VALUTAZIONE COMPARATIVA DI DUE METODI

IV° Congresso Regionale FITELAB

Il Tecnico di Laboratorio Biomedico:

Nuove competenze e professionalità.

11-05-2013

Maniago (PN)

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VALUTAZIONE COMPARATIVA DI DUE METODI

CROMATOGRAFICI (HPLC) PER IL RILIEVO DELLA

TRANSFERRINA CARBOIDRATO CARENTE (CDT) NEL SIERO,

QUALE MARCATORE DI ABUSO CRONICO DI ALCOOL.

Università degli studi di Udine

Facoltà di Medicina e Chirurgia

Corso di Laurea in Tecniche di Laboratorio Biomedico

Obiettivi del Lavoro

La tesi si è basata su un doppio lavoro:

� Un’analisi comparativa tra la CDT (Transferrina Carboidrato Carente) e i

marcatori classici dell’abuso alcolico cronico, quali ALT, γGT e MCV.

� Confronto tra due sistemi cromatografici diversi forniti di due kit di due � Confronto tra due sistemi cromatografici diversi forniti di due kit di due

diverse ditte per l’analisi della Transferrina Carboidrato Carente.

2

L’ ETANOLO

� Alcool a catena corta [ CH3CH2OH ], assorbimento a

livello gastrico e primo intestino ed rapida immissione in

circolo (5 minuti circa).

� Metabolizzato (via ossidativa) prevalentemente a livello

epatico (80%).

� Produce effetti su :

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• Sistema nervoso,

• Tessuto Epatico,

• Apparato Cardiovascolare,

• Apparato Gastroenterico.

Effetti dell’Alcool Etilico e AlcolemiaALCOLEMIA è la concentrazione di alcool nel medium acquoso espresso

in g/L, all’aumentare della concentrazione aumentano gli effetti

psicosomatici:

� 0.1-0.4 riduzione inibizioni e del rischio, riduzione visione laterale e

riflessi;

� 0.5-0.8 limite legale, riflessi alterati, ridotta capacità di giudizio;

� 0.9-1.5 disarticolazione del linguaggio, alterazione dell’equilibrio, � 0.9-1.5 disarticolazione del linguaggio, alterazione dell’equilibrio,

compromissione visione-forme-colori-dimensioni;

� 1.6-3.0 compromissione grave stato psicofisico, comportamenti violenti,

stati apatici-depressivi;

� 3.1-4.0 incoscienza, allucinazioni, privazione dei riflessi, incontinenza,

vomito, coma;

� >4.0 battito cardiaco rallentato, coma, morte per arresto cardiocircolatorio

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Matrici utilizzabili per la rilevazione di Alcool Etilico

Esistono diverse matrici biologiche su cui è possibile rilevare l’alcool etilico:

� Siero,

� Sangue intero,

� Urine,

� Matrici cheratiniche,

� Umor vitreo,� Umor vitreo,

� Saliva,

� Aria Alveolare,

� Sangue Capillare,

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Marcatori & tempo di rilevazione nelle matrici

biologiche

Ricerca di marcatori “temporali”:

� Acuto: Alcool, Acetaldeide, Alcool Espirato. Utilizzo in alcune ore.

� Recente: 5-HTOL, FAEE, EtG, EtS. Utilizzo da poche ore a alcuni giorni.

� Cronico: γGT, ALT, AST, MCV, CDT. Utilizzo da settimane a mesi.� Cronico: γGT, ALT, AST, MCV, CDT. Utilizzo da settimane a mesi.

Esistono marcatori diretti e indiretti:

� Diretti: Alcool (sangue, urine, espirato), Acetaldeide, FAEE, Peth, EtG, EtS

� Indiretti: γGT, AST, ALT, MCV, CDT, 5-HTOL

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Metodi di Rilevazione

Le metodiche di ricerca variano in relazione all’analita da ricercare:

� Alcool Espirato: Etilometro elettrochimici o spettrofotometrici.

� Alcool su siero o sangue: metodica enzimatica per screening su siero e

conferma in GC-HS su sangue intero (l’unica legalmente riconosciuta).

� Etilglucuronide: metodica immunochimica per screening su urina e conferma

in GC-MS su matrice cheratinica.

� CDT: metodiche di HPLC, Elettroforesi capillare.

� MCV: su strumentazione ematologica automatizzata.

� Transaminasi: su strumentazione di chimica clinica automatizzata.7

Molti marcatori acuti ma..

Esistono molti marcatori per valutare l’uso e l’abuso di alcolici in

range temporali stretti e alcuni sono da trattare come marcatori definitivi (Etg o

etanolo misurato in GC-HS).

Ciò che manca è un marcatore definitivo per l’ubuso alcolico cronico.

Esistono marcatori indiretti come ALT, γGT o MCV ma un loro aumento non è

direttamente riconducibile all’abuso alcolico cronico ma ad uno vasto spettro di direttamente riconducibile all’abuso alcolico cronico ma ad uno vasto spettro di

possibilità.

Dagli anni ’70 del XX secolo si è notata una transferrina anomala sensibile

all’elevata assunzione di alcool e non presente in soggetti epatopatici

non alcolisti.

8

Dalla Transferrina alla….La transferrina è una proteina che :

• catena di 76 Kda,

• solitamente veicola ioni di Fe3+ (2 max),

•diminuisce con sovraccarichi di ferro e aumenta in carenza,

•sintetizzata prevalentemente a livello epatico,

• presenta un’emivita di 10 giorni circa,

• si deve considerare un’insieme di isoforme a causa di:

9

• si deve considerare un’insieme di isoforme a causa di:

• livelli di acido sialico (0 a 8 molecole),

• presenza di uno o due atomi di Fe3+,

• mutazioni genetiche ( 38 varianti) e sindromi

CDG.

Transferrina Carboidrato Carente o CDT

Delle 8 isoforme della Transferrina, si considera CDT solo le proteine

asialotransferrina e disialotransferrina.

Ma solo la disialotransferrina è il target

diagnostico.

Miglior marcatore abuso cronico di alcool

grazie ad:

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Acido sialico

N-Acetilglucosamina

Mannoso

Galattoso

•emivita di circa 15 gg,

•Normalizza dopo 4 settimane di astinenza,

•Si evidenzia dopo un consumo di 80

grammi/die di sostanza per una settimana

Metodi di Rilevazione

Esistono diverse metodiche per rilevare la CDT ma le più utilizzate sono:

� L’ Elettroforesi Capillare, metodo semplice e rapido presenta però scarsa

risoluzione e con diverse interferenze, (lettura a 210 nm.).

� Cromatografia liquida ad alte prestazioni, metodica più complessa e lenta

permette un’alta risoluzione e ha poche interferenze, (lettura a 460 nm.).

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Confronto tra CDT e marcatori classici

Sono stati utilizzati 134 campioni di cui 28 sono stati eliminati a causa di

interferenze.

Sui 106 campioni rimanenti sono stati analizzati: transaminasi (ALT, γGT),

MCV e CDT.

I risultati dei vari esami sono stati elaborati tramite la funzione di correlazione:

� CDT vs ALT: coefficiente di correlazione r pari a 0,1248,

� CDT vs γGT: coefficiente di correlazione r pari a 0,06484,

� CDT vs MCV: coefficiente di correlazione r pari a 0,00262

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Confronto Grafico tra CDT e ALT

400

500

600

700

8,000

10,000

12,000

14,000

0

100

200

300

0,000

2,000

4,000

6,000

0 20 40 60 80 100 120

CDT

ALT

13

Confronto Grafico tra CDT e γGT

1000

1200

1400

1600

1800

8,000

10,000

12,000

14,000

0

200

400

600

800

1000

0,000

2,000

4,000

6,000

8,000

1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 91 96 101

CDT

GGT

14

Confronto Grafico tra CDT e MCV

80,000

100,000

120,000

140,000

8,000

10,000

12,000

14,000

0,000

20,000

40,000

60,000

80,000

0,000

2,000

4,000

6,000

8,000

0 20 40 60 80 100 120 140 160

CDTMCV

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Confronto dei valori di CDT su HPLC Shimadzu® e

HPLC GILSON®

Inoltre sono stati analizzati 12 campioni su due strumentazioni:

HPLC Shimadzu®:

HPLC GILSON®:

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Confronto dei valori di CDT su HPLC Shimadzu® e

HPLC GILSON®

I dati provenienti dalle analisi sono stati tabellati:

Campioni CDT su HPLC Shimadzu® con metodo Recipe®

Asialo Disialo Trisialo Tetrasialo Pentasilo CDT%

Eureka

CTRL A0 3,3 5,6 78,4 12,7 3,3

Eureka

CTRL B0 1,8 5,4 81,4 11,4 1,8

Campioni CDT su HPLC Gilson® con metodo Eureka®

Asialo Disialo Trisialo Tetrasialo Pentasilo CDT%

Eureka

CTRL A0 4,06 7,45 74,92 13,57 4,06

Eureka

CTRL B0 2,03 9,75 77,87 10,35 2,03

17

Sample 19 0 2 2,5 78,2 17,3 2

Sample 100 0 1,7 9,8 71,8 16,7 1,7

Sample 116 0 1,4 2,4 83,6 12,6 1,4

Sample 118 0 2 1,9 71,4 15,6 2,2

Sample 121 0 1,7 4,3 81,7 12,3 1,7

Sample 130 0 6,3 4,9 76,9 11,8 6,31

PZ 1 0 1 3,9 83,4 11,7 1

PZ 2 0 1,2 4,1 85,7 9 1,2

PZ 3 0 1,9 3,2 84,8 10,1 1,9

Sert 12 0 0,6 16,7 73,5 9,1 0,6

Sert 13 0 1,2 4,9 89,2 4,6 1,2

Sert 14 0 1,2 2,7 82,9 13,1 1,2

Sample 19 0 1,39 13,82 68,28 16,51 1,39

Sample

1000 1,05 7,34 74,93 16,68 1,05

Sample

1160 1,4 5,52 79,88 13,2 1,4

Sample

1180 1,25 4,09 77,81 16,84 1,25

Sample

1210 2,07 5,37 80,56 12 2,07

Sample

1300 5,78 2,8 77,87 13,55 5,78

PZ 1 0 1,46 4,01 83,1 11,44 1,46

PZ 2 0 1,57 3,77 86,24 8,42 1,57

PZ 3 0 2,05 3.13 83,29 11,54 2,05

Sert 12 0 0,69 9,55 74,13 15,64 0,69

Sert 13 0 1,26 4,06 81.09 13,59 1,26

Sert 14 0 1,78 2,3 76,77 19,16 1,78

Confronto dei valori di CDT su HPLC Shimadzu® e

HPLC GILSON®

Per l’elaborazione dati si è preferito utilizzare l’analisi statistica secondo

Bland-Altman:

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Tale sistema permette l’analisi di agreement tra due diversi metodi di

analisi dello stesso analita.

E’ stato escluso il metodo di correlazione poiché alti livelli di correlazione

non implicano che ci siano alti livelli di conformità tra i due metodi

analitici.

Confronto dei valori di CDT su HPLC Shimadzu® e

HPLC GILSON®

Per una seconda fase di studio dei dati è stato utilizzato il metodo

ICC, acronimo di Intraclass Correlation Coefficient, che permette di capire

con quale forza dati di un gruppo sono simili agli altri ovvero tale metodo

consente di valutare la coerenza di misurazioni quantitative eseguite con

metodi diversi su stessi campioni ricercando uno stesso analita:

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Differenze tra i due sistemi cromatografici

I sistemi cromatografici HPLC Shimadzu® e HPLC GILSON® risultano

essere simili in termini di risultati analitici, ma le differenze tecniche e

operative riscontrate sono state tali da far preferire l’utilizzo del sistema

proposto dalla Shimadzu® con metodica Recipe®:Fasi dell’analisi HPLC SHIMADZU® Metodo

RECIPE®

HPLC Gilson® Metodo

EUREKA®

Fase Pre analitica 1 vials di soluzione, Test solution

e controlli Ready to use

4 Reagenti (1 da ricostituire), più

fasi di miscelazione

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Fase Analitica Analisi in 12 o 9.5 minuti, pulizia

precolonna contemporanea

all’analisi.

Analisi in 10 minuti (5 pulizia 5

analisi),

Fase Interpretativa Sistema interpretativo user

friendly, facilità di accesso e

modifica dati.

Sistema di controllo macchina e

interpretazione complesso e

soggetto a blocchi.

Fase Post analitica Utilizzo del Programma

“overnight” come standby del

cromatogramma.

Scollegare detector, utilizzo 30mL

di fase mobile M3 con colonna

girata, invertire colonna flusso di

M1 per 15 minuti a 1.5 mL/min.

Discussione dei risultati e ConclusioniIn questo lavoro in una prima fase è stato analizzato un nuovo marcatore di abuso alcolico cronico, la CDT, in relazione a:

1. ALT,

2. γGT,

3. MCV,

E secondariamente sono stati confrontati due sistemi HPLC per l’analisi della CDT.

Pertanto:Pertanto:

1. La CDT può essere indicata come un possibile marcatore definitivo di abuso alcolico cronico,

2. I marcatori classici, seppur obsoleti, non possono essere del tutto abbandonati,

3. I sistemi HPLC di nuova generazione permettono un’analisi accurata e con elevate prestazioni della CDT,

4. E’ opportuno avviare uno studio policentrico per l’analisi del CDT così da creare una casistica che permetta il calcolo dei cut-off operativi a livello locale.

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Grazie per l’attenzione

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