LA GESTIONE DEGLI ALLERGENI IN AUTOCONTROLLO

Enrico PavoniIstituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna-Brescia

Roma 25/09/2013

Ruolo degli IIZZSS

Supporto agli organi di controllo (es: ASL, SIAN, UVAC, PIF), alle imprese (autocontrollo), ai consumatori (informazione e comunicazione)

Sviluppo di nuove metodiche (sempre più sensibili)

E.L.I.S.A.

CARATTERISTICHE DEI METODI DI ANALISI

1) MASSIMA SENSIBILITA’

2) ELEVATA SPECIFICITA’

3) STANDARDIZZABILI

DETECTION ALLERGENI

RICERCA DIRETTA DELLE PROTEINE ALLERGENICHE(E.L.I.S.A)

RICERCA DEL GENE CODIFICANTE (Real Time PCR)

E.L.I.S.A.Standard elevati nella qualità dei controlli

No cross-reazioni

Soluzioni di estrazione(ß-mercaptoetanolo, guanidina cloridrato,etanolo, PBS, Extraction additives®)

L’omogeneizzazione fondamentale buona riuscita analisi: minimo 50 g di matrice da omogeneizzare per processarne 0,25 – 1 g

Attraverso la rottura dei legami S-S, possono essere distrutte sia la struttura terziaria che la struttura quaternaria della proteina. L’etanolo denatura le proteine e le disidrata.

ANALISI IN AUTOCONTROLLO (ELISA):

GliadinaPARTICOLE, SUPERALCOLICI, DENTIFRICI, INSACCATI, SFARINATI DI SORGO, QUINOA, MAIS, AVENA

Gliadina, uovoPASTA, FARINE (materie prime), PRODOTTI DA FORNO, IMPASTI, PIATTI MENSE

ß-lattoglobuline, INSACCATI, PRODOTTI DELLA PASTICCERIA, SORBETTI

arachide, nocciola, mandorlaPASTE, BISCOTTI, CIOCCOLATA

CASI CLINICI

ESPRESSIONE DEL RISULTATO:Glutine QUANTITATIVA

ACCR

EDITA

TO

ESPRESSIONE DEL RISULTATO:ß-Lattoglobuline QUALITATIVA

ACCR

EDITA

TO

LOD = LOQ

ESPRESSIONE DEL RISULTATO:Proteine uovo QUALITATIVA

ACCR

EDITA

TO

VALID

ATO

NON CONFORMITA’ e OSSERVAZIONI EVIDENZIATE ACCREDEIA

NC:Non sono stati effettuati controlli per la verifica dell' accettabilità della prova:

OSS:Non risultano evidenti registrazioni delle validazioni dei fogli di calcolo come previsto al p.to 13.3 del MQ

Pesce

Soia

Crostacei

Molluschi

Pistacchio

Sesamo

Sedano

Lupino*

Arachide*

*Allergia crociata anche grave (30-60% allergici all’arachide)

REAL TIME PCR

ESTRAZIONE DEL DNAbiglie magnetiche

ERBE PER ARROSTI, SPEZIE (sedano, soia)

MORTADELLASENZA PISTACCHIO(pistacchio)

IMPASTI PIZZE (farina di lupino)

ALIMENTI SOSPETTI PER CASI CLINICI(tutto il pannello)

REAL TIME PCRqualitativa

PCR: 2n filamenti n= numero cicliDopo 30 cicli:230= 1,07x109 > 1 miliardo di molecole identiche

PCR:PolymeraseChain Reaction

REAL TIME PCRChimica della TaqMan:

La Pol trova come ostacolola sonda TaqMan: R vicino a Q,non c’è emissione

La Pol comincia a rimuovere lasonda TaqMan (5’esonucleasi)

Rottura della sonda: R si allontana da Q ed emette fluor.

La Pol completa la polimerizzazione: il DNA è raddoppiato

INTERPRETAZIONE dei RISULTATIL’emissione di fluorescenza

e’ proporzionale alla quantita’di DNA

REAL TIME QUALITATIVE PCR

Q

RFAM

TAMRA

SONDA

Esperienze di laboratorio: pistacchio

Cross reattività con Anacardiaceae (es. Pepe, mango), noci e nocciole

PEPE

Flavonoidi!

SPEZIE ED ERBE AROMATICHEcontengono inibitori PCR

Diluendo il DNA diluisco gli inibitori

DNA t.q. DNA 1:5 - 1:10Soluzione:

E.L.I.S.A o PCR:

COSA E’ MEGLIO?

Finalità N°   Matrice    

Autocontrollo 3225        

    2696 PASTA ALIMENTARE SECCA  

    108 CAMPIONI AMBIENTALI  

    86 ALTRE PREPARAZIONI ALIMENTARI

 

    70 CARNE E INSACCATI  

    27 ALTRI ADDITIVI  

    9 ALIMENTI PRONTI COTTI

 

    4 ADDITIVI  

    4 AMIDO  

    4 ALTRE CARNI  

    4 CAFFE'  

    2 PRODOTTI DELLA PASTICCERIA E BISCOTTERIA

    1 SPEZIE  

    1 ACQUA  

    209 ALTRE MATRICI    

CampionamentoAutocontrollogiugno 2012

÷giugno 2013

Trabatto 2 minuti di esposizione

Raffraddatore 5 minuti di esposizione

Silos carico pasta gluten free 10 minuti di esposizione

Glutine: CAMPIONI AMBIENTALI (piastre Petri per apposizione)

Pastificio in autocontrollo:Pasta “normale”Pasta gluten freePasta senza uovoPasta con uovo

STESSE LINEE DI PRODUZIONE MA IN PERIODI DIVERSIPulizia accurata ambienti di lavoro nei cambi di produzione

Uscita silos stoccaggio gluten free 15 minuti

Nastro trasporto 30 minuti – 9 ore

Stenditrice 50 secondi

Ponte esposizione 60 sec

Sfilatrice 40 sec

Silo pasta lunga 38 – 416 oreNastro trasporto tazze 2 minuti

Preincarto 5 minuti

 FINALITA’

AUTOCONTROLLO  

ALLERGENENon

rilevato* Rilevato* TOTALEGLUTINE 3020 132   3152         ß-LATTOGLOBULINE 19 0   19         UOVO 51 3   54         TOTALE 3090 135   3225

*Limite di quantificazione glutine = 5ppm. Limite di quantificazione ß-latto = 0.5 ppm. Limite di quantificazione uovo = 2.5 ppm.

Risultati autocontrollo

Finalità N°   Matrice    Attività di conferma per altro Ente

6       

    2 SOGLIOLA 

    1 ALTRE PREPARAZIONI ALIMENTARI  

    1 CALAMARI 

    1 ROMBO/HALIBUT 

    1 FILETTO DI ORATA    Attività di controllo NAS 58        

  

9 PASTA ALIMENTARE SECCA 

  

7 BISCOTTI 

  

4 FARINA 

    3 OMOGENEIZZATI DI FRUTTA PER LO SVEZZAMENTO

  

3 ALTRI INTEGRATORI 

  

3 RAGU' 

    3 PREPARAZIONI PER ZUPPE, MINESTRE O BRODI

  

3 ERBE INFUSIONALI 

  

2 ARROSTO DI TACCHINO 

    2 PASTICCERIA ARTIGIANALE DA FORNO  

  

2 PRODOTTI PRIVI DI GLUTINE 

    1 OMOGENEIZZATI DI FRUTTA PER LO SVEZZAMENTO

  

1 PANE GRATTUGIATO 

  

1 CRACKERS 

  

1 AMIDO 

  

1 ZUCCHERO BIANCO 

    1 FETTE BISCOTTATE, CRACKERS, GALLETTE ED AFFINI

  

1 TORTELLINI 

  

1 PASTA CRUDA 

  

1 SUGO 

  

1 SPECK ALTO ADIGE IGP 

    1 ALTRI PRODOTTI PER DIETE SPECIALI      1 PASTICCERIA INDUSTRIALE DA FORNO A PASTA MOLLE    1 PASTA SECCA DI SEMOLA GRANO DURO  

  

1 CACAO  

    1 OMOGENEIZZATI DI ORTAGGI PER LO SVEZZAMENTO

  

1 LATTE SOIA 

    1 GELATO      

Totale 64

CampionamentoUfficiali

giugno 2012÷

giugno 2013

Finalità N°   Matrice    Piano Regionale Alimenti (Emilia Romagna)

169  

    74 PRODOTTI DA FORNO

 

   71 ALIMENTI PRONTI COTTI  

    16 CARNE E SALUMI  

    8 PRODOTTI ITTICI    Prelievo con finalità non definita

24    

  10 PRODOTTI PRIVI DI GLUTINE  

  3 PANE  

  2 DOLCI  

  2 PASTA ALIMENTARE SECCA  

 2 FETTE BISCOTTATE, CRACKERS, GALLETTE ED AFFINI

  2 PREPARAZIONI GASTRONOMICHE  

 1 CRACKERS  

  1 PASTA COTTA  

  1 BISCOTTI      

Tossinfezioni 1 1 CRACKERS      

Totale 194        

258 analisi

CampionamentoUfficiali/nongiugno 2012

÷giugno 2013

Risultati generali

glutine giugno 2012 – giugno 2013.

  N° ANALISI  

MATRICE <5ppm 5ppm<valore<20ppm 20ppm≤valore<80ppm TOTALEPASTA ALIMENTARE SECCA 2587 66 25 2678

PRODOTTI DA FORNO O PASTICCERIA 150 6 13 169

TAMPONI / PIASTRE PER APPOSIZIONE 98 2 5 105ALIMENTI PRONTI COTTI 73 1   74PREPARAZIONI ALIMENTARI 82 5 8 95

PREPARAZIONI GASTRONOMICHE 73 1 1 75SALSE 1     1INTEGRATORI 3     3PRODOTTI DIETETICI 2     2CAFFE' 4     4AMIDO 5     5CIOCCOLATO 2     2INSACCATI 79     79PRODOTTI ITTICI 22     22CARNE E DERIVATI 13     13ADDITIVI 7     7VERDURA, FRUTTA, CEREALI 39     39FORMAGGI 4     4ALTRO 24 3 1 28

         TOTALE 3270 84 (2,5%) 51 (1,5%) 3405

GLUTINE mg/70cm2 TEMPO ESPOSIZIONE (h)

SILO PASTA LUNGA > 80 416SILO PASTA LUNGA 15,7 24SILO PASTA LUNGA 37,9 48SILO PASTA LUNGA 28,8 72SILO PASTA LUNGA 43,3 96SILO PASTA LUNGA 47,4 116

     SCARICA SEMOLA* 5,9 6

*Contaminazione volontaria

Glutine: PIASTRE PER APPOSIZIONELavaggio 10 ml Et-OH 60%

• No cocktail solution (Mendez)• 980 µl sample diluent 1X + 20 µl sample• ELISA

N° ANALISI

MATRICENon rilevate (<0,5ppm)

Rilevate (≥0,5ppm) TOTALE

ACQUA 1  0 1ALTRI MATERIALI 8  0 8SALUMI 7  0 7PASTICCERIA E BISCOTTERIA 6  0 6TAMPONE 5  0 5       TOTALE 27  0 27

Risultati generali

ß-Lattoglobuline giugno 2012 – giugno 2013.

N° ANALISI

MATRICENon rilevate (<2,5ppm) Rilevate (≥2,5ppm) TOTALE

ALTRE SPEZIE 1  0 1PASTICCERIA E BISCOTTERIA 8  0 8FARINA 4 2  6FORMAGGIO GRATUGGIATO 5  0 5PASTA ALIMENTARE SECCA 31 1  32INSACCATI 2  0 2TAMPONE DA ATTREZZATURA 3  0 3       TOTALE 54  3  (5,2%) 57

Risultati generali

proteine dell’uovo giugno 2012 – giugno 2013.

Conclusioni

Glutine: 5 mg/kg < 2,5% < 20 mg/kg20 mg/kg < 1,5% < 80 mg/kgProteine uovo:5,2% > 2,5 mg/kg ß-Lattoglobuline: /

I prodotti alimentari italiani possono essere considerati “safe”

WORK IN PROGRESS

Corresponds to 0,13 mg/kg (ppm) egg white protein)

enrico.pavoni@izsler.it