ITS-HHP PER IL MONITORAGGIO DELLE COMUNITÀ BATTERICHE RUMINALI DI BOVINE ALIMENTATE CON SILOMAIS...
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ITS-HHP PER IL MONITORAGGIO DELLE COMUNITÀ BATTERICHE RUMINALI DI BOVINE ALIMENTATE CON SILOMAIS TRANSGENICO Bt Piano sperimentale Analisi delle comunità microbiche ruminali Cluster Analysis Analisi comparativa degli insilati Riproducibilità del metodo ITS-HHP Silomais controllo Silomais controllo Silomais controllo Silomais controllo Silomais Bt Silomais Bt Silomais Bt Silomais Bt Silomais normale Silomais normale Silomais normale Silomais normale Pre-prova T0 Primo trial T1 Secondo trial T2 Bovina A Bovina B Bovina C Bovina D Borin Sara 1 , Cittaro Davide 1 , Tamburini Alberto 2 , Succi Giuseppe 2 , Sorlini Claudia 1 e Daffonchio Daniele 1 Università di Milano, Via Celoria 2, 20133 Milano 1 Dipartimento di Scienze e Tecnologie Alimentari e Microbiologiche (DISTAM) 2 Istituto di Zootecnia [email protected] A1 A2 B1 B2 C1 C2 D1 D2 A B/C D B* A/B D C Liquido ruminale Nylon bags Bt N Bt N Bt N A nalisi brom atologiche Silom ais naturale Silom ais Bt Var.% Etanolo g/kg ss 8.85±0.83 7.72±0.08 -12.82 0.280 ns Acido acetico g/kg ss 8.00±2.57 7.72±0.08 -13.43 0.431 ns Acido propionico g/kg ss 0.52±0.35 7.72±0.08 -33.98 0.370 ns Acido isobutirrico g/kg ss 1.09±0.58 7.72±0.08 -16.51 0.656 ns Acido N-butirrico g/kg ss 0.48±0.10 7.72±0.08 +23.96 0.646 ns Acido lattico g/kg ss 39.04±4.56 7.72±0.08 -39.57 0.058 ps Proteine grezze g/100g ss 6.49±0.60 7.72±0.08 -5.09 0.576 ns M ateria grassa g/100g ss 2.59±0.01 7.72±0.08 -3.09 0.778 ns Fibre grezze g/100g ss 17.72±1.94 7.72±0.08 +1.38 0.065 qp ceneri g/100g ss 4.66±0.19 7.72±0.08 +29.54 0.555 ns NDF g/100g ss 40.02±2.39 7.72±0.08 -0.90 0.614 ns ADF g/100g ss 20.64±0.88 7.72±0.08 +2.57 0.455 ns ADL g/100g ss 1.24±0.05 7.72±0.08 -17.41 0.214 ns amido g/100g ss 32.01±1.51 7.72±0.08 -2.55 0.790 ns Zuccherisolubili g/100g ss 0.95±0.81 7.72±0.08 +158.95 0.109 ns Il metodo ITS-HHP fingerprinting M M M M M C C+T T T+B T+S B S B+S C+T+B C+T+B+S G+R G R G+C P+T+S C P P+B+S B S M: molecular size marker, C: E. coli, T: B. thuringiensis, S: Serratia marcescens, B: Streptococcus bovis, G: Geodermatophilus obscurus, R: Rhodococcus sp. ITS lungo tRNA 5’ ITS 3’ ITS ITS corto 16S rDNA 23S rDNA Molecole omoduplex Molecole eteroduplex Gli spaziatori ribosomali trascritti (Intergenic Transcribed Spacer, ITS) presentano polimorfismi in numero, lunghezza e sequenza. Dopo la loro amplificazione con primer universali che appaiano nella zona terminale del 16S rDNA ed in quella iniziale del 23S rDNA, la loro separazione in gel di poliacrilammide MDE evidenzia bande formate da frammenti omoduplex ed eteroduplex. L’analisi ITS-HHP, è stato applicato a ceppi appartenenti a specie diverse, singole o co-amplificate, dimostrandone l’informatività nel descrivere colture miste. Quando diverse specie sono co-amplificate, si ottengono profili di bande che contengono tutte le bande presenti nei profili dei singoli ceppi. Quando le specie sono affini, come nel caso di B. thuringiensis e S. bovis, si notano bande aggiuntive ( ) costituite da frammenti eteroduplex aventi ciascuna elica proveniente da una specie diversa. Specie ad elevata G+C, come G. obscurus, vengono efficientemente amplificati in coltura mista solo quando sono presenti in quantità preponderante (come nel caso di G+R). L’ITS-HHP fingerprinting è stato applicato al DNA estratto in due replicati da 2 campioni di liquido ruminale prelevati da ciascuna delle 4 bovine. Il metodo ha dimostrato una buona riproducibilità: tra i campioni è stata calcolata identità di bande pari in media all’89%, e valori di similarità tra i profili tra il 98% ed il 69% 4 bovine fistolate sono state alimentate per un periodo pre- prova con silomais commerciale (silomais controllo). Sono stati quindi effettuati 2 trial sperimentali ciascuno di 4 settimane, somministrando insilato preparato con mais transgenico (Novartis Bt evento 176) o con mais isogenico normale, seguendo uno schema a cross over,con inversione della dieta al termine del primo periodo. Nei giorni di prelievo sono stati inseriti nella cavità ruminale per 6 ore dei nylon bags contenenti lo stesso silomais presente nella dieta, con lo scopo di analizzare la microflora che colonizza direttamente il materiale solido introdotto con la dieta. Analisi bromatologiche e di degradabilità ruminale in vivo sono state condotte sui due tipi di insilato, coltivati raccolti ed insilati nelle medesime condizioni, allo scopo di valutare quanto le diete sottoposte alle bovine fossero sostanzialmente diverse. ANALISI LIQUIDO RUMINALE ANALISI CONTENUTO NYLON BAGS (FRAZIONE SOLIDA RUMINALE) Nelle analisi bromatologiche condotte sui 2 silomais non sono state riscontrate differenze statisticamente significative (<0,05). Alcuni valori sono tuttavia prossimi alla significatività: il silomais Bt contiene più fibra ed acido lattico, in connessione con un minor contenuto in zuccheri solubili, indici che la fermentazione lattica è stata più intensa durante l’insilamento. Questi dati sono in accordo con studi precedenti (Masoero et al., 1999, Maydica) 20 40 60 80 100 120 140 160 180 30 40 50 60 70 80 90 100 0 H oursofincubation in the rum en Degradability (% ) 20 40 60 80 100 120 140 160 180 30 40 50 60 70 80 90 100 0 H oursofincubation in the rum en Degradability (% ) 20 40 60 80 100 120 140 160 180 30 40 50 60 70 80 90 100 0 H oursofincubation in the rum en Degradability (% ) 30 40 50 60 70 80 90 100 0 30 40 50 60 70 80 90 100 0 H oursofincubation in the rum en Degradability (% ) Btsilage N orm alisogenicsilage Reference com m ercial silage Btsilage N orm alisogenicsilage Reference com m ercial silage 30 50 70 90 Degradabili tà % Ore di incubazione nel rumine 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Silomais Bt Silomais isogenico naturale Silomais controllo Prove di digeribilità in vivo non hanno evidenziato differenze nei 3 silomais in studio M M T0 T1 T2 T0 T1 T2 T0 T1 T2 T0 T1 T2 Cow A Cow B Cow C Cow D 250 bp 250 bp T1 T2 T1 T2 T1 T2 T1 T2 Cow A Cow B Cow C Cow D M M 250 bp 250 bp Liquido ruminale Nylon bags Dai campioni di liquido ruminale e di silomais contenuto dei nylon bags inseriti nel rumine, è stato estratto il DNA totale ed è stato applicato il metodo ITS-HHP fingerprinting. I profili ottenuti, formati rispettivamente da 263 e 219 bande polimorfiche, risultano altamente informativi. È stata costruita una matrice di similarità che riporta per ogni campione la presenza/assenza di ogni banda polimorfica, elaborata successivamente con 2 tipi di analisi statistica: Principal Component Analysis e Cluster Analysis. 3 giorni al termine di ogni periodo Principal Component Analysis I campioni, distribuiti su un grafico bidimensionale sulla base della loro variabilità, sono stati raggruppati in modo da evidenziare differenze correlate ai diversi silomais presenti nella dieta e nei nylon bags, o correlate ai diversi animali studiati. I risultati della PCA indicano che sia i campioni della fase liquida che della fase solida non sono distinti in base alle diverse diete, infatti si trovano su aree sovrapposte. I campioni, di solido o liquido, provenienti dalle 4 bovine si trovano invece su aree più separate. Da quest’analisi emerge quindi che la dieta non ha significativamente influenzato la microflora ruminale delle bovine. Popolazioni relativamente distinte, sia nella frazione solida che in quella liquida, sono invece state osservate nei 4 animali. I campioni di liquido o solido della bovina B durante il primo trial sperimentale sono particolarmente diversi dagli altri ( ): questo è probabilmente dovuto al fatto che la bovina B in quel periodo ha subito un’operazione, e pertanto ha riportato variazioni significative nella microflora ruminale. Dim1 15.5% Dim2 5.51% Silomais controll o Silomais Bt Silomais normale Dim1 15.5% Dim2 5.51% A B C D Liquido ruminale Variabilità tra le diete Variabilità tra le bovine Dim1 27.23% Dim3 8.84% Silomais Bt Silomais normale Dim1 27.23% Dim3 8.84% D C B A Nylon bags Variabilità tra le diete Variabilità tra le bovine L’analisi cluster ha raggruppato i campioni in 2 dendrogrammi di similarità che descrivono significativamente la loro diversità (coefficienti di correlazione 0,87 e 0,93). Anche quest’analisi riporta sostanzialmente gli stessi risultati ottenuti con l’analisi PCA: la variabilità esistente tra le comunità batteriche dei diversi animali è superiore alla variabilità creata dai diversi regimi alimentari. Nel liquido ruminale, i campioni della bovina operata (B*) risultano nettamente divergenti dagli altri, sottolineando la variabilità conferita dall’operazione. Analizzando separatamente i campioni da nylon bag di ogni singola bovina, si evidenzia che la microflora di ciascun animale è nettamente differenziata in base al regime alimentare. Questo risultato si presenta solo nei campioni provenienti da nylon bag, e non nel liquido ruminale, che probabilmente risente maggiormente della forte omeostasi ruminale. Bt N Bt N Conclusioni In questo lavoro proponiamo il metodo ITS-HHP, che sfrutta i polimorfismi di lunghezza e sequenza degli ITS tramite la loro separazione in poliacrilammide MDE, per la descrizione di comunità microbiche ambientali. Abbiamo dimostrato che l’ITS-HHP fornisce fingerprinting altamente informativi, riproducibili e sensibili. Applicato alle comunità eubatteriche ruminali di bovine alimentate con insilato di mais transgenico Bt ed isogenico non transgenico, l’ITS-HHP ha evidenziato nei singoli animali studiati delle differenze correlate alle diverse diete, in particolare nella microflora associata al silomais direttamente incubato nel rumine. La variabilità riscontrata tra i diversi animali è tuttavia maggiore delle differenze imputabili alle diverse diete che quindi non risultano significative.
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ITS-HHP PER IL MONITORAGGIO DELLE COMUNITÀ BATTERICHE RUMINALI DI BOVINE ALIMENTATE CON SILOMAIS TRANSGENICO
Bt
Piano sperimentale
Analisi delle comunità microbiche ruminali
Cluster Analysis
Analisi comparativa degli insilati
Riproducibilità del metodo ITS-HHP
Silomais controllo
Silomais controllo
Silomais controllo
Silomais controllo
Silomais Bt
Silomais Bt
Silomais Bt
Silomais Bt
Silomais normale
Silomais normale
Silomais normale
Silomais normale
Pre-provaT0
Primo trialT1
Secondo trialT2
Bovina A
Bovina B
Bovina C
Bovina D
Borin Sara1, Cittaro Davide1, Tamburini Alberto2, Succi
Giuseppe2, Sorlini Claudia1 e Daffonchio Daniele1
Università di Milano, Via Celoria 2, 20133 Milano 1Dipartimento di Scienze e Tecnologie
Alimentari e Microbiologiche (DISTAM)2Istituto di Zootecnia [email protected]
A1 A2 B1 B2 C1 C2 D1 D2
A
B/C
D
B*
A/B
D
C
Liquido ruminale Nylon bags
Bt
N
Bt
N
Bt
N
Analisi bromatologiche
Silomais naturale
Silomais Bt
Var. %
Etanolo g/kg ss 8.85±0.83 7.72±0.08 -12.82 0.280 ns
Acido acetico g/kg ss 8.00±2.57 7.72±0.08 -13.43 0.431 ns
Acido propionico g/kg ss 0.52±0.35 7.72±0.08 -33.98 0.370 ns
Acido isobutirrico g/kg ss 1.09±0.58 7.72±0.08 -16.51 0.656 ns
Acido N-butirrico g/kg ss 0.48±0.10 7.72±0.08 +23.96 0.646 ns
Acido lattico g/kg ss 39.04±4.56 7.72±0.08 -39.57 0.058 ps
Proteine grezze g/100g ss 6.49±0.60 7.72±0.08 -5.09 0.576 ns
Materia grassa g/100g ss 2.59±0.01 7.72±0.08 -3.09 0.778 ns
Fibre grezze g/100g ss 17.72±1.94 7.72±0.08 +1.38 0.065 qp
ceneri g/100g ss 4.66±0.19 7.72±0.08 +29.54 0.555 ns
NDF g/100g ss 40.02±2.39 7.72±0.08 -0.90 0.614 ns
ADF g/100g ss 20.64±0.88 7.72±0.08 +2.57 0.455 ns
ADL g/100g ss 1.24±0.05 7.72±0.08 -17.41 0.214 ns
amido g/100g ss 32.01±1.51 7.72±0.08 -2.55 0.790 ns
Zuccheri solubili g/100g ss 0.95±0.81 7.72±0.08 +158.95 0.109 ns
Il metodo ITS-HHP fingerprinting
M M M M MC C+T
T T+B
T+S
B S B+S
C+T+
BC+
T+B+
SG+
RG R G+
CP+
T+S
C P P+B+
SB S
M: molecular size marker, C: E. coli, T: B. thuringiensis, S: Serratia marcescens, B: Streptococcus bovis, G: Geodermatophilus obscurus, R: Rhodococcus sp.
ITS lungo
tRNA
5’ ITS 3’ ITS
ITS corto
16S rDNA
23S rDNA
Molecole omoduplex
Molecole eteroduplex
Gli spaziatori ribosomali trascritti (Intergenic Transcribed Spacer, ITS) presentano polimorfismi in numero, lunghezza e sequenza. Dopo la loro amplificazione con primer universali che appaiano nella zona terminale del 16S rDNA ed in quella iniziale del 23S rDNA, la loro separazione in gel di poliacrilammide MDE evidenzia bande formate da frammenti omoduplex ed eteroduplex.
L’analisi ITS-HHP, è stato applicato a ceppi appartenenti a specie diverse, singole o co-amplificate, dimostrandone l’informatività nel descrivere colture miste.Quando diverse specie sono co-amplificate, si ottengono profili di bande che contengono tutte le bande presenti nei profili dei singoli ceppi. Quando le specie sono affini, come nel caso di B. thuringiensis e S. bovis, si notano bande aggiuntive ( ) costituite da frammenti eteroduplex aventi ciascuna elica proveniente da una specie diversa. Specie ad elevata G+C, come G. obscurus, vengono efficientemente amplificati in coltura mista solo quando sono presenti in quantità preponderante (come nel caso di G+R).
L’ITS-HHP fingerprinting è stato applicato al DNA estratto in due replicati da 2 campioni di liquido ruminale prelevati da ciascuna delle 4 bovine.
Il metodo ha dimostrato una buona riproducibilità: tra i campioni è stata calcolata identità di bande pari in media all’89%, e valori di similarità tra i profili tra il 98% ed il 69%
4 bovine fistolate sono state alimentate per un periodo pre-prova con silomais commerciale (silomais controllo). Sono stati quindi effettuati 2 trial sperimentali ciascuno di 4 settimane, somministrando insilato preparato con mais transgenico (Novartis Bt evento 176) o con mais isogenico normale, seguendo uno schema a cross over,con inversione della dieta al termine del primo periodo.
Nei giorni di prelievo sono stati inseriti nella cavità ruminale per 6 ore dei nylon bags contenenti lo stesso silomais presente nella dieta, con lo scopo di analizzare la microflora che colonizza direttamente il materiale solido introdotto con la dieta.
Analisi bromatologiche e di degradabilità ruminale in vivo sono state condotte sui due tipi di insilato, coltivati raccolti ed insilati nelle medesime condizioni, allo scopo di valutare quanto le diete sottoposte alle bovine fossero sostanzialmente diverse.
ANALISI LIQUIDO RUMINALE
ANALISI CONTENUTO NYLON BAGS (FRAZIONE SOLIDA RUMINALE)
Nelle analisi bromatologiche condotte sui 2 silomais non sono state riscontrate differenze statisticamente significative (<0,05). Alcuni valori sono tuttavia prossimi alla significatività: il silomais Bt contiene più fibra ed acido lattico, in connessione con un minor contenuto in zuccheri solubili, indici che la fermentazione lattica è stata più intensa durante l’insilamento.Questi dati sono in accordo con studi precedenti (Masoero et al., 1999, Maydica)
20 40 60 80 100 120 140 160 18030
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Hours of incubation in the rumen
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Bt silage
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Bt silage
Normal isogenic silage
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Ore di incubazione nel rumine0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Silomais Bt
Silomais isogenico naturaleSilomais controllo
Prove di digeribilità in vivo non hanno evidenziato differenze nei 3 silomais in studio
M MT0 T1 T2 T0 T1 T2 T0 T1 T2 T0 T1 T2
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Cow A Cow B Cow C Cow D
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Liquido ruminale Nylon bags
Dai campioni di liquido ruminale e di silomais contenuto dei nylon bags inseriti nel rumine, è stato estratto il DNA totale ed è stato applicato il metodo ITS-HHP fingerprinting. I profili ottenuti, formati rispettivamente da 263 e 219 bande polimorfiche, risultano altamente informativi.È stata costruita una matrice di similarità che riporta per ogni campione la presenza/assenza di ogni banda polimorfica, elaborata successivamente con 2 tipi di analisi statistica: Principal Component Analysis e Cluster Analysis.
3 giorni al termine di ogni periodo
Principal Component Analysis
I campioni, distribuiti su un grafico bidimensionale sulla base della loro variabilità, sono stati raggruppati in modo da evidenziare differenze correlate ai diversi silomais presenti nella dieta e nei nylon bags, o correlate ai diversi animali studiati.
I risultati della PCA indicano che sia i campioni della fase liquida che della fase solida non sono distinti in base alle diverse diete, infatti si trovano su aree sovrapposte. I campioni, di solido o liquido, provenienti dalle 4 bovine si trovano invece su aree più separate.Da quest’analisi emerge quindi che la dieta non ha significativamente influenzato la microflora ruminale delle bovine. Popolazioni relativamente distinte, sia nella frazione solida che in quella liquida, sono invece state osservate nei 4 animali.I campioni di liquido o solido della bovina B durante il primo trial sperimentale sono particolarmente diversi dagli altri ( ): questo è probabilmente dovuto al fatto che la bovina B in quel periodo ha subito un’operazione, e pertanto ha riportato variazioni significative nella microflora ruminale.
Dim1 15.5%
Dim2 5.51%Silomais controllo
Silomais Bt
Silomais normale
Dim1 15.5%
Dim2 5.51%
A
B
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Liquido ruminale
Variabilità tra le diete Variabilità tra le bovine
Dim1 27.23%
Dim3 8.84%
Silomais Bt
Silomais normale
Dim1 27.23%
Dim3 8.84%
D
C
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A
Nylon bags
Variabilità tra le diete
Variabilità tra le bovine
L’analisi cluster ha raggruppato i campioni in 2 dendrogrammi di similarità che descrivono significativamente la loro diversità (coefficienti di correlazione 0,87 e 0,93).Anche quest’analisi riporta sostanzialmente gli stessi risultati ottenuti con l’analisi PCA: la variabilità esistente tra le comunità batteriche dei diversi animali è superiore alla variabilità creata dai diversi regimi alimentari.Nel liquido ruminale, i campioni della bovina operata (B*) risultano nettamente divergenti dagli altri, sottolineando la variabilità conferita dall’operazione.
Analizzando separatamente i campioni da nylon bag di ogni singola bovina, si evidenzia che la microflora di ciascun animale è nettamente differenziata in base al regime alimentare. Questo risultato si presenta solo nei campioni provenienti da nylon bag, e non nel liquido ruminale, che probabilmente risente maggiormente della forte omeostasi ruminale.
Bt
N
Bt
N
Conclusioni
In questo lavoro proponiamo il metodo ITS-HHP, che sfrutta i polimorfismi di lunghezza e sequenza degli ITS tramite la loro separazione in poliacrilammide MDE, per la descrizione di comunità microbiche ambientali. Abbiamo dimostrato che l’ITS-HHP fornisce fingerprinting altamente informativi, riproducibili e sensibili.
Applicato alle comunità eubatteriche ruminali di bovine alimentate con insilato di mais transgenico Bt ed isogenico non transgenico, l’ITS-HHP ha evidenziato nei singoli animali studiati delle differenze correlate alle diverse diete, in particolare nella microflora associata al silomais direttamente incubato nel rumine. La variabilità riscontrata tra i diversi animali è tuttavia maggiore delle differenze imputabili alle diverse diete che quindi non risultano significative.
