FILOGEOGRAFI CICAK JARI LENGKUNG (SQUAMATA:

GEKKONIDAE: CYRTODACTYLUS) DI JAWA DAN SUMATRA

BERDASARKAN ANALISIS MORFOLOGI DAN MOLEKULER

GEN NATRIUM DEHYDROGENASE SUBUNIT 4 (ND4)

SKRIPSI

oleh

MUHAMMAD ALIF FAUZI

135090101111007

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2017

FILOGEOGRAFI CICAK JARI LENGKUNG (SQUAMATA:

GEKKONIDAE: CYRTODACTYLUS) DI JAWA DAN SUMATRA

BERDASARKAN ANALISIS MORFOLOGI DAN MOLEKULER

GEN NATRIUM DEHYDROGENASE SUBUNIT 4 (ND4)

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains

dalam Bidang Biologi

oleh

MUHAMMAD ALIF FAUZI

135090101111007

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2017

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI

FILOGEOGRAFI CICAK JARI LENGKUNG (SQUAMATA:

GEKKONIDAE: CYRTODACTYLUS) DI JAWA DAN

SUMATRA BERDASARKAN ANALISIS MORFOLOGI DAN

MOLEKULER GEN NATRIUM DEHYDROGENASE

SUBUNIT 4 (ND4)

MUHAMMAD ALIF FAUZI

135090101111007

Telah dipertahankan di depan Majelis Penguji

pada tanggal 25 Juli 2017

dan dinyatakan memenuhi syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains dalam Bidang Biologi

Menyetujui

Pembimbing

Nia Kurniawan S.Si, MP., D,Sc

NIP 19600118 198601 1 001

Mengetahui

Ketua Program Studi S-1 Biologi

Fakultas MIPA Universitas Brawijaya

Rodliyati Azrianingsih, S.Si., M.Sc., Ph.D.

NIP 19700128 199412 2 001

iii

HALAMAN PERNYATAAN

Saya yang bertanda tangan di bawah ini:

Nama : Muhammad Alif Fauzi

NIM : 135090101111007

Jurusan : Biologi

Penulis Skrispi berjudul : Filogeografi Cicak Jari Lengkung

(Squamata: Gekkonidae: Cyrtodactylus)

di Jawa dan Sumatra Berdasarkan

Analisis Morfologi dan Molekuler Gen

Natrium Dehydrogenase Subunit 4 (ND4)

Dengan ini menyatakan bahwa:

1. Skripsi ini adalah benar-benar karya saya sendiri dan bukan hasil plagiat dari karya orang lain. Karya-karya yang

tercantum dalam Daftar Pustaka Skripsi ini semata-mata

digunakan sebagai acuan/referensi

2. Apabila kemudian hari diketahui bahwa isi Skripsi saya merupakan hasil plagiat, maka saya bersedia menanggung

segala resiko.

Demikian pernyataan ini dibuat dengan segala kesadaran

Malang, 4 Agustus 2017

Yang menyatakan

Muhammad Alif Fauzi

135090101111007

iv

v

HALAMAN PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI

Skripsi ini tidak dipublikasikan namun terbuka untuk umum dengan

ketentuan bahwa hak cipta ada pada penulis. Daftar Pustaka

diperkenankan untuk dicatat, tetapi pengutipan hanya dapat

dilakukan seizin penulis dan harus disertai keabsahan ilmiah dalam

menyebutkannya.

vi

Filogeografi Genus Cicak Jari Lengkung (Squamata;

Gekkonidae; Cyrtodactylus) di Jawa dan Sumatra Berdasarkan

Analisis Morfologi dan Molekuler Gen Natrium Dehydroganase

Subunit 4 (ND4)

Muhammad A. Fauzi., Nia Kurniawan

Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Brawijaya

2017

ABSTRAK

Sejarah geografis konstruksi Paparan Sunda menyebabkan adanya

pergeseran dan fluktuasi air laut yang mengakibatkan pulau di

Paparan Sunda mengalami pemisahan dan penggabungan. Aktivitas

ini mempengaruhi persebaran genus Cyrtodactylus di Jawa dan

Sumatra. Penelitian ini bertujuan untuk menjelaskan hubungan

kekerabatan dan zoogeografi Cyrtodactylus berdasarkan analisis gen

ND4 serta pengelompokan berdasarkan morfologi. Metode yang

digunakan meliputi morfometri, meristik, isolasi DNA, Polymerase

Chain Reaction dan sekuensing. Analisis morfologi dilakukan

menggunakan Principal Component Analysis (PCA) dengan software

PAST dan konstruksi pohon filogenetik dilakukan menggunakan tiga

analisis yaitu Maximum likelihood, Maximum Parsimony dan

Bayesian Inference. Hasil PCA menunjukkan kesamaan karakter

morfologi C. marmoratus jantan dan betina dari Jawa dan Sumatra.

Hubungan filogenetik menjelaskan bahwa Cyrtodactylus membentuk

satu clade monofiletik. Pohon filogenetik membagi Cyrtodactylus

dalam tiga clade yaitu clade A (Jawa Barat), clade B (Jawa Tengah),

dan clade C (Sumatra dan Kalimantan). Pada clade A dan B, C.

marmoratus Jawa Barat terpisah dari C. marmoratus Jawa Tengah.

Nilai p-distance C. marmoratus Jawa Barat dengan Jawa Tengah

(33,6%) lebih tinggi daripada C. cf marmoratus dari Sumatra Utara

(31,3%). Hal ini diakibat terbentuknya pegunungan pada Jawa

bagian barat yang membentuk lembah mengakibatkan terjadinya

barier geografis yang memisahkan clade A dan B. Selain itu,

pemisahan dan penggabungan pulau-pulau di Paparan Sunda secara

vii

berulang kali akan mempengaruhi diversifikasi dan variasi genetik

Cyrtodactylus.

Kata kunci : Cyrtodactylus, filogenetik, Paparan Sunda

Phylogeography of Bent-Toad Gecko (Squamata; Gekkonidae;

Crytodactylus) in Java and Sumatra Based on Morphological and

Molecular Analysis of Natrium Dehydroganase Subunit 4 (ND4)

Muhammad A. Fauzi., Nia Kurniawan

Biology Department, Faculty of Mathematics and Natural Science,

University of Brawijaya

2017

ABSTRACT

The geographical history of Sundaland lead a shift and fluctuation of

sea water which have an effect on the separating and merging

process of Sundaland. This affects the spreading of Cyrtodactylus in

Java and Sumatra. The aim of of this study is to explain the

relationship and zoogeography of Cyrtodactylus based on ND4 gene

analysis as well as morphological analysis. Methods used in this

study were morphometry, meristics, DNA isolation, Polymerase

Chain Reaction and sequencing. Morphological analysis was

performed using Principal Component Analysis with PAST software,

and phylogenetic tree was constructed by using Maximum likelihood,

Maximum Parsimony and Bayesian Inference. The result of PCA

showed that similarity characteristics morphological of male and

female C. marmoratus from Java and Sumatra. The phylogenetic

analysis showed that Cyrtodactylus forms a monophyletic clade. The

phylogenetic analysis resulted three clades consist of clade A (West

Java), clade B (Central Java), clade C (Sumatra and Kalimantan).

Clade A and B consists C. marmoratus of West Java separated from

C. marmoratus of Central Java. The p-distance value of C.

marmoratus from West Java with Central Java (33.6%) was higher

than C. cf marmoratus of North Sumatra (31.3%). This was probably

the result of the mountain formation in west Java that have valleys,

and resulting the occurrence of geographical barriers that separated

clades A and B. In addition, the separation and incorporation of

viii

islands in Sunda exposure will repeatedly affect the diversification

and genetic variation of Cyrtodactylus.

Key words: Cyrtodactylus, phylogenetic, Sundaland

ix

KATA PENGANTAR

Alhamdullilaahi Robbil ‘Aalamiin, dengan ungkapan rasa syukur

pada Allah Yang Maha Kuasa akhirnya penulis dapat menyelesaikan

penulisan skripsi yang merupakan syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains dalam bidang Biologi di Fakultas Matematika dan

Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang.

Pada kesempatan ini, penulis ingin menyampaikan ucapan terima

kasih kepada:

1. Bapak Nia Kurniawan S.Si, MP, D.Sc selaku Dosen Pembimbing yang selalu mendampingi dan memberi pengarahan, tambahan

ilmu serta saran -saran yang berguna bagi penulis.

2. Bapak Bagyo Yanuwiadi dan Bapak Widodo selaku Dosen Penguji yang telah memberi saran yang bermanfaat demi

perbaikan penyusunan skripsi.

3. Bapak Sujatmiko dan Ibu Trisnowati selaku orang tua penulis dan keluarga atas segala doa, dukungan, dan motivasi yang tidak

terkira.

4. Tim Master of Sundaland A.M. Kadafi., M. Fahmi, Bagus P., Anggun S.F., Agung Sih K, Adityas A., Erintha E.W.,

Mulyadiane M.P., Day Shine N, Noviati R., Ari A., M. Farih A.

yang memberikan masukan tambahan, pengetahuan dan saran

kepada penulis dalam menyelesaikan skripsi.

5. Teman-teman seperjuangan skripsi Putri Dyandra D., Rizha H., M. Nizar F., Zahrina Z.D., Jerry F.P., Jenvia R.P., Alveus R., M.

Luqman H., yang memberikan segala bantuan moral dan

semangat kepada penulis.

6. Teman-teman Biologi UB, khususnya angkatan 2013 dan teman-teman KSB, serta seluruh civitas akademik yang ada di Jurusan

Biologi.

Penulisan skripsi ini merupakan upaya optimal penulis sebagai

sarana terbaik dalam pengembangan ilmu pengetahuan. Saran dan

kritik yang membangun sangat diharapkan untuk menjadikan karya

ini semakin bermanfaat.

Malang, 4 Agustus 2017

x

Penulis

DAFTAR ISI

Halaman

ABSTRAK .................................................................................. v

ABSTRACT ................................................................................ vi

KATA PENGANTAR ................................................................ vii

DAFTAR ISI ............................................................................... viii

DAFTAR TABEL ....................................................................... x

DAFTAR GAMBAR ................................................................. xi

DAFTAR LAMPIRAN .............................................................. xiii

DAFTAR LAMBANG DAN SINGKATAN ............................. xiv

BAB 1 PENDAHULUAN ........................................................... 1

1.1 Latar Belakang ........................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah ...................................................... 2

1.3 Tujuan Penelitian ........................................................ 3

1.4 Manfaat Penelitian ...................................................... 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ................................................ 4

2.1 Sundaland (Paparan Sunda) ....................................... 4

2.2 Biogeografi Genus Cyrtodactylus ............................. 6

2.3 Genus Cyrtodactylus .................................................. 7

2.4 Biogeografi .......................... ...................................... 9

2.5 Konsep Spesies dan Spesiasi ...................................... 9

2.6 Morfometri ................................................................. 10

2.7 Analisis Filogenetik .................................................... 11

2.7 Analisis Molekuler ..................................................... 12

2.7.1 Polymerase Chain Reaction (PCR) ................. 13

2.7.2 Gen NADH Dehydrogenase Subunit 4 (ND4) 13

BAB III METODE PENELITIAN ........................................... 16

3.1 Waktu dan Tempat ..................................................... 16

3.2 Kerangka Kerja Penelitian .......................................... 16

3.3 Deskripsi Area Studi .................................................. 17

3.4 Pengambilan Sampel Cyrtodactylus ........................... 18

3.5 Analisis Molekuler ..................................................... 19

xi

3.5.1 Ekstraksi DNA ......................................................... 19

3.5.2 Amplifikasi gen ND4 .......................................... 20

3.5.3 Uji kualitatif DNA .............................................. 21

3.5.4 Pengumpulan data sekuena genus

Cyrtodactylus di kawasan Paparan Sunda ......... 21

3.6 Konstruksi Pohon Filogenetik .................................... 22

3.6.1 Contig dan alignment sekuens DNA .................. 21

3.6.2 Analisis sequence divergence (p-distance) ......... 22

3.6.3 Pemilihan Modeltest untuk Analisis Maximum

likelihood dan Bayesian Inference ...................... 23

3.6.4 Analisis Maximum likelihood dan Maximum

Parsimony .......................................................... 23

3.6.5 Analisis Bayesian Inference ............................... 23

3.7 Analisis Morfometri ................................................... 24

3.7.1 Pengambilan data morfometri ............................. 24

3.7.2 Analisis data morfometri .................................... 25

3.7.3 Analisis Principal Component Analysis

Cyrtodactylus ...................................................... 26

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .................................... 27

4.1 Morfometri dan Meristik Cyrtodactylus ..................... 27

4.1.1 Principal Component Analysis (PCA) genus

Cyrtodactylus di Jawa dan Sumatra berdasarkan

analisis morfologi ............................................... 29

4.2 Hubungan Kekerabatan Genus Cyrtodactylus di

Jawa dan Sumatra Berdasarkan Analisis Gen ND4 ... 32

4.2.1 Clade A ............................................................... 33

4.2.2 Clade B ............................................................... 34

4.2.3 Clade C ............................................................... 35

4.3 Zoogeografi Genus Cyrtodactylus di Jawa dan

Sumatra Berdasarkan Analisis Filogenetik ............... 43

4.4 Sifat Adaptif Cyrtodactylus........................................ 48

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ..................................... 50

5.1 Kesimpulan ................................................................ 50

5.2 Saran ........................................................................... 50

DAFTAR PUSTAKA ................................................................. 51

xii

LAMPIRAN ................................................................................ 59

DAFTAR TABEL

Nomor Halaman

1 Daftar Sampel Cyrtodactylus ................................................ 19

2 Data Sampel Cyrtodactylus dan Outgroup dari Genbank .... 22

3 Karakter Morfometri Cyrtodactylus ..................................... 24

4 Karakter Meristik Cyrtodactylus .......................................... 25

5 Hasil Morfometri Cyrtodactylus Betina ............................... 27

6 hasil Morfometri Cyrtodactylus Jantan ................................ 27

xiii

DAFTAR GAMBAR

Nomor Halaman

1 Rekonstruksi Geologis Indo-Australian Archipelago ........ 5

2 Batas Wilayah Paparan Sunda ........................................... 6

3 Cyrtodactylus semiadii ....................................................... 8

4 Peta Genom Mitokondria .................................................. 14

5 Peta Lokasi Sampling di Jawa dan Sumatra ....................... 17

6 Pola Precloacal dan Sisik Femoral.................................... 28

7 Hasil PCA Cyrtodactylus Jantan ........................................ 30

8 Hasil PCA Cyrtodactylus Betina ........................................ 31

9 Karakter Morfologi C. marmoratus dari Jawa Barat ......... 33

10 Karakter Morfologi Ventral dan Dorsal C. semiadii dan C. marmoratus ................................................................... 35

11 Filogram Maximum Likelihood, Maximum Parsimony dan Bayesian Inference Berdasarkan Gen ND4 di Jawa

dan Sumatra........................................................................ 37

12 Perbandingan Morfologi Bagian Dorsal C. consobrinus,

C. hikidai dan C. aurensis .................................................. 38

13 Perbandingan Karakter Morfologi Bagian Dorsal C.

lateralis dan C. semicinctus ............................................... 40

14 Perbandingan Karakter Morfologi Ventral C. lateralis dan

C. semicinctus .................................................................... 40

15 Persamaan Karakter Morfologi C. cf psarops. .................. 42

xiv

16 Karakter Morfologi C.cf marmoratus ................................ 43

17 Peta Persebaran Cyrtodactylus di Jawa dan Sumatra

Berdasarkan Analisis Gen ND4 ......................................... 44

xv

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Hal

1 Hasil Identifikasi Secara Morfologi ................................... 59

2 Hasil Elektroforesis Gen ND4 ............................................. 59

3 Hasil Alignment Sekuens ND4 ............................................ 60

4 Nilai P-Distance (Pairwise Distance) dengan menggunakan Program Mega 7 .................................................................. 60

5 Perhitungan Model Pohon menggunakan Jmodeltest.......... 61

6 Perhitungan Model Menggunakan Kakusan 4 .................... 62

7 Hasil Rekonstruksi Pohon Filogenetik Maximum Likelihood Bootstrap 100 dengan menggunakan Program

PAUP*4.0b10 ...................................................................... 62

8 Hasil Rekonstruksi Pohon Filogenetik Maximum Parsimony dengan Bootstrap 1000 menggunakan

PAUP*4.0b10 ...................................................................... 63

9 Hasil Rekonstruksi Filogenetik dengan Bayesian Inference menggunakan Software Mrbayes 3.0b4 .............. 63

xvi

DAFTAR LAMBANG DAN SINGKATAN

Simbol/Singkatan Keterangan

ATP adenosin triphospate

BI bayesian interference

bp base-pair

BPP bayesian posterior probability

DNA deoksiribosa nucleic acid

HGP human genome project

GPS global positioning system

GTR general time reversible

LGM last glacial maximum

MCMC monte carlo markov chain

ML maximum-likelihood

MLBS maximum-likelihood bootstrap

MP maximum parsimony

MPBS maximum parsimony bootstrap

mtDNA mitochondrial DNA

ND4 NADH dehydrogenase Subunit 4

PCA Principal Component Analysis

PCR Polymerase Chain Reaction

RFLP Restriction Fragment Length

Polymorphism

RNA ribonucleic acid

SVL snout vent length

TBE Tris Buffer EDTA

TBR tree bisection recognition

TL tail length

VES visual encounter surveys

Simbol/Singkatan Keterangan

C celcius

mm milimeter

µL mikroliter

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Paparan Sunda merupakan suatu wilayah yang meliputi Sumatra,

Borneo, Jawa dan Semenanjung Malaya pada periode Pleistosen dan

Pleiosen (Bird dkk., 2005). Paparan sunda merupakan kawasan tropis

dengan geografis yang paling kompleks di bumi. Selama periode

Pleistosen, terjadi kenaikan dan penurunan permukaan air laut yang

menyebabkan pulau di Paparan Sunda secara berulang mengalami

penggabungan dan pemisahan satu sama lain. Paparan Sunda

terbentuk akibat perluasan daratan Asia pada periode permukaan air

laut yang rendah dan memunculkan dasar laut antara Semenanjung

Malaya, Jawa, Sumatra dan Kalimantan (Lohman dkk., 2011).

Proses konstruksi Paparan Sunda menyebabkan beberapa spesies

yang dulunya berada dalam satu populasi mengalami pemisahan.

Akibatnya, beberapa spesies mengalami adaptasi pada suatu habitat

yang baru, sehingga memunculkan karakter yang berbeda dengan

spesies asal. Selain itu, isolasi geografis juga menyebabkan suatu

populasi memiliki divergensi sekuens dari populasi lainnya yang

sejenis (Endler, 1997). Kondisi ini dapat terjadi melalui mekanisme

isolasi antar populasi dan interaksi terhadap lingkungan sebagai

bentuk adaptasi organisme, sehingga diferensiasi karakter muncul

sebagai bentuk respon terhadap lingkungan fisik tempat hidup

organisme tersebut (Hill & Wiens, 2000).

Cyrtodactylus merupakan genus yang memiliki banyak spesies.

Eksplorasi herpetofauna, khususnya Cyrtodactylus, telah memberikan

kontribusi berupa sejumlah spesies yang dideskripsikan dari berbagai

wilayah meliputi Myanmar, Thailand, Vietnam, Malaysia, Filipina,

Borneo, Sulawesi, Papua dan Australia (Uetz, 2015). Menurut

Iskandar dkk. (2011), genus Cyrtodactylus terdiri lebih dari 130

spesies dengan perkembangan yang cepat dalam dua dekade terakhir

ini dengan ditemukannya spesies baru lebih dari 80 jenis. Terdapat

perbedaan morfologi yang membedakan beberapa spesies, misalnya

adalah adanya karakter spesifik pada salah satu spesies antara C.

marmoratus dari Jawa dengan spesies dari Sulawesi. Persebaran yang

sangat luas hampir di seluruh Asia Tenggara menyebabkan banyaknya

penemuan spesies baru yang ditandai dengan beberapa karakter kunci

dari segi morfologi akibat adaptasi terhadap barier geografis. Spesies

2

dari anggota genus Cyrtodactylus memiliki ciri morfologi dan corak

yang hampir sama, sehingga perlu dilakukan kajian DNA untuk

konfirmasi hasil identifikasi. Selain itu, minimnya informasi terkait

herpetofauna di kawasan Paparan Sunda menjadi salah satu implikasi

pentingnya dilakukan penelitian terhadap biodiversitas Indonesia

sebagai upaya konservasi (Iskandar & Elderen, 2006).

Teknik identifikasi suatu taksa menggunakan sekuens DNA (DNA

barcoding) didasarkan pada perubahan basa nukleotida akibat proses

evolusi. Perubahan sekuens di setiap spesies menjadi acuan untuk

konstruksi filogenetik. Susunan genom mitokondria memiliki sebuah

daerah dimana terdapat daerah konservatif dan variatif yang dapat

menginterpretasikan jejak historis evolusi organisme (Nei & Kumar,

2000). Penggunaan gen NADH Dehydrogenase Subunit 4 (ND4)

didasarkan pada aktivitas gen ini yang menghasilkan komplek enzim

yang besar untuk mitokondria. Aktivitas sel ini berpengaruh terhadap

segala macam aktivitas genom mitokondria dalam melakukan

aktivitasnya. Adaptasi habitat baru akibat pemisahan geologis

menyebabkan gen ini mengalami perubahan nukleotida, sehingga

akan merubah urutan sekuens gen ND4. Identifikasi molekuler dengan

gen ND4 mampu menginterpretasikan hubungan kekerabatan

berdasarkan variasi pada setiap jenis organisme yang dihubungkan

dengan demografi sejarah geologi (Zhang dkk., 2014).

Spesies dengan persebaran luas umumnya memiliki prioritas

konservasi yang rendah. Namun, beragamnya tingkat cryptic spesies

dapat menjadi (Bickford dkk., 2007). Studi tentang biogeografi dapat

digunakan sebagai upaya konservasi dengan menggunakan data

genetik. Pendekatan identifikasi secara biogeografi molekuler dapat

digunakan untuk mengetahui demografi sejarah dan perubahan

distribusi sebagai respon terhadap iklim (Lim dkk, 2011). Berdasarkan

penjelasan di atas, maka penelitian ini dilakukan untuk mengetahui

hubungan kekerabatan genus Cyrtodactylus di Jawa dan Sumatra.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang yang telah disebutkan maka didapatkan

beberapa permasalahan, yaitu:

1. Bagaimana pengelompokan Cyrtodactylus di Jawa dan Sumatra berdasarkan analisis morfologi ?

2. Bagaimana hubungan kekerabatan genus Cyrtodactylus di Jawa dan Sumatra berdasarkan analisis gen ND4?

3

3. Bagaimana zoogeografi antar spesies Cyrtodactylus di Jawa dan Sumatra berdasarkan analisis molekuler gen ND4?

1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah:

1. Menjelaskan pengelompokan Cyrtodactylus di Jawa dan Sumatra berdasarkan analisis morfologi.

2. Menjelaskan hubungan kekerabatan genus Cyrtodactylus di Jawa dan Sumatra berdasarkan analisis gen ND4.

3. Menentukan zoogeografi antar spesies Cyrtodactylus di Jawa dan Sumatra berdasarkan analisis molekuler gen ND4.

1.4 Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangsih

terhadap database genetik spesies dari genus Cyrtodactylus di Jawa

dan Sumatra, serta dapat menjadi bahan evaluasi perencanaan

konservasi.

4

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Paparan Sunda

Paparan Sunda adalah suatu perluasan lautan dangkal yang

menghubungkan Jawa, Sumatra, Kalimantan dan Semenanjung

Malaysia pada zaman Pleistosen akibat kenaikan dan penurunan level

air laut (Myers dkk., 2000). Periode Pleistosen menimbulkan air laut

terakumulasi pada kutub yang menyebabkan menurunnya level air laut

tropis sekitar 70-150 m. Akibat hal tersebut, laut dangkal mengalami

pengeringan, sehingga terjadi perluasan wilayah daratan Paparan

Sunda dan Paparan Sahul. Paparan Sunda, seperti Sumatra, Jawa dan

Kalimantan bersatu dengan kepulauan Melayu. Pulau Bali yang

merupakan wilayah dari Sunda Besar juga mengalami perluasan dan

ikut bersatu dengan daratan Paparan Sunda (Bird dkk., 2005).

Konstruksi Paparan Sunda terjadi pada awal Eosen dimana daratan

Sunda mengalami peregangan dimulai dari sisi Sumatra, kemudian

diikuti dengan Jawa. Ujung Jawa kemudian memisah dan bergabung

dengan bagian ujung pulau Sulawesi. Proses tersebut berlanjut pada

bagian Kalimantan dan Sulawesi akibat pergeseran lempeng Australia

yang bersinggungan dengan tepi paparan Sunda yang menyebabkan

bertambahnya luas laut dangkal. Tubrukan yang terjadi menghasilkan

daratan Wallacea yang lebih luas mencakup pulau Sulawesi (Gambar

1). Periode Neogene, Australia mengalami pergeseran ke utara dan

menghasilkan Sumatra dan Jawa sebagai daratan utama pada periode

Pliosen (Lohman dkk., 2011).

Perubahan distribusi fauna di Paparan Sunda disebabkan iklim

basah dan kering selama periode Pleistosen. Selama periode Last

Glacial Maximum (LGM) terdapat penurunan level air laut secara

global, sehingga memunculkan timbulnya paparan benua dari selatan

Thailand ke Sumatra, Jawa dan Kalimantan serta menghasilkan

Paparan Sunda dengan luas mirip dengan Eropa (Bird dkk., 2005).

Menurut Pelejero dkk. (1999), perluasan geografi tersebut berefek

pada persebaran genetik populasi dari daratan utama dengan populasi

pulau-pulau. Adanya perubahan habitat akibat evolusi geografis dan

iklimatis menyebabkan beberapa spesies hewan mengalami

perubahan. Variasi habitat menyebabkan perbedaan karakter pada

individu di dalam satu spesies akibat respon terhadap lingkungannya.

5

(Lohman dkk., 2011)

Gambar 1. Rekonstruksi geologis Indo-Australian Archipelago

Jejak historis distribusi spesies di sepanjang Paparan Sunda

menunjukkan bahwa beberapa spesies mengalami kepunahan di

Sumatra selama masa Pleistosen. Endemisme spesies di Sumatra yang

tidak ditemukan di beberapa daerah lain mengiindikasikan bahwa

Sumatra berfungsi sebagai persimpangan fauna Pleistosen. Sebagian

besar proses kepunahan suatu spesies merupakan suatu proses alami.

Spesies atau populasi yang hidup pada pulau kecil (misalnya Pulau

Mentawai) memiliki tingkat kepunahan yang lebih tinggi

dibandingkan dengan spesies yang terdistribusi pada pulau besar

(misalnya Pulau Sunda) (Burkey, 1995). Terdapat 2 skenario

penyebab kepunahan di Sumatra, yaitu perubahan iklim dan vegetasi

6

selama masa Pleistosen, serta pengaruh dari erupsi supervulkanik

Toba (Wilting dkk., 2012).

Garis Wallace merupakan garis pembatas yang membedakan

karakteristik antara fauna paparan Sunda dan pulau-pulau kecil di

dekat Sulawesi (Gambar 2). Menurut Mayr (1939), terdapat banyak

kawasan kering yang melebar dari Filipina dan Celebes hingga pulau

Buru, serta Jawa Timur hingga Nusa tenggara. Zona tersebut berperan

sebagai pembatas jalur antara Paparan Sunda dengan Papua. Terdapat

faktor yang mempengaruhi miskinnya fauna pada beberapa pulau

kecil, salah satunya adalah usia geologi yang masih muda, sehingga

membatasi kesempatan fauna untuk melakukan kolonisasi. Selain itu,

deretan kepulauan dari Jawa hingga Nusa Tenggara memiliki aktivitas

vulkanik yang tinggi. Aktivitas vulkanik ini terjadi di kawasan yang

terpencil, namun berefek pada kawasan yang cukup luas. Hal tersebut

diperkirakan menjadi alasan fauna Jawa lebih miskin dibanding

Sumatra dan Kalimantan.

(Lohman dkk., 2011)

Gambar 2. Batas Wilayah Paparan Sunda

2.2 Biogeografi Cyrtodactylus

Cyrtodactylus Asia/Pasifik merupakan genus dari Famili

Gekkonidae yang paling beragam dan terdistribusi sangat luas. Selain

itu, genus Cyrtodactylus juga memiliki beberapa spesies yang baru

saja ditemukan atau diidentifikasi. Pola utama dari sejarah evolusioner

7

Cyrtodactylus masih belum banyak diketahui karena belum ada

penelitian dengan sampel yang berskala geografi luas dan diversitas

morfologi dari genus ini. Cyrtodactylus merupakan spesies

monofiletik, hanya jika spesies India/Sri Lanka yang dikenal dengan

Geckoella. Divergensi membagi Cyrtodactylus menjadi 2 clade yaitu

spesies tunggal C. tibetanus, clade spesies dari Myanmar/Himalaya

selatan, dan clade besar yang meliputi Cyrtodactylus dan Geckoella.

Clade terbesar memiliki sub-clade paling beragam di Thailand,

Indochina Timur, kawasan Sunda, kawasan Papua, dan Filipina. Hasil

filogenetik, kaitannya dengan jam molekuler dan analisis area nenek

moyang, menunjukkan bahwa Cyrtodactylus berasal dari kawasan

circum-Himalayan pada zaman Cretaceous/Paleogene (Wood dkk.,

2012)

Daratan utama Asia Tenggara mengalami segregasi geografi yang

kuat terhadap pemisahan clade Cyrtodactylus dari Myanmar,

Thailand, Indochina Timur, dan Semenanjung Malaya. Hal tersebut

menunjukkan peran dari batas atau barier geografi jangka panjang

dalam membentuk endemisme regional. Salah satu barier yang

terkenal adalah wilayah Isthmus of Kra sebagai barier geografis antara

Thailand dengan Sunda (Semenanjung Malaya) (Hughes dkk., 2003;

Woodruff & Turner, 2009). Transgresi tersebut menyebabkan

terjadinya isolasi radiasi Cyrtodactylus. Barrier lain yang cukup

dikenal adalah Lembah Mekkong sebagai batas/barier antara

Cyrtodactylus Thai dan Indocina (Bain & Hurley, 2011).

2.3 Genus Cyrtodactylus

2.3.1 Klasifikasi Cyrtodactylus

Genus Cyrtodactylus adalah salah satu marga yang sangat umum

ditemui di daerah hutan. Cyrtodactylus dalam nama lokal sering

disebut dengan Cicak Kaki Bengkok. Menurut Reptile Database

(2014), cicak kaki bengkok masuk dalam Kingdom Animalia, Filum

Chordata, Subfilum Vertebrata, Kelas Reptilia, Ordo Squamata,

Famili Gekkonidae, dan Genus Cyrtodactylus.

Binomial nomenclature Cyrtodactylus menggantikan penamaan

sebelumnya yang menggunakan Geckoella. Genus ini juga dikenal

dengan nama lain Stenodactylus yang berkerabat dekat dengan genus

Hemidactylus. Perbedaan genus Cyrtodactylus dan Hemidactylus

8

didasarkan pada lamellae yang muncul pada bagian jari kaki (Bauer,

1994).

(Riyanto dkk., 2014)

Gambar 3. Cyrtodactylus semiadii

Cyrtodactylus merupakan anggota dari Famili Gekkonidae, sub-

ordo Sauria. Genus ini memiliki perbedaan morfologi yang mencolok.

Cyrtodactylus dapat mudah dikenali dengan melihat corak di bagian

dorsal hingga kloaka. Masing-masing spesies memiliki pewarnaan

corak yang berbeda. Berbeda dengan genus Hemidactylus, genus ini

tidak memiliki tip untuk menempel pada dinding. Hal ini disesuaikan

dengan habitat cicak batu yang dapat ditemukan pada bebatuan dan

kayu-kayu yang sudah lapuk. Bentuk tubuh cicak batu memanjang dan

tegap. Corak yang berada pada punggung memiliki warna coklat

dengan bentuk corak yang bulat kecil hingga garis memanjang

(Gambar 3). Genus Cyrtodactylus memiliki total Snout Vent Length

(SVL) 74,4 mm (Das, 2014).

2.4 Biogeografi

Cabang ilmu biogeografi merupakan ilmu multidisipliner yang

menggabungkan konsep biologi dan geologi. Studi biogeografi

menerangkan tentang distribusi suatu taksa. Persebaran jenis

organisme dalam sudut pandang biogeografi dapat dilihat dalam

beberapa aspek seperti ekologi dan iklim yang mempengaruhi tipe

adaptasi suatu spesies. Kajian biogeografi juga menganalisis proses

jangka panjang yang menyangkut konstruksi terbentuknya suatu

9

topografi wilayah. Proses jangka panjang pembentukan wilayah akan

mempengaruhi diversitas dan genetik dari suatu taksa, sehingga

menjadikan pola persebaran yang berbeda (Hugget, 2004).

Geografi suatu wilayah dari waktu ke waktu tentunya mengalami

perubahan dari segi habitat. Perubahan ini dapat dikarenakan akibat

isolasi geografis yang menjadikan suatu populasi mengalami adaptasi

pada geografis yang berbeda, sehingga menjadi subpopulasi kecil

yang mengkoloni suatu wilayah. Proses pemisahan dari populasi

utama tersebut akan mempengaruhi genetik, fisiologi dan morfologi

suatu taksa akibat adaptasi pada habitat yang baru. Kaitan kajian

biogeografi juga dapat dihubungkan dengan disiplin ilmu filogeografi

yang menginterpretasikan hubungan kekerabatan pada pola

persebaran organisme berdasarkan data biogeografis (Tjandra, 2012).

Kajian ini memiliki peran penting dalam memahami proses evolusi

yang didalamnya terdapat variasi yang dapat diturunkan melalui

materi genetik dan terjadi akibat proses seleksi alam serta adaptasi

(Morley, 2000).

2.5 Konsep Spesies dan Spesiasi

Menurut Campbell & Mitchell (2005), konsep spesies memiliki arti

bahwa spesies yang tergabung dalam suatu populasi memiliki

kemampuan untuk saling melakukan perkawinan satu sama lain dan

menghasilkan keturunan fertil. Di sisi lain, apabila dalam kelompok

spesies melakukan perkawinan dengan kelompok spesies lain maka

akan menghasilkan keturunan yang steril dan keturunan tersebut akan

mati. Suatu spesies biologis dapat dikatakan sebagai unit populasi

terbesar, dimana pertukaran genetik terjadi dan terisolasi secara

genetik dari populasi lain semacamnya. Dalam konsep spesies

tentunya berkaitan erat dengan keanekaragaman hayati. Banyak faktor

yang mempengaruhi hal tersebut, diantaranya adalah adanya barier

yang mengisolasi gen dari suatu spesies.

Spesiasi merupakan suatu proses evolusi dari nenek moyang

organisme yang membentuk spesies baru. Spesiasi terbentuk apabila

aliran gen antara populasi yang awalnya ada secara efektif telah

mereda, serta dipengaruhi oleh mekanisme isolasi. Spesies baru yang

terbentuk dalam kurun waktu yang panjang dipengaruhi oleh beberapa

model spesiasi yang terjadi pada suatu habitat (Brumfield, 2010).

Spesiasi umumnya timbul akibat dari proses adaptasi beberapa

populasi organisme pada kondisi lingkungan tertentu. Proses spesiasi

10

dapat terjadi melalui mekanisme aliran gen yang terinterupsi antara

dua populasi pada satu spesies (Ridley, 2004).

Spesiasi alopatrik terjadi jika aliran gen (gene flow) terinterupsi

ketika satu populasi terpisah secara geografis menjadi subpopulasi

yang terisolasi. Pemisahan populasi dapat terjadi karena kemampuan

beberapa organisme untuk melakukan perpindahan. Barier sungai

ataupun lautan dapat menyebabkan pemisahan populasi hewan yang

tidak dapat melakukan penyebrangan, sehingga individu akan

mengkoloni pada wilayah yang terisolir. Akibat yang dihasilkan

adalah keturunan yang terisolasi dari populasi induknya (White,

1978). Menurut Mallet (2010), spesiasi simpatrik dapat terjadi pada

populasi organisme yang berada pada geografis yang sama. Spesiasi

terbentuk jika aliran gen berkurang karena faktor poliploidi,

diferensiasi habitat dan seleksi seksual (sexual selection). Diferensiasi

habitat menyebabkan faktor genetik meningkatkan kemampuan suatu

subpopulasi dalam mengeksploitasi habitat yang tidak digunakan oleh

populasi induk.

2.6 Morfometri

Morfometri adalah metode pengukuran pada karakter morfologi

suatu hewan untuk mengetahui variasi antar individu dari setiap

populasi yang berbeda (Jensen, 1981; Munshi & Dutta, 1996). Studi

morfometrik secara kuantitatif memiliki tiga manfaat, yaitu dapat

membedakan jenis kelamin dan spesies, mendeskripsikan pola-pola

keragaman morfologis antar populasi atau spesies, mengklasifikasikan

dan menduga hubungan kekerabatan diantara spesies maupun dalam

intraspesies (Jensen, 1981). Perbedaan yang muncul dari hasil

pengukuran morfometri serta meristik adalah hasil interaksi antara gen

yang mengalami ekspresi yang berbeda pada fisiologis dan DNA yang

diakibatkan oleh adaptasi terhadap lingkungannya. Barrier dan

kondisi ekologis akan memunculkan variasi dan diferensiasi karakter

antar populasi yang dipicu akibat respon terhadap lingkungan (Hill &

Wiens, 2000). Namun, hasil morfometri ini masih dianggap kurang

dalam menggambarkan variabilitas dari berbagai populasi. Di sisi lain,

data morfometri ini dapat dijadikan sebagai landasan awal untuk

menduga adanya variabilitas genetik (Chernoff, 1982).

Identifikasi secara morfometri pada genus Cyrtodactylus telah

dilakukan oleh beberapa peneliti dan banyak ditemukan banyak

spesies baru dari genus ini. Iskandar dkk. (2011) melaporkan bahwa

11

C. fumosus, terdistribusi di Sulawesi dan Jawa, memiliki perbedaan

karakter morfologi yang spesifik antara lokasi Jawa dan Sulawesi.

Hartman dkk. (2016), melakukan identifikasi holotype C. fumosus

yang berasal dari Sulawesi dan mendapatkan hasil bahwa C. fumosus

dari Jawa merupakan jenis baru. Selain itu, Riyanto dkk. (2016)

menemukan spesies baru dari Nunukan, Kalimantan Timur.

Penemuan jenis baru ini adalah yang pertama sejak 26 tahun yang lalu

setelah Hikida (1990) mendeskripsikan tiga spesies baru, yaitu C.

ingerii, C. matsui, dan C. yoshii.

2.6 Analisis Filogenetik

Pendekatan filogenetik didasarkan pada sebuah hubungan evolusi

dari sebuah kelompok organisme yang anggotanya memiliki

kesamaan karakter dan memiliki kekerabatan yang dekat, serta

diperkirakan masih dalam satu nenek moyang yang sama. Konstruksi

filogenetik juga memerlukan organisme yang digunakan sebagai

outgroup untuk validasi pohon filogenetik (Hartl & Clark, 1997).

Menurut Mount (2001), outgroup merupakan salah satu prosedur

untuk meyakinkan dari sekuens asli. Penambahan outgroup dapat

meningkatkan prediksi dari pohon dengan metode yang digunakan.

Sekuens dari outgroup yang dipilih harus berkolerasi dekat dengan

sekuen-sekuen yang dianalisa, tetapi juga mempunyai perbedaan yang

signifikan antara outgroup dengan sekuens yang lain. Pemilihan

sekuens outgroup yang terlalu jauh kekerabatannya kemungkinan

akan menghasilkan prediksi pohon yang salah atau kurang tepat akibat

terdapat perbedaan yang secara random lebih banyak diantara sekuens

outgroup dengan sekuens lainnya.

Konstruksi filogenetik menggunakan marker DNA digunakan

karena memiliki karakter yang konsisten dibandingkan karakter

morfologi. Pemikiran lain penggunaan DNA dalam studi filogenetik

didasarkan pada perubahan basa nukleotida menurut waktu, sehingga

dapat diperkirakan kecepatan evolusi yang terjadi dan dapat

direkonstruksi hubungan evolusi antara kelompok organisme. Analisis

filogenetik dipilih sebagai marker identifikasi spesies karena DNA

menyediakan informasi yang merepresentasikan karakter yang

muncul pada morfologi. Pengujian set data model mengambil konsep

DNA conserve yang akan mengelompokkan spesies berdasarkan

kesamaan nukelotida. Polimorfisme DNA yang muncul akan

12

memunculkan cabang pohon yang lebih variatif, sehingga spesies

akan terpisah menjadi beberapa clade (Lemey dkk., 2009).

Analisis filogenetik sekuens DNA dan protein akan menjadi

wilayah penting dalam analisis sekuens. Filogenetik dapat

menganalisis perubahan yang terjadi dalam evolusi organisme yang

berbeda. Sekuens yang mempunyai kedekatan dapat diidentifikasi

melalui penempatan di cabang yang bertetangga pada pohon.

Hubungan filogenetik di antara gen dapat digunakan untuk

memprediksi kemungkinan fungsi yang ekuivalen. Prediksi fungsi ini

dapat duji dengan eksperimen genetik (Nielsen & Yang, 1998).

Analisis metode bootstrap adalah metode yang menguji seberapa

baik set data model yang dihasilkan. Data dianalisis ulang secara

random dengan cara memilih kolom vertikal dari sekuens yang

disejajarkan untuk menghasilkan alignment baru dengan panjang yang

sama. Sebagai konfirmasi, maka dilakukan validitas penyusunan

cabang dalam prediksi filogenetik, yaitu dengan resampled dari kolom

multiple sequence alignment untuk membentuk pensejajaran baru.

Cabang-cabang dalam topologi filogenetik diprediksi akan menjadi

signifikan jika set data bootstrap memiliki nilai >70% untuk

memprediksi cabang-cabang yang sama (Matsui dkk, 2010). Menurut

Hedges (1992), metode penghitungan bootstrap digunakan untuk

memperoleh perkiraan kesalahan non-parametrik dalam rekonstruksi

pohon filogenetik. Setiap cabang pohon filogeni yang tersusun berasal

dari hasil replikasi data dan frekuensi kelompok cabang taksa tertentu.

Susunan pohon filogenetik memiliki batas kepercayaan perhitungan

bootstrap dengan nilai >70 %.

2.7 Analisis Molekuler

Perkembangan teknologi di bidang biologi molekuler seperti

Human Genome Project (HGP) menyebabkan penelitian diarahkan

pada hipotesis pohon filogenetik untuk menarik kesimpulan mengenai

keragaman genetik dan hubungan antara populasi dengan spesies

(Budiarsa, 2013). Evolusi merupakan proses gradual suatu organisme

yang memungkinkan spesies dengan struktur yang sederhana menjadi

kompleks melalui akumulasi perubahan dari generasi ke generasi.

Evolusi didasarkan pada perubahan adaptasi dengan lingkungan

tempat spesies tinggal. Proses adaptasi menyebabkan adanya suatu

perbedaan dari ancestor (nenek moyang). Variasi dan diferensiasi

dapat diketahui dari jumlah basa polimorfik dari suatu lokus gen

13

masing-masing populasi berdasarlkan urutan DNA (Cavalli & Sforza,

1997).

Metode molekuler digunakan sebagai marker genetik karena

memiliki beberapa kelebihan, diantaranya adalah satu gen pada

sepasang jenis atau populasi yang berevolusi secara clocklike fashion

atau jam molekuler yang digunakan untuk memperkirakan perbedaan

waktu (Hartl & Clark, 1997). Pengunaan marker molekuler ini

dilakukan dalam taksonomi dilakukan melalui beberapa metode,

diantaranya adalah melalui peta restriksi fragmen DNA dengan RFLP,

hibridisasi, dan sekuensing DNA (Singh, 2012).

2.7.1 Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik perbanyakan

DNA (replikasi) secara in vitro. Teknik ini mengacu pada siklus

thermal pada mesin PCR. Suhu pada mesin diatur untuk dapat

melakukan amplifikasi. Menurut Theopillus (2008), prinsip dalam

melakukan PCR yaitu denaturasi, annealing dan ekstensi. Template

DNA akan terdenaturasi menjadi single helix, selanjutnya suhu pada

mesin diturunkan agar primer dapat menempel pada template DNA

atau gen target yang diinginkan. Primer yang menempel pada template

DNA akan membentuk jembatan hidrogen dengan sekuen yang

komplementer dengan sekuen primer. Selain itu, enzim DNA

polymerase yang ada pada primer digunakan untuk memperpanjang

hasil copy DNA. Siklus mesin PCR dilakukan optimal untuk dapat

melakukan amplifikasi secara optimal kurang lebih sebanyak 30-35

siklus. Amplifikasi gen target pada untai DNA harus dilakukan dengan

penggunaan primer yang spesifik. Visualisasi DNA target yang telah

diamplifikasi dilakukan dengan gel elektroforesis (Newton &

Graham, 1994).

2.7.2 Gen NADH Dehydrogenase Subunit 4 (ND4)

Deoxyribose Nucleic Acid (DNA) merupakan makromolekul yang

memiliki karakteristik sebagai penyimpan informasi genetik.

Informasi ini dapat diteruskan dari sel induk ke sel anak melalui proses

replikasi. Struktur DNA tersusun dari monomer nukleotida yang

saling berkomplemen membentuk untai heliks ganda. DNA terdapat

di dalam inti sel dan mitokondria (Kumazawa & Endo, 2004). DNA

mitokondria (mtDNA) terletak di dalam matriks mitokondria. DNA

mitokondria memiliki sususan unit kode genetik dengan panjang basa

14

15,7-19,5 Kb (Arlyza & Adrim, 2007). Daerah genom mitokondria

terbagi atas 13 gen penyandi protein yang terdiri atas 3 subunit

sitokrom oksidase (COI-COIII), 7 subunit NADH Dehidrogenase

(ND1-6 dan ND 4L), 2 subunit ATPase (6 dan 6L), sitokrom b (cyt b),

2 gen rRNA (12s dan 16s) dan 22 gen tRNA (Gambar 4.) (Melnick &

Hoelzer, 1993).

(Moraes dkk., 2002)

Gambar 4. Peta Genom Mitokondria.

DNA mitokondria digunakan sebagai penanda untuk DNA

barcoding dikarenakan laju mutasi yang terjadi sangat sedikit.

Informasi genetik dari DNA mitokondria diwariskan secara maternal

dan berukuran cukup besar. NADH Dehydrogenase subunit 4 (ND4)

saat ini digunakan sebagai salah satu penanda molekuler untuk

identifikasi spesies dan hubungan kekerabatannya. Pemilihan gen ini

didasarkan pada urutan nukleotida yang sangat efektif dalam menguji

kesesuaian dan memperkirakan filogeni suatu organisme (Hayaska

dkk., 1988). Selain itu, ND4 memiliki karakter penting dalam

menjelaskan hubungan kekerabatan yang didasarkan pada variasi di

setiap jenis organisme (Zhang dkk., 2014). Penggunaan identifikasi

spesies dengan penanda ND4 memiliki keunggulan yang

menunjukkan sejarah demografi berdasarkan proses geologi suatu

spesies (Kumuzawa & Mutsumi, 2000).

15

Gen ND4 merupakan kompleksitas susunan gen mitokondria. Gen

ND4 melakukan sintesis protein dengan hasil NADH Dehydrogenase

4. Protein ini adalah bagian dari kompleks enzim yang besar yang aktif

di dalam genom mitokondria. Struktur sel mitokondria pada dasarnya

mengkonversi energi dari makanan menjadi bentuk lain yang dapat

digunakan oleh sel. Stuktur selular mitokondria memproduksi energi

yang siap digunakan untuk proses fosforilasi oksidatif, dimana

oksigen dan gula digunakan untuk menghasilkan Adenosin

Triphosphate (ATP) yang merupakan sumber utama energi sel

(Huoponen, 2001).

16

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian tentang “Filogeografi Cicak Jari Lengkung (Squamata;

Gekkonidae; Crytodactylus) di Jawa dan Sumatera Berdasarkan

Analisis Morfologi dan Molekuler Gen NADH Dehydrogenase

Subunit 4 (ND4)” dilaksanakan pada bulan November-Mei 2017

bertempat di Laboratorium Ekologi dan Diversitas Hewan serta

Biologi Molekuler Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya.

3.2 Kerangka Kerja Penelitian

Tahapan penelitian yang akan dilaksanakan meliputi beberapa

langkah, diantaranya sebagai berikut :

1. Studi pendahuluan dilakukan untuk mengetahui dan memperoleh kajian terkait konstruksi Paparan Sunda, persebaran Cyrtodactylus,

lokasi pengambilan sampel, metode ekstraksi DNA dan

rekonstruksi pohon filogenetik.

2. Koleksi sampel Cyrtodactylus dari Jawa dan Sumatra. 3. Pengawetan dan pengambilan jaringan Cyrtodactylus untuk

mendapatkan sampel DNA.

4. Ekstraksi DNA Cyrtodactylus yang bertujuan untuk mendapatkan DNA yang murni.

5. Pemotongan gen target (ND4) dan perbanyakan untai DNA menggunakan mesin thermal cycler yang bertujuan untuk

menandai DNA target untuk dilakukan sekuensing.

6. Sekuensing gen ND4, bertujuan untuk menterjemahkan urutan DNA dari sampel Cyrtodactylus yang dipilih dari setiap wilayah

di Paparan Sunda.

7. Pengumpulan data pembanding dan tambahan dari Cyrtodactylus diambil dari Genbank. Selain itu, dilakukan pencarian data

outgroup yang bertujuan untuk mengkonfirmasi rekonstruksi

filogenetik dari Cyrtodactylus

8. Pembuatan pohon filogenetik dari hasil sekuensing untuk mengetahui hubungan kekerabatan genus Cyrtodactylus di Paparan

Sunda.

17

3.3 Deskripsi Area Studi

Topografi pulau Sumatra terbagi atas dua bagian, yaitu

pegunungan dan dataran rendah. Adanya barier ekologi berupa

pegunungan Bukit Barisan yang membentang membagi Sumatra

menjadi dua bagian, sehingga beberapa satwa mengalami diferensiasi

dan variasi morfologi akibat adaptasi dengan lingkungannya (Voris,

2000). Berbeda dengan Sumatra, pulau Jawa merupakan daerah yang

sebagian besar adalah hutan dataran rendah yang kini telah ditebangi

dan banyak berkurang. Hanya sedikit hutan pegunungan yang masih

ada saat ini dan membentuk habitat pulau-pulau yang terisolasi tanpa

penghubung di antaranya. Kondisi ini kemungkinan menghambat

terjadinya aliran gen antara populasi dari barat dan pusat Jawa (Matsui

dkk., 2010).

Gambar 5. Peta lokasi sampling Cyrtodactylus di Pulau Sumatra dan

Jawa

Lokasi pengambilan sampel di pulau Sumatra meliputi Aceh,

Sumatra Barat, Sumatra Utara dan Jambi. Sedangkan lokasi

pengambilan sampel di pulau Jawa meliputi Jawa Barat dan Jawa

Tengah. Setiap provinsi dilakukan pengambilan sampel pada beberapa

18

kota/kabupaten. Masing-masing dipilih lokasi yang dapat

menginterpretasikan wilayah tersebut. Jumlah sampel dan lokasi dapat

ditinjau pada tabel 1. Lokasi sampling Cyrtodactylus di Jawa dan

Sumatra dapat ditinjau pada Gambar 5.

3.4 Pengambilan Sampel Cyrtodactylus

Metode pengambilan data Cyrtodactylus dilakukan dengan metode

Visual Encounter Surveys (VES) yang dimodifikasi dengan metode

transek (Heyer dkk, 1994). Metode transek digunakan untuk pencarian

sampel pada lokasi yang luas dengan waktu yang singkat. Metode

transek dilakukan untuk mencari sampel yang umum dengan populasi

yang besar dan merata di sepanjang jalur transek. Metode VES

dilakukan dengan jelajah bebas pada lokasi pengambilan sampel. VES

digunakan untuk mengetahui keragaman jenis pada suatu daerah.

Setiap sampel Cyrtodactylus diidentifikasi dengan buku panduan

lapang dan dikoleksi menggunakan kantong spesimen. Koordinat

sampel yang telah ditemukan dicatat menggunakan Global

Positioning System (GPS). Preservasi sampel dilakukan dengan

menyuntik sampel hidup menggunakan etanol 70%. Sampel yang

telah mati selanjutnya dilakukan pengambilan gambar bagian dorsal,

ventral dan lateral. Pengambilan sampel jaringan dilakukan pada

bagian liver kemudian diawetkan pada etanol absolut 96%.

Penyimpanan sampel awetan dilakukan dengan menyuntikkan

formalin 10% pada seluruh bagian tubuh. Sampel awetan yang telah

diisi formalin ditata seperti halnya sampel yang masih hidup.

19

Tabel 1. Daftar sampel Cyrtodactylus

No.

Nomor

Lapang Spesies Locality

1. ENS 16026 C. semicinctus Kerinci, Jambi

2. ENS 15476 C. cf psarops Karo, Sumatra Utara

3. ENS 16108 C. marmoratus Sukabumi, Jawa Barat

4. ENS 16889 C.cf psarops Tapanuli Selatan, Sumatra

Utara

5. ENS 19697 C. consobrinus Andalas Forest, Sumatra

Barat

6. NK 0018 C. semiadii Cilacap, Jawa Tengah

7. NK 0120 C. marmoratus Nusakambangan, Cilacap

8. ENS 18770 C. lateralis Seulawah Agam, Aceh

9. ENS 16595 C. cf marmoratus Toba Samosir, Sumatra

Utara

10. ENS 19224 C. cf psarops Payakumbuh, Sumatra

Barat

3.5 Analisis Molekuler

3.5.1 Ekstraksi DNA

Sampel Cyrtodactylus yang dikoleksi selanjutnya diambil jaringan

otot pada bagian paha/liver, kemudian diawetkan dengan etanol

absolut 96%. Sampel jaringan yang telah diambil diekstraksi DNA

sesuai dengan protokol QiagenAmp. Prinsip isolasi DNA terbagi atas

empat tahap yaitu lisis, deproteinase, presipitasi dan pelarutan DNA.

Sampel jaringan yang telah diambil ditimbang sebanyak 0,25 g atau

25 µL sampel DNA, kemudian ditambahkan larutan buffer ATL 180

µL, kemudian divortex. Selanjutnya, ditambahkan larutan proteinase-

K sebanyak 20 µL. Penambahan larutan ini bertujuan untuk

mengurangi kontaminan berupa protein yang dapat mengurangi

kemurnian DNA. Sampel kemudian diinkubasi pada suhu 56̊ C selama

1 jam 30 menit. Setiap 30 menit dilakukan vortex agar larutan

proteinase-K dapat bekerja kembali. Setelah proses inkubasi, sampel

disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 15 detik. Langkah

selanjutnya, ditambahkan buffer lisis (buffer AL) sebanyak 200 µL

dan divortex. Buffer AL berfungsi untuk lisis DNA dari histon yang

ada pada kromosom. Pemaksimalan kerja buffer AL dilakukan dengan

inkubasi pada suhu 70̊ C selama 10 menit dan kemudian dilakukan

sentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 15 detik. Larutan etanol

20

96% ditambahkan sebanyak 200 µL untuk langkah presipitasi DNA.

Langkah ini dilakukan agar DNA tidak tercampur oleh komponen lain,

seperti protein dan RNA yang dapat mengurangi kemurnian DNA.

Larutan dipindahkan ke dalam tube minispin dan disentrifugasi pada

8000 rpm selama 1 menit. Selanjutnya, bagian atas minispin diangkat

dan dipindahkan pada mikrotube baru.

Prinsip presipitasi pada protokol menggunakan kit dilakukan

dengan menambahkan prosedur washing untuk memastikan

kemurnian DNA. Sampel yang telah berada mikrotube baru

selanjutnya ditambahkan larutan buffer AW1 sebanyak 500 µL dan

disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Bagian atas

minispin diangkat kembali dan dipindahkan ke mikrotube baru.

Selanjutnya ditambahkan larutan buffer AW2 sebanyak 500 µL dan

disentrifugasi sebanyak 14000 rpm selama 3 menit. Prinsip isolasi

DNA yang terakhir adalah dissolve DNA yaitu dengan cara

mengangkat bagian atas minispin kemudian dipindahkan ke dalam

mikrotube baru dan ditambahkan buffer AE sebanyak 200 µL. Sampel

diinkubasi pada suhu ruang selama 1 menit, dan selanjutnya

disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Bagian atas

minispin dibuang dan DNA yang berupa cairan disimpan pada

refrigrator -20̊ C untuk menjaga kondisi DNA. Suspensi DNA yang

disimpan selanjutnya digunakan sebagai template dalam amplifikasi

gen ND4 dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR).

3.5.2 Amplifikasi gen ND4

Satu pasang primer yang digunakan untuk mendapatkan sekuens

ND4 adalah ND4 (forward) 5’TGA CTA CCA AAA GCT CAT GTA

GAA GC 3’ dan LEU (reverse) 5’ TA CCT TTA CTT GGA TTT

GCA CCA 3’ (Arevalo dkk., 1994). Komposisi PCR mix terdiri dari

Go taq green sebanyak 5 µL kemudian ditambahkan ddH2O sebanyak

3,6 µL. Komplemen primer forward dan reverse masing-masing

ditambahkan sebanyak 0,2 µL. DNA sampel ditambahkan pada

komposisi PCR mix dan primer yang berfungsi sebagai template

amplifikasi gen ND4. Total volume reaksi sebanyak 10 µL. PCR tube

yang telah berisi komponen PCR selanjutnya dimasukkan ke dalam

mesin thermocycling. Amplifikasi gen ND4 menggunakan metode

PCR dengan pengulangan siklus sebanyak 32 kali. Siklus denaturasi

dengan suhu 93° C selama 30 detik, annealing pada suhu 60° C selama

45 detik dan extension 72° C selama 1 menit. Pre-denaturasi dimulai

21

sebelum semua siklus PCR dimulai dengan suhu 95° C selama 2

menit. Pemaksimalan siklus PCR dilakukan dengan post-extension

selama 7 menit pada suhu 72° C. Hasil PCR kemudian diuji secara

kualitatif dengan gel agarose 1% untuk konfirmasi keberhasilan

amplifikasi gen ND4. Sekuens sampel Cyrtodactylus dilakukan

dengan jasa dari PT. GENETIKA SCIENCE Jakarta Barat.

3.5.3 Uji kualitatif DNA

Konfirmasi keberhasilan amplifikasi gen target ND4 dilakukan

dengan pendekatan kualitatif menggunakan elektroforesis gel agarosa.

Bubuk agarosa ditimbang sebanyak 0,35 gram kemudian dimasukkan

ke dalam erlenmeyer, selanjutnya ditambahkan dengan buffer TBE 1x

sebanyak 35 mL. Erlenmeyer beserta larutan pada dipanaskan pada

panic panas selama 5 menit. Setelah itu, agar didiamkan beberapa

detik hingga tidak terlalu panas, kemudian ditambahkan EtBr 0,3 µL

untuk mewarnai sampel DNA. Plate elektroforesis yang telah

ditancapkan sisiran 16 sumuran digunakan untuk uji kualitatif.

Larutan dimasukkan pada plate elektroforesis dan ditunggu hingga

mengeras. Sisiran selanjutnya diambil dari plate dan gel elektroforesis

dipindahkan pada chamber elektroforesis. Sampel 1 µL dan 2 µL

loading dye dimasukkan. Panjang DNA ditentukan melalui

penambahan ladder 1 kilobase (kb). Selanjutnya, alat elektroforesis

dirunning pada 90 V selama 30 menit. Visualisasi hasil elektroforesis

dilakukan dengan UV transilluminator.

3.5.4 Pengumpulan data sekuens Cyrtodactylus di kawasan

Paparan Sunda

Pencarian data sekuens beberapa spesies Cyrtodactylus yang ada

di kawasan Paparan Sunda bertujuan untuk mengetahui pola

pengelompokan dan kekerabatan Cyrtodactylus dari Jawa dan

Sumatra. Selain itu, dilakukan pencarian sekuens outgroup yaitu

sekuens DNA dari kerabat dekat genus Cyrtodactylus yang bertujuan

untuk mengkonfirmasi topologi pohon kekerabatan. Menurut Mount

(2001), outgroup merupakan salah satu prosedur yang digunakan

untuk validasi dari sekuens asli. Sekuens dari outgroup yang dipilih

harus berkorelasi dekat dengan sekuen-sekuen yang dianalisa, tetapi

juga mempunyai perbedaan yang signifikan antara outgroup dengan

sekuens yang lain. Pencarian sekuens DNA yang digunakan gen

22

Mitokondria (mtDNA) ND4 dengan panjang 527- 702 bp. Berikut

sekuens yang didapatkan dari Genbank dapat dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Data sampel Cyrtodactylus dan outgroup dari Genbank

No. Spesies Locality Accesion

Number

1. C. consobrinus Kalimantan Barat, Kalimantan EU268412.1

2. C. loriae Papua Nugini EU268413.1

3. Gekko gecko China EU268422.1

4. Cnemaspis limi Malaysia NC020039.1

3.6 Rekonstruksi Pohon Filogenetik

3.6.1 Contig dan alignment sekuens DNA

Sekuens ND4 dari beberapa sampel Cyrtodactylus yang telah

didapatkan dari hasil sekuensing selanjutnya dilakukan contig

(penggabungan) untuk mendapatkan sekuens yang utuh. Hasil contig

dari seluruh sekuens selanjutnya dilakukan allignment dengan

program MEGA7 menggunakan alignment Clustal W. Hasil

alignment akan terdapat gap yang berada pada awal dan akhir sekuens,

sehingga dilakukan trimming (pemotongan) secara manual sehingga

didapatkan 680 bp. Penghapusan gap yang muncul dilakukan untuk

meminimalisir kesalahan software dalam merekonstruksi pohon

filogenetik. Data sekuens yang telah dilakukan alignment diexport

dalam format fasta dan MEGA.

3.6.2 Analisis Sequence Divergence (p-Distance)

Munculnya perbedaan basa nukleotida pada hasil alignment

dianalisis dengan metode pairwise distance. Analisis ini dilakukan

dengan tujuan untuk mengetahui jumlah nukleotida atau asam amino

yang berbeda pada lokus DNA. Nilai p-distance dapat dijadikan

sebagai dasar penentuan spesies namun tidak dapat menjelaskan jejak

historis evolusi dari suatu taksa (Lemey dkk., 2009). Dari hasil

penelitian ini nilai p-distance 15 % pada sekuens gen ND4 sudah

dapat dinyatakan beda spesies.

23

3.6.3 Pemilihan Modeltest untuk Analisis Maximum likelihood dan

Bayesian Inference

Pembuatan modeltest dilakukan untuk mendapatkan permodelan

pohon yang sesuai dengan hasil alignment yang dimiliki, sehingga

software tidak perlu melakukan semua uji probabilitas untuk

mendapatkan topologi pohon (Lemey, 2009). Pemilihan modeltest

untuk analisis menggunakan software Jmodeltest berdasarkan AIC

(Akaike Information Center). Pemilihan untuk analisis Bayesian

Inference dilakukan dengan software Kakusan 4.

3.6.4 Analisis Maximum Likelihood dan Maximum Parsimony

Metode maximum parsimony (MP) memilih kriteria pohon dengan

perubahan evolusi paling sedikit atau panjang cabang terpendek

sebagai pohon yang paling sesuai dengan kondisi evolusi yang

sebenarnya (Lemey, 2009). Pemilihan analisi filogenetik juga harus

mempertimbangkan model evolusi pohon filogeni. Penggunaan

maximum likelihood (ML) didasarkan pada model kemungkinan, yaitu

program yang merekonstruksi pohon filogeni terbaik dengan nilai

probabilitas yang tinggi. Metode ML akan mencari pohon filogenetik

yang mencerminkan proses evolusi yang sebenarnya dengan cara

mencari setiap kemungkinan topologi pohon yang terbentuk dan

mempertimbangkan setiap posisi nukleotida atau asam amino dalam

suatu alignment, dengan memanfaatkan model subtitusi dan tingkat

variasi mutasi dalam setiap sites alignment (Nei dan Kumar, 2000).

Maximum likelihood (ML) dan maximum parsimony (MP) dianalisis

dengan PAUP* 4.0 (Swofford, 2002). Heuristic search option dari

MP dianalis dengan tree bisection recognition (TBR) dengan replikasi

pencarian (nreps) 10 kali dan bootstrap 1000 kali. Permodelan untuk

analisis ML berdasarkan AIC didapatkan model evolusi TrN+I+G,

dengan instruksi Lset base=(0.3475 0.3759 0.0828 ) nst=6

rmat=(1.0000 19.9856 1.0000 1.0000 7.6329) rates=gamma

shape=0.6080 ncat=4 pinvar=0.2940;). Heuristic search option

dianalisis dengan TBR replikasi 10 kali dan bootstrap 100 kali.

3.6.5 Analisis Bayesian Inference

Bayesian Inferior Probablity (BPP) diestimasi melalui MrBayes

3.0b4. Modeltest untuk analisis Bayesian dari hasil Kakusan 4 adalah

GTR (General Time Reversible) dan bentuk parameter Gamma yang

muncul sebagai modeltest terbaik dengan hasil alignment yang

24

dimiliki. Perhitungan mcmc (monte carlo markov chain) berjumlah

1.000.000, perhitungan sampel tiap generasi (nreps) 1000 kali

generasi.

3.7 Morfometri

3.7.1 Pengambilan data morfometri

Pengambilan data morfometri dilakukan pada sampel awetan yang

ada di Laboratorium Ekologi dan Diversitas Hewan (UB). Selain itu,

morfometri juga dilakukan dari foto dengan menggunakan software

ImageJ. Metode ini dipilih dikarenakan sampel yang digunakan dalam

penelitian ini berada di Laboratorium Amfibi dan Reptil University of

Texas at Arlington. Pengambilan data ini bertujuan untuk menguatkan

hasil analisis molekuler menggunakan data clade yang dibangun dari

karakter morfologi. Selain itu, identifikasi morfometri dilakukan juga

untuk mengetahui variasi setiap spesies dari Cyrtodactylus.

Pengukuran karakter morfometri dan meristik yang dilakukan

mengacu pada (Riyanto dkk., 2016).

Tabel 3. Karakter morfometri Cyrtodactylus

No. Karakter Morfometri Singkatan

1. Panjang mulut sampai kloaka SVL

2. Panjang ekor TailL

3. Panjang badan diantara anggota gerak AGL

4. Panjang kepala HeadL

5. Lebar kepala HeadW

6. Panjang antara mata dan mulut EyeS

7. Diameter mata EyeD

8. Panjang jarak mata dan hidung SnEye

9. Panjang jarak antara mata dan telinga EarEye

10. Panjang jarak antar mata IO

25

Tabel 4. Karakter meristik Cyrtodactylus

No. Karakter Meristik Singkatan

1. Sisik bibir atas SupraL

2. Sisik bibir bawah InfraL

3. Tuberkel pada tangan TB

4. Tuberkel pada kaki TA

5. Tuberkel dorsal DT

6. Tuberkel punggung diantara alat gerak PVT

7. Sisik perut VS

9. Tuberkel pada lipatan ventrolateral TVF

10. Jumlah sisik besar femoral EFS

11. Jumlah sisik besar precloacal EPS

12. Jumlah pori sisik femoral FP

13. Jumlah pori sisik precloacal PP

14. Bentuk precloacal PG

15. Jumlah digiti pada jari kaki ke empat Lam

Hasil dari pengukuran dan identifikasi meristik dicatat pada

microsoft excel. Selanjutnya dilakukan pengolahan data dan analisis

dengan software PAST untuk mengetahui pengelompokan

Cyrtodactylus melalui PCA (Principal Component Analysis) yang

berdasarkan morfologi.

3.7.2 Analisis data morfometri

Analisis data dilakukan dari hasil pengukuran dan identifikasi dari

setiap karakter yang diamati kemudian dilakukan pengkonversian

standarisasi untuk Clustering Analysis dan PCA. Nilai SVL digunakan

sebagai pembagi dari setiap karakter yang diamati, kemudian di Log

10 dan dilakukan pengkalian 100 (persamaan 1) (Kurniawan

dkk.,2011).

(1)= Log10 (Karakter/SVL) x 100%

26

3.7.3 Analisis Principal Component Analysis Cyrtodactylus Analisa hubungan kekerabatan Cyrtodactylus dilakukan dengan

menggunakan software PAST. Software PAST digunakan untuk

analisis PCA (Principal Component Analysis). Principal Component

Analysis dilakukan untuk mengetahui pola persebaran berdasarkan

karakteristik morfometrik.

27

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Morfometri dan Meristik Cyrtodactylus

Berdasarkan analisis morfometri dan meristik yang dilakukan pada

sampel awetan, telah diidentifikasi sebanyak 6 spesies yaitu C.

marmoratus, C. semicinctus, C. psarops, C. lateralis, C. consobrinus

dan C. semiadii. Berdasarkan hasil pengukuran pada seluruh sampel,

didapatkan bahwa ukuran betina mengalami sex dimorfisme yaitu

memiliki SVL yang lebih pendek dibandingkan dengan jantan. Selain

itu, terdapat perbesaran sisik femoral dan pori pada sisik precloacal

yang mengalami diferensiasi (Tabel 5 dan 6).

Tabel 5. Karakter morfometri Cyrtodactylus betina

Spesies SVL

(mm)

TailL

(mm)

Sisik

besar

femoral

Sisik

precloacal

C. consobrinus, Sumbar 119,7 104,2 Tidak ada 12

C. cf psarops, Sumbar 57,4 70,3 Ada 11

C. cf marmoratus, Sumut 54,9 68,5 Ada 7

C. marmoratus, Jabar 46,1 28,4

(reg)

Ada 12

C. cf psarops, Sumut 68,8 54,6 Ada 11

Tabel 6. Karakter morfometri Cyrtodactylus jantan

Spesies SVL

(mm)

TailL

(mm)

Sisik

besar

femoral

Sisik

precloacal

C. lateralis, Aceh 76,81 46,5

(reg)

Ada 10

C. psarops, Sumut 60,1 72,8 Ada 14

C. semicinctus, Jambi 58,6 70,2 Ada 15

C. semiadii, Jateng 43,9 29,4 Tidak Ada 0

C. marmoratus, Jateng 58,9 72,8 Ada 17

Pola sisik precloacal, sisik femoral, pori sisik femoral dan pori

sisik precloacal merupakan karakter yang dapat dijadikan sebagai ciri

pembeda setiap spesies (Harvey dkk., 2015). Perbedaan setiap spesies

28

dalam genus Cyrtodactylus dapat ditinjau melalui karakter tersebut

karena aktivitas reproduksi yang berbeda dan dipengaruhi struktur

sekunder dari organ reproduksi yang dipengaruhi oleh lingkungan

(Russel dkk., 2015). Berdasarkan hasil meristik yang dilakukan pada

keseluruhan individu didapatkan karakter pembeda spesies yang dapat ditinjau pada Gambar 6.

(Dokumentasi pribadi, 2017)

Gambar 6. Pola precloacal dan sisik femoral. Ket: a) C. psarops; b)

C. consobrinus; c) C. lateralis; d) C. marmoratus e) C.

semiadii; f) C. semicinctus

Berdasarkan gambar 6, tipe pola precloacal dan sisik femoral

menunjukkan perbedaan yang signifikan pada seluruh spesies

Cyrtodactylus di Paparan Sunda. C. psarops tidak memiliki bentuk

precloacal, tidak terjadi perbesaran sisik precloacal terjadi sisik yang

a b

c

d

f e

,

b

c

e f

d

e

a

,

.

29

tiba-tiba antara post femoral dan femoral. Sisik besar femoral tersusun

kontinu sebanyak 28-35. Berbeda dengan C. psarops, C. consobrinus

tidak memiliki perbesaran sisik femoral namun terjadi perbesaran sisik

precloacal dengan jumlah antara 8-10. Dalam penelitia ini, variasi

pada C. consobrinus terjadi pada dua populasi besar, yaitu Sumatra

dan Kalimantan. Populasi Kalimantan terdapat pori pada sisik

precloacal, sedangkan pada populasi Sumatra tidak ditemukan.

C. lateralis merupakan spesies endemik Sumatra yang memiliki

tipe perbesaran sisik femoral dan pori sebanyak 9 yang tidak

menyambung satu sama lain. Bentuk precloacal wide dengan sisik

besar cloacal sebanyak 10. Gambar 8d, C. marmoratus memiliki sisik

femoral yang kontinu sebanyak 42-50, pola precloacal berbentuk

angular. Tidak memiliki pori pada sisik femoral dan sisik precloacal.

Gambar 8e, C. semiadii tidak memiliki perbesaran sisik femoral dan

cloacal. Karakter kunci dari spesies ini adalah ekor yang pendek,

membesar dan silindris. Gambar 8f, C. semicinctus memiliki

perbesaran sisik femoral yang menyambung dengan jumlah 36-38,

pola precloacal subtriangular, terjadi perbedaan sisik yang tiba-tiba

antara post femoral.

4.1.1 Principal Component Analysis (PCA) Cyrtodactylus di Jawa

dan Sumatra berdasarkan analisis morfologi

Analisis PCA dilakukan untuk mengidentifikasi pola

pengelompokan Cyrtodactylus di Jawa dan Sumatra berdasarkan

persamaan karakter yang diamati. Pengelompokan yang dilakukan

pada sampel awetan Cyrtodactylus dibedakan berdasarkan jenis

kelamin sampel. Perbedaan sampel jantan dan betina didasarkan pada

ukuran SVL, panjang kepala, lebar kepala dan ukuran ekor.

Munculnya sex dimorfisme disebabkan kebutuhan reproduksi dalam

menghasilkan keturunan yang baik (Nesty, 2013) Hasil PCA dari

karakter morfometri dapat ditinjau pada Gambar 7.

30

Gambar 7. Hasil PCA Cyrtodactylus jantan Ket. CM: C. marmoratus;

CL: C. lateralis; CSM: C. semiadii; CSC: C. semicinctus;

CK: C. klakahensis

Berdasarkan gambar 7, Cyrtodactylus jantan mengelompok

berdasarkan jenis spesis. Pada pengelompokan C. marmoratus, antara

populasi Jawa dan Sumatra memiliki ciri khas yang secara

keseluruhan sama. Karakter morfometri menunjukkan nilai yang

mirip sehingga menyebabkan pengelompokan pada genus

Cyrtodactylus. Spesies C. semiadii merupakan spesies baru yang

dicirikan dengan ekor pendek yang membulat memiliki

pengelompokan di luar kelompok C. marmoratus. Selain itu, C.

semicinctus yang merupakan spesies dari Jambi yang secara morfologi

berbeda dengan kelompok C. marmoratus. Kelompok C. lateralis

yang berasal dari Aceh memiliki pengelompokan sendiri berdasarkan

karakter SVL dan TL yang panjang. Pengelompokan yang sangat jauh

dari dua kelompok besar yaitu C. klakahensis. Spesies ini merupakan

jenis baru yang karakter morfologinya sangat jauh berbeda dari C.

marmoratus dan C. lateralis.

Pengelompokan C. marmoratus dapat dikatakan bahwa secara

morfologi populasi dari Jawa dan Sumatra mengalami kesamaan

karakter. Melihat persebaran yang luas yang memisahkan Jawa dan

Sumatra dengan adaptasi dalam jangka waktu yang lama akan

31

menyebabkan tingginya variasi genetik dari C. marmoratus.

Terjadinya isolasi populasi melalui periode waktu yang sangat

panjang, sebagian besar dikarenakan batas (barrier) geografi yang

mengijinkan perkembangan karakteristik varian mtDNA pada

populasi individu spesies tersebut (Bohlen dkk, 2011).

Gambar 8. Hasil PCA Cyrtodactylus betina Ket. CM: C. marmoratus;

CP: C. psarops; CCS: C. consobrinus; Ccf: C.cf

marmoratus)

Berdasarkan Gambar 8 pengelompokan dari kelompok

Cyrtodactylus betina menunjukkan kesamaan dengan kelompok

jantan. Populasi C. marmoratus dari Jawa dan Sumatra mengelompok

menjadi satu kelompok yang memiliki kesamaan karakter. Selain itu,

C. psarops yang merupakan spesies endemik Sumatra mengelompok

antar locality. Terdapat hal yang menarik, dimana C. consobrinus dari

Sumatra Barat masuk ke dalam kelompok C. marmoratus. Hal ini

disebabkan karakter SVL dan TL dari spesies ini sangat mirip dengan

C. marmoratus. Namun, secara karakter meristiknya kedua spesies ini

sangat berbeda jauh. Hal ini mengindikasikan bahwa C. consbrinus

dari Sumatra Barat masih juvenille. C.cf. marmoratus dari pulau

Samosir merupakan spesies yang unidentified yang secara morfologi

mirip dengan C. marmoratus, namun ditinjau dari hasil PCA

32

mengindikasikan spesies ini berbeda dari seluruh Cyrtodactylus dari

Jawa dan Sumatra. Sangat banyaknya variasi Cyrtodactylus

disebabkan adaptasi terhadap lingkungannya. Respon terhadap

lingkungan ditanggapi oleh perubahan fisiologis dari suatu organisme

sehingga memunculkan variasi-variasi morfologi akibat pemisahan

geografis dan jarak dari populasi induk suatu spesies (Nesty, 2013).

4.2 Hubungan Kekerabatan Genus Cyrtodactylus di Jawa dan

Sumatra Berdasarkan Analisis Gen ND4

Rekonstruksi pohon filogenetik dilakukan pada 12 sekuens

Cyrtodactylus dan dua sekuens outgroup dengan panjang 611 bp.

Filogram pohon dilakukan tiga analisis yaitu Maximum Likelihood

(ML), Maximum Parsimony (MP), dan Bayesian Inference (BI)

memiliki topologi pohon yang sama, sehingga dapat dikonstruksi

menjadi satu pohon filogenetik. Nilai bootstrap yang muncul pada

pohon filogenetik dari ketiga analisis menunjukkan perbedaan akibat

dari uji statistik yang berbeda dari setiap analisis dalam rekonstruksi

filogenetik. Kevalidan cabang pohon filogenetik didasarkan pada nilai

bootstrap Maximum Likelihood Bootstrap (MLBS), Maximum

Parsimony Bootstrap (MPBS), Bayesian Posterior Probabilty (BPP).

Topologi pohon filogenetik Cyrtodactylus dapat ditinjau pada Gambar

11. Pengelompokan yang terjadi didasarkan pada kesamaan genetis

dari setiap spesies. Hasil rekonstruksi filogenetik Cyrtodactylus

menunjukkan bahwa Cyrtodactylus merupakan kelompok monofiletik

yang terbagi atas dua clade besar (B dan C).

Clade A, B, dan C menunjukkan hubungan monofiletik yang

didukung dengan nilai bootstrap (MLBS=95, MPBS=99, BPP=93).

Clade A merupakan kelompok yang berasal dari Jawa namun terdapat

pemisahan clade B dari Jawa Tengah. Clade B merupakan kelompok

Cyrtodactylus dari Jawa Tengah. Clade C adalah kelompok

Cyrtodactylus dari Sumatra, Kalimantan, dan Papua. Pemisahan clade

outgroup (Gekko gecko dan Cnemaspis limi) dengan clade

Cyrtodactylus didukung dengan nilai bootstrap yang tinggi

(MLBS=95, MPBS=100, BPP=100). Selain itu, ditinjau dari nilai

uncorrected p-distance, dua spesies tersebut memiliki perbedaan

genetis sebesar 44-52%.

33

4.2.1 Clade A

Clade A terdiri dari satu spesies, yaitu C. marmoratus yang berasal

dari Jawa Barat. Clade ini didukung dengan nilai bootstrap yang valid

(MLBS=95, MPBS=99, BPP=93). Clade A terdiri atas spesies

monofiletik. Clade ini menunjukkan bahwa C. marmoratus

merupakan sister lineage dari spesies yang lain dengan nilai bootstrap

yang valid. Nilai bootstrap dianggap valid apabila pada cabang pohon

filogenetik mencapai nilai 70% (Hedges, 1992 dalam Matsui dkk.,

2011). Nilai bootstrap yang ditunjukkan pada topologi pohon >70 %,

menjelaskan bahwa clade A jelas mengalami pemisahan dari clade B

yang merupakan clade dari Jawa Tengah. Berdasarkan pohon

filogenetik, C. marmoratus dari Jawa Barat ini termasuk ancestor dari

semua spesies. Selain itu, nilai p-distance clade A yang terpisah

dengan clade B (33,6%) lebih tinggi dibanding dengan C. marmoratus

dari Sumatra Utara (31,3%). Hal ini berbeda dengan penelitian

sebelumnya oleh Wood dkk. (2012). Perbedaan yang ada yaitu C.

marmoratus dari Jawa Barat mengalami pengelompokan clade dari

Jawa Timur dan NTT. Hasil ini dapat diasumsikan bahwa C.

marmoratus dari Jawa Barat akan mengelompok sendiri dengan C.

marmoratus dari Sumatra.

(Dokumemtasi ENS, 2013)

Gambar 9. Karakter morfologi C. marmoratus dari Jawa Barat.

Keterangan: a) Dorsal; b) Ventral

a

A

,

.

b

,

.

34

Berdasarkan Gambar 9, C. marmoratus memiliki total SVL 46,1

mm. Spesies ini memiliki pewarnaan coklat dengan bercak hitam yang

tersusun dua garis dari pangkal ekor hingga kepala. Identifikasi secara

meristik didapatkan bahwa pada lipatan ventrolateral terdapat

tuberkel bulat kecil. Jumlah sisik femoral berjumlah 42. Hal ini

berbeda dengan penelitian yang dilakukan Mecke dkk. (2016) yang

menyatakan bahwa C. marmoratus tidak memiki tuberkel pada lipatan

ventrolateral dan jumlah sisik femoral 49-54. Berdasarkan hasil clade

dan morfologi, C. marmoratus dari Jawa Barat mengalami diferensiasi

genetik maupun morfologi sehingga dapat diasumsikan menjadi

subspesies maupun spesies baru.

4.2.2 Clade B

Clade B terdiri atas C. marmoratus dan C. semiadii yang berasal

dari Cilacap, Jawa Tengah. C. marmoratus dan C. semiadii

sebenarnya merupakan spesies yang berbeda (p-distance=0,28). Clade

B termasuk kelompok monofiletik yang didukung dengan nilai

bootstrap yang cukup signifikan (MLBS=85, MPBS=63, BPP=92).

Secara genetis maupun morfologi, kedua spesies ini sangat berbeda.

Hal ini dapat dikatakan sebagai kerabat dekat. C. semiadii adalah

spesies yang baru dideskripsikan oleh Riyanto dkk. (2014) melalui

analisis morfologi. Ditinjau pada Gambar 10, morfologi dari C.

marmoratus dan C. semiadii menunjukkan perbedaan yang sangat

jelas, namun pohon filogenetik posisi C. semiadii masih dalam clade

C. marmoratus complex. Hal ini dapat disimpulkan bahwa C. semiadii

merupakan sinonim dari C. marmoratus.

35

(Dokumentasi NK, 2014)

Gambar 10. Karakter morfologi ventral dan dorsal. Ket: a) C.

semiadii; b) C. marmoratus

Berdasarkan Gambar 10, terdapat perbedaan dari C. marmoratus

dan C. semiadii yang dapat dilihat pada ukuran panjang dan bentuk

ekor. C. semiadii memiliki ekor yang silindris sedangkan C.

marmoratus memiliki ekor yang panjang. Corak warna pada C.

semiadii terdapat bercak hitam yang tersusun rapi dari tengkuk hingga

ekor. Berbeda dengan C. marmoratus, pola warna yang ada pada

bagian dorsal berwarna hitam yang tersusun acak pada tengkuk hingga

paha. Selain itu, pola warna pada ekor berwarna hitam dan putih

hingga ujung ekor. Ditinjau dari bagian ventral pada Gambar 10,

menunjukkan perbedaan yang jelas pada pola sisik precloacal. C.

semiadii tidak memiliki pola sisik precloacal dan tidak memiliki

perbesaran sisik femoral. Pola precloacal pada C. marmoratus

berbentuk angular dengan sisik femoral menyambung dan mengalami

perubahan sisik yang tiba-tiba pada post femoral.

4.2.3 Clade C

Clade C terdiri atas C. consobrinus dari Sumatra Barat dan

Sarawak, C. semicinctus dari Jambi, C. lateralis dari Aceh, C. cf

psarops dari Sumatra Utara dan Sumatra Barat, C. cf marmoratus dari

Sumatra Utara. Clade C didukung dengan nilai bootstrap (MLBS=85,

a

,

.

b

,

.

36

MPBS=-, BPP=95) yang menunjukkan bahwa clade ini memiliki hasil

topologi yang valid. Clade C ini terbagi atas 2 kelompok, yaitu

subclade I dan II. Subclade II terbagi atas subclade kecil yaitu IIa dan

IIb. Nilai bootstrap >70 pada ML dan MP menunjukkan topologi

pohon didukung oleh bootstrap yang valid. Analisis BI dikatakan

menunjukkan cabang pohon yang valid apabila nilai bootstrap

mencapai 95 (Wood dkk., 2012).

Subclade CI terdiri atas C. consobrinus dari Sumatra Barat dan

Sarawak. Subclade I mempunyai hubungan monofiletik yang

didukung dengan nilai bootstrap (MLBS=100, MPBS=99, BPP=100)

yang menunjukkan hasil topologi pohon yang valid. Hasil

rekonstruksi pada subclade I mengindikasikan bahwa dalam tingkat

persebaran yang luas C. consobrinus masih dalam satu clade dengan

nilai p-distance 10%. Hasil ini menunjukkan kesamaan dengan

penelitian yang dilakukan Wood dkk. (2012). C. consobrinus berada

dalam satu clade dengan C. caverniculos, C. malaynus, C.

consobrinus dari Sumatra. C. consobrinus merupakan sister lineage

dari spesies complex C. irregularis. C. consobrinus merupakan

spesies yang berkerabat dekat dengan C. irregularis (Wood dkk.,

2012). C. consobrinus memiliki karakter morfologi yang sangat mirip

dengan C. aurensis (Grismer, 2005) dan C. hikidai (Riyanto dkk.,

2012). Perbandingan morfologi dapat ditinjau pada Gambar 12. Hasil

analisis menunjukkan bahwa C. consobrinus dapat digolongkan dalam

spesies complex. Hasil penelitian Wood dkk. (2012) menjelaskan

bahwa posisi C. consobrinus dengan C. aurensis terpisah oleh clade.

C. consobrinus ikut dalam clade Borneo dan Sumatra sedangkan C.

aurensis ikut dalam clade Filipina.

37

Gambar 11. Filogram Maximum likelihood, Maximum Parsimony dan Bayesian Inference berdasarkan Gen

ND4 di Jawa dan Sumatra. Ket: ‘*’=bootstrap 100.

38

a b

c d

(Riyanto dkk, 2015; Grismer, 2005)

Gambar 12. Perbandingan morfologi bagian dorsal. Ket: a) C.

consobrinus; b) C. hikidai; c) C. consobrinus; d). C.

aurensis

Berdasarkan Gambar 12, C. consobrinus memiliki pola warna pada

kepala hingga tengkuk berwarna putih yang saling menyambung

membentuk pola triangle. Berbeda dengan C. hikidai memiliki pola

warna yang hampir mirip dengan C. consobrinus, hanya yang

membedakan pada garis yang membentuk pola triangle tidak terlihat

jelas. Ditinjau dari karakter SVL, C. consobrinus memiliki total SVL 121

mm, sedangkan C. aurensis dan C. hikidai masing-masing 92-94 dan 72-

100 mm. Bagian dorsal memiliki pola garis yang berwarna putih

melintang membelah bagian dorsal seperti menjadi beberapa segmen.

Seperti halnya pada C. hikidai, perbedaan C. consobrinus dan C. aurensis

39

hanya pada pola garis di tengkuk hingga kepala (Grismer, 2005 dalam

Riyanto dkk., 2012).

Subclade II terdiri dari subclade kecil IIa dan IIb. Subclade IIa terdiri

dari C. semicinctus dari Jambi dan C. lateralis. Subclade ini tidak

didukung dengan nilai bootstrap (MLBS=57, MPBS=-, BPP=54).

Subclade IIa merupakan perpaduan dua spesies yang berada pada satu

clade. Hasil ini menunjukkan perbedaan pengelompokan pada C.

semicinctus yang pada penelitian Harvey dkk. (2015). Posisi C.

semicinctus berada dalam satu clade dengan C. semenanjungensis

(Grismer & Leong, 2005) dengan nilai dukung bootstrap MLBS dan BPP

92 dan 100. Sama halnya dengan C. lateralis, posisi C. lateralis pada

penelitian ini berkerabat dengan C. semicinctus namun nilai bootstrap

pada penelitian ini belum bisa dikatakan sebagai sister spesies. Harvey

dkk. (2016) menyatakan bahwa C. lateralis masuk dalam clade C.

spinosus, C. durio, C. nuaulu, C. stresemanni, dan C. serratus yang

dicirikan dengan tuberkel yang mirip duri pada lipatan ventrolateral dan

ekor.

Karakter morfologi pada gambar 13 menunjukkan adanya perbedaan

yang sangat jelas. Bagian dorsal C. lateralis berwarna kecoklatan dengan

bercak hitam kepucatan dan tuberkel yang mirip dengan duri pada

tubuhnya. Perbedaan yang sangat terlihat pada C. semicinctus dan C.

lateralis dilihat dari pola corak warna yang ada pada bagian dorsal. C.

semicinctus memiliki warna coklat mengkilap dengan warna bercak

hitam yang tersusun menutupi warna coklat. Bercak hitam pada bagian

kepala sebanyak 5-7 dan badan sebanyak 7-9 (Harvey dkk., 2015).

C.lateralis memiliki warna coklat kehitaman dengan pola bercak abu-abu

pada bagian kepala hingga ekor.

Pola sisik femoral dan precloacal memiliki perbedaan yang sangat

jelas. Pola sisik femoral dapat ditinjau pada gambar 14. C. lateralis

memiliki sisik besar femoral yang tidak menyambung satu sama lain,

dengan jumlah 5-7. Pola precloacal C. lateralis adalah wide, dimana

terdapat pori berjumlah 9. C. semicinctus terjadi perbesaran sisik femoral

dan pori yang menyambung dengan sisik precloacal jumlah 36-38.

Bentuk precloacal subtriangular. Menurut Harvey dkk. (2016), C.

lateralis merupakan spesies endemik Sumatra Barat dan Aceh, yang

dicirikan dengan tuberkel tubuh seperti duri. Pola precloacal berbentuk

wide dengan pore berjumlah 9-13.

40

(Dokumentasi ENS, 2014)

Gambar 13. Perbandingan karakter morfologi. Ket: a) C. lateralis; b) C.

semicinctus

(Dokumentasi ENS, 2014)

Gambar 14. Perb