La malattia di Aujeszky:

aspetti diagnostici

Stefano Nardelli

Istituto Zooprofilattico Sperimentale

delle Venezie

Isola della Scala (VR)

10.05.2011

STORIA

• (1813) prima descrizione USA

―prurito pazzo‖

• (1902) Aujeszky identifica l‘agente

infettivo come un virus

• (1934) il virus causale è identificato

come Herpesvirus

Eziologia

• Herpesvirus suino tipo 1 (SuHV-1)

• Sierologicamente unico

• Ceppi a virulenza variabile

• Struttura simile all‘IBR

STRUTTURA DEL VIRUS SuHV-1

gB

gE

Altre ...

Glicoproteine di membrana• proteine virus-specifiche; variabili da ceppo a ceppo• inducono anticorpi neutralizzanti

ENVELOPE

NUCLEOCAPSIDE

DNA Delezione!!!

GLICO

PROTEINA

RUOLO NELLA REPLICAZIONE VIRALE E NELLA VIRULENZA IMMUNITA‘

Essenziale Adsorbimento Penetrazione Diffusione Virulenza Umorale Cellulare

B + - + + ? ++ +

C + + + - +/- +++ +

D + + + - ? ++ ++

E + - - + + + -

G - - - + - - -

H + - + - ? + ?

I + - - + + ? -

L + - + - ? ? ?

Principali glicoproteine del virus di Aujeszky

Dott. Paolo Cordioli - IZSLER

Spettro d‘ospite

• Ospite principale suino (serbatoio!)

FORMA NERVOSA (suinetti)

FORMA RESPIRATORIA (ingrasso)

FORMA GENITALE (scrofe)

• Ospiti occasionali altri mammiferi

– molto sensibili: gatto, ovicaprini, bovini

– moderatamente sensibili: gli altri in genere

– poco sensibili: primati

FORMA NERVOSA (prurito!) CON ESITO LETALE

(nb: morte di tali animali indicazione di sospetto)

Trasmissione del virus

• TRASMISSIONE DIRETTA

– aerosol (la più importante)

– escreti/secreti

– via venerea

• TRASMISSIONE INDIRETTA

EVIDENZA DI TRASMISSIONE

AEROGENA A LUNGA DISTANZA(DIFFERENZA CON IBR: elevato numero animali?)

Patogenesi (nel suino)

A partire dalla via di ingresso (di norma oronasale)

• Forma nervosa

nervi olfattori SNC

• Forma respiratoria

torrente circolatorio epiteli respiratori, macrofagi alveolari

• Forma genitale

torrente circolatorio barriera placentare

riassorbimento, aborto

LATENZA! (nel bulbo olfattorio - ganglio del trigemino)

RIATTIVAZIONE!

Patogenesi (nel cinghiale)

• Popolazione selvatica in grado di mantenere

autonomamente il virus

• Tendenzialmente ceppi più attenuati rispetto a quelli

isolati nel suino domestico (anche nei confronti di

mammiferi diversi dal suino)

• Possibile ritardo nella sieroconversione (il 45% dei

cinghiali con virus nelle tonsille, ma non nei gangli del

trigemino, è sieronegativa)

Sintomatologia

• Forma nervosa suinetti– incoordinamento, tremori, paralisi treno posteriore

– morte (specie per animali =< 3 settimane, anche 100%)

• Forma respiratoria magroni, grassi– dispnea, tosse, scolo nasale, starnuti

– morte (casi limitati), complicanze batteriche

• Forma genitale– riassorbimento (primo terzo di gestazione)

– aborto (secondo e terzo terzo di gestazione)

– spesso assente risentimento generale

POSSIBILI ANCHE FORME SUBCLINICHE

Diagnosi di laboratorio

• DIRETTA

Cervello, tonsille, polmoni, tamponi nasali, feti

– Isolamento

– Immunofluorescenza

– PCR (differenziale per ceppi

di campo gE+ / vaccinali gE-)

• INDIRETTA

Siero di sangue

– Anticorpi ‗totali‘ SN, ELISA Ac tot, ELISA Ac gB

– Anticorpi gE ELISA Ac gE

NB: persistenza Ac materni 2 – 3 mesi

sieroconversione 7 – 10 gg

Perché 57 campioni?

Tabella campionamento

prevalenza attesa 5% - errore 5%

Numero capi

In azienda Da controllare

7-27 sino a 25

28-37 sino a 29

38-55 35

56-100 45

101-600 56

> 600 57

Tabella campionamento

prevalenza attesa 5% - errore 5%

probabilità che UN campione scelto a caso

• sia positivo = 5% = 0,05

• sia negativo = 95% = 0,95

totale = 1,00

Tabella campionamento

prevalenza attesa 5% - errore 5%

probabilità che DUE campioni scelti a caso

• siano positivo-positivo = 0,05 x 0,05 = 0,0025

• siano negativo-positivo = 0,95 x 0,05 = 0,0475

• siano positivo-negativo = 0,05 x 0,95 = 0,0475

• siano negativo-negativo = 0,95 x 0,95 = 0,9025

totale = 1,0000

Tabella campionamento

prevalenza attesa 5% - errore 5%

probabilità che DUE campioni scelti a caso

• siano positivo-positivo = 0,0025 +

• siano negativo-positivo = 0,0475 +

• siano positivo-negativo = 0,0475 +

siano ALMENO UNO positivo = 0,0975

• siano negativo-negativo = 0,9025

totale = 1,0000

Tabella campionamento

prevalenza attesa 5% - errore 5%

probabilità che ALMENO UNO di n campioni sia

positivo

P = 1 - Pneg

Pneg = probabilità che TUTTI gli n campioni siano

negativi

Tabella campionamento

prevalenza attesa 5% - errore 5%

Pneg - PROBABILITA’ CHE TUTTI I CAMPIONI RISULTINO NEGATIVI

N.

campioni Pneg(1) Pneg(2) Pneg(3) Pneg(4) Pneg

PROBABILITA’ CHE

ALMENO UN CAMPIONE

RISULTI POSITIVO

(1 – Pneg)

1 0,95 0,951 = 0,95 = 0,05

2 0,95 0,95 0,952 = 0,9025 = 0,0975

3 0,95 0,95 0,95 0,953 = 0,857375 = 0,142625

4 0,95 0,95 0,95 0,95 0,954 = 0,81450625 = 0,18549375

… … … … … … … …

56 0,9556

= 0,057 = 0,943

57 0,9557

= 0,053 = 0,947(*)

58 0,9558

= 0,051 = 0,949

59 0,9559

= 0,048 = 0,952

(*) ARROTONDATO = 0,95

Perché troviamo i falsi positivi?

• Qualsiasi test diagnostico è soggetto a due tipi di errore

– ESITO FALSAMENTE POSITIVO

– ESITO FALSAMENTE NEGATIVO

• E‘ possibile quantificare l‘errore del test diagnostico definendone

– Sensibilità diagnostica (Se): probabilità che ha un campione positivo di risultare positivo al test

– Specificità diagnostica (Sp): probabilità che ha un campione negativo di risultare negativo al test

Se, Sp possono assumere un valore compreso fra 0 1

REAZIONE ELISA COMPETITIVA (PHV-1 gE)

Fenomeno dell’impedimento sterico

Glicoproteina B

Glicoproteina E

PIASTRA ELISA ADSORBITA CON VIRUS PHV-1

SIERO IN ESAME

(positivo Ac gB)

ANTICORPO CONIUGATO

ANTI - gE

ENZIMA

SUBSTRATO

INCOLORE COLORATO

ESITO

neg

ESITO

falso pos

Specificità di gruppo (Spg)

Spg = Probabilità che, dato un gruppo di n animali veri negativi,

cui viene applicato un test con specificità Sp, tutti gli animali del

gruppo risultino negativi

Spg = Spn

Quindi, dato un gruppo di 57 scrofe negative Aujeszky che

vengono controllate con ELISA gE competitiva avente Sp=0,99,

la specificità di gruppo Spg risulta essere:

Sp = 0,99 Spg = 0,9957 = 0,56

Nel 44% dei casi almeno uno dei 57 capi risulta falso pos

PER OVVIARE:

si applicano due test combinandoli in serie

Combinando due test diagnostici ...

E‘ POSSIBILE

• APPROCCIO IN PARALLELO: renderemassima la sensibilità (l‘animale è positivo sereagisce ad almeno una delle due prove) ades. ELISA + SN per ingresso tori centrogenetico

• APPROCCIO IN SERIE: rendere massimala specificità (l‘animale è positivo se reagiscead entrambe le prove) ad es. conferma gBsu positivi IBR anticorpi totali

IPOTIZZANDO L‘IMPIEGO DI DUE TEST

INDIPENDENTI, ENTRAMBI CARATTERIZZATI DA

Se = 0,99

Sp = 0,99

Test

singolo

2 Test in parallelo

( A + B)

2 test in serie

(A B [+])

Se 0,99 0,9999 0,98

Sp 0,99 0,98 0,9999

I due test devono essere INDIPENDENTI

• NEI SUINI NON VACCINATI– ELISA (Ac tot, gB) seguita da sieroneutralizzazione

– ELISA (Ac tot) seguita da ELISA gB

• NEI SUINI VACCINATI CON DELETONon esiste (per ora) un secondo test indipendente: i test

commerciali sono tutti sostanzialmente strutturati nella stessa

maniera

MONOCLONALI ANTI-gE IZSLER

3E3 4F5 3H1 1D9 2E1 2B6 2A8 2F5 3G12 5A6 3D5

KIT 1 P P P P P P P N N N N

KIT 2 P P P N N N N N N N N

KIT 3 P P P P P P P N N N N

KIT 4 P P P P P P P N N N N

KIT 5 P P P P P P N N N N N

KIT 6 P P P P P P N N N N N

Diagnosi sierologica della malattia di Aujeszky:

Confronto fra test sierologici gE

Dott. Paolo Cordioli - IZSLER

Diagnosi sierologica della malattia di Aujeszky:

Confronto fra test sierologici gE

117 sieri sperimentali, prodotti attraverso 6 diverseinfezioni in suini negativi o vaccinati, sono stati testati con6 kit commerciali e non per la ricerca anticorpi anti gE

– Tutti i presieri e i sieri da animali vaccinati sono risultati negativi con tutti i kit

– Sieri precoci (5-6 g p.i.) hanno dato esito negativo con tutti i test (falsi negativi)

– Sieri prelevati dai 7-15 g p.i : risultati discordanti

– Sieri prelevati oltre i 15 g sono stati rilevati come positivi da tutti i kit

Dott. Paolo Cordioli - IZSLER

REAZIONE ELISA (SuHV-1 gE)

Glicoproteina B

Glicoproteina E

PIASTRA ELISA ADSORBITA CON VIRUS SuHV-1

SIERO IN ESAME

(positivo Ac gB)

ANTICORPO CONIUGATO

ANTI - gE

ENZIMA

SUBSTRATO

INCOLORE COLORATO

ESITO

neg

ESITO

neg

Ag ricombinante Ag tradizionale

Test ELISA con Ag ricombinante

• Attualmente a livello sperimentale (no kit

commerciale)

• Difficoltà nel produrre l‘antigene

ricombinante

– Epitopo gE conformazionale

– Epitopo gE glicosilato ( espressione in

vettore eucariota)

Ma i positivi ―isolati‖ sono sempre

falsi positivi?

UN POSITIVO ISOLATO PUO‘ ESSERE

• Un falso positivo

• Un primo positivo (inizio sieroconversione –

possibile, ma poco probabile)

• Un ultimo positivo (fase finale eradicazione)

• Un unico positivo (ceppi a bassa capacità di

diffusione Bartha)

Ma i positivi ―isolati‖ sono sempre

falsi positivi?

• In alcuni soggetti è possibile riattivare l‘infezionecon trattamento cortisonico(*)

• In altri soggetti è possibile identificare la presenzadel genoma virale nei gangli del trigemino / bulbiolfattori, MA NON si riesce a riattivare l‘infezionecon trattamento cortisonico ( esperienza svedese)

(*) trattamento molto più energico rispetto al bovino

- 2 – 3 mg/kg desametasone x 5 gg SUINO

- 0,1 mg/kg desametasone x 5 gg BOVINO

Quante volte succede di avere

positivi ―isolati‖?

Sierologia Aujeszky gE - Anno 2010

Veneto + Trentino +Friuli VG

• N. 306 prelievi con ≥ 35 campioni, ripartiti in n. 174 aziende (aziende con consistenza ≥ 38 capi)

• N. 286 prelievi (156 aziende) tutti negativi

• N. 20 prelievi (18 aziende) almeno un campione positivo– 2 prelievi 1 campione positivo (nella stessa azienda!)

– 2 prelievi 2 campioni positivi

– 1 prelievo 3 campioni positivi

– 1 prelievo 4 campioni positivi

– 14 prelievi ≥ 8 campioni positivi

Come controlliamo le prestazioni

delle prove ELISA?

DECISIONE DELLA COMMISSIONE

del 21 febbraio 2008

che stabilisce garanzie supplementari

per la malattia di Aujeszky

negli scambi intracomunitari di suini,

e fissa i criteri relativi alle informazioni

da fornire su tale malattia

(2008/185/CE)

PER L’APPROVAZIONE DELLA PROVA

La sensibilità della prova deve essere di livello tale da

catalogare come positivi i seguenti sieri di riferimento CE:

— Siero di riferimento CE ADV 1 alla diluizione 1:8

— Siero di riferimento CE ADV-gE A

— Siero di riferimento CE ADV-gE B

— Siero di riferimento CE ADV-gE C

— Siero di riferimento CE ADV-gE D

— Siero di riferimento CE ADV-gE E

— Siero di riferimento CE ADV-gE F

PER L’APPROVAZIONE DELLA PROVA

La specificità della prova deve essere di livello tale da

catalogare come negativi i seguenti sieri di riferimento CE:

— Siero di riferimento CE ADV-gE G

— Siero di riferimento CE ADV-gE H

— Siero di riferimento CE ADV-gE J

— Siero di riferimento CE ADV-gE K

— Siero di riferimento CE ADV-gE L

— Siero di riferimento CE ADV-gE M

— Siero di riferimento CE ADV-gE N

— Siero di riferimento CE ADV-gE O

— Siero di riferimento CE ADV-gE P

— Siero di riferimento CE ADV-gE Q

PER L’APPROVAZIONE DEI SINGOLI

LOTTI

Siero di riferimento positivo CE ADV 1 alla

diluizione 1:8 deve risultare positivo

Uno dei sieri di riferimento negativi (ADV gE G

Q) deve risultare negativo

Controllo ―grossolano‖

RING TEST

CENTRO REFERENZA

IZSLER

2010/2011

DISEGNO DEL RING TEST

PANNELLO = 20 SIERI• No. 2 = suini neg ac totali (SPF)

• No. 6 = suini neg ac gE / pos ac totali (vaccinati da 1 a 3x)

• No. 12 = suini positivi ac tot / gE

- 4 = 10 gg PI (suini neg ac tot)

- 8 = da 15 a 24 gg PI

(suini vacc da 1 a 5x)

N. LABORATORI PARTECIPANTI = 21

N. KIT ELISA UTILIZZATI = 4IZSLER – Idexx – IdVet - Synbiotics

RISULTATI DEL RING TEST

SOLO QUATTRO CAMPIONI HANNO

DATO RISULTATI DISCORDANTI

corrispondono ai 4 prelievi effettuati da suini

10 gg PI (=> esito atteso = positivo)

QUESTI QUATTRO CAMPIONI RISULTANO

TUTTI POSITIVI ALLA PROVA ELISA gB

(eseguita in 9 dei 21 laboratori partecipanti)

Aujeszky Aladár

1869 - 1933

medico e

veterinario

ungherese