurologia, Dipartimento di Medicina,Ospedale Garibaldi, CataniaValutazione dell’efficacia della stimolazione transcranica acorrente diretta (tDCS) nella disfagia associata a sclerosimultiplaProgetto di ricerca € 35.000 - 1 anno

Giorgio SANDRINIIRCCS Istituto Neurologico Nazionale C. Mondino e Universitàdegli Studi di Pavia, Dipartimento di Sanità Pubblica,Neuroscienze, Medicina Sperimentale e Forense, PaviaEffetto della stimolazione spinale a corrente continuasul dolore nella sclerosi multipla: valutazione clinica,neurofisiologica e dell’attività del sistemaendocannabinoideProgetto di ricerca € 54.000 - 2 anni

QUALITÀ DELLA VITA

Eleonora COCCOUniversità di Cagliari, Dipartimento di Sanità Pubblica,Medicina Clinica e Molecolare, Centro Sclerosi Multipla,Ospedale Binaghi, CagliariGeoepidemiologia della sclerosi multipla: i fattoriambientaliProgetto di ricerca € 220.000 - 3 anni

Roberto D’AMICOUniversità di Modena e Reggio Emilia, Dipartimento diOncologia, Ematologia e Patologie dell’Apparato Respiratorio,Unità di Statistica Medica, ModenaMigliorare la sintesi dei risultati della ricerca suitrattamenti nella sclerosi multipla per il loro utilizzo nellapratica clinica e per influenzare l’agenda della ricerca futuraProgetto di ricerca € 200.000 - 3 anni


PATOGENESI E FATTORI DI RISCHIOGiancarlo COMI, Gianluigi MANCARDIon behalf of CoSMo Collaborative StudyGroupEstensione “Studio di prevalenza della CCSVI nella sclerosimultipla e in altre malattie neurodegenerative (CoSMo)”Progetto speciale € 100.000 - 1 anno

VERSO NUOVI TRATTAMENTIAntonio UCCELLICBA, Laboratorio di Neuroimmunobiologia, GenovaStudio immunologico ancillare al protocollo: cellulestaminali mesenchimali per la terapia della sclerosimultipla-Progetto MESEMProgetto speciale € 170.000 - 2 anni

NEURORIABILITAZIONE E NEUROPLASTICITÀGiampaolo BRICHETTOFondazione Italiana Sclerosi Multipla, GenovaMultiple sclerosis rehabilitation outcomesProgetto speciale € 380.000 - 2 anni

NEURORIABILITAZIONE E NEUROPLASTICITÀMaria Laura LOPES DE CARVALHOAssociazione Italiana Sclerosi Multipla, GenovaBalance disorders in multiple sclerosisProgetto speciale € 320.000 - 2 anni

QUALITÀ DELLA VITAAlessandra SOLARIFondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta,Unità di Neuroepidemiologia, MilanoHome-based palliative care for people with severemultiple sclerosis: developmental phase of the PalliativeNetwork for Severely Affected Adults with MS in Italy(PeNSAMI) studyProgetto speciale € 60.000 - 1 anno

QUALITÀ DELLA VITAMichela PONZIOFondazione Italiana Sclerosi Multipla, GenovaFamiglia e persona di fronte alla disabilità: il caso dellasclerosi multipla (analisi stakeholder)Progetto speciale € 114.000 - 1 anno

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Cristina AGRESTIIstituto Superiore di Sanità, Dipartimento di Biologia Cellularee Neuroscienze, RomaStudio del ruolo dei recettori del TNF durante i processi didemielinizzazione e rimielinizzazioneProgetto di ricerca € 117.600 - 2 anni

Francesca ALOISIIstituto Superiore di Sanità, Dipartimento di Biologia Cellularee Neuroscienze, RomaAnalisi dell’infezione con virus di Esptein-Barr edella risposta immunitaria nel fluido cerebrospinale enel sangue di pazienti con sclerosi multipla mediantetecniche altamente sensibili di PCRProgetto di ricerca € 97.000 - 1 anno

Vincenzo BARNABASapienza Università di Roma, Dipartimento di MedicinaInterna e Specialità Mediche, RomaImmuno-attivazione cronica nella sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 100.000 - 1 anno

Paola CAIAFASapienza Università di Roma, Facoltà di Farmacia e Medicina,Dipartimento di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia, RomaRiprogrammazione epigenetica nella sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 40.000 - 1 anno

Paolo CALABRESIUniversità di Perugia, Clinica Neurologica, Laboratori diNeurologia Sperimentale, Dipartimento Specialità Medico-Chirurgiche e Sanità Pubblica, Ospedale S Maria dellaMisericordia, PerugiaUno studio elettrofisiologico dei meccanismidi alterata plasticità sinaptica in modelli sperimentalidi sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 35.000 - 1 anno

Annalisa CHIOCCHETTIIRCAD & Università del Piemonte Orientale,Dipartimento Scienze Mediche, NovaraRuolo di Osteopontina e degli anticorpi anti-Osteopontinanella sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 70.000 - 2 anni

Sandra D’ALFONSOUniversità degli Studi del Piemonte Orientale “AmedeoAvogadro”, Dipartimento di Scienze Mediche, NovaraMappatura fine dei loci di suscettibilità alla SM nella

popolazione dell’Italia continentale: dai marcatori geneticiidentificati attraverso studi di associazione genome-widealla varianti causaliProgetto di ricerca € 150.000 - 2 anni

Dario DI LUCAUniversità degli Studi di Ferrara, Sezione di Microbiologia,Dipartimento di Medicina Diagnostica e Sperimentale,FerraraStudio delle alterazioni nelle risposte antiviralidell’immunità innata in pazienti con SMProgetto di ricerca € 100.000 - 1 anno

Bruno GRANUniversity of Nottingham, Division of Clinical Neurology,Nottingham (UK)Modulazione dell’equilibrio tra cellule T regolatricie T helper 17 da parte di recettori Toll-like: implicazioniper la sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 28.000 - 1 anno

Roberta MAGLIOZZIIstituto Superiore di Sanità, Biologia Cellulare eNeuroscienze, RomaStudio neuropatologico e molecolare mirato acomprendere la relazione tra processo infiammatorio nellemeningi e danno cerebrale corticale nella sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 69.300 - 2 anni

Mara MARONGIUCNR - Consiglio Nazionale delle Ricerche,IRGB - Istituto di Ricerca Genetica e Biomedica, CittadellaUniversitaria Monserrato, Monserrato (CA)Studio del meccanismo funzionale alla basedell’associazione di CBLB con la scerosi multiplaProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Stefano MORARAConsiglio Nazionale delle Ricerche, Istituto di Neuroscienze,MilanoRuolo protettivo di Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP)nella patogenesi dell’EAEProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Francesco NOVELLIUniversità di Torino, Dipartimento Medicina e OncologiaSperimentale, Centro Ricerche Medicina Sperimentale,AOU San Giovanni Battista, TorinoRegolazione interferone-dipendente dei linfociti Th17 eTh22 nella sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 40.000 - 1 anno


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COMPENDIO 2014

Stefano PREVITALIFondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, INSPE,Divisione di Neuroscienze, MilanoRuolo di COP5/Jab1 nella mielinizzazione e nellarimielinizzazione del sistema nervoso centrale (SCN)Progetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Marco SALVETTISapienza Università di Roma, Neurologia e CentroNeurologico Terapie Sperimentali, Dipartimentodi Neuroscienze, Salute Mentale e Organi di Senso, RomaCaratterizzazione dei genoptipi del virus di Epstein-Barrnella sclerosi multipla attraverso approcci disequenziamento massivoProgetto di ricerca € 150.000 - 2 anni

Antonio UCCELLIUniversità di Genova, Dipartimento di Neuroscienze,Oftalmologia e Genetica, GenovaStudio di un modello murino transgenico per lacaratterizzazione del proteoglicano NG2/CSPG4 nellapatogenesi della sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Flavia VALTORTAFondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor,Divisione di Neuroscienze, Laboratoriodi Neuropsicofarmacologia Sperimentale, MilanoRuolo delle citochine pro- e anti-infiammatorie nellamodulazione dell’attività e della composizionepresinaptica: nuove prospettive nella ricerca sulla sclerosimultiplaProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Laura BERGAMASCHIDuke University - Medical Center, Center for HumanGenetics, Durham, NCAnalisi molecolare dell’espressione allele specifica diIL-7Ralpha e il suo effetto sul segnale mediato da IL-7in cellule: mDC, CD4+ e CD8+ isolate da pazienticon sclerosi multipla e controlli saniBorsa di ricerca € 37.000 - 1 anno

Giuseppe CHIAPPETTAIstituto Superiore di Sanità, Reparto di “Malattieinfiammatorie e demielinizzanti del sistema nervoso”,Dipartimento di “Biologia Cellulare e Neuroscienze”, RomaRicerca di interazioni patogeneticamente rilevantitra EBV e il retrovirus endogeno della famiglia W MSRVnel cervello con sclerosi multiplaBorsa di addestramento € 22.000 - 1 anno

Manolo SAMBUCCIIstituto di ricovero e cura a carattere scientificoFondazione Santa Lucia, Unità di Neuroimmunologia, RomaRuolo svolto dall’immunosenescenza nell’insorgenza enella progressione della sclerosi multiplaBorsa di ricerca senior € 64.000 - 2 anni

Anna FALCOFondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor,Istituto Scientifico, Divisione di Neuroscienze, MilanoRegolazione degli interneuroni cerebrali e spinali da partedelle GTPasi RacBorsa di addestramento € 37.000 - 2 anni

Silvia MUSIOIRCCS Istituto Neurologico C.Besta, Immunologia e PatologiaMuscolare, MilanoIl ruolo dei basofili nella encefalite autoimmunesperimentale, un modello animale di sclerosi multiplaBorsa di ricerca € 52.000 - 2 anni

Jonathan VINETDepartment of Neuroscience, section Medical Physiology,University Medical Center Groningen, Groningen, TheNetherlandsCaratterizzazione di un fenotipo microgliale favorevolealla rimielinizzazioneBorsa di ricerca € 55.000 - 2 anni

CLASSIFICAZIONE E DIAGNOSIDELLA MALATTIA

Andrea COSSARIZZAUniversità di Modena e Reggio Emilia, Dipartimento diScienze Biomediche, Sezione di Patologia Generale, ModenaPolifunzionalità delle cellule iNKT periferiche comemarcatore immunologico delle differenti forme di sclerosimultiplaProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Massimo FILIPPIFondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor,Neuroimaging Research Unit, INSPE, Divisione di Neuroscienze, MilanoDefinizione della rete di connettività strutturale efunzionale nella sclerosi multipla tramite l’applicazionedell’approccio “graph theory”Progetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Pasquina MARZOLAUniversità di Verona, Dipartimento di Informatica, VeronaImaging funzionale nello studio della plasticità neuronalein un modello sperimentale di sclerosi multipla su rattoProgetto di ricerca € 50.000 - 1 anno

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Franca DERIUUniversità di Sassari, Dipartimento di Scienze Biomediche,Lab di Fisiologia e Bioingegneria dell’Uomo, SassariStudio neurofisiologico, neuroradiologico e clinicodel tronco encefalico in pazienti con sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Morena MARTUCCICharitè Medical University, Institute of Biochemistry,Berlin (Germany)Identificazione di marcatori infiammatori e dei relativimeccanismi specific per la sclerosi multiplaBorsa di addestramento € 58.000 - 2 anni


Pasquale ANNUNZIATAUniversità degli Studi di Siena, Dipartimento di ScienzeNeurologiche, Neurochirurgiche e del Comportameno, SienaStudio degli effetti immunomodulatori di un nuovocannabinoide agonista selettivo per il recettore CB2su cellule immunocompetenti nella sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 40.000 - 1 anno

Luca BATTISTINIFondazione Santa Lucia, Neuroscienze Sperimentali, RomaRuolo delle cellule MAIT nella sclerosi multipla: comela flora intestinale influenza le risposte autoimmuniProgetto di ricerca € 50.000 - 1 anno

Francesco CUCCAIRGB “Istituto di Ricerca Genetica e Biomedica”(IRGB) of CNR, Dipartimento di Biomedicina del CNRIRGB,Cittadella Universitaria di Monserrato, Monserrato (CA)Approccio razionale per la ricerca di composti per la curadella sclerosi multipla basato sull’analisi dei targetbiologici individuati dagli studi di associazione sull’interogenoma in SardegnaProgetto di ricerca € 100.000 - 1 anno

Roberta DE SIMONEDipartimento di Biologia Cellulare e Neuroscienze, IstitutoSuperiore di Sanità, RomaI mitocondri come bersagli e mediatori degli effettibenefici degli agonisti PPARg nella sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 61.000 - 2 anni

Massimo DEGANOFondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Divisionedi Immunologia, Trapianti e Malattie Infettive, MilanoComprendere il meccanismo ed aumentare l’efficacia delcomposto FTY720 (Fingolimod) nella terapia della sclerosimultipla tramite un approccio di biologia strutturaleProgetto di ricerca € 70.000 - 1 anno

Rosetta PEDOTTINeurological Institute Foundation IRCCS Carlo Besta,Neuroimmunology and Muscolar Pathology Unit, MilanoIl sistema delle prokineticine nelle malattie demielinizzantiautoimmuni del sistema nervoso centrale: meccanismipatogenetici e possibili nuovi bersagli di terapia perla sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Paola TIRASSAConsiglio Nazionale delle Ricerche, Istituto Biologia Cellulare& Neurobiologia, RomaIl nerve growth Factor dato in forma di collirioin un modello animale di sclerosi multipla: uno studioprospettico sul trattamento durante le fasi precocidella malattiaProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Loretta TUOSTOSapienza Università di Roma, Dipartimento di Biologia eBiotecnologie Charles Darwin, RomaCaratterizzazione delle vie di segnalazione del CD28 comebersagli terapeutici nella regolazione della tolleranzaimmunologica nella sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 100.000 - 2 anni


Laura BONZANOUniversità degli Studi di Genova, DINOG - Dipartimentodi Neuroscienze, Oftalmologia e Genetica, GenovaPerformance motoria della mano come nuovo endpointclinico quantitativo nella SM: valutazione longitudinalesu pazienti CIS e correlazione con accumulo di disabilità eintegrità tissutale alla RMProgetto di ricerca € 50.400 - 1 anno

Marco BOVEUniversità degli Studi di Genova, Dipartimento di MedicinaSperimentale, Sezione di Fisiologia Umana, GenovaL’impatto della riabilitazione motoria e cognitivasulle proprietà dinamiche della struttura cerebrale:verso la personalizzazione di interventi terapeuticiin pazienti affetti da sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 146.000 - 2 anni

Flavia MATTIOLIOspedali Civili di Brescia, UO Riabilitazione Specialistica,BresciaL’efficacia della stimolazione tramite tDCS (transcranialDirect Current Stimulation) nella riabilitazione cognitivadella sclerosi multipla: studio clinico controllatoProgetto di ricerca € 50.000 - 1 anno

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COMPENDIO 2014

Letizia LEOCANIIRCCS university Hospital San Raffaele, Neurological Dep.t;INSPE-Experimental Neurophysiology, MilanoStimolazione cerebrale transcranica a corrente direttacome terapia immunomodulante nella SM: studio pilotain modelli muriniProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Franca TECCHIOConsiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), ISTC, LET’S,Dip. di Neuroscienze, Ospedale Fatebenefratelli, RomaAlleviare la Fatica nella sclerosi multipla mediantestimolazione transcranica in corrente continua (tDCS):è possibile differenziare target di stimolazione entrole cortecce primarie sensorimotorie?Progetto di ricerca € 24.000 - 1 anno

Valentina TOMASSINIUniversity of Oxford, Nuffield Department of ClinicalNeurosciences, (FMRIB Centre and Clinical Neurology),FMRIB Centre, John Radcliffe Hospital, Headington, Oxford,Cardiff (UK)Valutazione delle capacità di immaginazione motoria edegli effetti della pratica mentale di un compito motorioin pazienti affetti da sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Carlo TROMPETTOIstituto di Neurologia, Dipartimento di Neuroscienze,Oftalmologia e Genetica, Università di Genova, GenovaEffetto delle onde d’urto sulla rigidità della cavigliain pazienti con sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 41.300 - 2 anni

QUALITÀ DELLA VITA

Marta BASSIUniversità degli Studi di Milano, Dipartimento di ScienzeCliniche, MilanoIl sistema della cura: promozione del benessere trapersone con sclerosi multipla, caregiver ed operatorisanitariProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno


VERSO NUOVI TRATTAMENTICarla TAVEGGIAIstituto di Neurologia Sperimentale, Ospedale San Raffaele,MilanoLaboratorio Interazioni Axo-GlialiProgetto speciale € 240.000 - 3 anni

NEURORIABILITAZIONE E NEUROPLASTICITÀDiego CENTONZEUniversità Tor Vergata, Dipartimento di Neuroscienze,Facoltà di Medicina e Chirurgia, RomaTrattamento sintomatico per persone con SM medianteprocedure di neurostimolazione centrale e perifericaProgetto speciale € 401.100 - 3 anni

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COMITATO SCIENTIFICOFISM 2013

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COMITATO SCIENTIFICO FISM 2013

BIOMEDICAL RESEARCH FISM SCIENTIFIC COMMITTEE

Antonio BertolottoAOU S. Luigi Gonzaga, Centro di riferimento Regionale Sclerosi Multipla (CReSM) – Orbassano (TO)

Luca BattistiniIRCCS S. Lucia Neuroimmunology Unit European Centre for Brain Research – ROMA

Diego CentonzeFondazione Santa Lucia IRCCS e Università di Tor Vergata, Clinica Neurologica, Dipartimento di Neuroscienze – ROMA

Gabriela ConstantinDipartimento di Patologia e Diagnostica, Università degli Studi di Verona – VERONA

Francesco CuccaDipartimento di Scienze Biomediche, Università degli Studi di Sassari – SASSARI

Roberto FurlanUnità di Neuroimmunologia Clinica, Ospedale San Raffaele, DIBIT – MILANO

Peter GoodfellowVisiting Professor in Biosciences at the University of Kent, UK

Matilde IngleseMount Sinai School of Medicine – NEW YORK, USA

Paolo MuraroDivision of Experimental Medicine, Centre for Neuroscience, Imperial College London – LONDON, UK

Lawrence WrabetzHunter James Kelly Research Institute (HJKRI), University at Buffalo – Buffalo NY, USA

Stefano PluchinoDept of Clinical Neurosciences, Centre for Brain Repair and Wellcome Trust-MRC Cambridge Stem Cell Institute,University of Cambridge – CAMBRIDGE, UK

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COMPENDIO 2014

DIRETTORE RICERCA SCIENTIFICA

Paola ZaratinAssociazione Italiana Sclerosi Multipla - Fondazione Italiana Sclerosi Multipla – GENOVA

SOCIAL & BEHAVIOURAL SCIENCE RESEARCH FISMSCIENTIFIC COMMITTEE

Franco FranchignoniFondazione Salvatore Maugeri, Istituto Scientifico di Riabilitazione – VERUNO (NO)

Olga CiccarelliDepartment Brain Repair and Rehabilitation, University College London, Institute of Neurology – LONDON, UK

Monica FalautanoDipartimento di Neurologia, Servizio di Psicologia, Ospedale San Raffaele – MILANO

Peter FeysREVAL Rehabilitation Research Center. BIOMED. University of Hasselt – DIEPENBEEK, Belgium

Maura PugliattiFacoltà di Medicina e Chirurgia, Università degli Studi di Sassari, Clinica Neurologica – SASSARI

Marco RovarisFondazione Don Gnocchi, Unità Sclerosi Multipla, IRCCS Santa Maria Nascente – MILANO

Alessandra SolariUnità di Neuroepidemiologia, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta – MILANO

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COMPENDIO 2014

BIOMEDICAL RESEARCH FISM SCIENTIFIC COMMITTEE

Antonio BertolottoAOU S. Luigi Gonzaga, Centro di riferimento Regionale Sclerosi Multipla (CReSM) – Orbassano (TO)





Roberto FurlanUnità di Neuroimmunologia Clinica, Ospedale San Raffaele, DIBIT – MILANO

Peter GoodfellowVisiting Professor in Biosciences at the University of Kent, UK



Lawrence WrabetzHunter James Kelly Research Institute (HJKRI), University at Buffalo – Buffalo NY, USA

Stefano PluchinoDept of Clinical Neurosciences, Centre for Brain Repair and Wellcome Trust-MRC Cambridge Stem Cell Institute,University of Cambridge – CAMBRIDGE, UK

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DIRETTORE RICERCA SCIENTIFICA

Paola ZaratinAssociazione Italiana Sclerosi Multipla - Fondazione Italiana Sclerosi Multipla – GENOVA

SOCIAL & BEHAVIOURAL SCIENCE RESEARCH FISMSCIENTIFIC COMMITTEE

Olga CiccarelliDepartment Brain Repair and Rehabilitation, University College London, Institute of Neurology – LONDON, UK

Monica FalautanoDipartimento di Neurologia, Servizio di Psicologia, Ospedale San Raffaele – MILANO

Peter FeysDepartment of Physical Medicine and Rehabilitation, AZ Sint-Blasius – DENDERMONDE, BELGIUM

Franco FranchignoniFondazione Salvatore Maugeri, Istituto Scientifico di Riabilitazione – Veruno, NOVARA

Maura PugliattiFacoltà di Medicina e Chirurgia, Università degli Studi di Sassari, Clinica Neurologica – SASSARI

Marco RovarisFondazione Don Gnocchi, Unità Sclerosi Multipla, IRCCS Santa Maria Nascente – MILANO

Jean-Louis ThonnardUniversite catholique de Louvain, Institute of NeuroScience (IoNS) – BRUXELLES, BELGIQUE

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Francesca BagnatoDepartment of Radiology and Radiological Sciences, Institute of Imaging Science; Vanderbilt University – Nashville, USA


Antonio BertolottoASO S. Luigi Gonzaga, Centro di riferimento Regionale Sclerosi Multipla (CReSM) – Orbassano, TORINO




Umberto DianzaniDipartimento di Scienze Mediche, I.R.C.A.D., Università del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro – NOVARA

Roberto FurlanUnità di Neuroimmunologia Clinica, IRCCS Ospedale San Raffaele, DIBIT – MILANO

Maria Grazia GrassoIRCCS Fondazione Santa Lucia – ROMA

Gianvito MartinoUnità di Neuroimmunologia, IRCCS Ospedale San Raffaele, DIBIT – MILANO



Vito PistoiaLaboratorio di Oncologia, I.R.C.C.S. G. Gaslini – GENOVA

Paolo RiccioDipartimento di Biologia, Difesa e Biotecnologie Agro-Forestali, Università della Basilicata – POTENZA

Marco SalvettiSapienza Università di Roma, Neurologia e Centro Neurologico Terapie Sperimentali (CENTERS) – ROMA

Jean-Louis ThonnardUniversité catholique de Louvain, Institute of NeuroScience (IoNS) – BRUXELLES, BELGIQUE

Bernard ZalcBâtiment ICM, Centre de Recherche de l’Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, Hôpital de la Salpêtrière –PARIS, FRANCE

Alessandra SolariUnità di Neuroepidemiologia, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta – MILANO

CHAIRMAN COMITATO SCIENTIFICO FISM

Giulio LeviIstituto Superiore di Sanita, Laboratorio Fisiopatologia di Organo e Sistema - ROMA

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COMPENDIO 2014

Abbracchio Maria Pia 85

Aloisi Francesca 49

Annunziata Pasquale 92

Avolio Carlo 102

Baldari Cosima 26

Barnaba Vincenzo 60

Basaglia Nino 123

Bassi Marta 127

Battistini Luca 72

Bononi Angela 36

Caiafa Paola 23

Calabresi Paolo 111

Casazza Simona 79

Chiappetta Giuseppe 52

Cossarizza Andrea 62

De Stefano Nicola 65

Deriu Franca 68

Disanto Giulio 14

Dolei Antonina 56

Filippini Graziella 131

Gran Bruno 30

Maccarrone Mauro 94

Marongiu Mara 17

Marzola Pasquina 109

Morara Stefano 39

Novelli Francesco 33

Palmisano Marilena 89

Pedotti Rosetta 98

Perga Simona 20

Piccio Laura 42

Ria Francesco 46

Riccio Paolo 75

Saccardi Riccardo 82

Solari Alessandra 135

Tecchio Franca 116

Tirassa Paola 105

Tomassini Valentina 120

LISTA DEGLI AUTORI / LIST OF THE AUTHORS

Finito di stampare nel mese di maggio 2014da Arti Grafiche Bicidi srl - Genova

LA RICERCA SULLA SCLEROSI MULTIPLA · Riprogrammazione epigenetica nella sclerosi multipla...

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