ISOLASI DAN SKRINING BAKTERI ENDOFIT PENGHASIL ...repository.ub.ac.id/7031/1/FIFTA FRIZKI SETYA...
64
ISOLASI DAN SKRINING BAKTERI ENDOFIT PENGHASIL ENZIM L-GLUTAMINASE DARI MANGROVE (Sonneratia alba) SKRIPSI Oleh : FIFTA FRIZKI SETYA NIINGRUM 135080301111108 PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN JURUSAN MANAJEMEN SUMBERDAYA PERAIRAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2017
Transcript of ISOLASI DAN SKRINING BAKTERI ENDOFIT PENGHASIL ...repository.ub.ac.id/7031/1/FIFTA FRIZKI SETYA...
i
ISOLASI DAN SKRINING BAKTERI ENDOFIT PENGHASIL ENZIM L-GLUTAMINASE DARI MANGROVE (Sonneratia alba)
SKRIPSI
Oleh :
FIFTA FRIZKI SETYA NIINGRUM 135080301111108
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN JURUSAN MANAJEMEN SUMBERDAYA PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG 2017
i
i
ISOLASI DAN SKRINING BAKTERI ENDOFIT PENGHASIL ENZIM L-GLUTAMINASE DARI MANGROVE (Sonneratia alba)
SKRIPSI
Sebagai Salah Satu Syarat untuk Meraih Gelar Sarjana Perikanan
Di Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Brawijaya
Oleh :
FIFTA FRIZKI SETYA NINGRUM 135080301111108
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN JURUSAN MANAJEMEN SUMBERDAYA PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG 2017
1
2
Judul :ISOLASI DAN SKRINING BAKTERI ENDOFIT PENGHASIL ENZIM L-
GLUTAMINASE DARI MANGROVE (Sonneratia alba)
Nama Mahasiswa : FIFTA FRIZKI SETYA NINGRUM
NIM : 135080301111108
Program Studi : Teknologi Hasil Perikanan
PENGUJI PEMBIMBING:
Pembimbing 1 : Dr. Sc. ASEP AWALUDIN PRIHANTO, S.Pi, MP
Pembimbing 2 : Dr. Ir. HARTATI KARTIKANINGSIH, MS
PENGUJI BUKAN PEMBIMBING:
Dosen Penguji 1 : Dr. Ir. DWI SETIJAWATI, M.Kes
Dosen Penguji 2 : ABDUL AZIZ JAZIRI,S.PI, M.Sc
Tanggal Ujian : 26 SEPTEMBER 2017
3
PERNYATAAN ORISINALITAS
Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam skripsi isolasi dan skrining
bakteri endofit penghasil enzim L-glutaminase dari mangrove Sonneratia alba
yang saya tulis ini benar merupakan hasil karya sendiri, dan sepanjang
pengetahuan saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis
atau diterbitkan oleh orang lain kecuali yang tertulis dalam naskah ini dan
disebutkan dalam daftar pustaka.
Apabila kemudian hari tebukti atau dapat dibuktikan skripsi ini hasil
penjiplakan (plagiasi), maka saya bersedia menerima sanksi atas perbuatan
tersebut, sesuai hukum yang berlaku di Indonesia.
Malang, Oktober 2017 Mahasiswa
Fifta Frizki Setya Ningrum NIM. 135080301111108
4
DAFTAR RIWAYAT HIDUP
Nama lengkap penulis, yaitu Fifta Frizki Setya Ningrum. Lahir
di Jombang, Jawa Timur. Pada tanggal 08 September 1995,
merupakan anak ke-1 dari 2 bersaudara. Penulis lahir dari
pasangan suami istri Bapak Saipul muslim dn Ibu Astutik.
Penulis bertempat tinggal di Desa: Kebondalem, Kecamatan:
Bareng, Kabupaten :Jombang, Provinsi: Jawa Timur. Penulis berkebangsaan
Indonesia dan beragama islam.
Adapun riwayat pendidikan penulis, yaitu menyelesaikan pendidikan dasar
di SD Negeri 1 Kebondalem Kecamtan Bareng Kabupaten Jombang lulus pada
tahun 2007. SMP Negeri 1 Ngoro Kecamtan Ngoro Kabupaten Jombang lulus
pada tahun 2010. Lalu melanjutkan ke SMA Islam Ngoro jurusan Ilmu
Pengetahuan Alam dan lulus tahun 2013. Setelah itu kuliah di Universitas
Brawijaya Malang jurusan Teknologi Hasil Perikanan. Pada semester akhir tahun
2017 penulis telah menyelesaikan skripsi yang berjudul “Isolasi dan Skrining
Bakteri Penghasil Enzim L-Glutaminase dari Mangrove (Sonneratia Alba)”.
UCAPAN TERIMAKASIH
5
Penyusunan penulisan laporan penelitian ini selesai karena adanya
bantuan dari berbagai pihak maka dari itu penulis menyampaikan ucapan
terimakasih kepaada :
1. Orang tua tercinta Bapak Saiful Muslim dan Ibu Astutik, yang telah
memberikan motivasi, dukungan do’a restu, dan ridho sehingga penulis
dapat menyelesaikan laporan skripsi ini dengan baik.
2. Bapak Dr. Sc. Asep Awaludin Prihanto, S.Pi, MP dan Ibu Dr. Ir. Hartati
Kartikaningsih, MS selaku dosen pembimbing dalam penulis laporan
skripsi yang senantiasa selalu memberikan arahan dan bimbingan
kepada penulis.
3. Adik tersayang yang telah memberikan motivasi, dukungan dan nasehat
selama penulisan skripsi
4. Keluarga besar dari penulis yang telah memberikan semangat, dukungan
dan do’a sehingga skripsi ini dapat berjalan dengan lancar.
5. Sahabat-sahabat seperjuangan Nabilla Aprilianti Ningrum, Intan Dina Dwi
Wati, Farah Rahmadiani, Liestia Ayu, Nur Khasanah Agustika dan Nahda
Nur Fabiyani yang selalu memberikan dukungan dan semangat agar
skripsi ini dapat terselesaikan
6. Pebri Dwi Saputro yang telah memberikan semangat, motivasi, nasehat
dan yang selalu menerima keluh kesah penulis hingga skripsi ini dapat
terselesaikan dengan baik.
7. Teman-teman sebimbingan yang telah memberikan dukungan dan
semangat yang dapat menjadikan motivasi penulis untuk dapat
menyelesaikan skripsi ini dengan baik.
8. Semua pihak yang tidak dapat penulis sampaikan semua, yang telah
memberikan bantuan kepada penulis selama proses hingga skripsi ini
dapat terselesaikan.
6
Malang, Oktober 2017
Fifta Frizki Setya Ningrum NIM. 135080301111108
ABSTRAK
Enzim L-glutaminase merupakan enzim yang mengkatalis dan hidrolisis dari L-glutamin menjadi L-glutamat dan ammonia. L-glutaminase banyak ditemukan di tumbuhan, bakteri dan jamur. Salah satu jenis tumbuhan yang memiliki potensi untuk menghasilkan enzim L-glutaminase adalah endofit mangrove Sonneratia alba. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan
7
bakteri penghasil enzim L-glutaminase dari endofit mangrove Sonneratia alba asal pantai bajul mati malang jawa timur. Metode penelitian yang digunakan adalah deskriptif eksploratif. Pada penelitian ini menggunakan sampel akar, batang dan daun dari mangrove Sonneratia alba, yang di ambil dari pantai bajul mati malang. Sampel yang telah diambil dalam bentuk segar akar, batang dan daun kemudian dipotong dan dilakukan penanaman pada media LBA. Setelah didapatkan isolat bakteri maka akan dilakukan skrining dengan menggunakan media selektif L-glutaminase dan didapatkan hasil bakteri penghasil L-glutaminase. Bakteri yang memiliki aktifitas enzim paling besar akan dilakukan identifikasi bakteri dengan uji pewarnaan gram dan uji microbac system. Dari
hasil isolasi bakteri endofit didapatkan 3 isolat bakteri yang positif menghasilkan enzim L-glutaminase yaitu dari A.SBM, B.SBM dan D.SBM adalah bakteri gram negatif yang memiliki bentuk sel basil dengan motilitas motil, berdiameter koloni 2, 19 mm dan menurut uji microbact system yang dilakukan bakteri tersebut adalah Pseudomonas aeruginosa Kata Kunci : endofit, L-glutaminase, Microbact system, Pseudomonas aeruginosa
ABSTRACT
L-glutaminase enzyme is enzyme that catalyze and hydrolyze L-glutaminase into L-glutamat and ammonia. L-glutaminase enzyme mostly found in plants, bacterias, and fungi. One type of plant that potentially produce L-glutamine enzyme is the endophyte of Sonneratia alba. The purpose of this study was to obtain the bacteria that produce L-glutamine enzyme from endophyte of Sonneratia alba from Bajulmati Beach, Malang, East Java. This research used descriptive explorative method. Fresh samples were roots, stems and leaves of Sonneratia alba were taken from Bajulmati Beach, Malang, East Java. The fresh samples roots, stems and leaves were cutted and planted in LBA media. After isolation of bacteria, the isolates were screened using selective media L-glutamine. The bacteria that had the greatest enzyme activity will be identified using gram staining test and microbact system test. From the result of endophytes bacteria isolation, there were 3 isolates (A. SBM, B.SBM, and D.SBM) which positive ly produced L-glutaminase enzyme, and A.SBM had the best enzyme activity. A.SBM was a gram negative bacteria, basil, motile, and had 2.99mm colony diameters. According to microbact system test, the bacteria well known as Pseudomonas aeruginosa. Keyword : endophyte, L-glutaminase. Microbact system, Pseudomonas aeruginosa
RINGKASAN
8
FIFTA FRIZKI SETYA NINGRUM. Isolasi dan Skrining Bakteri Endofit Penghasil
Enzim L-Glutaminase dari Mangrove Sonneratia alba .(Dibawah bimbingan Dr.
Sc. Asep Awaludin Prihanto, S.Pi, MP dan Dr. Ir. Hartati Kartikaningsih, MS)
Enzim L-glutaminase merupakan enzim yang mengkatalisis dan hidrolisis dari L-glutamin menjadi L-glutamat dan ammonia. Enzim ini dapat dimanfaatkan untuk kesehatan dan pangan. Pada kesehatan enzim ini dimanfaatkan untuk terapi leukemia, dan pada pangan digunakan untuk penambah rasa pada makanan. L-glutaminase banyak ditemukan di jaringan hewan, tumbuhan, bakteri,dan jamur. Salah satu jenis yang memiliki potensi untuk menghasilkan enzim L-glutaminase adalah endofit mangrove. Mikroba endofit merupakan mikroba yang hidup di dalam jaringan tumbuhan dan mampu untuk membentuk suatu koloni dalam jaringan tumbuhan tanpa member efek negatif pada tumbuhan yang ditempatinya sebagai inang. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan bakteri endofit dari mangrove Sonneratia alba yang mampu menghasilkan enzim L-glutaminase dan mengetahui identifikasi bakteri dengan melakukan uji pewarnaan gram dan uji Microbact system. Metode penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah deskriptif eksploratif yang dilakukan dalam dua tahapan. Tahap pertama yaitu skrining bakteri yang menghasilkan enzim L-glutaminase dari endofit mangrove Sonneratia alba. Tahap kedua yaitu identifikasi bakteri penghasil enzim L-glutaminase berdasarkan uji microbact system. Prosedur penelitian yang
dilakukan meliputi isolasi bakteri endofit, skrining bakteri L-glutaminase, dan identifikasi microbact system. Hasil skrining L-glutaminase menunjukkan bahwa ketiga isolat mengasilkan enzim L-glutaminase. Isolat dari akar Sonneratia alba mempunyai
warna biru yang paling terang dan menyebar penuh hingga melebihi batas garis tengah cawan dibandingkan isolat dari batang dan daun. Kemudian mempunyai hasil positif (+++) tiga kali. Sedangkan isolat dari batang dan daun hanya positif (++) dua kali. Hal ini menandakan bahwa isolat dari akar Sonneratia alba
merupakan isolat bakteri yang mampu menghasilkan zona aktivitas enzim L-glutaminase yang paling baik. sehingga digunakan untuk diidentifikasi secara microbact system. Hasil uji microbact system menunjukkan bahwa isolat akar Sonneratia alba adalah Pseudomonas aeruginosa. Hal ini ditandai dengan hasil positif pada uji oksidase sehingga termasuk bakteri Gram negatif. Selanjutnya dilakukan dengan uji microbact 24E.karakteristik bakteri setelah diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 1000x mempunyai karakteristik berbentuk batang, deiameter 2,19 mm, tepi tidak rata, elevansi cembung dan konsistensi kering.
.
9
KATA PENGANTAR
Segala puji dan ucapan syukur dipanjatkan kepada Allah SWT yang
telah melimpahkan rahmat serta karunia-Nya sehingga penulis dapat
menyelesaikan Usulan Skripsi dengan judul ”Isolasi dan Identifikasi Bakteri
Penghasil Enzim L-Glutaminase dari Endofit Mangrove Sonneratia Alba”
Atas terselesaikan skripsi ini penulis menyampaikan terima kasih
sedalam-dalamnya kepada :
1. Dr. Sc, Asep Awaludin Prihanto, S.Pi. MP dan Dr. Ir. Hartati Kartikaningsih,
MP selaku Dosen Pembimbing, yang telah banyak memberikan pengarahan
serta bimbingan sejak penyusunan usulan penelitian skripsi sampai dengan
selesainya penyusunan usulan skripsi ini.
2. Kepada keluarga yang selalu memberikan doa dan dukungan selama
penyusunan usulan skripsi ini.
3. Serta seluruh pihak yang telah membantu terselesaikannya usulan skripsi,
yang tidak bisa disebutkan satu-persatu, saya ucapkan terima kasih.
Dengan segala keterbatasan kemampuan dan kerendahan hati,
semoga skripsi ini bermanfaat dan dapat memberikan informasi bagi pembaca.
Amin.
Malang,
Penyusun
10
DAFTAR ISI
RINGKASAN........................................................................................................... 7 KATA PENGANTAR .............................................................................................. 9 DAFTAR ISI .......................................................................................................... 10 DAFTAR GAMBAR .............................................................................................. 11 DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................... 13 1. PENDAHULUAN .................................................... Error! Bookmark not defined.
1.1 Latar Belakang........................................Error! Bookmark not defined. 1.2 Rumusan Masalah ..................................Error! Bookmark not defined. 1.3 Tujuan Penelitian ....................................Error! Bookmark not defined. 1.4 Manfaat Penelitian ..................................Error! Bookmark not defined. 1.5 Tempat dan Waktu Pelaksanaan ...........Error! Bookmark not defined.
2. TINJAUAN PUSTAKA ........................................... Error! Bookmark not defined.
2.1 Morfologi dan Klasifikasi Sonneratia alba ............. Error! Bookmark not defined. 2.2 Endofit Mangrove ...................................Error! Bookmark not defined. 2.3 Enzim L-Glutaminase .............................Error! Bookmark not defined.
2.3.1 Sumber Enzim L- Glutaminase ..Error! Bookmark not defined. 2.3.2 Aplikasi L-Glutaminase ...............Error! Bookmark not defined.
2.4 Isolasi dan Identifikasi Spesies Mikroorganisme .. Error! Bookmark not defined.
2.4.1 Isolasi Mikroorganisme ...............Error! Bookmark not defined. 2.4.2 Identifikasi Spesies Bakteri Menggunakan Pewarnaan Gram
....................................................Error! Bookmark not defined. 3 METODE PENELITIAN ......................................... Error! Bookmark not defined.
3.1 Alat dan Bahan .......................................Error! Bookmark not defined. 3.1.1 Alat Penelitian ............................Error! Bookmark not defined. 3.1.2 Bahan Penelitian .........................Error! Bookmark not defined.
3.2 Metode Penelitian ...................................Error! Bookmark not defined. 3.3 Prosedur Penelitian ................................Error! Bookmark not defined.
3.3.3 Tahap 1 (Skrining Bakteri Penghasil L-Glutaminase) ........ Error! Bookmark not defined.
3.3.4 Tahap 2 (Identifikasi Mikroorganisme dengan Microbact System) .......................................Error! Bookmark not defined.
4. HASIL DAN PEMBAHASAN ................................. Error! Bookmark not defined.
4.1 Kadar Air Mangrove Sonneratia alba .....Error! Bookmark not defined. 4.2 Isolasi Bakteri Endofit Mangrove ............Error! Bookmark not defined. 4.3 Skrining Bakteri Penghasil L-Glutaminase............ Error! Bookmark not defined. 4.4 Identifikasi Mikroorganisme ....................Error! Bookmark not defined.
4.4.1 Uji Pewarnaan Gram ..................Error! Bookmark not defined. 4.4.2 Uji Microbact System ..................Error! Bookmark not defined.
5. KESIMPULAN DAN SARAN ................................. Error! Bookmark not defined.
5.1 Kesimpulan .............................................Error! Bookmark not defined. 5.2 Saran ......................................................Error! Bookmark not defined.
11
DAFTAR PUSTAKA ................................................... Error! Bookmark not defined. LAMPIRAN ................................................................. Error! Bookmark not defined.
12
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Sonneratia alba ...................................................Error! Bookmark not defined.
2. Mangrove Pedada Putih (Sonneratia alba) ........Error! Bookmark not defined.
3. Tahapan Pewarnaan Gram. ...............................Error! Bookmark not defined.
4. Lokasi Pengambilan Sampel ..............................Error! Bookmark not defined.
5. Bakteri yang tumbuh pada sampel A.SBM akar, B.SBM batang,
D.SBM.daun .......................................................Error! Bookmark not defined.
6. Streak Plate Kuadran ..........................................Error! Bookmark not defined.
7. Stok Isolat agar miring ........................................Error! Bookmark not defined.
8. Foto Hasil Pengamatan Uji aktivitas semikuantitatif L-glutaminase
A.SBM (akar ), B.SBM (batang), D.SBM ( daun).............. Error! Bookmark not
defined.
9. Sel bakteri gram negatif dari endofit mangrove Sonneratia alba kode
A.SBM (perbesaran 1000X) ...............................Error! Bookmark not defined.
10. Pseudomonas aeruginosa(Perbesaran 1000X) .............. Error! Bookmark not
defined.
13
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1. Ciri-ciri Sonneratia alba ................................................ Error! Bookmark not defined.
2. Klasifikasi Enzim ........................................................... Error! Bookmark not defined.
3. Komposisi Media Luria Bertani Agar (LBA) ............... Error! Bookmark not defined.
4. Isolat Bakteri yang Positif L-glutaminase ................... Error! Bookmark not defined.
5. Hasil Identifikasi isolat kode A.SBM dengan Microbact system Error! Bookmark
not defined.
14
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1. Prosedur Penelitian .............................................Error! Bookmark not defined.
2. Diagram Alir Uji Kadar Air Endofit Mangrove Sonneratia alba Error! Bookmark
not defined.
3. Preparasi Sampel Endofit Mangrove Sonneratia alba ...... Error! Bookmark not
defined.
4. Pembuatan Media LBA (Luria Bertani Agar) ......Error! Bookmark not defined.
5. Isolasi Bakteri ......................................................Error! Bookmark not defined.
6.Pemindahan Isolat Bakteri Ke Media Agar Miring .............. Error! Bookmark not
defined.
7. Skrining L-Glutaminase.......................................Error! Bookmark not defined.
8. Identifikasi Mikroorganisme ................................Error! Bookmark not defined.
9. Pengujian Kadar Air ............................................Error! Bookmark not defined.
10. Preparasi Sampel .............................................Error! Bookmark not defined.
11. Pembuatan media LBA .....................................Error! Bookmark not defined.
12. Penanaman sampel ..........................................Error! Bookmark not defined.
13. Isolasi ................................................................Error! Bookmark not defined.
14. Skrining enzim L-glutaminase...........................Error! Bookmark not defined.
15. Identifikasi mikroorganisme ..............................Error! Bookmark not defined.
1
1. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Mangrove merupakan tumbuhan yang memiliki adaptasi yang unik untuk
menghadapi tekanan lingkungan berupa salinitas tinggi, temperatur tinggi dan
radiasi sinar matahari yang kuat serta melimpahnya mikroorganisme dan insekta
(Kokpol, 1990). Tumbuhan yang dapat hidup pada daerah ekstrim tentu memiliki
senyawa metabolit sekunder yang ditemukan pada tumbuhan mangrove meliputi
golongan alkaloid, fenolat dan ekologik penting yang dapat melindungi mangrove
dari kerusakan (Banerjee et al., 2008) adanya peningkatan metabolit sekunder
apabila tumbuh dalam kondisi tertekan.
Sonneratia alba merupakan salah satu spesies mangrove yang tumbuh
dalam keadaan ekstrim salah satunya di Pantai Bajul Mati yang memiliki kadar
garam yang cukup tinggi dan juga temperatur panas tinggi. Pantai Bajul Mati
terletak pada 8026’1” LS dan 112038’11” BT. Pantai Bajulmati merupakan pantai
yang berada pada laut selatan yang mempunyai kadar garam yang cukup tinggi
dibandingkan peraran lain seperti pantai utara, Pantai Bajulmati terletak di
Kecamatan Gedangan, tepatnya ± 58 Km arah selatan dari kota Malang.kondisi
mangrove didaerah ini masih sangat baik dan belum tercemar (Nuddin dan
Setiawan, 2017).
Mikroba endofit mangrove merupakan mikroba yang hidup pada jaringan
vaskular tanaman mangrove dan tidak memberikan efek negatif pada tanaman
tersebut. Kemampuan mikroba endofit dalam menghasilkan metabolit sekunder
yang sama bahkan lebih besar dari tanaman inangnya menjadi peluang yang
besar untuk memperoleh mikroba yang dapat menghasilkan metabolit sekunder
yang diisolasi dari tanaman mangrove tersebut. Hingga saat ini tanaman
mangrove yang diteliti endofitnya masih sedikit sekali sehingga masih terbuka
2
kesempatan yang sangat besar untuk mendapatkan jenis bakteri baru. Endofit
mangrove ini sebagian besar belum termanfaatkan secara maksimal. Cara untuk
mendapatkan endofit mangrove adalah dengan mengisolasi bagian-bagian
mangrove dan menskrining apakah memang terdapat endofit penghasil metabolit
sekunder dari Sonneratia alba (Muhsoni, 2015).
Senyawa metabolit yang terdapat pada endofit Sonneratia alba adalah
Enzim L-glutaminase yang merupakan enzim yang menghidrolisis L-glutamin
menjadi asam L-glutamat dan melepaskan ammonia (Sivakumar et al., 2006). L-
glutaminase berfungsi sebagai enzim terapi dan juga sebagai agen leukemia dan
juga sebagai agen penambah rasa pada makanan. Beberapa penelitian yang
dilakukan sebelumnya melaporkan bahwa bakteri Pseudomonas dan Bacillus
mampu menghasilkan L-glutaminase di air laut. Namun informasi mengenai L-
glutaminase yang di isolasi dari bakteri endofit mangrove dari perairan Indonesia
sangat jarang. Dengan melihat potensi mikroorganisme ini perlu dilakukan
eksplorasi lebih lanjut. Isolasi enzim dari endofit mangrove dilakukan dengan
proses skrining dengan menggunakan media L-glutaminase. Untuk mengetahui
mikroorganisme yang ada pada endofit mangrove digunakan identifikasi
mikroorganisme dengan menggunakan uji microbact yaitu identifikasi untuk
mengetahui mikroorganisme yang terdapat pada suatu endofit mangrove.
1.2 Rumusan Masalah
Rumusan masalah dalam penelitian ini adalah apakah terdapat
mikroorganisme endofit pada mangrove Sonneratia alba yang dapat
menghasilkan enzim L-glutaminase?
3
1.3 Tujuan Penelitian
Tujuan yang ingin dicapai dalam penelitian ini yaitu untuk
mendapatkandan mengidentifikasi spesies bakteri endofit mangrove Sonneratia
alba yang berpotensi menghasilkan enzim L-glutaminase.
1.4 Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan mikroorganisme
penghasil enzim L-glutaminase. Enzim yang dihasilkan sangat berpotensi untuk
diaplikasikan dalam industri pangan maupun non pangan.
1.5 Tempat dan Waktu Pelaksanaan
Penelitian ini dilaksanakan melalui dua tahapan. Penelitian tahap pertama
yaitu isolasi dan skrining bakteri yang menghasilkan enzim L-Glutaminase yang
dilaksanakan di Laboratorium Keamanan Hasil Perikanan dan Laboratorium
Parasit dan Penyakit Ikan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas
Brawijaya Malang pada bulan November 2016 – Maret 2017.
Penelitian tahap kedua yaitu identifikasi spesies bakteri menggunakan
microbact di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas
Brawijaya Malang pada bulan Maret 2017. Sementara pengambilan sampel
dilaksanakan pada bulan November 2016 di Pantai Bajul Mati, Desa Gajahrejo,
Kecamatan Gedangan, Kabupaten Malang.
4
2. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Morfologi dan Klasifikasi Sonneratia alba
Klasifikasi mangrove pedada putih (Sonneratia alba) adalah sebagai
berikut (Safnowandi, 2015).
Kingdom : Plantae
Sub Regnum : Tracheobionta
Super Divisi : Spermatophyta
Divis : Mangnoliophyta
Kelas : Mangnoliophyta
Ordo : Myrtales
Family : Sonneratiaceae
Genus : Sonneratia
Spesies : Sonneratia alba
Gambar 1. Sonneratia alba
Mangrove pedada putih (Sonneratia alba) merupakan tanaman yang
berasal dari salah satu suku Sonneratiaceae. Tanaman ini memiliki ketinggian
±15 meter. Kulit kayu yang dimiliki Sonneratia alba berwarna putih tua hingga
5
coklat dan terdapat celah longitudinal yang halus. Akar dari tanaman ini dapat
muncul dari tanah yang digunakan sebagai akar nafas atau pneumatofor (akar
khusus yang digunakan sebagai pembantu proses pernafasan tambahan
tumbuhan yang hidup diair atau rawa) yang tingginya kira-kira 25 cm berbentuk
lancip dan bagian akar berwarna merah. Habitat dari Sonneratia alba ini lebih
banyak pada daerah pesisir pantai. Kemudian struktur daunnya tersusun
bersebarangan pada cabang yang sama. Bentuk daunnya yaitu bulat telur dan
ujung daun berbentuk emerginate (berlekuk). Panjang daun yaitu rata-rata 5-10
cm, bunganya membentuk kelompok satu hingga tiga bunga perkelompok.
Bunga ini dikelilingi daun mahkota berwarna putih dan mudah sekali rontok.
Kelopak bunga berjumlah 6-8. Bentukan daun seperti lonceng dengan warna
bagian luar hijau dan didalam kemerahan. Sedangkan bentuk buah yaitu bola
dengan ujungnya bertangkai dan bagian dasar terbungkus kelopak bunga, dan
sifat buah tidak membuka ketika matang. Buah mempunyai ukuran 3,5-4,5 cm
dengan warna hijau, permukaan halus dengan kelopak bentuk cawan yang
menutupi dasar buah dan berisi 200 biji. Mangrove pedada putih (Sonneratia
alba) dapat dilihat pada Gambar 2.
Kandungan aktioksidan yang terdapat pada mangrove pedada putih
(Sonneratia alba) adalah senyawa fenol, tanin, busa saponin, dan tritepenoid.
Senyawa alkaloid dan senyawa flavonoid tidak ditemukan pada spesies ini.
Senyawa aktif tanin dapat berperan mendenaturasi protein dan mencegah
pencemaran bakteri. Senyawa saponin merupakan karbohidrat turunan yang ada
ditanaman. Saponin berfungsi sebagai penyimpan karbohidrat, dan merupakan
produk limbah dari metabolisme tumbuh-tumbuhan. Selain itu, saponin juga
berfungsi sebagai pelindung dari serangga. Senyawa tanin merupakan senyawa
polifenol yang terbukti sebagai salah satu senyawa antioksidan yang bekerja
dengan cara menghambat radikal bebas melalui proses oksidasi rantai
6
transportasi elektron. Mekanismenya dengan cara menghambat ion superoksida
yang merupakan radikal bebas endogen (Naiborhu, 2002). Ciri-ciri Sonneratia
alba dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Ciri-ciri Sonneratia alba
Bagian Ciri-ciri
Nama local Prapat, pedada putih, bogem dan prepat Bentuk Pohon dengan tinggi mencapai 15-16 m Akar Berupa akar nafas dan berbentuk kerucut Daun Memiliki susunan tunggal, bersilangan sampai bulat telur.
Bagian ujung membundar sampai berlekuk, panjang 5-10 cm, dengan bagian atas dan bawah permukaan daun hampir sama
Tipe biji Biji normal Kulit kayu Halus,memiliki celah searah longitudinal/retak, warna kulit
krem sampai coklat Ciri khusus Tangkai daun pada bunga dewasa berwarna kuning, helai
kelopak menyebar atau sedikit melengkung ke arah buah Fenologi atau perkembangan tanaman
Berbunga sepanjang tahun (antara 3-4 bulan) Berbuah pada bulan Mei-Juni dan Oktober-November Pembuahan sampai masak yaitu sekitar 2-3 bulan
Bunga Rangkaian satu sampai beberapa bunga bersusun, diujung atau cabang/dahan pohon; mahkota berwarna putih, dengan diameter 5-8 cm; bunga sehari (ephemeral), terbuka menjelang malam hari dan berlangsung sepanjang malam, mengandung banyak madu pada pembuluh kelopak
Buah Memiliki diameter 3,5-4,5 cm; berwarna hijau; permukaan halus; kelopak bunga berbentuk cawan, menutupi dasar buah, helai kelopak menyebar atau melengkung dan berisi 150-200 biji dalam buah
Sumber: Susmalinda (2013)
Gambar 2. Mangrove Pedada Putih (Sonneratia alba) (A. Daun, B. akar dan C. pohon)
Sumber: (Susmalinda, 2013)
7
2.2 Endofit Mangrove
Endofit merupakan mikroorganisme yang hidup bersimbiosis pada
jaringan tanaman tanpa menyebabkan penyakit pada tanaman tersebut. Istilah
endofit pertama kali dikenal pada tahun 1866 oleh De Bary sebagai suatu
mikroorganisme yang hidup pada tanaman dan tidak memberikan efek negatif
(Wang et al., 2008). Mikroba endofit merupakan mikroba yang tumbuh pada
bagian jaringan tumbuhan. Mikroba ini mampu membentuk koloni dalam jaringan
tumbuhan (xylem dan floem) tanpa memberikan efek negatif pada inangnya.
Mikroba endofit yang mampu menghasilkan metabolit sekunder terdapat disetiap
tanaman tingkat tinggi. Mikroba endofit ini tumbuh dijaringan vaskular dari
tanaman inangnya (Stone et al., 2000).
Jaringan vaskular (pembuluh) terletak diseluruh tubuh tanaman untuk,
mengangkut zat-zat antara akar dan tunas (Campbell et al., 2002). Dari berbagai
jenis tanaman yang tersebar di bumi atau sekitar 300.000, tanaman ini masing-
masing mengandung mikroba endofit berjumlah satu atau lebih. Mikroba endofit
ini banyak ditemukan di batang, daun, buah dan akar (Strobel dan Daisy, 2003).
Penelitian yang dilakukan oleh Xiang Ling membuktikan bahwa dalam satu
tumbuhan dapat diisolasi jenis mikroba endofit yang masing-masing mempunyai
potensi untuk memproduksi satu atau beberapa senyawa bioaktif (Xiang et al.,
2007). Selain itu mikroba endofit tidak hanya bakteri tetapi juga jamur atau
mikroba lainnya. Mikroba endofit ini juga dapat berfungsi sebagai antibakteri,
antijamur dan dapat menghasilkan enzim yang bermanfaat untuk bidang industri
maupun pangan (Sinaga, 2009).
Endofit dan tanaman inangnya mempunyai hubungan yang saling
menguntungkan. Mikroba endofit akan melindungi tanaman inangnya dari
serangan patogen dengan menggunakan senyawa yang dikeluarkannya.
Senyawa ini adalah hasil dari metabolisme mikroba endofit yaitu senyawa
8
metabolit sekunder. Metabolit sekunder yang dikeluarkan oleh mikroba endofit
berupa senyawa bioaktif yang berfungsi untuk membunuh patogen. Selain itu
juga dapat menghasilkan enzim. Sedangkan tanaman inangnya akan
menyediakan nutrisi yang dibutuhkan untuk pertumbuhan mikroba endofit
tersebut (Prihatiningtias dan Mae, 2011). Menurut Tan dan Zou (2001), mikroba
endofit memang mempunyai kemampuan untuk menghasilkan metabolit
sekunder yang karakternya sama atau mirip dengan tanaman inangnya. Hal ini
bisa disebabkan karena adanya pertukaran genetik yang terjadi diantara
tanaman inangnya dengan mikroba endofit secara evolusioner.
2.3 Enzim L-Glutaminase
Enzim mampu bekerja terhadap zat atau substrat yang memiliki
hubungan atau kecocokan antara enzim dan substrat. Hubungan keduanya
dapat terjadi pada bagian atau tempat tertentu saja. Bagian atau tempat yang
dapat berhubungan tersebut dinamakan sebagai bagian aktif (active site).
Hubungan tersebut akan terjadi apabila bagian aktif memliki ruang yang tepat
sehingga dapat menampung substrat. Hubungan antara substrat dan enzim akan
membentuk kompleks enzim-substrat (Yuniarsih, 2012).
Enzim juga dapat diklasifikasikan berdasarkan reaksi kimia yang
dikatalisnya. Klasifikasi enzim ini dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Klasifikasi Enzim
Enzim Reaksi Katalis
Hidrolase Dapat mengkatalisis reaksi hidrolisis dari berbagai ikatan yang umumnya melibatkan perpindahan air (H2O). Contoh: esterase, nuklease, deaminase, amidase dan protease.
Isomerase Dapat mengkatalisis isomerase pada molekul yang mengakibatkan perubahan struktur molekul
Ligase Ligase dapat menggabungkan dua molekul menjadi ikatan kovalen
Oksidoreduktase Mengkatalisis reaksi oksidasi atau reduksi yang umunya dapat melibatkan transfer elektron. Contoh: oksidase dan dehidrogenase
Transferase Mentransfer gugus fungsional (metil atau gugus fosfat). Contoh: transglikosidase, transmetilase dan transasetilase.
9
Sumber: (Lehninger, 1982)
Menurut Masri (2014), L-glutaminase merupakan salah satu jenis enzim
hidrolase. Dimana dapat mengkatalisis reaksi hidrolisis L-glutamin menjadi asam
glutamat dan amonia dengan memutus ikatan amida. Enzim hidrolase
merupakan kelompok enzim yang penting dalam pengolahan pangan Karena
enzim ini dapat memecah substrat dengan bantuan molekul air.
Enzim L-glutaminase (EC3.5.1.2) adalah enzim amidohidrolase yang
menghidrolisis L –glutamin menjadi asam L-glutamat dan amonia.Enzim L-
glutaminase mempunyai manfaat yang besar dibidang farmasi dan aditif
makanan (Nandakumara et al., 2003). L-glutaminase diusulkan sebagai enzim
terapi untuk kanker, terutama untuk limfositik akut dan sebagai alternatif L-
asparaginase. L-glutaminase yang diberikan pada sel kanker akan berkorelasi
dengan penipisan glutamin karena ketidak mampuan limfatif sel kanker untuk
mensintesis glutamin sebagai sel normal sehingga dapat menghambat
pertumbuhan sel kanker tersebut. L-glutaminase merupakan enzim yang
dibutuhkan pada industri pangan karena berperan penting mengontrol rasa lezat
makanan seperti kecap karena bertambahnya kandungan asam glutamat
(Siddalingeshwara et al., 2010).
2.3.1 Sumber Enzim L- Glutaminase
Enzim L-glutaminase merupakan enzim yang menghidrolisis asam L-
glutamat dan melepaskan ammonia dan merupakan sebgai bakteri terapi
(Sivakumar et al., 2006). Sumber enzim L-glutaminase ditemukan dibeberapa
bakteri laut yaitu diantaranya adalah bakteri Pseudomonas sp, Vibrio costicola,
Bacillus, Moraxella, Aeromonas, Acinetobacter dan Micrococcus sp. Kemudian
terdapat laporan bahwa mangrove yang berada pada kawasan pantai timur india
memiliki aktivitas L-glutaminase lebih tinggi dari kawasan lain. Mayoritas L-
10
glutaminase diproduksi oleh mikroorganisme yang diisolasi dari tanah tetapi juga
terdapat di lingkungan perairan laut. Kemudian dapat juga produksi komersial L-
glutaminase dapat dilakukan dengan teknologi fermentasi (Dharmaraj et al,
1997). Bakteri penghasil L-glutaminase juga dapat ditemukan di ekosistem
maupun endofit mangrove yaitu jenis Rhizopora, Avicenia, Sonneratia alba dan
Nypa (Bhat dan Shewadeleena, 2013).
2.3.2 Aplikasi L-Glutaminase
Enzim L-glutaminase dapat di aplikasikan pada makanan karena
mempunyai manfaat sebagai agen penguat rasa dan aroma pada makanan
karena dapat meningkatkan kandungan asam glutamat dari makanan kemudian
tahan garam dan panas stabil yang membuat diminati industri makanan
(Loeliger, 2000).
Aplikasi lainnya pada makanan yaitu sebagai aditif selama fermentasi
kecap. Karena komponen dasar bumbu fermentasi adalah asam amino yang
terkandung dalam bahan baku dan diantaranya adalah asam L-glutamat banyak
dikenal sebagai asam amino yang meningkatkan rasa. Sebagai contoh rasa
kecap fermentasi yang unik diatribusikan terutama untuk asam glutamat. Karena
itu aktivitas L-glutaminase yang bertanggung jawab untuk sintesis asam glutamat
membuatnya sebagai aditif penting selama fermentasi kecap. dikenal sebagai
komponen rasa dasar bumbu fermentasi (Nandakumaraet al., 2003).
2.4 Isolasi dan Identifikasi Spesies Mikroorganisme
2.4.1 Isolasi Mikroorganisme
Mikroorganisme di lingkungan pada umumnya berada dalam populasi
campuran, sulit ditemukan mikroorganisme sebagai spesies tunggal. Untuk itu
dibutuhkan metode isolasi agar dapat mencirikan dan mengidentifikasi suatu
11
mikroorganisme tertentu. Langkah pertama yang harus dilakukan adalah
memisahkan mikroorganisme yang satu dari mikroorganisme lainnya yang
dijumpai dalam habitatnya, lalu ditumbuhkan menjadi biakan murni dan barulah
diidentifikasi. Prinsip pada metode isolasi agar cawan adalah mengencerkan
mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari
organism lainnya. Setelah inkubasi. Setiap koloni yang tampak terpisah pada
cawan tersebut adalah berasal dari satu sel tunggal.
Bakteri dapat diisolasi dari berbagai sumber seperti tanah, air, sayuran,
buah-buahan dan berbagai jenis makanan. Isolasi bakteri adalah suatu proses
pemisahan koloni campuran hingga diperoleh koloni tunggal. Bakteri yang
tumbuh secara alami sebagian besar merupakan koloni campuran sehingga
perlu dilakukan isolasi untuk mendapatkan biakan murni. Isolasi bakteri menurut
Hadioetomo (1990), dapat dilakukan dengan menggunakan tiga cara yaitu :
a. Metode Goresan (Streak Plate Method)
Isolasi bakteri dengan metode gores dapat dilakukan dengan cara
menggoreskan suspensi bahan yang mengandung bakteri pada permukaan
media yang terdapat dalam cawan petri steril. Setelah dilakukan proses inkubasi,
bekas goresan akan menjadi koloni-koloni terpisah yang mungkin berasal dari
satu sel bakteri atau biakan murni.
Metode goresan praktis untuk digunakan, hemat biaya dan waktu. Akan
tetapi membutuhkan keterampilan. Kesalahan-kesalahan yang biasa dilakukan
dalam metode ini adalah inokulum yang digunakan dalam jumlah banyak
sehingga menyebabkan kesulitan dalam pemisahan sel. Lalu, permukaan
medium tidak digunakan dalam proses penggoresan, akibatnya pengenceran
tidak terjadi secara optimal.
12
b. Metode Agar Tuang (Pour Plate Method)
Pour plate method dilakukan dengan menginokulasikan suspensi bahan
yang mengandung bakteri kedalam cawan petri steril dan dilanjutkan dengan
menuangkan media agar yang sedang mencair. Koloni-koloni tersebar pada
permukaan agar setelah dilakukan inkubasi yang mungkin berasal dari satu sel
bakteri sehingga dapat diisolasi lebih lanjut. Metode ini mempunyai kelemahan
yaitu membutuhkan waktu yang lama dan bahan dalam jumlah yang banyak
akan tetapi tidak membutuhkan keterampilan tinggi. Biakan campuran diencerkan
dengan menggunakan medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan.
Pengenceran dilakukan dalam beberapa tahap hingga diperoleh koloni tunggal.
c. Metode Sebaran (Spread Plate Method)
Spread Plate Method adalah metode isolasi dengan cara menyebarkan
sampel cair yang mengandung mikoorganisme pada permukaan media agar
dalam petridish steril. Setelah inkubasi, para permukaan media akan tumbuh
koloni-koloni terpisah sehingga didapatka biakan murni.
Metode isolasi merupakan suatu metode untuk memisahkan mikroba
tertentu dari populasi campuran. Terdapat beberapa tahapan untuk mengisolasi,
yaitu pemisahan dengan agar cawan, media cair, isolasi dengan biakan dua
anggota, isolasi sel tunggal dan penggunaan media khusus. Isolasi pada agar
cawan dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu metode gores dan tuang. Isolasi
ini dilakukan pada mikroba yang dapat membentuk koloni yang mudah terpisah
pada media padat seperti kebanyakan bakteri (Hadioetomo, 1985). Isolasi
metode tuang dilakukan menggunakan media cair sebagai medium pengenceran
adalah penurunan jumlah mikroorganisme, sehingga pada pengenceran terakir
akan didapatkan jumlah sel yang semakin sedikit di dalam media. Oleh karena itu
dengan cara dengan cara agar tuang akan diperoleh lempengan jumlah bakteri
yang optimum untuk isolasi (Lay, 1994). Media selektif dapat dipakai untuk
13
mengisolasi mikroba dari alam, baik secara langsung maupun menggunakan
kultur (Rehm dan Read, 1981). Penggunaan media khusus bersifat memberi
kemudahan bagi tumbuhnya galur lain yang tidak dikehendaki. Namun cara ini
masih memungkingkan tumbuhnya galur yang lain yang tidak dikehendaki.
Namun cara ini masih memungkinkan tumbuhnya galur yang lain dengan sifat
hampir bersamaan, akan lebih meyakinkan terutama dalam hal kemurniannya
(Judoamidjojo et al., 1990).
Menurut Hadioetomo (1985) metode cawan gores mempunyai dua
keuntungan yaitu menghemat bahan dan waktu. Akan tetapi metode ini
memerlukan keterampilan yang diperoleh dengan latihan. Maka dari itu peru
diketahui hal-hal yang penting dalam proses penggoresan. Salah satunya adalah
dengan membagi cawan dengan garis. Penggoresan yang sempurna akan
menghasilkan koloni yang terpisah. Sel-sel bakteri akan terpisahkan satu dari
yang lainnya. Sel-sel tunggal yang terpisahkan seperti ini disebut sel induk. Pada
waktu inkubasi setiap sel induk membelah diri dengan belahan biner dalam
waktu 20-30 menit menjadi 2 sel anak dan begitu seterusnya.
Krettiawan (2011) menjelaskan bahwa teknik penanaman dengan
penggoresan bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya ke
dalam medium baru. Adapun model-model penggoresan dalam proses isolasi
antara lain : goresan sinabung, goresan T dan goresan kuadran. (1) Goresan
sinabung tidak digunakan untuk mendapatkan koloni tunggal,melainkan untuk
peremajaan koloni ke media baru, (2) Goresan T yaitu membagi cawan menjadi
bagian menggunakan spidol, kemudian inokulasi daerah 1 sampai 3 dengan
streak zig-zag dan (3) Goresan kuadran hampir sama dengan goresan T, namun
berpola 4 bagian. Goresan awal masih mengandung banyak sel mikroorganisme,
goresan selanjutnya disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin
sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal.
14
Menurut Rostinawati (2008), mengamati morfologi koloni merupakan
tindakan pertama kali jika ingin mempelajari suatu jenis mikroorganisme lebih
lanjut, khususnya untuk tujuan identifikasi. Setelah mendapatkan kultur murni
maka biakan yang diinginkan di tumbuhkan ke berbagai bentuk media untuk
dikenali ciri koloninya. Berikut adalah hal-hal yang perlu diketahui dalam
mengamati morfologi antara lain : (1) ukuran : pinpoint ( titik), small (kecil),
moderate (sedang), large (besar). (2) pigmentasi : mikroorganisme kromogenik
sering memproduksi pigmen intraseuler, beberapa jenis lain memproduksi
pigmen ekstraseluler yang dapat terlarut dalam media. Karakteristik optik diamati
berdasarkan jumlah cahaya yang melewati koloni, opaque (tidak dapat ditembus
cahaya), translucent (dapat ditembus cahaya sebagian), Transparan (bening),
Bentuk : circular,iiregular, spindle, filamentous, rhizoid. (3) Permukaan : halus
mengkilap, kasar, berkerut, kering seperti bubuk. (4) Elevasi :flat, raised, convex,
umbonate, dan (5) Margins : entire, lobate, undulate, serrate, filamentous, curled.
Di dalam dalam ilmu mikrobiologi untuk dapat menelah mikroorganisme
khususnya dalam skala laboratorium, maka terlebih dahulu kita dapat
menumbuhkan mereka dalam suatu biakan yang mana di dalamnya hanya
terdapat mikroorganisme yang kita butuhkan tanpa adanya kontaminasi dari
mikroorganisme lain. Biakan yang semacam ini biasanya dikenal dengan istilah
biakan murni. Untuk melakukan hal ini haruslah dimengerti jenis-jenis nutrisi yang
disyaratkan bakteri dan juga macam lingkungan fisik yang menyediakan kondisi
optimum bagi pertumbuhan bakteri tersebut. Isolasi mikroorganisme yaitu
inokulasi yang merupakan suatu teknik pemindahan biakan tertentu dari medium
yang lama ke medium yang baru dengan tujuan untuk mendapatkan suatu
biakan murni tanpa adanya kontaminasi dari mikroorganisme yang lain yang
tidak diinginkan (Pelczar dan Chan,1986).
15
Media selektif atau media penghambat adalah media yang ditambah zat
kimia tertentu yang bersifat selektif untuk mencegah pertumbuhan
mikroorganisme lain sehingga dapat mengisolasi mikroorganisme tertentu.
Misalnya media yang mengandung kristal violet pada kadar tertentu, dapat
mencegah pertumbuhan bakteri gram positif tanpa mempengaruhi bakteri gram
negatif. Media ini selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu
sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroorganisme lain dan
merangsang pertumbuhan mikroorganisme yang diinginkan. Dijelaskan juga
bahwa menggunakan beberapa jenis media sekaligus memerlukan banyak waktu
dan biaya. Karena itu menggunakan satu jenis media yang paling selektif dan
spesifik akan sangat membantu dan lebih efisien. Untuk dapat memilih dengan
tepat media yang digunakan diperlukan pengetahuan mengenai komposisi media
dan peranan setiap bahan dalam media ( Suwandi, 1999).
2.4.2 Identifikasi Spesies Bakteri Menggunakan Pewarnaan Gram
Identifikasi suatu mikroorganisme dapat dilakukan dengan cara
pewarnaan gram. Metode pewarnaan gram pada suatu mikroorganisme dapat
dikelompokkan menjadi dua, yaitu gram-positif dan gram-negatif berdasarkan
reaksi atau sifat mikroorganisme terhadap cat yang diberikan. Reaksi tersebut
ditentukan oleh komposisi dinding selnya (Nikaido, 1996).
Bakteri gram negatif lebih resisten terhadap obat-obatan dibandingkan
dengan bakteri gram positf. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri
tersebut adalah perbedaan struktur dinding sel bakteri. Pada bakteri gram positif
susunan dinding sel lebih sederhana terdiri dari 2 lapis namun memiliki
lapisanpeptioglikan yang tebal, sementara untuk bakteri gram negatif lebih
kompleks dan terdiri dari 3 lapis namun lapisan peptidoglikan tipis (Lay, 1994).
Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna kristal violet
sehingga akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri
16
gram negatif akan kehilangan zat warna kristal violet setelah dicuci dengan
alkohol, kemudian diberi zat pewarna tandingan yaitu safranin akan tampak
berwarna merah. Perbedaan warna tersebut disebabkan oleh adanya perbedaan
struktur kimiawi pada dinding selnya (Nofiani dan Gusrizal, 2004).
Gambar 3. Tahapan Pewarnaan Gram.
2.4.3 Identifikasi Spesies Mikroorganisme Microbact
Pengidentifikasian spesies mikroorganisme yaitu dengan cara
menganalisa kemapuan metabolisme dengan menggunakan metode uji biokimia.
Uji biokimia tersebut meliputi kemampuan mikroorganisme dalam menggunakan
bagian dari beberapa jenis sumber karbon dan senyawa lainnya yang terdapat
pada tubuhnya. Uji biokimia ini beragam dan semakin banyak jenis senyawa
pengujian yang dilakukan maka akan dapat menghasilkan identifikasi
mikroorgasime secara spesifik hingga tingkat spesiesnya (Brocket al., 1978).
Uji secara fisiologis dapat menggunakan Microbact Identification System,
pada uji ini digunakan untuk mengetahui karakteristik fisiologis dari bakteri gram
positif atau bakteri gram negatif, sehingga dapat diketahui genus dan jenis
bakterinya. Format yang digunakan pada uji ini dalam bentuk test-strip atau
microplate sederhana, dengan hasil yang jelas terlihat sebagai reaksi-reaksi
17
warna berbeda yang dapat diintepretasikan menggunakan Microbact (Arrizal et
al., 2013).
Kit Microbact 12E dan Microbact 12B merupakan identifikasi sitem
komersial yang digunakan untuk bakteri secara umum, bakteri gram positif, dan
bakteri gram negatif golongan enterobacter. Microbact 12E untuk bakteri gram
negatif dan Microbct 12B untuk bakteri gram positif. Pada uji ini terdiri dari
sebanyak 12 substrat biokimia yang berbeda uji ini akan menggunakan
Microbact. Pengujian dengan menggunakan Microbact akan mempermudah
untuk melakukan identifikasi suatu mikroorganisme. Microbact memiliki sistem
yang telah dirancang sedemikian rupa untuk mengidentifikasi mikroorganisme
dengan komposisi substrat dan peraksi yang telah distandarisasi. Pengujian
dengan manggunakan Microbact akan memiliki beberapa ketentuan sebelum
dilakukan pengujian, yaitu sampel isolat yang akan diujikan harus merupakan
isolat yang telah dimurnikan dan dilarutkan kedalam garam fisiologis
(Murtiningsih, 1997).
Prinsip kerja dari Microbact adalah dengan mereaksikan sejumlah suspense
isolat kedalam sumur-sumur yang telah berisi sumber karbon dan senyawa
senyawa biokimia lain yang berjumlahkan 12 jenis. Suspensi bakteri yang
dilarutkan ke dalam garam fisiologis akan ditambahkan ke dalam masing-masing
12 sumur uji biokimia yang telah tersedia. Setelag dilakukan inkubasi selama18-
24 jam pada suhu 37oC reagen yang sesuai akan ditambhkan dan perubahan
warna pada setiap sumur yang berbeda akan dicatat. Evaluasi hasil dapat dilihat
melalui sumur-sumur Microbact apakah positif atau negatif dengan cara
membandingkan dengan tabel warna dan hasil akan ditulis pada formulir Patient
Record. Angka-angka oktal yang telah didapat dari penjumlahan reaksi positif
saja dari tiap-tiap kelompok (3 sumur didapatkan 1 angka oktal). Nama bakteri
18
dapat dilihat dengan menggunakan komputer berdasarkan dengan angka oktal
yang telah didapatkan (Murtiningsih, 1997).
18
3 METODE PENELITIAN
3.1 Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan pada penelitian adalah sebagai berikut:
3.1.1 Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah pisau, mortal dan alu,
timbangan digital, autoklaf, lemari pendingin (LG), pipet mikro, mistar, spidol,
jarum ose, cawan petri, gelas ukur, beaker glass, erlenmeyer, corong, tri angel,
spatula, pipet tetes, bunsen, pengaduk magnet (stirrer), lemari pendingin,pipet
serologis, vortex,pinset, ph meter, dan LAF (Laminer Air Flow).
3.1.2 Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan yaitu daun,buah dan akar dari mangrove
Sonneratia alba, etanol, spirtus, alkohol, medium LBA (yeast extract 0,5%,
pepton 1%, Nacl 1%, agar bakterioogi 15%), akuades, reagen warna (kristal
violet, aquades, yodium, etanol, safranin), kaldu karbohidrat (glukosa, sukrosa,
laktosa, maltose, manitol, BTB (Brom Timol Blue),methyl red-Voges Proskauer
(MR-VP). (Pepton 0,7% (b/v), dektrosa 0,5% (b/v) dan KH2PO4 0,5% (b/v), Na-
fis,media,kertas, kapas steril, media L-Glutaminase (D-glucose, L-Glutaminase,
Na2HPO4, KH2HP04,MgSO4. 7H2O. NaCl, CaCl,agar,dan bromothymol blue),
alumunium foil, tisu, dan plastic warp.
3.2 Metode Penelitian
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode deskriptif
eksploratif. Metode deskriptif ekplortif yaitu metode yang menggambarkan suatu
keadaan atau kejadian. Dalam penelitian yang menggunakan metode deskriptif
hanya akan menggambarkan keadaan objek atau persoalannya dan tidak
dimaksudkan untuk mengambil kesimpulan yang berlaku untuk umum
19
(Suryabrata, 2006). Sedangkan metode eksploratif adalah metode yang
bertujuan untuk menggambarkan keadaan suatu fenomena dalam penelitian ini
tidak dimaksudkan untuk menguji hipotesis tertentu tetapi menggambarkan apa
adanya suatu variable,gejala atau keadaan (Arikunto, 2002).
Metode penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah deskriptif
eksploratif yang dilakukan dalam dua tahapan. Tahap pertama yaitu skrining
bakteri yang menghasilkan enzim L-glutaminase dari endofit mangrove
Sonneratia alba. Tahap kedua yaitu idetifikasi bakteri penghasil enzim L-
glutaminase berdasarkan uji microbact. Hasil penelitian dipaparkan secara
deskriptif eksploratifberdasarkan tahapan-tahapan penelitian yang dilakukan.
Sedangkan pengolahan data dipaparkan secara kuantitatif.
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Pengambilan Sampel dari Endofit Mangrove Jenis Sonneratia alba
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah sampel yang berasal
dari endofit mangrove jenis Sonneratia albayaitu akar, batang dan daun yang
berasal dari pantai Bajul Mati Malang Jawa Timur. Sampel daun Sonneratia alba
diambil dengan cara acak dan dipilih daun sedang tidak terlalu tua dan tidak
terlalu muda dan tidak cacat, kemudian sampel batang Sonneratia alba dipilih
batang percabangan bagian tengah berdiameter ±1cm diambil dengan panjang
10 cm yang tidak cacat, dan untuk sampel akar Sonneratia alba diambil secara
acak akar yang menjulang ke atas dengan keadaan tidak caacat yang
berdiameter ±1cm dengan panjang 10 cm. Kemudian di masukkan ke dalam
wadah sampel. Sampel yang telah diambil dibawa menuju Laboratorium
Keamanan Hasil Perikanan Universitas Brawijaya Malang dan didimpan pada
suhu 4 0C hingga sampel akan digunakan. Pantai Bajul Mati merupakan pantai
pesisir selatan pulau Jawa yang bertempat di Desa Gajahrejo, Kecamatan
Gedangan, Kabupaten Malang, Jawa Timur. Memiliki jarak sekitar 58 km dari
20
kota Malang. Letak geografis pantai Bajulmati pada 8025’52.6” S dan
112038’07.8” E. Peta wilayah pegambilan sampel dapat dilihat pada Gambar 9
Gambar 1. Lokasi Pengambilan Sampel
3.3.2 Uji Kadar Air (BSN, 2006)
Pengujian kadar air, pertama adalah mengkondisikan oven pada suhu
yang akan digunakanhingga mencapai kondisi stabil. Lalu dimasukkan cawan
kosong ke dalam oven minimal 2 jam. Kemudian dipindahkan cawan kosong ke
desikator sekitar 30 menit sampai mencapai suhu ruang dan cawan kosong
(dihitung sebagai berat A). Selanjutnya ditimbang tiap ekstrak yang telah
dihaluskan sebanyak 2 gram ke dalam cawan (dihitung sebagai berat B). Lalu
dimasukkan cawan yang telah diisi dengan sampel ke dalam oven pada suhu
105oc selama 24 jam. Kemudian pindahkan cawan dengan menggunakan alat
penjepit ke dalam desikator selama ± 30 menit kemudian ditimbang (dihitung
sebagai berat C). Perhitungan pengujian kadar air dapat dilihat dibawah ini :
Pantai Bajul Mati
21
Keterangan :
A = berat cawan kosong, dinyatakan dalam gram
B = berat cawan dan sampel, dinyatakan dalam gram
C = berat cawan dan sampel kering atau berat akhir
3.3.3 Tahap 1 (Skrining Bakteri Penghasil L-Glutaminase)
3.3.3.1 Pembuatan Media LB (Luria Bertani Agar) (Kurniasari, 2005)
Pertama semua bahan disiapkan termasuk untuk membuat media LB,
komposisi media tersebut dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 1. Komposisi Media Luria Bertani Agar (LBA)
Bahan Kimia Komposisi
media
Yeast extract 5gr/L Pepton 10gr/L NaCl 10gr/L Agar 15 gr/L Aquades 1L
Sumber : Luria Bertani Agar Himedia (2017)
Untuk menghitung jumlah media yang digunakan, dihitung dulu jumlah
cawan petri yang digunakan,jumlah cawan petri 3 (akar,batang dan daun) yang
tiap cawannya diasumsikan berisi 20 ml media. Sehingga dibutuhkan 3 x 20 ml =
60 ml media LB. Sehingga pembuatan media dibuat sebanyak 100 ml karena di
khawatirkan tumpah atau kurang. Siapkan Erlenmeyer 250 ml masukkan
akuades 50 ml dan bahan 0,5 gram yeast extract, 1 gram pepton, 1 gram NaCl,
1,5 gram agar dan homogenkan dengan magnetic stirrer setelah homogen
kemudian tambahkan 50 ml akuades dan homogenkan kembali. Hal tersebut
bertujuan agar media yang dibuat homogen dan tidak menggumpal pada dasar
Erlenmeyer. kemudian media yang sudah dihomogenkan ditutup kapas dan
% Kadar Air = A+B −C
B X 100%
22
dilapisi lagi dengan alufo dan di sterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada
suhu 1210C selama 15 menit dengan tekanan 1 atm .
3.3.3.2 Sterilisasi Alat dan Media (Mayanti, 2013)
Semua alat yang akan disterilisasi harus dalam keadaan bersih dan
kemudian dibungkus dengan menggunkan kertas dan memasukkan kedalam
autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit dengan tekanan 1 atm. Untuk media
dilakukan penghomogenan media dengan menggunakan magnetic stirrer dan
kemudian direbus terlebih dahulu selama 15 menit untuk lebih menghomogenkan
media. Setelah dilakukan perebusan kemudian dilakukan sterilisasi pada autoklaf
suhu 121oC selama 15 menit dengan tekanan 1 atm. Sedangkan untuk alat-alat
yang tidak tahan panas tinggi cukup dilakukan sterilisasi dengan menggunakan
alkohol 70 %.
3.3.3.3 Preparasi Sampel (Prihanto et al., 2011)
Sampel yang digunakan adalah tanaman mangrove jenis Sonneratia
alba bagian akar, batang dan daun. Pertama hal yang dilakukan yaiitu
membersihkan sampel supaya kotoran tidak menempel dan untuk sampel daun
di potong berukuran kecil ± 1,5 cm x 1,5 cm masing – masing sampel sebanyak
5 potong kemudian untuk sampel batang terlebih dahulu dibelah bagian tengah
tengah dan di potong berukuran kecil ±1,5 cm x 1,5 cm dan sampel akar
perlakuannya sama dengan sampel batang dibelah bagian tengah terlebih
dahulu kemudian di potong berukuran kecil ±1,5 cm c 1,5 cm. Kemudian rendam
potongan sampel pada wadah yang berisi etanol 70 % selama 90 detik untuk
sterilisasi permukaan. kemudian keringkan potongan sampel yang sudah
direndam etanol 70% dengan menggunakan tissue steril Kemudian dilakukan
penanaman pada media LBA.
23
3.3.3.4 Penanaman Sampel pada Media LBA (Kharisma dan Abdul, 2012 )
Setelah media yang telah disterilisasi diletakan ke dalam LAF
(Laminer Air Flow) yang sudah disinari UV selama kurang lebih 30 menit agar
kondisi LAF lebih aseptis. Media dibiarkan hingga menjadi hangat kuku sehingga
tidak terlalu panas. Media yang sudah hangat kuku kemudian dituang pada
cawan petri dan diasumsikan setiap cawan diberikan 20 ml media. Kemudian
media ditunggu hingga padat. Setelah dingin dan media telah padat, sampel
pengenceran ditanam pada media LBA dari pengenceran 10-3 sampai 10-6
secara duplo sebanyak 200 µl pada tiap cawanya. Cawan yang telah dilakukan
penggoresan bakteri kemudian di wrap menggunakan plastik wrap yang
bertujuan untuk meminimalisir adanya kontaminasi dari luar. Selanjutnya media
yang telah ditanam diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0C.
3.3.3.5 Isolasi Bakteri (Pastra et al., 2012)
Setelah diinkubasi bakteri yang berkoloni baik dan tidak spreader
diisolasi kembali pada media yang baru dengan menggunakan metode T dengan
gores 3 bagian dan diinkubasi dengan suhu 37 0C selama 24 jam. Tujuan dari
metode ini adalah untuk mendapatkan koloni yang murni sehingga proses
identifikasi nanti akan jauh lebih mudah dilakukan. Pada tahap ini dilakukan
dengan cara membagi media cawan menjadi 3 bagian. Goresan pada media
dilakukan 3 kali dengan membentuk pola zig-zag. Jarum ose ditempelkan pada
sumber isolat dan kemudian digoreskan secara zig-zag rapat pada media baru
dibagian pertama. Lalu, jarum ose difiksasi bunsen dan digunakan untuk
menggores goresan sebelumnya pada sisi kedua namun tidak serapat goresan
pertama dan begitu pula pada sisi ke tiga goresan dibuat renggang. Pada
metode ini, goresan sisi pertama diharapkan koloni tumbuh padat dan
berhimpitan , sedangkan pada goresan sisi kedua koloni mulai tampak jarang
dan begitu pula selanjutnya. Sehingga didapatkan koloni yang tumbuh secara
24
terpisah dari koloni lain atau disebut dengan isolat murni. Cawan yang telah
dilakukan penggoresan bakteri kemudian di wrap menggunakan plastik wrap
yang bertujuan untuk meminimalisir adanya kontaminasi dari luar. Selanjutya
diinkubasi selama24 jam pada suhu 37 0C.
3.3.3.6 Inokulasi pada Agar Miring (Rakhmawati, 2012)
Hasil dari isolat murni yang didapatkan dari isolasi strik kemudian
dilakukan inokulasi pada tabung reaksi yang berisi media LBA berbentuk agar
miring. Inokulasi dilakukan dengan cara memanaskan jarum ose pada bunsen
hingga memerah kemudian dibiarkan sejenak hingga sedikit dingin. Selanjutnya
jarum ose digunakan untuk mengambil isolat murni (bakteri yang terpisah dari
koloninya) dan digoreskan secara zig-zag pada agar miring. Kemudian tabung
reaksi ditutup dengan menggunakan kapas secara rapat dan diwrap
menggunkan plastik wrap yang bertujuan untuk meminimalisir adanya
kontaminasi dari luar. Selanjutya diinkubasi selama24 jam pada suhu 37 0C.
3.3.3.7 Skrining Bakteri Penghasil Enzim L-Glutaminase (Gulati et al.,1997)
Skrining bakteri yang berpotensi menghasilkan enzim L-glutaminase,
pertama disiapkan bahan media L-glutaminase yaitu D-glucose 0.2 gr, L-
glutaminase 0.5 gr, Na2HP04 0.6 gr, KH2HP04 0.3 gr, MgSO4.7H2O 0.3gr, NaCl
0.05 gr, CaCl 0.002 gr, dan agar 1.5 gr, kemudian dilarutkan dalam 100 ml
aquades dan kemudian dihomogenkan. Setelah homogen ditambahkan
Bromothymol blue 0.0007 % sebagai indikator warna dan ukur pH 5.5 – 6.5,
setelah itu di tutup menggunakan kapas dan alumunium foil dan direbus selama
15 – 20 menit. Kemudian di sterilisasi selama 15 menit pada autoklaf 1210C yang
selanjutnya dituang pada cawan yang sudah steril. Setelah media memadat
ditanam dengan isolat yang telah didapat dari koloni yang diisolasi dalam agar
miring dengan menggunakan tusuk gigi steril . selanjutnya media yang telah
25
diinokulasi, diinkubasi pada suhu 370C selama 24-72 jam. Kemudian diamati
perubahan warna terjadi setiap 24 jam. Apabila positif + glutaminase maka isolat
bakteri yang diinokulasi ke media akan berubah warna . bakteri yang di anggap
bagus kemudian di uji microbact.
3.3.4 Tahap 2 (Identifikasi Mikroorganisme dengan Microbact System)
3.3.4.1 Pewarnaan Gram (Hadioetomo, 1995)
Tahap awal adalah pengambilan isolat murni dengan menggunakan
jarum ose yang sebelumnya dipanaskan terlebih dahulu pada bunsen.
Selanjutnya satu ose bakteri diletakkan pada preparat dan dibuat pewarnaan.
Langkah ini dilakukan sebanyak 3 kali sehingga pada setiap preparat terdapat 3
kali pewarnaan yang diberi kode yang berbeda. Sebelum diberikan pewarnaan,
preparat diberi akuades terlebih dahulu agar mempermudah pemberian
pewarnaan pada preparat. Hasil pewarnaan yang didapat di blower sampai
kering sehingga dapat mempermudah proses pewarnaan gram. Preparat yang
telah kering difiksasi agar bakteri pada preparat mati tetapi tidak merusak struktur
selnya. Kemudian ditetesi kristal ungu dan ditunggu satu menit. Pemberian kristal
ungu adalah sebagai pewarna primer. Setelah ditunggu 1 menit preparat dibilas
untung mencuci sisa kristal ungu yang ada. Lalu diberi iodium untuk memperkuat
warna dan didiamkan kembali satu menit dan dibilas. Kemudian diberi alkohol 70
% untuk melarutkan lemak dan dibilas denga air untuk menghilangkan sisa
alkohol yang tidak terpakai. Tahap berikutnya adalah pemberian safranin sebagai
pewarna sekunder dan dibiarkan selama 30 menit dan dibilas dengan air dan
ditetesi minyak imersi untuk memperjelas indeks bias, preparat yang telah
diwarnai kemudia diamati degan mikroskop.
3.3.3.2 Uji Microbact System (Murtiningsih, 1997)
Uji microbact system adalah uji yang digunakan untuk mengidentifikasi
mikroorganisme. Pengujian ini bergantung pada hasil uji oksidase yang dilakukan
26
sebelumnya. Apabila hasil oksidasenya positif maka pengujian dilakukan dengan
menggunakan microbact24E, dan jika hasil yang didapat negatif maka akan
menggunakan microbact 12E. Sistem ini adalah sistem mikro-substrat standar
yang dirancang untuk mensimulasikan substrat biokimia konvensional yang
digunakan untuk mengidentifikasi basil gram negatif (Murtiningsih, 1997).
Tahapan pada uji ini pertama isolat murni di sentrifuge dengan kecepatan 3000
rpm selama 15 menit. Dari hasil sentrifuge didapatkan supernatan dan pelet
namun yang digunakan hanya bagian yang pelet saja. Kemudian pelet yang
dihasilkan diberi Nafis sebanyak 5 ml kemudian dimasukkan pada sumur
Microbact 24E atau 12E tergantung kepada hasil oksidasenya sebanyak 0,1 ml
dan diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37 0C. Evaluasi hasilnya dapat
dilihat pada sumur microbact, apakah hasilnya positif atau negatif dengan cara
membandingkan tabel warna dan hasilnya akan ditulis pada formulir Patient
Record. Angka-angka oktal didapat dari penjumlahan reaksi positif saja, dari tiap-
tiap kelompok. Dari total ini selanjutnya dapat diketahui spesies bakteri yang
dimaksud dengan memasukkan data kedalam software komputer (Ballows et al.,
1991).
Identifikasi mikroorganisme menggunakan Microbact System ini terdiri
dari beberapa uji yaitu uji oksidase, motilitas, nitrat, lisin, ornitin, H2S, glukosa,
manitol, sitrat, indol, urease,V-P, sitrat, TDA, gelatin, malonase, intisitol, sorbitol,
rhamnosa, sukrosa, lactosa, arabinosa, adonitol, raffinosa, salicin, dan arginin.
Untuk penjelasan dari tiap uji dapat dijabarkan sebagai berikut:
- Uji Motilitas (Tittsler, 1996 dan Presscott, 2002)
Uji motilitas biasanya digunakan sebagai uji untuk membedakan
mikroorganisme berdasarkan matilitasnya, yaitu adalah salah satu ciri dari
mahluk hidup atau mikroorganisme yan mempunyai alat gerak sederhana yang
berupa flagel atau cilia. Bakteri menggunakan energi yang mereka dapat dari
27
ATP untuk bergerak. ATP diuraikan oleh koenzim ATP-ase dan membentuk fosfo
anorganik. Cara kerja pengujian ini adalah dengan menanam isolat pada media
NA tegak dan ditusukkan sedalam 5 mm, kemudian diinkubasi selama 24 jam
pada suhu 37 0C.
- Uji Oksidase (Lay, 1994)
Uji oksidase dilakukan untuk mengetahui adanya sitokrom oksidase yang
dapat ditemukan pada mikroorganisme tertentu. Pertama, biakan ditumbuhkan
pada media NA dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30 0C. Kemudian
ditambahkan reagen uji oksidase yang terdiri dari campuran 1 % larutan α-naftol
dan 1 % larutan-p-fenilendiamin oksalat pada koloni bakteri dan selanjutnya
didiamkan selama 30 menit. Hasil uji dinyatakan postif apabila berwarna hitam.
- Uji Nitrat (Wedhastri, 2002)
Penggunaan uji nitrat adalah untuk menguji kemampuan mikroorganisme
yang dapat tumbuh pada media yang mengandung pepton sebagai sumber
nitrogen. Cara kerja dari pengujian ini adalah isolat ditumbuhkan pada media
yang mengandung KNO3, kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 0C.
Setelah itu ditambahkan larutan asam sulfanilat dan larutan alfa-naftilamin, dan
dilihat reaksinya. Pada umumnya, pada medium agar milk, isolat akan tumbuh
berbentuk bulat, dengan warna yang beragam dan besar diameter yang beragam
pula.
- Uji Ornitin (Wahyunio, 2011)
Pada pengujian ditahap ini kita menggukan media MIO untuk dapat
mengetahui reaksi terhadap ornitin, dapat juga digunakan untuk megetahui ada
atau tidaknya pergerakan bakteri yang diuji serta kemampuan bakteri tersebut
dalam penghasilan indol.
28
- Uji H2S (Didje et al., 2006)
Uji H2S biasa digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme
dalam menghidrolisis logam berat yang terdapat pada media biakan. Hasil uji
dinyatakan positif apabila terjadinya pembentukan warna hitam pada media.
Cara kerja yang dilakukan adalah dengan menanam isolat pada media TSIA
(Triple Sugar Iron Agar).
- Uji Urease (Ramdany, 2008)
Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui apakah suatu bakteri dapat
menghidrolisis atau mendegradasi urea dengan enzim urease. Isolat pertama di
tumbuhkan pada media yang mengandung urea. Beberapa bakteri mampu
menghasilkan enzim urease yang daoan menguraikan urea menjadi amonium
dan CO2. Uji ini dinyatakan positif apabila terjadi perubahan warna dari warna
merah jingga menjadi merah ungu. Apabila telah terjadi perubahan warna maka,
penguraian urea telah terjadi.
- Uji Indol (Ramdany, 2008)
Uji indol adalah uji untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme unutk
mmbentuk lapisan cincin yang memiliki warna merah muda pada permukaan
biakan dengan penambahan larutan kovacs. Selain itu, Norman (2008) juga
menyatakan bahwa uji ini mampu menunjukan mampu atau tidaknya suatu
bakteri untul menghidrolisis triptofan dengan memanfaatkan enzim triftophanase.
Cara kerja dari pengujian ini adalah dengan menumbuhkan isolat bakteri pada
media yang mengandung triptofan dan menginkubasi biakan tersebut selama 48
jam pada suhu 37 0C. Kemudian dilakukan penambahan larutan reagen yang
mengandung paradimetil aminobenzal dehida.
- Uji V-P (Ramdany, 2008)
Uji V-P (Vogues-Proskauer) digunakan untuk menguji kemampuan bakteri
atau mikroorganisme untuk bereaksi dengan asetonin dan oksigen yang
29
menghasilkan fermentasi akhir berupa asetil metil karbinol. Cara kerja dari
pengujian ini adalah isolat ditumbuhkan pada media yang mengandung glukosa
dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 0C. Lalu, dilakukan penambahan
reagen KOH 40 % dan 15 tetes larutan alpha naphtol.
- Uji Gelatin (Ramdany, 2008)
Uji gelatin digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme
dalam mencairkan gelatin. Cara kerja dari uji ini adalah dengan cara menusukan
isolat bakteri kedalam media semi pada yang mengandung nutrient kaldu dan
gelatin dan kemudian diinkubasi pada suhu 35 0C dan diamati. Gelatin yang telah
mencair setelah diinkubasi kemudia diletakkan kedalam lemari es selama 30
menit. Apabila bakteri dapat mencerna gelatin maka, media semi padat gelatin
tersebut akan tetap berbentuk cair, apabila bakteri tidak mampu mencerna
gelatin, maka media akan menjadi beku.
- Uji Sitrat (Ramdany, 2008)
Uji sitrat ini biasanya dilakukan untuk mengetahui dan menguji apakah
bakteri atau mkiroorganismee mampu memfermentasikan asam sitrat sebagai
sumber karbon satu-satunya pada media. Biasanya terjadinya fermentasi asam
sitrat terjadi dengan terjadinya perubahan warna pada media menjadi biru perusi
yang dinyatakan dengan hasil yang positif (+). Apabila tidak terjadi perubahan
warna maka, hasil yang didapatkan adalah negatif (-). Bakteri yang mengalami
perubahan menandakan bahwa bakteri tersebut memiliki enzim sitrat yang
merupakan enzim yang spesifik pembawa sitrat menuju kedalam sel.
- Uji Lisin (Wayan, 2007)
Uji lisin biasanya digunakan untuk mengetahui reaksi bakteri terhadap
asam amino, dan selain itu pengujian ini bertujuan untuk mengetahui apakah
bakteri yang diperiksa akan membetuk asam sulfida dan terjadi perubahan pH
media.
30
- Uji Arginin (Ramdany, 2008)
Pada pengujian arginin cara kerja yang dilakukan hampir sama dengan
kerja uji lisin. Pengujian ini dilakukan unutk mengetahui reaksi apakah yang
terjadi pada bakteri terhadap asam amino yang lebih kompleks. Apabila uji ini
dinyatakan positif (+) maka bakteri mampu bereaksi dengan asam amino, dan
apabila bakteri mendapatkan hasil negatif (-) maka, bakteri tidak mampu bereaksi
dengan asam amino kompleks.
- Uji Gula-gula (Tedja, 2007)
Uji gula-gula digunakan untuk mengetahui kemampuan suatu
mikroorganisme dalam mendegradasi dan memfermentasikan karbohidrat yang
akan disertai dengan adanya pembentukan asam maupun gas yang meliputi uji :
glukosa, sukrosa, laktosa, manitol, galaktosa dan maltose.
31
4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Kadar Air Mangrove Sonneratia alba
Kadar air dari mangrove Sonneratia alba adalah akar (75,19%), batang
(46, 34%) dan daun (78,14%) . Kadar air mangrove dari hasil penelitian Jacoeb
et al. (2011). Adalah akar (68,96%), batang (47,12%) dan daun (74,72%). Dari
hasil uji kadar air didapatkan kandungan air lebih banyak dibandingkan dengan
akar dan batang. Perbedaan tersebut terkait fungsi daun dalam fotosintesis yang
menghasilkan kadar air. Kadar air hasil penelitian lebih besar jika dibandingkan
dengan kadar air hasil penelitian Jacob et al. (2011). Hasil tersebut
memperlihatkan bahwa sampel penilitian yang digunakan masih sangat segar .
Kadar air batang penelitian lebih kecil, hasil kadar air penelitian rendah
disebabkan oleh habitat mangrove yang bersalinitas tinggi dan suhu habitat yang
tinggi. Kadar air diperlukan untuk kelangsungan biokimia organisme hidup,
sehingga sangat esensial dalam menentukan kandungan kadar air pada bahan.
Menurut Ahmadi dan Estiasih (2009), mikroorganisme dapat tumbuh pada
kisaran kadar air tertentu untuk tumbuh karena ketika kadar air tidak sesuai maka
dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Menurut Piggot dan Tucker
(1990), mikroorganisme yang dapat tumbuh pada kisaran kadar air 75-100%
adalah bakteri Pseudomonas, Acetobacter, Flavobaterium dan Zymomonas.
4.2 Isolasi Bakteri Endofit Mangrove
Pada penelitian ini diperoleh bakteri yang diisolasi dari endofit (akar,
batang dan daun) mangrove jenis Sonnetaria alba mempunyai kadanddapat
tumbuh dan berkembang dengan baik pada media uji. Media tersebut adalah LB
(Luria Bertani). Bakteri yang tumbuh dapat dilihat pada Gambar 5. setelah
diinkubasi selama 24 jam bakteri tumbuh dengan baik berbentuk koloni.
32
Kemudian koloni bakteri dimurnikan dengan metode streak plate secara kuadran
pada media LB. streak plate secara kuadran bertujuan untuk mendapatkan
bakteri yang murni atau terpisah koloninya bakteri yang tumbuh pada streak plate
dapat dilihat pada Gambar 6. Hal tersebut sesuai dengan pernyataan Pelczar
dan Chan (1986). Streak kuadran bertujuan untuk mendapatkan suatu biakan
murni tanpa adanya kontaminasi dari mikroorganisme yang lain yang tidak
diinginkan. Berdasarkan hasil streak plate kuadran diperoleh 3 isolat bakteri.
Isolat bakteri diberi kode A.SBM, B.SBM, D.SBM (A.SBM adalah akar Sonneratia
alba dari pantai Bajulmati, B.SBM adalah batang Sonneratia alba dari Pantai
Bajulmati, D.SBM adalah daun Sonneratia alba dari Pantai Bajulmati).
zzzz
Gambar 1. Bakteri yang tumbuh pada sampel A.SBM akar, B.SBM batang, D.SBM.daun
Gambar 2. Streak Plate Kuadran
Koloni bakteri endofit mangrove mempunyai permukaan koloni yang
cenderung berwarna putih,kekuningan,atau putih kental seperti susu. Ciri yang
A.SBM B.SBM D.SBM
M
A.SBM B.SBM
M
D.SBM
33
lain yaitu dengan bentuk sel individu,serta bentuk koloni bulat, oval atau tidak
beraturan (Pelczar dan Chan, 1986).
Isolat bakteri pada cawan kemudian dipindahkan pada agar miring. Hal
tersebut dilakukan bertujuan untukmenyimpan isolat bakteri sehingga dapat
digunakan dalam jangka waktu yang lama. Peremajaan dilakukan secara
berkala. Peremajaan bertujuan untuk mengaktivasi isolat bakteri dan
mengoptimalkan pertumbuhan bakteri tersebut. Isolat bakteri pada agar miring
dapat dilihat pada Gambar 7.
Gambar 3. Stok Isolat agar miring
4.3 Skrining Bakteri Penghasil L-Glutaminase
Sebanyak 3 isolat bakteri berhasil diisolasi dari endofit mangrove
Sonneratia alba. Selanjutnya masing-masing isolat tersebut diinokulasikan pada
media skrining L-glutaminase yang telah diberi indikator BTB (Bromotymol Blue).
Media ini berfungsi untuk penapisan atau skrining bakteri yang dapat
menghasilkan enzim L-glutaminase. Skrining bakteri dapat dilihat pada Gambar.
8 Apabila isolat bakteri ini positif (+) L-glutaminase maka akan terjadi perubahan
warna pada koloni bakteri yaitu dari kuning menjadi biru adapun pengamatan
34
semikuantitatif skrining bakteri dapat dilihat pada Gambar 8. Sedangkan untuk
pengamatan pertumbuhannya dapat dilihat pada Tabel 4.
Pengulangan I
Pengulangan II
Gambar 4. Foto Hasil Pengamatan Uji aktivitas semikuantitatif L-glutaminase A.SBM (akar ), B.SBM (batang), D.SBM ( daun)
Tabel 1. Isolat Bakteri yang Positif L-glutaminase
No Kode Zona Aktivitas Enzim
1. A.SBM, +++ 2. B.SBM ++ 3. D.SBM ++
Keterangan : + : Zona Aktivitas Enzim yang dihasilkan sedikit ++ : Zona Aktivitas Enzim yang dihasilkan sedang +++ : Zona Aktivitas Enzim yang dihasilkan banyak
Dari Gambar 8, diperoleh bahwa cawan dengan kode A.SBM mempunyai
warna biru yang paling menyebar penuh hingga melebihi garis tengah,
D.SBM B.SBM A.SBM
M
A.SBM
MM
B.SBM
D.SBM
35
sedangkan untuk cawan kode B.SBM dan D.SBM tidak terlalu terang dan tidak
menyebar terlalu luas. Warna biru yang paling menyebar penuh dicawan
merupakan bakteri yang dapat menghasilkan enzim L-glutaminase paling baik.
Menurut Yati, 2010. Selama pengamatan berlangsung diberikan tanda positif (+)
pada kolom pengamatan sesuai dengan perubahan warna pada cawan. Apabila
zona aktivitas enzim yang dihasilkan sedikit diberikan tanda positif (+) satu kali,.
zona aktivitas enzim yang dihasilkan sedang positif (++) dua kali dan jika zona
aktivitas enzim yang dihasilkan banyak maka positif (+++) tiga kali. Dari tabel
diatas, cawan A.SBM mempunyai hasil positif (+++) tiga kali. Sedangkan cawan
B.SBM positif (++) dua kali dan D.SBM positif (++) dua kali. Hal tersebut
manandakan bahwa cawan A.SBM merupakan isolat bakteri yang mampu
menghasilkan zona aktivitas enzim paling banyak pada media skrining L-
glutaminase dan dapat digunakan untuk diidentifikasi mikroorganisme dengan uji
microbact.Perubahan warna pada medium disekitar koloni mikroba yang
memproduksi L-glutaminase yang semula kuning menjadi biru karena
penambahan bromothymol blue merupaka indikasi perubahan pH karena
pewarna BTB akan berwarna kuning pada pH asam dan akan berubah mejadi
biru pada pH basa. Karena adanya pembentukan amoniak, maka pH media akan
menjadi alkali dan pewarna BTB akan berubah menjadi biru. Kelebihan BTB
dibandingkan dengan phenol red adalah memberikan warna yang tajam dan
kontras (Gulatiet al., 1977).
4.4 Identifikasi Mikroorganisme
Mikroba berukuran sangat kecil, sehingga diperlukan alat bantu untuk
mengamatinya. Namun demikian, penggunaan alat bantu tersebut hanya untuk
mengamati morfologinya. Masih diperlukan metode lain untuk mampu
mengidentifikasinya. Identifikasi mikroba berguna untuk mempelajari secara
36
detail karakter fisik, kimiawi, dan biologis mikroba sehingga dapat diketahui dan
dimanfaatkan secara optimal. Identifikasi merupakan kegiatan utama dalam
kegiatan untuk membuat klarifikasi atau toksonomi. Berdasarkan klasifikasi dan
taksonomi keanekaragaman hayati makhluk hidup dapat dipelajari dan
dipahami dengan lebih mudah dan utuh. Kegiatan identifikasi adalah
menentukan nama hewan atau tumbuhan dengan bener dan menempatkannya
di dalam system klasifikasi hewan dan tumbuhan. Identifikasi mikroorganisme
dilakukan dengan dua tahapan yang pertama uji pewarnaan gram sehingga
diketahui bakteri gram positif atau gram negatif kemudian dilakukan uji lanjutan
yaitu uji microbact system yang bertujuan untuk mengetahui sifat biokimia pada
bakteri sehingga dapat ditentukan jenis dan spesies.
4.4.1 Uji Pewarnaan Gram
Uji pewarnaan gram dilakukan untuk mengetahui apakah bakteri
tersebut merupakan bakteri gram positif atau bakteri gram negatif, bakteri gram
positif memiliki warna ungu sedangkan bakteri gram negatif bewarna merah,
Perwarnaan gram bertujuan untuk mengamati morfologi sel bakteri dan
mengetahui kemurnian sel (Fardiaz, 1993). Hasil pewarnaan gram bahwa
bakteri gram positif adalah beteri yang dapat mempertahankan zat warna metal
ungu saat diamati di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negatif tidak
dapat mempertahankan zat warna metal ungu dan bakteri gram negatif akan
bewarna merah muda saat diamati dibawah mikroskop. Perbedaan klasifikasi
antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur
dinding sel bakteri (Pelezar dan Chan, 1986).
Perbedaan reaksi kedua golongan bakteri tersebut terhadap pewarnaan
gram disebabkan bakteri gram positif memiliki dinding sel tebal yang akan
menyusut pada saat pembilasan alkohol, sehingga pori-porinya menutup dan
37
mencegah keluarnya kompleks pewarna primer pada saat pemucatan.
Sedangkan dinding sel bakteri gram negatif mengandung banyak lipid yang
larut dalam alkohol pada saat pembilasan. Larutnya lipid memperbesar pori-pori
dinding sel dan proses pemucatan berlangsung cepat ( Cappucino,1983).
Pada hasil yang didapatkan bakteri dari endofit akar mangrove
Sonneratia alba, bahwa sel bakteri yang diamati menggunakan mikroskop
dengan perbesaran 1000X tersebut termasuk dalam golongan bakteri gram
negatif karena memiliki warna merah. Bakteri tersebut memiliki bentuk batang
dengan motilitas motil. Memiliki diameter koloni 2,19 mm.
Gambar 5. Sel bakteri gram negatif dari endofit mangrove Sonneratia alba kode
A.SBM (perbesaran 1000X)
4.4.2 Uji Microbact System
Setelah dilakukan uji pewarnaan gram dan diketahui bahwa isolat bakteri
merupakan jenis bakteri gram negatif, maka dilakukan tahap identifikasi bakteri
dengan menggunakan microbact system, sebelum dilakukan uji microbactsystem
dilakukan uji oksidase terlebih dahulu uji oksidase, apabila uji oksidase yang
telah dilakukan hasilnya positif maka menggunakan microbact 24E, dan apabila
hasil dari uji oksidase tersebut negatif maka menggunakan microbact 12E
(Murtiningsih,1997).
Pada hasil yang didapatkan bakteri dari endofit akar mangrove
Sonneratia alba. Bahwa bakteri tersebut memiliki uji oksidase negatif, sehingga
pada uji microbact system ini menggunakan microbact 24E. Pada uji tersebut
38
akan dilakukan uji meliputi uji motilitas, oksidase, spora, nitrat, lysine, ornithin,
H2S, glukosa, manitol, xylosa, ONPG, indole, V-P, sitrat, TDA, gelatin, moalonat,,
adonitol, raffinosa, salicin, arginin, katalase, koagulase, hemolisa, starch
hydrolysis, casein hydrolysis. Hasil menyebutkan bahwa bakteri dari endofit akar
mangrove Sonneratia alba adalah spesies Pseudomonas aeruginosa. Hasil
identifikasi dapat dilihat pada Tabel 5.
Tabel 2. Hasil Identifikasi isolat kode A.SBM dengan Microbact system
No. Uji Biokimia Penelitian Bergeys Hayati (2006)
1 Spora - Tidak diketahui - 2 Oksidase + + + 3 Motilitas + Tidak diketahui + 4 Nitrat + Tidak diketahui - 5 Lysine + + - 6 Ornithin - + - 7 H2S - - - 8 Glukosa + + + 9 Manitol - + +
10 Xylosa + - - 11 ONPG - Tidak diketahui + 12 Indole - Tidak diketahui - 13 Urease - - - 14 V-P - - - 15 Sitrat + + - 16 TDA - - + 17 Gelatin + + - 18 Malonat + + - 19 Inositol - - - 20 Rhamnosa + - - 21 Sukrosa - - - 22 Lactose - - - 23 Arabinosa - - + 24 Adonitol - - - 25 Raffinosa - Tidak diketahui - 26 Salicin - Tidak diketahui - 27 Katalase + + - 28 Arginin - Tidak diketahui +
29 Koagulase - Tidak diketahui Tidak
diketahui
30 Hemolisa Beta Tidak diketahui Tidak
diketahui
31 Uji sensitive Novobiosin
TDK Tidak diketahui Tidak
diketahui
32 Starch hydrolysis - - Tidak
diketahui
33 Casein hydrolysis + Tidak diketahui Tidak
diketahui
39
Dari hasil yang didapatkan pada tabel 5, dapat dijelaskan sebagai berikut
- Uji Fermentasi Gula
Berdasarkan hasil identifikasi bakteri dengan menggunakan uji microbact
12A/12E, maka isolat bakteri dari endofit akar mangrove Sonneratia alba
termasuk dalam spesies Pseudomonas aeruginosa. Adapun fermentasi gula-gula
yang dihasilkan bernilai positif adalah glukosa, xylosa, rhamnos dan malonat
sedangkan yang bernilai negatif adalah manitol, arabinosa, inositol, sukrosa,
lactosa, adonitol, rafinosa, salicin dan arginin. Sumber gula-gula sederhana
dimanfaatkan bakteri sebagai sumber karbon untuk fermentasi. Jika sumber gula
sederhana tidak ada maka bakteri memanfaatkan sumber gula kompleks untuk
fermentasi (Tedja, 2007). Hal tersebut dapat dilihat bahwa kemampuan isolat
bakteri dari endofit daun mangrove Sonneratia alba dapat memfermentasikan
komponen gula glukosa,xylosa,rhamnosa dan malonat.
- Uji Karakteristik Biokimia
Uji karakteristik biokimia yang dilakukan adalah endospora,
oksidase,motilitas,reduksi nitrat, H2S,indole, V-P,gelatin,katalase,beta-
hemolisa,starch hydrolysis, dan casein hydrolysis. Hasil uji tersebut secara
berturut-turut adalah endospora negatif (-), oksidase positif (+),motilitas positif
(+), reduksi nitrat positif (+), H2S negatif (-),indole negatif (-), V-P negatif (-
),gelatin positif (+),katalase positif (+),beta-hemolisa positif (+),starch hydrolysis
negatif (-), dan casein hydrolysis positif (+).
Uji VP (Voges Proskauer) adalah tes yang digunakan untuk medeteksi
acetoin dalam kultur cair bakteri. Pengujian ini dilakukan dengan menambahkan
alpha naftol dan kalium hidroksida dengan kaldu voges-proskauer yang telah
diinokulasi dengan bakteri. Warna merah menunjukkan hasil yang positif,
40
sedangkan warna kuning-coklat menunjukkan hasil negatif. Tes ini tergantung
pada pencernaan glukosa menjadi accetylmethylcarbinol. Jika glukosa pecah,
maka akan bereaksi dengan alpha naftol(VP reagen 1) dan kalium hidroksida
(VP reagen 2) untuk membentuk warna merah. Alpha naftoldan kalium hidroksida
adalah bahan kimia yang mendeteksi accetoin (Sridhar,2006). Asetil metil
karbinol (acetoin) adalah perantara dalam produksi butilen glikol dalam
fermentasi karbohidrat. Peran alpha naftol adalah untuk katalis dan penguat
warna. Uji ini negatif untuk Pseudomonas aeruginosa karena Pseudomonas
aeruginosa memfermentasikan karbohidrat menjadi produk asam dan tidak
menghasilkan produk netral seperti asetoin.
Uji motilitas sering kali digunakan dalam diferensiasi dari
enterobacteriaceae (Fardiaz, 1992). Hasil uji motilitas Pseudomonas aeruginosa
adalah positif, hal ini ditunjukkan adanya pertumbuhan bakteri disekitar area
penusukan. Pergerakan dari bakteri tersebut karena media semisolid (SIM)
dirancang dengan mengurangi konsentrasi agar pada media yaitu sekitar 0,4%
pada media yang hanya cukup untuk mempertahankan benuknya sementara
memungkinkan pergerakan bakteri bergerak (Sridhar,2006).
4.3.3 Pseudomonas aeruginosa
Klasifikasi dari Pseudomonas aeruginosa sebagai berikut :
Division : Proteobacteria Kelas : Gammaproteobacteria Ordo : Pseudomonadales Family : Pseudomonadaceae Genus : Pseudomonas Spesies : Pseudomonas aeruginosa
41
Gambar 6. Pseudomonas aeruginosa(Perbesaran 1000X)
Pseudomonas aeruginosa merupakan bakteri gram negatif yang
berbentuk batang, tersusun secara tunggal atau dalam rantai,mempunyai flagel
tunggal dan terkadang terdiri atas 2-3 flagel, mempunyai ukuran 0,5-1µm x 3-4
µm (Radji, 2011).
Pseudomonas aeruginosa adalah bakteri gram negatif berbentuk
batang,bergerak dengan flagella dan bersifat aerob. Bakteri ini banyak
menginfeksi penderita di rumah sakit dengan predisposisi tertentu. Mempunyai
pili type IV yang berfungsi sebagai adhesin untuk mengikat sel host.
Pseudomonas aeruginosa dapat melakukan adhesi dan kolonisasi pada
bermacam-macam type sel dari epitel sel buccal, paru, ginjal dan sel endhotel
(Comolli, 1999).
Bakteri Gram negatif yang dominan ditemukan pada mangrove yaitu
Vibrio, Pseudomonas aeruginosa, Methylococcus, Acinetobacter dan
Alteromonads spp. Pada mangrove karena kekayaan dalam kandungan karbon
dan kandungan nutrisi lainnya, kebanyakan mikroba yang hidup pada mangrove
adalah bakteri halophilic dan halotolerant. Mikroba tersebut mempunyai
kemampuan untuk mentolelir kondisi hiper asin serta berbagai logam berat dan
metaloid. Karena toleransi stresnya yang tinggi maka mikroorganisme ini sangat
bermanfaat dibidang industri atau sebagai aplikasi di bioteknologi (Nurhayati,
2006).
L-glutaminase ditemukan dibeberapa bakteri laut yang hidup di mangrove
pantai timur india memiliki aktivitas L-glutaminase lebih tinggi dibandingkan
dengan daerah lain diantaranya adalah Pseudomonas sp, Vibrio costicola,
Bacillus, Moraxella, Aeromonas, Acinetobacter dan Micrococcus sp. (Damaraj et
al.,1997).
42
Bakteri Pseudomonas aeruginosa merupakan patogen oportunistik, yaitu
memanfaatkan kerusakan pada mekanisme pertahanan inang untuk memulai
suatu infeksi. Bakteri tersebut dapat menyebabkan infeksi saluran kemih, infeksi
saluran pernafasan, dermatitis, infeksi jaringan lunak, bakterimia, infeksi tulang
dan sendi, infeksi saluran pencernaan dan bermacam-macam infeksi sistemik,
terutama pada penderita luka bakar berat dan AIDS yang mengalami penurunan
sistem imun(Mayasari, 2006).
Pseudomonas aeruginosa merupakan bakteri yang bersifat pathogen bagi
manusia ketika sistem kekebalan tubuh manusia menurun dan dapat menginfeksi
secara kronis dengan cara beradaptasi didalamnya dengan membentuk biofilm
untuk membantu kelangsungan hidupnya saat membentuk koloni paru-paru
manusia. Tetapi ketika keadaan tubuh manusia sehat, maka tahan terhadap
bakteri Pseudomonas aeruginosa dan tidak terjadi infeksi (Joana, 2017)
43
5. KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Kesimpulan dari penelitian ini menunjukkan bahwa terdapat bakteri
penghasil enzim L-Glutaminase yang diperoleh dari mangrove Sonneratia alba.
Berdasarkan uji microbact system menunjukkan bahwa isolat terbaik penghasil L-
Glutaminase tersebut adalah Pseudomonas aeruginosa.
5.2 Saran
Saran yang dapat diberikan untuk penelitian selanjutnya adalah dengan
penambahan uji yang dapat dilakukan seperti uji aktivitas enzim L-Glutaminase
dengan faktor-faktor seperti permainan suhu, pH, sumber karbon dan lain
sebagainya. Selain itu, untuk uji spesies bakteri dapat dilakukan dengan
menggunakan metode lain seperti 16sRNA sehingga bakteri yang digunakan
telah diketahui jenis spesies yang lebih spesifik lagi.
44
DAFTAR PUSTAKA
Arikunto, S. 2002. Metodologi Penelitian. Jakarta: PT. Rineka Cipta. Arrizal, S., Rachmadiarti, F., dan Yuliani. 2013. Identifikasi Rhizobakteri pada
Semanggi (Marsilea crenata Presl.) yang Terpapar Logam Berat Timbal (Pb). Lent. Bio. 2(1):165-169.
Cappuccino, JG and Sherman N. 1983. Microbiology a Laboratory Manual. 4th
ed. Menlo Park: Addison-Wesley Publ. Company, Inc. Cappuccino, JG and Sherman N. 2005. Microbiology a Laboratory Manual. 6th
ed. Menlo Park: Addison-Wesley Publ. Company, Inc. Chanway CP. 1996. Endophytes they’re not just fungi. Canadian J Bot. 74: 321-
322. Dharmaraj K., Selvakumar N., Chandramohan D.and Natarajan R. 2009. L-
glutaminase activity in marine sediments. J.Mar.Sci. 6: 168. Didje, N. dan Sartini. 2006. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Laboratorium Biologi
Farmasi. Universitas Hassanudin. Makasar. Dwilestari, Awaloei, H., Posangi, J.,Bara, R. 2015. Uji Efek Antibakteri Jamur
Endofit pada Daun Mangrove Sonneratia alba terhadap Bakteri Uji Staphylococcus aureus dan Eschericia coli. J. e-Bm Unsrat. 3(1): 394-398.
Fardiaz, S., 1993. Analisi Mikrobiologi Pangan. PT Gramedia Pustaka Utama.
Jakarta. Firdaus, Sinda,L. 2003. Peranan Sonnetaria sp, dalam Fermentasi Nira Aren
Menjadi Minuman Beralkohol. [Skripsi]. UNHAS. Gulati, R., Saxena, R.K., dan Gupta, R. 1997. A Rapid Plate Assay for Screening
L-Asparaginase Producing Micro-Organismes. Lett Appl. Micro. 24(1): 23-26.
Harahab, N. dan Setiawan. 2017. ECSOFIM :Journal of Economic and Sosial of
Fisheries and Marine. 04(02): 153-165. Hadioetomo, R. S. 1985. Mikrobiologi Dasar-dasar Praktik. Gramedia. Jakarta. Holt. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology 9th Edition. USA:
Williams and Wilkins Baltimore. Jawetz, E., Melnick, J.L., dan Adelberg, E.A. 1996. Mikrobiologi Kedokteran Edisi
ke-20. Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta. Judoamidjojo, R, Mulyono. 1990. Biokonversi. Bogor: Dikti Pusat Antar
Universitas Bioteknologi.
45
Katili, A. S. 2009. Struktur Vegetasi Mangrove di Kecamatan Kwandangan
Kabupaten Gorontalo Utara, Provinsi Gorontalo. J. Pelangi Ilmu 5(2): 18-23 .
Kharisma dan Abdul. 2012. Aktivitas Asam Proteolitik Bakteri Asam Laktat dalam
Fermentasi Susu Kedelai. [Skripsi]. UGM: Yogyakarta. Krettiawan H. 2011. Minimasi limbah padat budidaya ikan nila (Oreochromis
niloticus) melalui produksi Daphnia sp.[Tesis]. IPB. Bogor. Kurniasari, R.M. 2005. Pengaruh Logam Berat terhadap Pertumbuhan
Mikroorganisme Pendegradari Minyak Diesel. [Skripsi]. Bogor: IPB. Lay B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Rajawali Pers. Jakarta. Leena S. dan Bhat MR. 2013. Isolation and characterization of microorganism
from mangrove soil of CBD Belapur creek, Nvi Mumbai, MS India. Int. J. of Envirom Sci. 3(6):0976-4402.
Lehninger. 2005. Dasar-Dasar Biokimia I. Erlanggga. Jakarta. Mayasari, E. 2005. Pseudomonas aeruginosa: Karakteristik, Infeksi dan
Penggunaan. [Skripsi]. Universitas Sumatra Utara. Mayati, B. 2013. Identifikasi Keragaman Bakteri pada Comeal Seed Pengolahan
Limbah Cair Cat. [Skripsi]. IPB: Bogor. Murtiningsih. 1997. Evaluation Of The Serobact And Microbact System for The
Detection and Identification of Listeria spp. Department of Food Science and Technology, The University of New South Wales, Sydney, NWS, Australia.
Naiborhu, P.E. 2002. Ekstraksi dan Manfaat Ekstrak Mangrove (Sonneratia alba
dan Sonneratia caesolaris) sebagai Bahan Alami Antibakteri: pada Patogen Udang Windu, Vibrio Harvey. [Tesis]. Institut Pertanian Bogor: Bogor.
Nandakumara R., Rush M., Shahjahan A., O’Reilly K., Groth D. 2003. Bacterial
panicle blight of rice in the southern United States caused by Burkholderia glumae and B.gladioli. Phytoathology. 95: 573.
Nofiani dan Gusrizal. 2004. Bakteri Resisten Merkuri Spektrum Sempit dari
Daerah Bekas Penambangan Emas Tanpa Izin (PETI) Mandor, Kalimantan Barat. J. Natur Ind. 6(2): 67-74.
Nurhayati, T., Maggy TS., Lilis N., dan Sri BP. 2006. Karakterisasi Awal Inhibitor
Protease dari Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons Asal Pulau Panggang. Hayati.13(2): 58-64.
Pastra, D. A., Melki., dan Surbakti, H. 2012. Penapisan Bakteri yang
Bersimbiosis dengan Spons Jenis Aplysina sp sebagai Penghasil Antibakteri dari Perairan Pulau Tegal Lampung. Masp J. 4(1): 77-82.
46
Pelczar, M.J. and E. C. S. Chan. 1986. Dasar- Dasar Mikrobiologi. UI Press.
Jakarta. ___________________________. 2006. Dasar-dasar Mikrobiologi Jilid 2. UI
Press. Jakarta. Presscott. 2002. Laboratory Excercise In Microbiology. The Mac-Graw Hill
Companies. New York. Prihatiningtias, W., dan M.S.H. Wahyuningsih. 2011. Prospek Mikroba Endofit
sebagai Sumber Senyawa Bioaktif. Universitas Gadjah Mada: Yogyakarta. Prihanto, A. A., Firdaus, M., dan Nurdiani, R. 2011. Endophytic Fungi Isolatt from
(Rhyzopora mucronata) and Its Antibacterial Activity on Staphylococcus aureus and Escherichia coli. J. Food Sci Engineer. 1(1): 386-389.
Radji, M., 2005, Peranan Bioteknologi dan Mikroba Endofit dalam
Pengembangan Obat Herbal. Maj Ilmu Farm. 2(3): 113-124. Rakhmawati, A. 2012. Penyiapan Media Mikroorganisme. FMIPA. Yogyakarta:
UNY. Ramdany. 2008. Identifikasi Bakteri Vibrio parahaemolitycus Dengan Metode
Biologi Secara PCR. J. Sain Tek Farm. 13(1): 1-7. Rehm, H.J. dan G. Reed. 1981. Biotechnology, Microbial Fundamental. Verlag
Chemie Gmbh, Weinheim. Rostinawati, T. 2008. Skrining dan Identifikasi Bakteri Penghasil Enzim Kitinase
dari Air Laut di Perairan Pantai Pondok Bali. Fakultas Farmasi Universitas Padjajaran Jatinagor.
Safnowandi. 2015. Struktur Komunitas Mangrove di Teluk Poton Bako sebagai
Buku Panduan untuk Pemantapan Ekosistem pada Guru Biologi SMA di Kabupaten Lombok Timur. J. Ilmiah IKIP Mataram. 2(1): 365-379.
Shahib, N. 2005. Biologi Molekular Medik. Unpad Press. Bandung. Siddalingeshwara KG, Devi DN, Pramoda T, Vishwanatha T, Sudipta KM, Mohsin
SK .2010. Rapid screening and confirmation of L-Glutaminase producing novel Aspergillus wenti. Int. J. ChemTech Res. 2: 830-833.
Sinaga, E., Noverita dan D. Fitria. 2009. Daya antibakteri jamur endofit yang
diisolasi dari daun dan rimpang lengkuas (Alpinia galangal Sw.). Jurnal Farmasi Indonesia 4(4): 161-70.
Sivakumar K, Sahu MK, Manivel PR, Kannan L. 2006. Optimum conditions for L-
glutaminase production by actinomycete strain isolated from estuarine fish, Chanos chanos (Forskal, 1775). Ind. J. Exp. Biol. 44: 256-258.
Sridhar, R. P.N. 2006. Polymerase Chain Reaction (PCR). Dept. Of Microbiology.
JJMMC. Davangere.
47
Stone, J.K., C.W. Bacon, dan J.F. White. 2003. An Overview of Endophytic
Microbes: Endophytismm. Microcial Endophytes. Marcel Dekker. New york Strobel, G.A. 2003. Endophytes as sources of bioactive products. Microbes
Infect. 5(6): 535-544. Sudarsono, A. 2008. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri pada Ikan Laut dalam
spesies Ikan Gindara (Lepidocibium flavobronneum). [Skripsi]. Institut Pertanian Bogor: Bogor.
Suhartono, M.T. 1989. Enzim dan Bioteknologi. PAU IPB. Bogor. Suryabrata, Sumadi, 2006. Metodologi Penelitian. Raja Grafindo Persada.
Jakarta. Suwandi, U. 1999. Peran Media untuk Identifikasi Mikroba Patogen.Cermin Dunia
Kedokteran. 124: 21-24. Tan, R. X and Zou, W. X. 2001. Endophyte : A rich source of fungtional
metabolite. Nat.Prod, Rep. 18: 448-459. Tedja, I. 2007. Seleksi Galur-galur Bradyrhizobium japanicum Resisten Logam
Berat. Laporan Penelitian KB VI. FMIPA IPB. Bogor. Tittsler, M. 1996. Introduction to Soil Microbiology. 2 ed. Willey Eastern Limited,
New Delhi. Wahyunio. 2011. Dasar-Dasar Biokimia. Universitas Indonesia. Jakarta. Wang, Y., H. Lo., dan P. Wang. 2008. Endophytic Fungi from Taxus mairei in
Taiwan: First Report of Colletotrichum gloeosporioides as an Endophyte of Taxus mairei. Botanical Studies 49: 39-43.
Wayan, dan Qomariah. 2007. Isolasi dan Identifikasi E.coli. Bali. Wedhastri. S. 2002. Isolasi dan seleksi Azotobacter spp. penghasil faktor tumbuh
dan penambat nitrogen dari tanah masam. Jurnal Ilmu Tanah Lingkungan. 3(1): 45-51.
Xiang, L., C. Lu, Y. Huang, Z. Zeng, W. Su, and Y. Shen. 2007. Endophytic
Fungi from A Pharmaceutical Plant, Camptotheca acuminata: Isolation, Identification and Bioactivity. World Journal of Microbiology and Biotechnology 23(7): 1037-040.
Yuniarsih, M. 2012. Uji Aktivitas Antidiabetes Ekstrak dan Fraksi dari n-Heksana
Buah Ketapang (Terminalia catappa) sebagai Inhibitor α-Glukosidase dan Penapisan Fitokimia dari Fraksi Teraktif. [Skripsi]. Universitas Indonesia.
![Analisis Proses Bisnis dan Implementasi Aplikasi pada ......6901 dan 6891 sampai 6900 [9]. Berdasarkan pada beberapa penelitian yang telah dilakukan mengenai . C. loud Computing dan](https://static.fdocumenti.com/doc/165x107/610a7710d6afb4031072550e/analisis-proses-bisnis-dan-implementasi-aplikasi-pada-6901-dan-6891-sampai.jpg)
